Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.
Artykuł metodologiczny
Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obecnie hodowla organoidów stanowi ważne narzędzie do badań in vitro różnych aspektów biologicznych i chorób w różnych narządach. Mysie krypty jelita cienkiego mogą tworzyć organoidy, które naśladują nabłonek jelitowy podczas hodowli w macierzy zewnątrzkomórkowej 3D. Organoidy składają się ze wszystkich typów komórek, które spełniają różne funkcje homeostatyczne jelit. Należą do nich komórki Panetha, komórki enteroendokrynne, enterocyty, komórki kubkowe i komórki kępkowe. Dobrze scharakteryzowane cząsteczki są dodawane do pożywki hodowlanej w celu wzbogacenia jelitowych komórek macierzystych (ISC) znakowanych powtórzeniami bogatymi w leucynę zawierającymi receptor 5 sprzężony z białkiem G i są wykorzystywane do napędzania różnicowania w dół określonych linii; cząsteczki te obejmują naskórkowy czynnik wzrostu, Noggin (białko morfogenetyczne kości) i R-spondynę 1. Ponadto szczegółowo opisano protokół generowania organoidów z pojedynczego ISC dodatniego receptora wątrobowokomórkowego B2 (EphB2) wytwarzającego erytropoetynę. W tym artykule opisano techniki izolowania krypt jelita cienkiego i pojedynczego ISC z tkanek oraz zapewnienia skutecznego tworzenia organoidów.
Wprowadzenie
Organoidy jelitowe, które zostały po raz pierwszy założone w 2009 roku, stały się potężnym narzędziem in vitro do badania biologii jelit, biorąc pod uwagę ich morfologiczne i funkcjonalne podobieństwo do dojrzałych tkanek. Niedawny postęp technologiczny w zakresie hodowanych organoidów pochodzących z komórek macierzystych dorosłych tkanek pozwolił na długoterminową hodowlę jelitowych komórek macierzystych (ISC) o potencjale samoodnawiania i różnicowania. Te organoidy są szeroko stosowane w podstawowych i translacyjnych badaniach nad fizjologią i patofizjologią przewodu pokarmowego1,2,3,4,5,6. Organoidy 3D opracowane przez grupę Clevers stanowią potężne narzędzie do badania nabłonka jelitowego o zwiększonym znaczeniu fizjologicznym7. Ponieważ organoidy jelitowe pochodzą z tkankowych komórek macierzystych i składają się z wielu typów komórek, podsumowują one funkcjonalność nabłonka jelitowego. Warto zauważyć, że posortowana komórka macierzysta bogata w powtórzenia bogate w leucynę, zawierająca 5-dodatni receptor 5-dodatni (Lgr5+) sprzężona z białkiem G może również generować organoidy 3D bez żadnych komórek Panetha lub niszy ISC, takiej jak nisza nabłonkowa lub nisza zrębu7. Jednak zdolność do tworzenia organoidów posortowanych pojedynczo komórek Lgr5 + jest niska w porównaniu z dubletami komórek krypty i ISC-Paneth8.
Coraz więcej badań wykazało, że metody inkubacji kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) lub dysocjacji kolagenazy powodują rozluźnienie nabłonka i uwolnienie krypt. Ponieważ dysocjacja enzymatyczna może mieć wpływ na stan komórek krypt, do dysocjacji tkanki zwykle stosuje się metodę izolacji mechanicznej. Chociaż trawienie mechaniczne jest szybką techniką, metoda ta może być związana z niespójną wydajnością krypt lub słabą żywotnością komórek9. Dlatego leczenie EDTA i dysocjacja mechaniczna mogą być łączone w celu uzyskania lepszych plonów krypt. Cechą metodologii przedstawionej w tym artykule jest użycie energicznego wytrząsania fragmentów tkanek po chelatacji EDTA10. Energiczne wytrząsanie pozwala na skuteczną izolację krypt z kompleksów krypta-kosmków w jelicie cienkim. Stopień ręcznego wstrząsania decyduje o separacji. Dlatego pozyskiwanie krypt z kompleksów jest ważne dla eksperymentatorów w tej dziedzinie. Dodatkowo, odpowiednie umiejętności mogą zredukować zanieczyszczenie kosmkami do minimum i zwiększyć liczbę krypt.
