Method Article

Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

DOI:

10.3791/65220

⸱

June 2nd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), Pôle MIRO, Université Catholique de Louvain (UCLouvain), 2Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), Pôle de Pneumologie, ORL et Dermatologie (PNEU), Université Catholique de Louvain (UCLouvain), 3Division of Pneumology, Cliniques Universitaires St-Luc, Université Catholique de Louvain (UCLouvain), 4IREC Imaging Platform, Université Catholique de Louvain (UCLouvain), 5Institut Roi Albert II, Department of Medical Oncology and Gastroenterology, Cliniques Universitaires St-Luc

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrośrodowisko guza (TME) składa się z mnóstwa różnych typów komórek, takich jak cytotoksyczne komórki odpornościowe i komórki immunomodulujące. W zależności od swojego składu i interakcji między komórkami nowotworowymi a komórkami okołonowotworowymi, TME może wpływać na progresję nowotworu. Charakterystyka nowotworów i ich złożonego mikrośrodowiska może przyczynić się do lepszego zrozumienia chorób nowotworowych i może pomóc naukowcom i klinicystom w odkryciu nowych biomarkerów.

Niedawno opracowaliśmy kilka multipleksowych paneli immunofluorescencyjnych (mIF) opartych na wzmocnieniu sygnału tyramidu (TSA) do charakterystyki TME w raku jelita grubego, raku płaskonabłonkowym głowy i szyi, czerniaku i raku płuc. Po zakończeniu barwienia i skanowania odpowiednich paneli, próbki są analizowane w oprogramowaniu do analizy obrazu. Pozycja przestrzenna i barwienie każdej komórki są następnie eksportowane z tego oprogramowania do oceny ilościowej do R. Opracowaliśmy skrypty R, które pozwalają nam nie tylko analizować gęstość każdego typu komórek w kilku przedziałach nowotworowych (np. środku guza, brzegu guza i zrębie), ale także wykonywać analizy odległościowe między różnymi typami komórek.

Ten szczególny przepływ pracy dodaje wymiar przestrzenny do klasycznej analizy gęstości, która jest już rutynowo wykonywana dla kilku markerów. Analiza mIF może pozwolić naukowcom lepiej zrozumieć złożoną interakcję między komórkami nowotworowymi a TME i odkryć nowe predykcyjne biomarkery odpowiedzi na leczenie, takie jak inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych i terapie celowane.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z rozwojem terapii celowanych i inhibitorów immunologicznych punktów kontrolnych, stało się sprawą najwyższej wagi, aby lepiej scharakteryzować interakcje między komórkami nowotworowymi a ich mikrośrodowiskiem, a jest to obecnie ważna dziedzina badań translacyjnych. TME składa się z wielu różnych typów komórek, z równowagą immunologicznych komórek cytotoksycznych ukierunkowanych na komórki nowotworowe i komórek immunomodulujących, które mogą sprzyjać wzrostowi guza i inwazyjności1,2,3,4. Charakterystyka tego złożonego środowiska może przyczynić się do lepszego zrozumienia chorób nowotworowych i może pomóc naukowcom i klinicystom w odkryciu nowych biomarkerów predykcyjnych i prognostycznych w celu lepszej selekcji pacjentów do przyszłego leczenia5,6. Na przykład Galon i jego zespół opracowali Immunoscore, który jest powtarzalną metodą oceniania, którą można wykorzystać jako biomarker predykcyjny. Wynik immunologiczny oblicza się na podstawie gęstości limfocytów T CD3 + i CD8 + w marginesie inwazyjnym i w środku guza7,8.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano komercyjne rozwiązania dla mIF, ale są one często drogie i zaprojektowane dla konkretnych paneli antygenów. Aby przezwyciężyć zapotrzebowanie na specyficzne panele antygenów w badaniach akademickich i translacyjnych, opracowaliśmy opłacalną metodę wykonywania mIF na skrawkach guza FFPE, umożliwiając barwienie od dwóch do sześciu antygenów dodanych do jąder komórkowych w celu przeciwbarwienia próbek ludzkich i mysich.

Po zabarwieniu całych skrawków tkanek i zeskanowaniu ich za pomocą skanera fluorescencyjnego, próbki mogą być analizowane przez kilka programów do analizy obrazów obsługujących duże zestawy danych piramidalnych. Wreszcie, surowe dane mogą być wykorzystywane w środowisku do obliczeń statystycznych i grafiki, takim jak oprogramowanie R (wersja 4.0.2) w celu wykonywania analiz gęstości i przestrzennych.

Protokół zoptymalizowany pod kątem barwienia pięcioma markerami, jak również sztuczki i wskazówki dotyczące optymalizacji nowych paneli, jest przedstawiony w tym manuskrypcie. Ponadto wyjaśniono szczegółowe etapy analizy obrazu oraz funkcje R wykorzystywane do analizy statystycznej i przestrzennej.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie próbki użyte w niniejszym protokole pochodzą z badania zatwierdzonego przez lokalne komisje etyczne i autoryzowanego przez kompetentną władzę. Wszyscy uczestnicy badania wyrazili pisemną świadomą zgodę. Badanie jest zarejestrowane w ClinicalTrials.gov (NCT03608046).

