Artykuł metodologiczny

Preparat na bazie metanolu do badania komórek zwojowych siatkówki

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65222

⸱

7 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Renmin Hospital of Wuhan University

W tym artykule

Podsumowanie

Metanol może być używany jako pomocnicze stałe podłoże do przygotowania całej siatkówki i długoterminowego przechowywania, co jest przydatne do badania komórek zwojowych siatkówki.

Streszczenie

Komórki zwojowe siatkówki (RGC), które są neuronami projekcyjnymi siatkówki, propagują zewnętrzne informacje wizualne do mózgu. Zmiany patologiczne w RGC mają ścisły związek z licznymi chorobami zwyrodnieniowymi siatkówki. Barwienie immunologiczne całej siatkówki jest często stosowane w badaniach eksperymentalnych na RGC w celu oceny warunków rozwojowych i patologicznych siatkówki. W pewnych okolicznościach niektóre cenne próbki siatkówki, takie jak te od myszy transgenicznych, mogą wymagać przechowywania przez długi czas bez wpływu na morfologię lub liczbę RGC. Aby uzyskać wiarygodne i powtarzalne wyniki eksperymentalne, niezbędne jest użycie skutecznego podłoża konserwującego. W tym miejscu opisujemy działanie metanolu jako pomocniczego stałego podłoża do preparatów siatkówki w całości i długotrwałego przechowywania. Krótko mówiąc, podczas procesu izolacji, zimny metanol (−20 °C) jest pipetowany na powierzchnię siatkówki, aby pomóc utrwalić tkanki i ułatwić ich przepuszczalność, a następnie siatkówki mogą być przechowywane w zimnym metanolu (−20 °C) przed barwieniem immunologicznym. Protokół ten opisuje przebieg izolacji siatkówki i protokół przechowywania próbek tkanek, który jest przydatny i praktyczny w badaniu RGC.

Wprowadzenie

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) są jedynymi neuronami projekcyjnymi w siatkówce, integrują się i przekazują zewnętrzne informacje wizualne do mózgu1. Wiele chorób neurodegeneracyjnych, takich jak jaskra i urazowa neuropatia nerwu wzrokowego, charakteryzuje się nieodwracalnym uszkodzeniem i utratą RGCs2,3. Analiza zmian morfologicznych i ilościowych RGC jest kluczowym krokiem w określeniu, w jaki sposób rozwijają się i postępują choroby neurodegeneracyjne4,5.

Pośredni test immunofluorescencyjny jest powszechnie akceptowaną metodą monitorowania dystrybucji białek i zliczania komórek. W laboratorium barwienie immunologiczne całej siatkówki jest powszechnie stosowane w badaniach eksperymentalnych na RGC w celu oceny fizjologicznych i patologicznych warunków siatkówki6. Najczęstsze markery używane do oznaczania ilościowego RGC w całej siatkówce to Brn3a, białko wiążące RNA z wielokrotnym splicingiem (RBPMS) i tak dalej7,8. Scharakteryzowanie ilości i rozmieszczenia RGC wymaga wysokiej jakości barwienia immunologicznego całej siatkówki. Ogólnie rzecz biorąc, w protokołach barwienia immunologicznego siatkówka jest zanurzana w chemicznych utrwalaczach przed inkubacją w przeciwciałach. Idealne utrwalacze nie powinny zmieniać kształtu komórek, dostępności ani powinowactwa epitopów do przeciwciał, ani wymiarów liniowych tkanki9,10.

Ze względu na złożoną strukturę siatkówki, problemy takie jak kruchość i fałdowanie siatkówki, a także niektóre typowe trudności, takie jak kurczenie się komórek i niejasne jądra, są często występujące podczas tworzenia całego plastra siatkówki, co ma negatywny wpływ na badania eksperymentalne. Ponadto nie wszystkie siatkówki są natychmiast wybarwione immunologicznie, zwłaszcza jeśli chodzi o siatkówki myszy transgenicznych o wysokich cenach, które są cennego pochodzenia, co wymaga zachowania dodatkowych próbek siatkówki do dalszego wykorzystania.