Stąd, ten eksperymentalny protokół, który wykorzystuje organoidy jelita cienkiego pochodzące z myszy, może lepiej izolować krypty za pomocą siły fizycznej po leczeniu EDTA w celu dysocjacji. Wiadomo, że wzorzec ekspresji receptora wątrobowokomórkowego B2 wytwarzającego erytropoetynę (EphB2) częściowo odzwierciedla środowisko krypty. Na przykład komórki EphB2-dodatnie są zorganizowane od dołu do góry11. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) przeprowadzono w oparciu o ekspresję EphB2, a uzyskane komórki podzielono na cztery grupy: EphB2wysoki, EphB2średni, EphB2niski i EphB2neg. Następnie wykazano wzrost organoidów z posortowanych komóreko wysokiej zawartości EphB2 u myszy typu dzikiego (WT).
Protokół
Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Suntory (APRV000561), a wszystkie zwierzęta były utrzymywane zgodnie z wytycznymi komitetu dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Użyto standardowego szczepu WT Mus musculus (C57BL6/J). Użyto zarówno samców, jak i samic myszy w wieku od 10 tygodni do 20 tygodni. Myszy zostały poddane eutanazji z uduszeniemCO2
.1. Izolacja jelita cienkiego
- Wytnij jelito cienkie, w tym dwunastnicę i bliższą połowę jelita czczego, nożyczkami laboratoryjnymi.
- Przenieś tkankę na szalkę Petriego i przepłucz jelito cienkie 5 ml zimnego PBS-ABx (PBS + penicylina-streptomycyna [1%] + gentamycyna [0,5%]) w strzykawce o pojemności 5 ml w celu usunięcia zawartości światła.
- Przeciąć tkankę wzdłuż nożyczkami laboratoryjnymi i ręcznie umyć zimnym PBS-ABx, potrząsając.
UWAGA: Poprzez zeskrobanie kosmków za pomocą szkiełka, zanieczyszczenie kosmków może zostać zmniejszone12. - Zebrać około 5 mm x 5 mm kawałki odcinka jelitowego za pomocą nożyczek laboratoryjnych. Przenieś fragmenty do probówki o pojemności 50 ml za pomocą pęsety i dodaj 25 ml zimnego PBS-ABx.
- Umyj fragmenty, mieszając tam iz powrotem 10 razy 25 ml zimnego PBS-ABx, aby usunąć zawartość jelitową z probówki o pojemności 50 ml.
2. Izolacja krypty
- Inkubować kawałki w PBS-ABx zawierającym 2 mM EDTA przez 30 minut na lodzie, bez wstrząsania.
- W celu łatwego zestalenia macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) należy wcześniej inkubować 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C.
- Odessać roztwór EDTA z systemu hodowli komórkowej za pomocą pompy próżniowej, dodać 25 ml świeżego, zimnego PBS-ABx, a następnie energicznie potrząsać kawałkami ręcznie w górę iw dół 30x-40x, aby uwolnić kompleksy krypta-kosmki.
UWAGA: Oddzielone krypty i kosmki można sprawdzić poprzez obserwację mikroskopową kropli o objętości 25 μl z zawiesiny przy 4-krotnym powiększeniu. - Następnie należy jednokrotnie przefiltrować zawiesinę przez sitko o średnicy 70 μm.
- Odwirować zawiesinę o stężeniu 390 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić osad krypty w 20 ml sorbitolu DMEM (zaawansowany DMEM/F12 + penicylina-streptomycyna [1%] + gentamycyna [0,5%] + płodowa surowica bydlęca [1%] + sorbitol [2%]) z pipetowaniem i przenieść zawiesinę krypty do dwóch nowych probówek o pojemności 15 ml w celu podziału na dwie roztwory o pojemności 10 ml do wirowania z niską prędkością.
UWAGA: Dużą masę komórkową i komórki/szczątki można oddzielić za pomocą wirowania o niskiej prędkości. Duża masa komórkowa znajduje się w osadzie, a komórki/szczątki znajdują się w supernatancie. - Odwirować dwie zawiesiny krypty w temperaturze 80 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie delikatnie odessać supernatant.