1. Multipleksowa immunofluorescencja

  1. Cięcie FFPE
    1. Utrwalić tkankę w 4% paraformaldehydzie i zanurzyć utrwaloną tkankę w parafinie.
    2. Wytnij odcinki o grubości 5 μm i umieść je na samoprzylepnych szkiełkach mikroskopowych.
    3. Szkiełka suszyć przez noc w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Deparafinowanie i hamowanie endogennych peroksydaz
    1. Odwoskować tkanki, zanurzając szkiełka w toluenie (3x po 5 minut) i metanolu (3x po 5 minut) pod wyciągiem.
    2. Zahamuj endogenne peroksydazy, zanurzając szkiełka w 3% nadtlenku wodoru rozcieńczonym w metanolu na 20 minut pod wyciągiem.
    3. Opłukać szkiełka w destylowanym (d)H2O (1x przez 3 min).
  3. Multipleksowe barwienie immunofluorescencyjne
    1. Zanurz szkiełka w słoiku barwiącym o pojemności 300 ml zawierającym 10 mM buforu cytrynianu (pH 6) lub EDTA (pH 9) uzupełnionego 0,1% TritonX-100,
      UWAGA: Zastosowany bufor (pH 6 lub pH 9) zależy od wybarwionego antygenu (patrz Tabela 1).
    2. Umieść słoik do barwienia z zamkniętą pokrywką w kuchence mikrofalowej na 3-5 minut z maksymalną mocą (np. 900 W), aż bufor zacznie wrzeć.
      UWAGA: Optymalny czas gotowania zależy od kuchenki mikrofalowej i objętości bufora. Korekty mogą być konieczne, aby znaleźć idealny czas. W przypadku niektórych delikatnych antygenów lub delikatnych i mniej przylegających próbek (np. organoidów i sferoidów) gotowanie w kuchence mikrofalowej może być zbyt ostre. W takim przypadku zamiast tego można użyć szybkowaru.
    3. Utrzymuj bufor w temperaturze bliskiej wrzenia, wkładając zamknięty słoik do barwienia do kuchenki mikrofalowej na małą moc (np. 90 W) na 15 minut.
    4. Wykonaj ostatni etap podgrzewania, ustawiając kuchenkę mikrofalową na maksymalną moc na 90 sekund.
    5. Wyjmij słoik z kuchenki mikrofalowej i pozwól buforowi ostygnąć przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Płukać szkiełka 3x po 5 minut w dH2O i 1x przez 5 minut w trójbuforowym roztworze soli fizjologicznej zawierającym 0,1% Tween 20 (TBS-T).
    7. Wyjmij TBS-T, osuszając szkiełka na ręczniku papierowym
    8. Umieść szkiełka (płasko) na tacy z komorą barwienia lub pudełku na szkiełka mikroskopowe (patrz Tabela materiałów).
    9. Otocz tkankę hydrofobowym pisakiem.
    10. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania, pokrywając tkankę 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczoną w TBS-T przez 30 minut.
    11. Usuń bufor blokujący, osuszając szkiełka na ręczniku papierowym.
      UWAGA: Nie spłukuj szkiełek po etapie blokowania.
    12. Inkubować tkankę przez 60 minut z pierwszorzędowym przeciwciałem (patrz Tabela 1) rozcieńczonym w 1% BSA TBS-T, pokrywając tkankę około 300 μl roztworu.
    13. Płucz szkiełka 3x po 3 minuty za pomocą TBS-T.
    14. Inkubować tkankę przez 40 minut z przeciwciałem drugorzędowym poli-HRP (patrz Tabela 1), pokrywając tkankę około 300 μl roztworu.
    15. Płucz szkiełka 3x przez 3 minuty za pomocą TBS-T.
    16. Inkubować tkankę przez 10 minut z odczynnikiem fluorochromowo-tyramidowym (patrz Tabela 1) rozcieńczonym 200-krotnie w buforze boranowym (0,1 M boranu, pH 7,8, 3 M NaCl) uzupełnionym doraźnie 0,003% H2O2 , pokrywając tkankę około 300 μl roztworu.
    17. Płucz szkiełka 3x przez 3 minuty za pomocą TBS-T.
    18. Powtarzaj kroki 1.3.1-1.3.16, aż zostanie wykonane całe barwienie TSA.
    19. Inkubować tkankę przez noc w temperaturze 4 °C z ostatnim pierwszorzędowym przeciwciałem (patrz Tabela 1) rozcieńczonym w 1% BSA TBS-T.
      UWAGA: Ponieważ inkubacja odbywa się przez noc, ważne jest, aby przykryć tacę komory barwienia lub pudełko na szkiełka mikroskopowe i dodać dH2O na ręczniku papierowym na dnie pudełka (pod szkiełkami), aby upewnić się, że tkanki nie wyschną podczas inkubacji.
    20. Płukać chusteczkę 3x po 5 minut za pomocą TBS-T.
    21. Inkubować tkankę przez 120 minut z przeciwciałem drugorzędowym (bezpośrednio sprzężonym z fluorochromem) rozcieńczonym 200-krotnie w 1% BSA TBS-T.
    22. Płukać chusteczkę 3x po 5 minut za pomocą TBS-T.
    23. Wybarwić jądra przez inkubację tkanki przez 5 minut w bibenzimidu (20 mM) rozcieńczonym 1000-krotnie w 10% BSA TBS-T.
      UWAGA: Bisbenzimid można zastąpić DAPI, ale ten ostatni jest bardziej toksyczny i należy się z nim obchodzić ostrożnie pod wyciągiem.
    24. Płukać chusteczkę 3x po 3 minuty w dH2O.
    25. Zamontuj szkiełka za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego i borokrzemianowych szkieł nakrywkowych.