Odpowiedni roztwór utrwalający może szybko utrwalić tkankę, uniknąć autolizy tkanek, zachować normalną morfologię i strukturę komórek tkankowych oraz zachować antygenowość białek i innych substancji10. Obecnie utrwalanie na bazie formaldehydu jest szeroko stosowane w różnych tkankach, w tym w oddzielonych siatkówkach, półwyciętych muszlach ocznych i całych gałkach ocznych10. Kurczenie się tkanek i zmiany morfologiczne komórek to dwa krytyczne wyzwania napotykane po zanurzeniu w formaldehydzie11. Ponadto coraz częściej pojawiają się zmodyfikowane preparaty utrwalające, aby zmaksymalizować zachowanie pierwotnych właściwości siatkówki i komórek docelowych9,10. Różne zabiegi utrwalania siatkówki mogą w różny sposób wpływać na strukturę siatkówki, immunogenność białek, wzbudzenie fluorescencji i cykl tłumienia12,13. Siatkówki utrwalone roztworem Davidsona są bardziej morfologicznie nienaruszone w porównaniu z tymi utrwalonymi formaliną, ale roztwór Davidsona jest mniej kompatybilny z niektórymi przeciwciałami, takimi jak mikroglejowy marker zjonizowany adaptor wiążący wapń cząsteczka 112. Biorąc pod uwagę delikatną naturę siatkówki, naukowcy naturalnie zastanawiają się, czy integralność siatkówki, a także właściwości i morfologia komórek docelowych zmienią się po długotrwałym przechowywaniu. Jednak możliwy wpływ roztworu utrwalającego na morfologię siatkówki i komórek RGC po przechowywaniu przez kilka miesięcy był rzadko zgłaszany. Optymalizacja stabilizacji siatkówki ma kluczowe znaczenie dla oceny i zachowania RGC.

Dostarczamy szczegółowy opis niezawodnej i technicznie prostej metody, której używamy do barwienia całej siatkówki u myszy. Nasza metoda kładzie nacisk na właściwe przygotowanie i przechowywanie siatkówk do badania RGC, biorąc pod uwagę konieczność długotrwałego przechowywania tkanki siatkówki, a także specyficzne aspekty powstawania lub degradacji fluoroforu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie użyte myszy C57BL/6J zostały uzyskane z Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Wuhan, a wszystkie powiązane eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Wuhan. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie myszy.

1. Wyłuszczenie i utrwalenie oczu

  1. Uśpij myszy za pomocą uduszenia dwutlenkiem węgla i delikatnie wyłuszczej gałkę oczną za pomocą bezzębnej pęsety.
  2. Przepłukać gałkę oczną jednorazowo w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Nakłuć gałkę oczną igłą strzykawkową na rogówce pod mikroskopem (okular WF: 10x/22; obiektyw o ciągłym powiększeniu: 0,67x-4,5x), aby przyspieszyć fiksację w gałce ocznej i poprawić skuteczność mocowania.
  4. Przenieść na 24-dołkową płytkę zawierającą 4% paraformaldehydu (PFA).
  5. Umocuj gałkę oczną w 4% PFA na 45 minut, a następnie przenieś ją do 1x PBS, aby usunąć nadmiar PFA (przemyć trzy razy, 5 minut/czas) natychmiast.