UWAGA: Ponieważ tworzenie się osadu jest słabe, nie należy zbyt mocno zasysać. Pozostawić 2 ml supernatantu w każdej probówce. - Ponownie dodaj 10 ml sorbitolu DMEM do każdej probówki. Odwirować zawiesinę o stężeniu 80 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
- Po zaessaniu supernatantu, pozostawiając 2 ml supernatantu w każdej probówce, dodać 10 ml sorbitolu DMEM do ponownego zawieszenia i odwirować zawiesinę krypty w temperaturze 80 × g przez ostatnie 3 minuty w temperaturze 4 °C.
- Po odessaniu supernatantu, pozostawiając 2 ml supernatantu w każdej probówce, dodać 10 ml kompletnego DMEM (zaawansowany DMEM/F12 + penicylina-streptomycyna [1%] + gentamycyna [0,5%] + płodowa surowica bydlęca [1%]) w celu ponownego zawieszenia osadu przez pipetowanie w górę i w dół, i pozostawić na 1 min.
UWAGA: Poczekaj 1 minutę, aby skutecznie uzyskać pływające krypty. - Po 1 minucie zebrać każde 10 ml zawiesiny, aby uzyskać łącznie 20 ml i przefiltrować raz za pomocą sitka do komórek o wielkości 70 μm, aby oczyścić krypty.
- Przed wysiewem zasadniczo czystych krypt należy policzyć liczbę krypt w przefiltrowanym kompletnym DMEM, a następnie odwirować przy 290 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
- Wlej 25 μl kropelek do 6-centymetrowego naczynia w trzech punktach. Policz liczbę krypt pod mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu i oblicz stężenie krypt na kroplę o objętości 25 μl.
- Zawieś 100 krypt z 40 μl ECM na studzienkę. Pipetować w górę i w dół 5x-10x, aby uzyskać jednorodną zawiesinę krypt w ECM, a następnie wysiewać na wstępnie podgrzanej płytce 24-dołkowej o temperaturze 37 °C.
UWAGA: Zawsze trzymaj ECM na lodzie, aby uniknąć polimeryzacji. Ostrożnie pipetować, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza w ECM. - Inkubować 24-dołkową płytkę przez 15 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu polimeryzacji ECM.
- Na koniec przykryj ECM 500 μl pożywki hodowlanej zawierającej mysi naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), rekombinowaną mysią R-spondynę 1 i rekombinowaną mysią Noggin w temperaturze pokojowej. Końcowe stężenie materiałów w studzience jest następujące: penicylina-streptomycyna (1%), po 50 U/ml każdy; gentamycyna (0,5%), 25 μg/ml; EGF, 20 ng/ml; Noggin, 100 ng/ml; R-spondyna 1, 500 ng/ml; L-glutamina, 2 mM.
- Rozpocznij hodowlę krypty w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2.
UWAGA: Pożywka hodowlana dla organoidów na płytce 24-dołkowej znajduje się w tabeli 1. - Przeprowadzaj długoterminowe obrazowanie na żywo, aby obserwować morfogenezę organoidów za pomocą mikroskopu poklatkowego wyposażonego w obiektyw z 20-krotnym powiększeniem co 3 godziny przez okres do 7 dni. Uzyskuj szeregowe obrazy ułożone w stos z krokami co 1 μm (1 μm x pięć kroków).
- Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
3. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)
- Odizoluj krypty od myszy (patrz sekcja 2).
- Izolowane krypty należy traktować 2 ml trypsyny przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Zatrzymaj reakcję za pomocą 10 ml PBS, a następnie przepuść przez sitko o wielkości 20 μm.
- Odwirować roztwór o stężeniu 390 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić ze 100 μl kompletnego DMEM.
- Dodać przeciwciało sprzężone z anty-EphB2 APC (1/50) i inkubować przez 30 minut na lodzie.
- Umyj komórki 3x PBS, a na koniec dodaj 7-amino-aktynomycynę D (7-AAD) (1/100).
- Posortuj poplamione komórki za pomocą FACS.
- Dostosuj współczynnik skalowania obszaru i posortuj według rozmiaru komórki (rozproszenie do przodu, FSC-A) w porównaniu z granulacją (rozproszenie boczne, SSC-A).
- Sortuj ujemne i dodatnie ogniwa 7-AAD pod kątem żywotności za pomocą zestawu laserowego o długości fali 488 nm i mocy 50 mV.