2. Skanowanie slajdów

  1. Digitalizuj slajdy, skanując je na fluorescencyjnym skanerze slajdów przy 20-krotnym powiększeniu (szczegóły skanera slajdów znajdują się w Tabeli materiałów).
    UWAGA: Reprezentatywny skan optymalnego multipleksu jest pokazany w Rysunek 1.

3. Analiza obrazu

  1. Zaimportuj skany do oprogramowania do analizy obrazu (File > Open Image).
  2. Przejdź do karty Klasyfikatory i wybierz wtyczkę DenseNet AI V2.
  3. Wytrenuj wtyczkę DenseNet AI V2, aby rozpoznawała jądra, otaczając około 500 jąder na jednym obrazie.
  4. Trenuj sztuczną inteligencję na kilku innych szkiełkach z tej samej partii i różnych partiach barwienia mIF, otaczając kilka jąder (50) na kilku szkiełkach (około 10).
    UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z wtyczki AI można znaleźć w instrukcji oprogramowania. Wykorzystanie sztucznej inteligencji do wykrywania jąder jest opcjonalne. Inne metody wykrywania jąder są dostępne w zależności od używanego oprogramowania do analizy obrazu.
  5. Zapisz wytrenowaną sztuczną inteligencję (Classifier Actions > Save).
  6. Przejdź do karty Adnotacje i utwórz adnotację dla każdego obszaru zainteresowania (ROI), takiego jak środek guza i margines guza, za pomocą narzędzia Adnotacja pióra.
  7. W razie potrzeby usuń regiony z zagięciami i obszary, które wydają się rozmyte za pomocą narzędzia Adnotacja wykluczeń.
    UWAGA: Barwienie hematoksyliną-eozyną odcinka przylegającego do odcinka użytego do mIF można przeprowadzić przed barwieniem mIF, aby upewnić się, że komórki nowotworowe są obecne w próbce i pomóc anatomopatologom w określeniu ROI.
  8. Przejdź do zakładki Analiza i wybierz algorytm HighPlex FL (Ustawienia, Akcje > Załaduj > HighPlex FL).
  9. Wybierz kartę Wybór barwnika i wybierz interesujący Cię barwnik.
  10. Na karcie Nuclear Detection (Wykrywanie jądrowe) przejdź do pozycji Nuclear Segmentation Type (Typ segmentacji jądrowej) i wybierz opcję AI custom.
  11. W obszarze Klasyfikator segmentacji jądrowej wybierz sztuczną inteligencję zapisaną w kroku 3.5.
  12. W zakładce Wykrywanie błon i cytoplazm wybierz maksymalny promień cytoplazmy (w tym badaniu użyto 1,5) oraz liczbę barwników błonowych.
  13. Dla każdego barwnika wybierz próg dodatni jądra, próg dodatni cytoplazmy i próg dodatni błony.
    UWAGA: Próg jest różny dla każdego barwienia i powinien być dostosowany do każdej partii szkiełek i każdego barwionego antygenem. Użycie narzędzia Ustawienia widoku (Widok > Ustawienia widoku) może pomóc w wybraniu odpowiedniego progu przy użyciu wartości intensywności na końcu szczytu intensywności (po prawej).
  14. Dla każdego barwnika wybierz procentowy procent wartości kompletności jądra, błony i cytoplazmy.
    UWAGA: Ten parametr jest ważny, aby uniknąć fałszywie dodatniego wykrywania, gdy dwie komórki o różnym zabarwieniu znajdują się blisko siebie (Rysunek 2).
  15. Zapisz algorytm (Ustawienia, Akcje > Zapisz).
  16. Analizuj ROI (Analizuj warstwę adnotacji >).
  17. Przejdź do zakładki Wyniki i zaznacz wszystkie dane w polu Dane obiektu (ctrl + A).
  18. Eksportuj dane w formacie .csv (kliknij prawym przyciskiem myszy > Eksportuj dane obiektu > . Csv).
    UWAGA: Ta tabela zawiera pozycję (Xmin, Xmax; Ymin, Ymax) i pozytywność każdego markera każdej analizowanej komórki.