2. Izolacja i spłaszczenie siatkówki

  1. Przenieś gałkę oczną na szklane szkiełko podstawowe i umieść je pod mikroskopem preparacyjnym (okular WF: 10x/22; obiektyw o ciągłym powiększeniu: 0,67x-4,5x).
  2. Trzymaj kleszcze w jednej ręce i użyj ich do zaciśnięcia brzegu rogówki, aby zapobiec ruchom gałki ocznej. Drugą ręką przytrzymaj nożyczki do preparowania i przetnij wokół rogówki na głębokości około 1 mm przez rąbek rogówki. Zdejmij soczewkę i korpus ciała szklistego.
  3. Przytrzymaj tarczę nerwu wzrokowego pośrodku i za pomocą nożyczek preparacyjnych przetnij siatkówkę promieniście wzdłuż czterech kwadrantów, osiągając około 2/3 promienia siatkówki.
  4. Zacisnąć jedną z krawędzi twardówki za pomocą kleszczy zębatych. Drugą ręką przytrzymaj krawędź twardówki nieząbkowanymi kleszczami i przesuń się od miejsca, w którym twardówka jest przymocowana przez kleszcze zębate, w kierunku podstawy twardówki. Ostrożnie obierz siatkówkę.
  5. Pobrać PBS za pomocą pipety (200 μl), aby przepłukać i zwilżyć siatkówkę, a następnie usunąć nadmiar PBS za pomocą małego kawałka chłonnego papieru. W razie potrzeby delikatnie spłaszcz siatkówkę małą szczoteczką z włosia.
  6. Powoli pipetować zimny metanol (wstępnie schłodzony w zamrażarce o temperaturze -20°C) kropla po kropli na wewnętrzną powierzchnię siatkówki (objętość metanolu nie jest ustalona, o ile siatkówka może być całkowicie pokryta metanolem). Siatkówka zmienia kolor na biały i rozwija zwiększoną wytrzymałość.
  7. Delikatnie spłaszcz siatkówkę i usuń zanieczyszczenia, takie jak resztki błon pigmentowych i ciało szkliste, za pomocą małych szczoteczek z włosia. Odwróć siatkówkę za pomocą małych szczoteczek z włosia i powtórz wyżej wymieniony proces.
  8. Przenieś siatkówkę nasączoną metanolem do studzienki na 24-dołkowej płytce i utrzymuj ją nasączoną metanolem.
  9. Przechowywać w temperaturze -20°C przez 1-2 godziny w celu natychmiastowego barwienia immunologicznego lub pozostawić siatkówkę w metanolu i przechowywać w temperaturze -20°C do długotrwałego przechowywania.
  10. Usuń metanol z płytki 24-dołkowej i przepłucz siatkówkę 1x PBS.