- Rozgranicz bramki, aby posortować komórki EphB2-high (EphB2 high), EphB2-medium (EphB2med), EphB2-low (EphB2low) i EphB2-ujemne (EphB2neg) za pomocą lasera ustawionego na długość fali 640 nm i moc 100 mV.
- Rozpocząć hodowlęwysokokomórkową EphB2 w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 .
4. Organoidy z hodowli jednokomórkowej
- Przeprowadź metodę izolacji komórek zgodnie ze stopniowanymi poziomami powierzchni EphB211, a następnie uzyskaj cztery odrębne populacje (wysoką, średnią, niską i ujemną).
- Zebrać, osadzać z odwirowaniem w stężeniu 390 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i zatopić pojedynczo posortowane komórki owysokiej zawartości EphB2 w ECM przez pipetowanie, a następnie wysiewać na płytce 24-dołkowej (100 singletów/40 μl ECM/basenik).
- Podobnie jak w kroku 2.14, pozwól ECM na polimeryzację i przykryj ECM pożywką hodowlaną zawierającą inhibitor kinazy związanej z Rho (ROCK) (10 μM) przez pierwsze 2 dni, aby utrzymaćwysokie komórki EphB2.
UWAGA: Inhibitor ROCK jest skuteczny przeciwko anoikis. - Ręcznie zbadaj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu przy 40-krotnym powiększeniu i obserwuj żywotne organoidy z tworzeniem sferoidów i wypukłymi kryptami.
Wyniki
W celu generowania organoidów jelita cienkiego myszy, w celu wydajnej izolacji krypt można zastosować połączenie traktowania EDTA oraz metody izolacji mechanicznej10,13. Wyniki niniejszego badania wykazały, że niemal wszystkie wyizolowane krypty zostały natychmiast zamknięte i przybrały kształt stożka po ich wyciśnięciu z nisz nabłonkowych (Rycina 1A). Aby zminimalizować zanieczyszczenie kosmkami, otrzymaną zawiesinę przepuszczono przez sito komórkowe 70 µm, a następnie filtrat odwirowano. Ponieważ niektóre krypty ulegają zniszczeniu podczas filtracji i zawieszania, etapy te należy przeprowadzać ostrożnie. Wyniki wykazały, że niemal wszystkie krypty w końcowej frakcji były nienaruszone i nadawały się do hodowli (Rycina 1B). Aby umożliwić indywidualną wizualizację wszystkich wysianych krypt, w każdym dołku wysiano 100 krypt (Rycina 1C). Po dodaniu specyficznej pożywki do hodowli krypt (Rycina 1D), rozwój organoidów monitorowano codziennie za pomocą mikroskopu. Ponadto wzrost organoidów z krypt obserwowano za pomocą obrazowania time-lapse, aby monitorować ich rozwój (Rycina 1E oraz Wideo uzupełniające S1). Hodowane krypty zachowywały się w sposób stereotypowy. Wewnętrzne światło organoidu wypełniała masa komórek apoptotycznych. Aktywna proliferacja i różnicowanie ISC zachodziły w regionie krypt z pączkowaniem (Rycina 1E oraz Wideo uzupełniające S1). Pączkowanie było powiązane z migracją i proliferacją ISC oraz różnicowaniem komórek Panetha. Zróżnicowane komórki Panetha zawsze znajdowały się w miejscu pączkowania (Rycina uzupełniająca S1). Po potwierdzeniu stabilności organoidów w hodowli przy użyciu mikroskopu odwróconego z powiększeniem 10x, technikę tę można wykorzystać do badania formowania się krypt w rozwijającym się jelicie cienkim oraz do określania zdolności do regeneracji tkanek i długoterminowego przetrwania ISC w celu produkcji nowych komórek nabłonka jelitowego14,15,16.