4. Bioinformatyka z użyciem R

UWAGA: Skrypt języka R zawierający więcej szczegółów na temat następujących kroków jest dostępny na GitHubie (benidovskaya/Ring: Pipeline for the analysis of multiplex immunofluorescence stainings. [github.com])

  1. Korzystając z wyeksportowanej tabeli, najpierw zdefiniuj różne typy komórek na podstawie barwień kolokalizacyjnych. Na przykład zdefiniuj cytotoksyczne limfocyty T za pomocą podwójnie dodatnich komórek CD3 + / CD8 +.
  2. Następnie zrekonstruuj uproszczony obraz slajdu na wykresie punktowym, używając współrzędnych wyeksportowanych z oprogramowania do analizy obrazu i ggplot2 (Rysunek 3). Korzystając z tych danych, można przeprowadzić kilka rodzajów analiz:
    1. Analiza gęstości
      UWAGA: Najprostszą analizą jest analiza gęstości.
      1. Wykonaj analizę gęstości dla wszystkich typów komórek, używając całego szkiełka do biopsji lub określonego obszaru tkanki. Na przykład oblicz gęstość limfocytów T CD3 + i CD8 + w środku guza i na brzegu guza (Figura 4A-C).
      2. Aby obliczyć te gęstości, użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby utworzyć określoną ramkę danych dla każdej próbki z fenotypem i współrzędnymi każdej komórki. Za pomocą funkcji grupowania (k-najbliższy sąsiad) na R utwórz obiekt wielokąta przy użyciu granic badanej biopsji i oblicz gęstość typów komórek będących przedmiotem zainteresowania w jego wnętrzu.
        UWAGA: Pozwala to na porównanie gęstości różnych typów komórek w różnych warunkach (takich jak różne punkty czasowe, typy leczenia, typy tkanek i odpowiedź na leczenie) i lokalizacjach (środek guza, margines guza, zwłóknienie zrębu i obszar martwicy) w zależności od hipotezy biologicznej. Ze względu na dużą bliskość między komórkami rakowymi, komórkami okołonowotworowymi i komórkami naciekającymi nowotwór, oprogramowanie do analizy obrazu może wykrywać komórki podwójnie dodatnie jako komórki odpornościowe i rakowe w tym samym czasie. W takim przypadku należy bioinformatyczną skorygować ten problem, wspominając, czym są te podwójnie dodatnie komórki. W tym przypadku komórki CD3 + CD8 + cytokeratyna + zostały oznaczone jako komórki cytotoksyczne, ponieważ dodatnia cytokeratyna była spowodowana komórkami nowotworowymi otaczającymi naciekające limfocyty.
    2. Mapy popularności
      1. Korzystając z gęstości każdego typu komórki z różnych paneli i stosując normalizację (np. centrowanie skalowania), narysuj mapy cieplne (Rysunek 5) reprezentujące obfitość komórek w populacji próbek.
      2. Korzystając z hierarchicznego grupowania bez nadzoru w oparciu o gęstość komórek, grupuj pacjentów o podobnym składzie TME i koreluj te klastry z parametrami klinicznymi, takimi jak odpowiedź na leczenie i przeżycie.
        UWAGA: Mapy cieplne i klastryzację można łatwo wykonać za pomocą pakietu R ComplexHeatmap9.
    3. Przestrzenny rozkład komórek
      1. Oblicz bioinformatyczny odległości między komórkami (np. komórkami odpornościowymi i nowotworowymi; Rysunek 6A, B) na podstawie współrzędnych komórek dostarczonych przez analizę obrazu. Użyj mediany i średnich odległości między typami komórek będących przedmiotem zainteresowania, aby porównać bliskość komórek we wszystkich próbkach kohorty.
    4. Przestrzenne funkcje opisowe
      1. Użyj funkcji krzyżowej najbliższego sąsiada G, dostępnej za pośrednictwem pakietu R spatstat10, aby określić prawdopodobieństwo, że komórka będąca przedmiotem zainteresowania, X (np. komórka nowotworowa), spotka się z najbliższą komórką, Y (np. komórką T), w określonym promieniu wokół komórki X.
      2. Oblicz obszar pod krzywą empiryczną, aby uzyskać wartość liczbową reprezentującą naciek guza limfocytów T CD3 + wokół komórek nowotworowych11 (Rysunek 6C). Użyj innych przestrzennych funkcji opisowych, takich jak funkcja F lub funkcja J12.
    5. Analiza Immunoscore
      1. Oblicz Immunoscore (I), opracowany przez zespół Galon7,8, używając gęstości limfocytów T CD3+ i CD8+ w centrum guza i inwazyjnym marginesie guza.
        UWAGA: Wynik waha się od I0 do I4. Niska gęstość zarówno limfocytów T CD3 +, jak i CD8 + w środku i na marginesie guza wiąże się z wynikiem I0, podczas gdy wysoka gęstość limfocytów T CD3 + i CD8 + w obu regionach wiąże się z wynikiem I4. Niedawno wpływ prognostyczny Immunocore został potwierdzony w badaniu z próbkami od 2 681 pacjentów z rakiem jelita grubego w stadium I-III z 14 ośrodków w 13 krajach7. Jednak, aby można było obliczyć, Immunoscore wymaga chirurgicznie wyciętej próbki zawierającej zarówno środek, jak i margines guza. Dla biopsji, które zwykle nie mają marginesu, niedawno opracowano Immunoscore dostosowany do biopsji13.
      2. Aby obliczyć Immunoscore dostosowany do biopsji, przelicz wartość gęstości limfocytów T CD3 + i CD8 + na percentyl, a następnie użyj średniego percentyla limfocytów T CD3 + i CD8 + do oceny w jednej z trzech kategorii (tj. niskiej, pośredniej i wysokiej)13.
    6. Analiza hotspotów
      1. Użyj analizy hotspotów, używając funkcji quadratcount (spatstat)10, aby porównać gęstości różnych typów komórek w najbardziej infiltrowanym obszarze tkanki. Na przykład, możliwe jest obliczenie wyniku "podobnego do Immunoscore" przy użyciu wartości gęstości limfocytów T CD3 i CD8 najbardziej naciekanych kwadratów tkanki (Rysunek 7). Zastosuj tę metodę do analizy dowolnego typu komórek o niejednorodnym rozmieszczeniu w tkance.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z tym protokołem, należy zbadać kilka parametrów, aby upewnić się, że tkanka jest prawidłowo zabarwiona. Po pierwsze, barwienie TSA powinno wykazywać dobry zakres dynamiczny przy niskich czasach naświetlania (zwykle 2-100 ms) podczas procesu skanowania. Krótki czas ekspozycji oznacza, że amplifikacja została wykonana prawidłowo podczas reakcji z HRP. W przypadku antygenów barwionych przeciwciałem drugorzędowym bezpośrednio sprzężonym z fluorochromem czas ekspozycji może być znacznie dłuższy, co może prowadzić do fotowybielania (spadku intensywności sygnału z powodu długiego czasu ekspozycji). Po drugie, ważne jest, aby sprawdzić, czy każde barwienie wykazuje wysoki SNR. Wysoki sygnał tła z niskim sygnałem antygenu może wskazywać, że przeciwciało pierwszorzędowe nie jest wystarczająco specyficzne, że endogenne peroksydazy nie zostały prawidłowo inaktywowane lub że jeden z etapów protokołu nie został wykonany odpowiednio. Po trzecie, w zależności od skanera slajdów i zestawów filtrów użytych do skanowania, możliwe jest zaobserwowanie nakładania się dwóch kolorów (np. AF555, AF594 i AF647). Wybór odpowiednich zestawów filtrów w skanerze i właściwego rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia ewentualnych detekcji krzyżowych. Kontrola jakości polega na wykrywaniu pojedynczych wybarwionych komórek dla każdego znacznika na zeskanowanym pliku. Na koniec ważne jest również, aby dodać kontrolę dodatnią i ujemną dla każdej partii barwienia. Dla komórek odpornościowych migdałek jest dobrą kontrolą pozytywną. Reprezentatywny wynik optymalnego barwienia jest pokazany na Rysunek 1.