3. Barwienie immunofluorescencyjne RGC

  1. Ostrożnie przenieść siatkówkę na 24-dołkową płytkę hemaglutynacyjną za pomocą plastikowej pipety Pasteura i zablokować 5% PBS-TX-BSA (5 g sproszkowanej albuminy surowicy bydlęcej rozpuszczonej w 100 ml 1 x roztworu PBST; PBST tworzy się przez dodanie 10 ml Triton X-100 do 2 000 ml 1 x PBS) w temperaturze pokojowej przez 4 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C. Trzymaj ganglion stroną do góry.
  2. Usunąć PBS-TX-BSA i inkubować siatkówkę w temperaturze 4 °C przez 48-96 godzin, dodając 100 μl wybranego przeciwciała pierwszorzędowego (przeciwciało przeciwko RBPMS świnki morskiej) w rozcieńczeniu 1:400.
  3. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i przepłucz siatkówkę trzy razy (po 20 minut) 1x PBS, wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  4. Inkubować siatkówkę, delikatnie wstrząsając przez noc w temperaturze 4 °C ze 100 μl odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego (patrz tabela materiałów), cyjaniny Cy3 affiniPure anty-donkey anti-finea pig IgG (H+L), stosując rozcieńczenie 1:400.
  5. Przepłukać siatkówkę 1x PBS trzy razy (po 20 minut).
  6. Połóż siatkówkę płasko na szkiełku podstawowym z warstwą komórek zwojowych skierowaną do góry, upuść odpowiednią ilość środka antyfluorescencyjnego wygaszającego wokół siatkówki za pomocą pipety i przykryj szkiełko nakrywkowym szkiełkiem nakrywkowym (należy uważać, aby nie pojawiły się pęcherzyki).
    UWAGA: Aby określić odpowiednią ilość środka antyfluorescencyjnego, upewnij się, że pokrywa on całą siatkówkę. Następnie zakryj szkiełko, nie pozwalając siatkówce unosić się i łatwo się poruszać.
  7. Uszczelnij suwak dookoła środkiem uszczelniającym, aby zapobiec jego przesuwaniu się. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20°C i chronić przed światłem.
  8. Zobrazuj siatkówkę za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego/konfokalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po rozbiorze, siatkówka powinna wyglądać jak płaska czterolistna koniczyna. W tym badaniu, przy użyciu protokołu opisanego powyżej, siatkówka zmieniła kolor na biały po dodaniu metanolu (Rysunek 1). W międzyczasie siatkówka zmieniła się z miękkiej na giętką i płaską. Następnie RGC zostały oznaczone jako anty-RBPMS8. Cztery pola obrazu wykonano w całej siatkówce (n = 3) za pomocą mikroskopu konfokalnego (okular: 10x; obiektyw: 40x). Reprezentatywne widoki wizualizowanych RGC sia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Fiksacja jest niezbędnym krokiem do zachowania siatkówki, co może mieć wpływ na wszelkie późniejsze badania RGC oparte na morfologii. Skuteczna fiksacja pozwala szybko uchwycić strukturę i stan siatkówki w momencie wystawienia jej na działanie podłoża utrwalającego, co ma kluczowe znaczenie dla dalszej analizy. Chociaż formaldehyd został uznany za jeden z najczęstszych środków utrwalających do utrwalania i konserwacji tkanek i komórek, sam formaldehyd nie zawsze działa dobrze jako optymalny utrwalacz chemiczny w niektóry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie są świadomi żadnych powiązań, członkostwa, finansowania lub udziałów finansowych, które mogłyby wpłynąć na obiektywność tego badania.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Hubei Key Laboratories Opening Project (grant nr 2021KFY055), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Hubei (grant nr 2020CFB240) oraz Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (grant nr 2042020kf0065).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowy klaster kultur komórkowychCostarFiksacja gałki ocznej
24-dołkowa płytka hemaglutynującaFirma Labedit Preparatyinkubacji przeciwciał
adhezyjnychCitotestLub podobny
Antyfluorescencyjny uchwyt do wygaszaniaServicebioG1401Spowolnienie wygaszania fluorescencji
BSA (albumina surowicy bydlęcej)ServicebioGC305010Odczynnik blokujący
Mikroskop konfokalnyOLYMPUSZastosuj 40-krotną soczewkę obiektywową
Zakrzywione nożyczkiJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Narzędzia preparacyjne
Mikroskop preparacyjnyRWD Life science Co., LTD 77001SNarzędzia preparacyjne
KleszczeJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Narzędzia preparacyjne
MetanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.20210624GC≥ 99,5%
Lakier do paznokciSecheViteŚrodek uszczelniający
Igły Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.Przyspiesz utrwalanie
Roztwór paraformaldehyduServicebioG1101Utrwalenie gałki ocznej
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem pH 7,4)ServicebioG0002Przepłukać gałkę oczną 
Przeciwciało pierwszorzędowe: białko wiążące anty-RNA świnki morskiej z wielokrotnym splicing (RBPMS)PhosphoSolutionsNr kat. #1832-RBPMSDo immunofluorescencji. Używany w 1:400
Przeciwciało wtórne: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch706-165-148Do immunofluorescencji. Używany w 1:400
Nożyczki prosteJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Narzędzia preparacyjne
mikroskopowe do

Bibliografia

  1. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  2. Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
  3. Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070(2022).
  4. Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
  5. Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
  6. Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31(2020).
  7. Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  8. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  9. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  10. Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
  11. Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
  12. Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
  13. Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
  14. Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
  15. Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59(2012).
  16. Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260(2022).
  17. Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
  18. Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
  19. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
  20. Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
  21. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
  22. Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fiksacja metanolemizolacja siatk wkiimmunostaining siatk wkiprzechowywanie pr bek tkanekchoroby degeneracyjne siatk wkisiatk wka myszy transgenicznychuszkodzenie nerwu wzrokowegochoroby neurodegeneracyjne

Powiązane artykuły