Lgr5 jest definiowany jako marker ISC, a komórki Lgr5+ myszy tworzą organoidy 3D7. Jednak ze względu na niską obfitość białka LGR5 na powierzchni komórek oraz brak przeciwciał anty-LGR5 o wysokim powinowactwie, wydajne izolowanie mysich ISC metodą FACS jest trudne. EphB2 został wcześniej zidentyfikowany jako marker powierzchniowy służący do oczyszczania mysich i ludzkich ISC z tkanek jelitowych17,18. Wzorzec ekspresji EphB2 zwiększa złożoność markerów ISC. Komórki EphB2-dodatnie są rozmieszczone w całej komorze proliferacyjnej, osiągając maksimum u podstawy krypt, podczas gdy ich liczba maleje gradientowo w kierunku szczytu krypt11. W kryptach zlokalizowane są również komórki Panetha oraz komórki progenitorowe. Komórki Panetha wykazują głównie ekspresję EphB3, która jest niezbędna do ich rozmieszczenia, natomiast komórki progenitorowe znajdujące się nad nimi w krypcie wykazują głównie ekspresję EphB2. W związku z tym, podczas oczyszczania ISC przy użyciu przeciwciała anty-EphB2, może dojść do zanieczyszczenia próbki oboma typami komórek. Odpowiednio, należy ocenić ekspresję ich genów markerowych oraz zdolność do tworzenia organoidów przez komórki izolowane za pomocą EphB2 metodą FACS.
W oparciu o te fakty, wykorzystując analizę FACS, komórki z oznakowaniem powierzchniowym EphB2 mogą zostać wyizolowane z krypt WT19. Badano, czy ekspresja EphB2 pozwala na rozróżnienie czterech grup na podstawie ekspresji specyficznych markerów, takich jak geny markerowe specyficzne dla ISC (Lgr5, Ascl2 i Olfm4) oraz geny markerowe specyficzne dla komórek progenitorowych (Ki67, Myc i FoxM1). Eksperyment ten wykazał, że komórki EphB2high były przeważnie komórkami ISC, w przeciwieństwie do komórek EphB2med20,21. Ostatecznie, w oparciu o metodę izolacji komórek, uzyskane komórki podzielono na cztery grupy (komórki EphB2high, EphB2med, EphB2low i EphB2neg) (Rycina 2). Następnie pojedyncze komórki wykazujące wysoką ekspresję EphB2, wyselekcjonowane metodą FACS, poddano hodowli w celu wzrostu organoidów. Pojedyncza komórka EphB2high może zostać niezależnie wykorzystana do miejscowej terapii i odtworzyć samoorganizujące się struktury kryptowo-kosmkowe przypominające prawidłowe jelito cienkie (Rycina 3). Jednakże komórki pochodzące z pozostałych grup (EphB2med, EphB2low i EphB2neg) nie generują organoidów20.
W poprzednim badaniu około 6% pojedynczo sortowanych komórek Lgr5-GFPhi było w stanie zainicjować organoidy kryptowo-kosmkowe7. Jednak pozostałe komórki nie były w stanie wytworzyć organoidów i obumarły w ciągu pierwszych 12 h7. Autorzy przypuszczali, że było to wynikiem stresu fizycznego i/lub biologicznego nieodłącznie związanego z procedurą izolacji7. Wzrost organoidów na poziomie poniżej 6% uzyskano również z pojedynczo sortowanych komórek EphB2high u myszy WT. Do 5. dnia hodowli uformowały się struktury przypominające sferoidy (Rycina 3). Od 7. do 9. dnia nastąpiła ewaginacja punktów, prowadząca do powstania krypt (Rycina 3). Co ważne, zastosowanie wybranego inhibitora ROCK w przypadku pojedynczo sortowanych komórek EphB2high zmniejszyło indukowaną dysocjacją apoptozę i zwiększyło wydajność wzrostu organoidów.