figure-results-1
Rysunek 1: Miejscowo zaawansowany rak odbytnicy wybarwiony metodą multipleksowej immunofluorescencji. Skróty: PD-1 = białko programowanej śmierci komórki 1; PD-L1 = Programowany ligand śmierci 1; ROR-γ = gamma sierocego receptora związanego z RAR; CD3 = klaster różnicowania 3; hPanCK = ludzka pan-cytokeratyna. Każde barwienie antygenem jest skanowane w skali szarości, a kolory przedstawione na rysunku są pseudokolorami. Skala w małym powiększeniu: 200 μm; Duże powiększenie skali paska: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wykrywanie jąder i barwienia miejscowo zaawansowanego raka odbytnicy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Bez prawidłowo ustawionego parametru procentu zupełności oprogramowanie wykrywa dwie komórki CD8+ (zielone kółko), ponieważ znajdują się one blisko siebie, ale tylko jedna komórka jest zabarwiona. Użycie 70% kompletności pomaga uniknąć tego fałszywie dodatniego wykrywania. Zielony = hPanCK; Żółty = CD3; Pomarańczowy = CD8. Podziałka skali: 100 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza obrazu i rekonstrukcja przerzutów raka jelita grubego do wątroby metodą kropkową. Na barwieniu multipleksowym (po lewej) ludzka pan-cytokeratyna jest w kolorze żółtym, CD3 jest w kolorze zielonym, CD8 jest w kolorze jasnoniebieskim, a IDO jest w kolorze pomarańczowym. Na wykresie kropkowym (po prawej) ludzkie komórki pan-cytokeratyny + są na żółto, komórki CD3 + CD8 - są na zielono, komórki CD3 + CD8 + są na niebiesko, a komórki IDO+ są na pomarańczowo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza przekroju chirurgicznego HNSCC. (A) Odcinek chirurgiczny HNSCC. Komórki rakowe są widoczne na zielono. Komórki okołonowotworowe są wizualizowane wokół wysp guzaowych (CD3 w kolorze żółtym i CD8 w kolorze fioletowym). (B) Środek guza (w kolorze żółtym z czarną obwódką) jest obliczany bioinformatyczną przez algorytm k-najbliższego sąsiada na podstawie odległości między wyspami guza z jednego obszaru. Wokół tego obszaru oblicza się margines inwazyjny (jasnożółty z szarą obwódką) na dowolnej podstawie 500 μm. (C) Inwazyjne limfocyty T są podświetlone czarnymi kropkami w środku guza i szarymi kropkami w inwazyjnym marginesie. Inne limfocyty T są podświetlone jasnozielonymi kropkami. Podziałka liniowa: 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Mapa cieplna gęstości różnych typów komórek w miejscowo zaawansowanych biopsjach raka odbytnicy. Mapa cieplna została narysowana przy użyciu nienadzorowanego grupowania gęstości różnych typów komórek z różnych paneli multipleksowych za pomocą pakietu ComplexHeatmap. Do normalizacji użyto skalowania i centrowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Odległości komórek CD4+ i CD8+ do każdej komórki IDO+ lub komórki nowotworowej. Ludzkie komórki pan-cytokeratyny + są koloru żółtego, komórki CD3 + CD8 - są zielone , komórki CD3 + CD8 + są niebieskie, a komórki IDO+ są pomarańczowe. (A) Najbliższa odległość między komórkami nowotworowymi a każdą limfocytem T CD8 +. (B) Wykresy słupkowe odległości między komórkami IDO+ a każdą komórką T CD8 + (niebieska) lub komórką T CD4 + (zielona). (C) Przykład próbki analizowanej za pomocą funkcji G-cross. Oś y pokazuje prawdopodobieństwo napotkania przez komórkę nowotworową limfocytu CD3 + w promieniu od 0 do 200 μm wokół komórki nowotworowej. Pokazane są trzy krzywe; krzywa teoretyczna jest zaznaczona kolorem zielonym (rozkład Poissona), skorygowana krzywa empiryczna z poprawką km jest zaznaczona kolorem czarnym, a skorygowana krzywa empiryczna z korektą granicy jest zaznaczona kolorem czerwonym przerywanym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Ilustracja liczby kwadratów. Obliczenia graniczne i quadrratcount zostały wykonane przy użyciu pakietu spatstats. Najbardziej zainfekowane kwadraty (hotspoty) mogą być wykorzystywane do dalszych statystyk. CD4 jest na zielono, CD8 na czerwono, a komórki nowotworowe są na żółto. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Optymalizacja rozcieńczania przeciwciał i pobierania antygenów. Chromogenne wykrywanie PD-1 przy użyciu trzech różnych rozcieńczeń i dwóch różnych roztworów do odzyskiwania antygenu pierwszorzędowego przeciwciała (cytrynian pH 6 i EDTA pH 9). Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: ) szt. powiedział: powiedział: powiedział:
Przeciwciało pierwszorzędoweRozcieńczeniuPobieranie antygenuPrzeciwciało drugorzędowe Fluorochrompozycja
PD-11/100EDTA (pH 9)Anty-królikAF6471
PD-L1 (Zasilacz PD-L11/1000EDTA (pH 9)Anty-królikAF488cyfra arabska
ROR-γ1/200EDTA (pH 9)Ochrona przed myszamiZobacz materiał ATT0-4253
Płyta CD31/100Cytrynian (pH 6)Anty-królikAF5554
hPanCK1/50Cytrynian (pH 6)Anty-mysz sprzężona z AF7505