Rysunek 1: Generowanie organoidów jelita cienkiego myszy. (A) Krypty przygotowane poprzez połączenie chelatacji EDTA i dysocjacji mechanicznej. (B) Uzyskane oczyszczone krypty. (C) Krypty zatopione w macierzy zewnątrzkomórkowej. (A-C) Czarne strzałki wskazują krypty. (D) Trójwymiarowa hodowla krypt i organoidów. (E) Reprezentatywne obrazy rosnącego organoidu pochodzącego z krypty. Białe strzałki wskazują pączkowanie krypt. Paski skali = (A-C) 100 µm oraz (E) 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej w celu uzyskania populacji komórek wykazujących ekspresję EphB2 (EphB2+) u myszy typu dzikiego. (A) Wykresy rozproszenia przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter) są wykorzystywane do oddzielenia komórek odpowiednio według ich wielkości i ziarnistości. (B) Rozproszenie fluorescencyjne jest wykorzystywane do oddzielenia żywych komórek na podstawie intensywności fluorescencji 7-AAD (PerCP). Wybrano bramkę dla populacji komórek 7-AAD-ujemnych. (C) Wybrano bramki dla populacji komórek o wysokiej ekspresji EphB2 (EphB2high), średniej ekspresji EphB2 (EphB2med), niskiej ekspresji EphB2 (EphB2low) oraz braku ekspresji EphB2 (EphB2neg). Skróty: FSC-A = pole powierzchni piku rozproszenia przedniego; SSC-A = pole powierzchni piku rozproszenia bocznego; 7-AAD = 7-amino-aktynomycyna D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Przebieg czasowy wzrostu organoidów z pojedynczo sortowanych komórek EphB2high u myszy typu dzikiego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Tabela 1: Pożywka hodowlana do płytki 24-dołkowej. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Wideo uzupełniające S1: Obrazy time-lapse rosnącego organoidu. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rysunek uzupełniający S1: Reprezentatywny obraz barwienia przeciwciałem przeciwko lizozymowi w organoidzie. Białe strzałki wskazują komórki Panetha. Skrót: DIC = mikroskop kontrastowo-fazowy (różnicowy kontrast interferencyjny). Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Protokół ten opisuje metodę konsekwentnego izolowania krypt jelita cienkiego i późniejszej hodowli organoidów 3D. Aby poprawić szybkość uwalniania krypty, opracowano metodę izolacji mechanicznej polegającą na energicznym wstrząsaniu po leczeniu EDTA. Skład pożywki różni się od oryginalnego protokołu Sato i wsp.7. Oryginalne podłoże jest stosunkowo drogie. W związku z tym pożywkę hodowlaną i dostosowane pożywki dla mysich organoidów jelita cienkiego zawierających inhibitory farmakologiczne, rekombinowane czynniki wzrostu i/lub kondycjonowane pożywki przedstawiono w tabeli 1. Wnt3A i N-acetylocysteina nie są zawarte w pożywce hodowlanej w tym protokole. Ponieważ komórki Panetha wyrażają Wnt3, komórki wytwarzają Wnt3 i wspierają utrzymanie ISC. Dodatkowo, w trakcie izolacji krypty, kondycjonowane podłoże nie jest używane. Model organoidowy jest dynamiczny i ma niejednorodność komórkową i strukturalną (komórki Panetha, enterocyty, komórki kubkowe, komórki enteroendokrynne, komórki kępkowe i ISC). W związku z tym organoidy te mogą być wykorzystywane na dużą skalę do badania podstawowych zagadnień biologii organoidów.
Gradient EphB2 utrzymuje łodygę ISC i proliferację wzdłuż osi krypta-kosmek w dorosłym jelicie cienkim18. Zaleta tworzenia organoidów z jednej pojedynczej komórki EphB2 w porównaniu z izolowanymi kryptami wiąże się ze zrozumieniem biologii mysich ISC, ponieważ ISC odgrywają kluczową rolę w różnych zaburzeniach jelitowych człowieka. Pojedyncze ISC owysokiej ekspresji EphB2 mogą być hodowane w celu utworzenia organoidów w podobny sposób, jak rozwój organoidów z pojedynczych ISC wykazujących ekspresję Lgr5. Najważniejszym krokiem jest precyzyjne podzielenie komórek na cztery grupy (EphB2wysoki, EphB2średni, EphB2niski i EphB2neg) zgodnie z wyrażeniem EphB2 w kryptach za pomocą FACS. Wykresy rozproszenia do przodu i z boku (FSC vs. SSC) są powszechnie używane do identyfikowania interesujących komórek na podstawie ich rozmiaru i szczegółowości. FSC wskazuje rozmiar komórki, a SSC odnosi się do złożoności lub ziarnistości komórki w bramce P0 (rysunek 2A). W tej pracy komórki, które znalazły się w zdefiniowanej bramce (P0), zostały następnie przeanalizowane pod kątem żywotności. Następnie określono ich żywotność na podstawie ujemnych i dodatnich populacji sygnałów fluorescencyjnych 7-AAD. Granica między komórkami 7-AAD-ujemnymi i -dodatnimi została ściśle ustalona, aby uzyskać ujemne komórki przy minimalnym pozytywnym zanieczyszczeniu komórek. Bramki EphB2 zostały z grubsza ustawione na podstawie stopniowanego wyrażenia EphB2.