Tabela 1: Przykład zoptymalizowanego panelu multipleksowego. Skróty: PD-1 = białko programowanej śmierci komórki 1; PD-L1 = Programowany ligand śmierci 1; ROR-γ = gamma sierocego receptora związanego z RAR; CD3 = klaster różnicowania 3; hPanCK = ludzka pan-cytokeratyna; AF = AlexaFluor; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy. CD3 służy do wykrywania limfocytów T; PD-1 służy do wykrywania wyczerpanych limfocytów; ROR-γ służy do wykrywania Th-17; a hPanCK służy do wykrywania komórek nowotworowych. Kolumna pozycji wskazuje kolejność, w jakiej ma być wykonywany multipleks sekwencyjny.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najważniejszymi parametrami, które należy wziąć pod uwagę w celu optymalizacji barwienia multipleksowego, są rozcieńczenie, swoistość i pobieranie antygenu stosowane dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego. Przed rozpoczęciem protokołu multipleksu należy przetestować optymalne rozcieńczenie każdego przeciwciała pierwotnego i optymalne pobieranie epitopów (pH 6 lub pH 9) za pomocą barwienia chromogennego (DAB). Zalecamy przetestowanie trzech rozcieńczeń dla każdego buforu do odzyskiwania antygenu: rozcieńczenie, które jest zwykle określone przez markę komercjalizującą przeciwciało, to samo rozcieńczenie podzielone dwukrotnie, a to samo rozcieńczenie pomnożone dwukrotnie (ryc. 8). Wybór odpowiedniego rozcieńczenia jest bardzo ważnym krokiem w celu weryfikacji swoistości przeciwciał i optymalizacji stosunku sygnału do szumu (SNR) barwienia. Po wybraniu odpowiedniego rozcieńczenia w DAB, to samo rozcieńczenie powinno być testowane dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego przy użyciu uniplex TSA. Po wybraniu rozcieńczenia i buforu do pobierania epitopów dla każdego barwienia antygenem, ważne jest również prawidłowe ustawienie sekwencji multipleksu; W szczególności niektóre antygeny są lepiej wybarwione w pierwszej pozycji, a inne w ostatniej. Zalecamy przetestowanie etykietowania multipleksu przy użyciu wszystkich możliwych permutacji kolejności, aby wybrać, które barwienie antygenem powinno być pierwsze, drugie itp. Jest to również bardzo ważny krok, ponieważ niektóre delikatne antygeny mogą ulec degradacji po kilku rundach pobierania epitopów, a niektóre antygeny są lepiej wybarwione po kilku rundach pobierania epitopów. Na przykład SNR jest zawsze wyższy na ostatniej pozycji dla CD3 i na pierwszej pozycji dla barwienia PD-1. Co więcej, barwienie kilku kolokalizowanych antygenów może być utrudnione przez efekt parasolowy (nasycenie miejsc reaktywnych tyramidu). Można to osłabić poprzez zmniejszenie stężenia tyramidu. Gdy ekspresja jednego antygenu jest uwarunkowana ekspresją innego (CD8 występuje tylko na limfocytach T eksprymujących CD3), zalecamy barwienie antygenu o najszerszej ekspresji (w tym przypadku CD3) po drugim. Wreszcie, wybór odpowiedniego fluorochromu dla każdego barwienia antygenem zgodnie ze specyfiką skanera jest również ważnym krokiem w celu uniknięcia wykrywania krzyżowego.