Aby potwierdzić, że cztery grupy zostały precyzyjnie podzielone, przeanalizowano ekspresję mRNA wybranych genów. Poziomy mRNA markerów ISC są wysokie w komórkacho wysokiej zawartości EphB220. Ponadto poziomy mRNA markerów specyficznych dla komórek progenitorowych są stosunkowo wysokie w komórkach EphB2med 20. Jednak depresja EphB2w komórkach EphB2 o niskim poziomie i neg EphB2 jest niska lub ujemna w porównaniu z komórkami EphB2o wysokim poziomie i EphB2med 20. Powyższe środki należy podjąć w celu zapewnienia wzbogacenia populacjikomórek o wysokiej zawartości EphB2 przed posiewem. Jednak wzrost organoidów mniejszy niż 6% z komóreko wysokiej zawartości EphB2 może być spowodowany śmiercią komórek macierzystych podczas procesu hodowli, a nie energicznym wstrząsaniem podczas izolacji krypty. Wykazano, że zastosowanie selektywnego inhibitora kinazy związanej z Rho (ROCK) do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych znacznie zmniejsza apoptozę wywołaną dysocjacją22. Dlatego jako zmianę techniczną warto spróbować dodać inhibitor ROCK w wyższym stężeniu i przy dłuższej inkubacji, aby poprawić żywotność.
Komórki Panetha wydzielające Wnt3A obok ISC zapewniają niezbędne wsparcie dla ISC8. Rzeczywiście, dublety komórkowe ISC-Paneth wykazują znacznie zwiększoną zdolność do tworzenia organoidów w porównaniu z pojedynczymi ISC8. Ponadto wykazano, że dodanie Wnt3A w stężeniu 100 ng/ml przez pierwsze 3 dni hodowli zwiększa zdolność tworzenia organoidów8. Tak więc, jako kolejna zmiana techniczna, dodanie egzogennego Wnt3A może poprawić zdolność do tworzenia organoidów przez pojedyncze ISC owysokiej ekspresji EphB2.
W porównaniu z podejściami in vivo, organoidy mogą być z łatwością wykorzystywane do manipulacji genetycznych, analizy fenotypów nowotworów złośliwych i badań przesiewowych leków20,23. Połączenie chelatacji EDTA i metody izolacji mechanicznej jest skuteczne, powtarzalne i efektywne czasowo w tworzeniu organoidów jelita cienkiego z krypt i może być łatwo śledzone przez personel laboratoryjny bez żadnego zaawansowanego doświadczenia. Tak więc dodanie izolacji mechanicznej z energicznym wytrząsaniem po leczeniu EDTA może skutecznie ustanowić mysie organoidy jelita cienkiego ex vivo i zapewnić potencjalne narzędzie do hodowli organoidów i modelowania chorób innych dorosłych tkanek nabłonkowych.