Głównymi zaletami tej techniki są uzyskane wzmocnienie i stosunek sygnału do szumu. Jednak ta technika ma ograniczenie, które polega na tym, że barwienie jest sekwencyjne, a fluorochromy są kowalencyjnie związane z tkanką. Niemniej jednak, po wykonaniu wszystkich rund wzmacniania sygnału tyramidu, możliwe jest również dodanie ostatniego barwienia przeciwciałem wtórnym bezpośrednio sprzężonym z fluorochromem (bez TSA). W niektórych panelach zastosowaliśmy tę metodę, aby dodać barwienie w kanale 750. Było to konieczne, ponieważ w tym czasie żaden tyramide-AF750 nie był dostępny na rynku. Warto zauważyć, że czas ekspozycji (podczas skanowania) na antygen wybarwiony AF750 będzie znacznie dłuższy niż w przypadku innych antygenów wybarwionych TSA. W takim przypadku zalecamy barwienie białka o wysokiej ekspresji, takiego jak cytokeratyna, lub zwiększenie stężenia przeciwciała pierwszorzędowego. W ten sposób możliwe jest barwienie maksymalnie pięciu do sześciu antygenów na szkiełko w jednej partii, w zależności od skanera fluorescencyjnego.

W przeciwieństwie do tego, kilka dostępnych na rynku technik wykorzystuje barwienie seryjne z kilkoma rundami barwienia, skanowania i strippingu lub fotowybielania w celu zwiększenia liczby antygenów, które można wybarwić na jednym odcinku tkanki. Jednak techniki te są często czasochłonne, drogie, nie mają wzmocnienia sygnału, wymagają zaawansowanych kroków obliczeniowych w celu prawidłowego połączenia skanów seryjnych i, z naszego doświadczenia, mogą wywołać nieodwracalne uszkodzenie tkanek z powodu licznych etapów procedury. Niemniej jednak donoszono, że przy użyciu tej metody można wybarwić do 30 antygenów na jednej tkance14.

Podsumowując, nasza metoda jest solidną, powtarzalną, łatwą w użyciu i opłacalną techniką immunohistofluorescencji, która może być stosowana w każdym laboratorium posiadającym fluorescencyjny skaner slajdów. Można użyć dowolnego skomercjalizowanego przeciwciała pierwszorzędowego odpowiedniego dla IHC, a panele nie są specyficzne dla żadnych komercyjnych zestawów. Analizę obrazu można przeprowadzić w kilku różnych programach, w tym w programach typu open source, takich jak QuPath i R. Uważamy jednak, że metoda ta może zostać nawet ulepszona w przyszłości dla dużych paneli antygenowych, umożliwiając wykonywanie seryjnego barwienia/skanowania tego samego szkiełka z różnymi panelami antygenów i z korzyścią wzmocnienia sygnału.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Derouane F za pomoc i wsparcie. Nicolas Huyghe jest pracownikiem naukowym finansowanym przez Belgijski Narodowy Fundusz Badań Naukowych (Télévie/FNRS 7460918F).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
przeciwciało pierwszorzędowe anty-CD3Abcamab16669monookrężnikowe
przeciwciało pierwszorzędowe anty-CD8królika DAKOM710301mysie przeciwciało monoklonalne
anty-hPanCK pierwotne przeciwciało DAKOM3515mysie przeciwciało monoklonalne
anty-PD-1Sygnalizacja komórkowaMonookrężne
przeciwciało pierwszorzędowe anty-PD-L1Sygnalizacja komórkowa13684monookrężne
przeciwciało pierwotne anty-RORCkrólika SigmaMABF81mysz monoklonalna
ATTO-425ATTOtec
Axioscan Z1ZeissŹródło światła: Colibri 7 (385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm) Zestawy filtrów: Wzbudzenie 379/34 – rozdzielacz wiązki 409 – emisja 440/40; Wzbudzenie 438/24 – rozdzielacz wiązki 458 – emisja 483/32; Wzbudzenie 490/20 – Rozdzielacz wiązki 505 – emisja 525/20; Wzbudzenie 546/10 – Rozdzielacz wiązki 556 – emisja 572/23; Wzbudzenie 592/21 – Rozdzielacz wiązki 610 – emisja 630/30; Wzbudzenie 635/18 – Rozdzielacz wiązki 652 – emisja 680/42; Wzbudzenie 735/40 – rozdzielacz wiązki QBS 405 + 493 + 611 + 762 - emisja QBP 425/30 + 524/51 + 634/38 + 785/38; Obiektyw: planapochromatyczny 20x/0,8; Aparat : Orca Flash 4.0 V3
Borokrzemianowe szkło osłonoweVWR631-0146
Envision+ anty-myszyDAKOK4001
Envision+ anty-królikDAKOK4003
Fluorescencyjne medium montażoweDAKOS3023
Goat anty-mysie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 750ThermoFischerA-21037
Oprogramowanie HALOIndicalabs
Hoescht Sigma14533
Szkiełka mikroskopowe Superfrost plusFisherscientific/Epredia10149870
Tyramide-AF488ThermoFischerB40953
Tyramide-AF555ThermoFischerB04955
Tyramide-AF647ThermoFischerB04958
królika

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ge, P., et al. Profiles of immune cell infiltration and immune-related genes in the tumor microenvironment of colorectal cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109228(2019).
  2. Fridman, W. H. The immune microenvironment as a guide for cancer therapies. Oncoimmunology. 1 (3), 261-262 (2012).
  3. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: Impact on clinical outcome. in Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  5. Calu, V., et al. Key biomarkers within the colorectal cancer related inflammatory microenvironment. Scientific Reports. 11 (1), 7940(2021).
  6. Havel, J. J., Chowell, D., Chan, T. A. The evolving landscape of biomarkers for checkpoint inhibitor immunotherapy. Nature Reviews. Cancer. 19 (3), 133-150 (2019).
  7. Pages, F., et al. International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study. Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).
  8. Mlecnik, B., et al. Integrative analyses of colorectal cancer show immunoscore is a stronger predictor of patient survival than microsatellite instability. Immunity. 44 (3), 698-711 (2016).
  9. Gu, Z., Eils, R., Schlesner, M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data. Bioinformatics. 32 (18), 2847-2849 (2016).
  10. Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial Point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2022).
  11. Barua, S., et al. Spatial interaction of tumor cells and regulatory T cells correlates with survival in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 117, 73-79 (2018).
  12. Parra, E. R. Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340(2021).
  13. El Sissy, C., et al. A diagnostic biopsy-adapted immunoscore predicts response to neoadjuvant treatment and selects patients with rectal cancer eligible for a watch-and-wait strategy. Clinical Cancer Research. 26 (19), 5198-5207 (2020).
  14. Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplex ImmunofluorescenceSpatial Image AnalysisTumor MicroenvironmentTyramide Signal AmplificationFluorescence In Situ HybridizationImmune Cell ProfilingAntibody StainingImage Analysis SoftwareColorectal CancerPredictive Biomarkers

Related Articles