Komórki nabłonka jelitowego są spolaryzowane i zorientowane ze stroną wierzchołkową skierowaną w stronę światła. Jednak strona wierzchołkowa skierowana w stronę światła organoidów 3D znajduje się w ich wnętrzu. W ten sposób organizacja ta uniemożliwia dostęp do strony wierzchołkowej, co stanowi problem podczas badania wpływu składników świetlnych, takich jak składniki odżywcze, drobnoustroje i metabolity na komórki nabłonkowe. Aby obejść tę wadę, opracowano hodowlę komórek organoidowych w postaci monowarstw2D 24. Jeśli chodzi o przyszłe zastosowania, wykorzystana zostanie hodowla monowarstw komórek organoidowych, ponieważ jest to najbardziej wydajny i łatwy w obsłudze system.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Grants-in-Aid for Scientific Research (C) dla T.T. (numery grantów JP17K07495 i JP20K06751). Dziękujemy prof. Mineko Kengaku za wykorzystanie sprzętu do długoterminowego obrazowania poklatkowego (LCV100; Olimp).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,5 ml Probówka Eppendorf | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| Strzykawka 5 ml | TERUMO | SS-05SZ | |
| 15 ml Tubka Falcon | Iwaki | 2325-015 | |
| 20 μ m sitko komórkowe | Sysmex | 04-004-2325 | |
| płytka 24-dołkowa | Iwaki | 3820-024 | |
| 50 mL Probówka Falcon | Iwaki | 2345-050 | |
| Naczynie do hodowli tkankowych 60 mm | FALCON | 353002 | |
| 70 μ m Sitko komórkowe | Falcon | 352350 | |
| 100 mm szalka Petriego | Iwaki | 3020-100 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
| Przeciwciało sprzężone z APC anty-EphB2 | BD Biosciences | ||
| Myszy C57BL6/J | Japonia SLC, Inc. | ||
| Czysta ławka | HITACHI | CCV-1306E | |
| Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy | Olympus | FV3000 | |
| EDTA (0,5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
| FACSMelody | BD Nauki Przyrodnicze-Biosciences | 661762 | |
| Surowica bydlęca | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
| Fidżi ( oprogramowanie) | https://fiji.sc/ | ||
| Gentamycyna (10 mg / ml) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μ g / ml |
| Nożyczki laboratoryjne Hammacher | SANSYO | 91-1538 | |
| Inkubator | Panasonic | MCO-170-PJ | |
| Pęseta laboratoryjna | AS-ONE | 7-164-04 | |
| L-glutamina 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | ECM do organoidów 3D |
| Mysz Anti-Human Lizozym | LSBio | LS-B8704-100 | |
| Mysz EGF (20 μ g/ml roztwór podstawowy) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/ml |
| PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
| Pipetman (10 μ L, 20 i mu; L, 200 μ L oraz 1,000 μ L) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15 i -16 | |
| Rekombinowany mysi Noggin (20 μ g/ml roztwór podstawowy | R& D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng / ml |
| Rekombinowana mysia R-Spondyna 1 (250 μ g/ml roztwór podstawowy) | R& D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
| Sorbitol | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
| TE2000-S (mikroskop odwrócony) | Nikon | 24131 | |
| Mikroskop poklatkowy | Olympus | LCV100 | |
| TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
| ULVAC ULVAC KIKO Inc. | |||
| Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μ M |
Bibliografia
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Seidlitz, T., et al. Human gastric cancer modelling using organoids. Gut. 68 (2), 207-217 (2019).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27, R99-R107 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Aronowitz, J. A., Lockhart, R. A., Hakakian, C. S. Mechanical versus enzymatic isolation of stromal vascular fraction cells from adipose tissue. Springerplus. 4 (1), 713(2015).
- Takahashi, T. New trends and perspectives in the function of non-neuronal acetylcholine in crypt-villus organoids in mice. Methods in Molecular Biology. 1576, 145-155 (2019).
- Batlle, E., et al. β-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB. Cell. 111 (2), 251-263 (2002).
- Baghdadi, M. B., Kim, T. -H. Analysis of mouse intestinal organoid culture with conditioned media isolated from mucosal enteric glial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101351(2022).
- Takahashi, T., et al. Non-neuronal acetylcholine as an endogenous regulator of proliferation and differentiation of Lgr5-positive stem cells in mice. FEBS Journal. 281 (20), 4672-4690 (2014).
- Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Miyoshi, H., et al. Wnt5a potentiates TGF-β signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. NatureMedicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
- Mao, W., et al. EphB2 as a therapeutic antibody drug target for the treatment of colorectal cancer. Cancer Research. 64 (3), 781-788 (2004).
- Takahashi, T., et al. Muscarinic receptor M3 contributes to intestinal stem cell maintenance via EphB/ephrin-B signaling. Life Science Alliance. 4 (9), e202000962(2021).
- Jung, P., et al. Isolation of human colon stem cells using surface expression of PTK7. Stem Cell Reports. 5 (6), 979-987 (2015).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Schulte, L., Hohwieler, M., Müller, M., Klaus, J. Intestinal organoids as a novel complementary model to dissect inflammatory bowel disease. Stem Cells International. 2019, 8010645(2019).
- Puzan, M., Hosic, S., Ghio, C., Koppes, A. Enteric nervous system regulation of intestinal stem cell differentiation and epithelial monolayer function. Scientific Reports. 8 (1), 6313(2018).
Przedruki i uprawnienia
