W tym badaniu szczegółowo opisujemy metody decelularyzacji, charakterystyki fizycznej, obrazowania i implantacji in vivo biomateriałów pochodzenia roślinnego, a także metody sadzenia i różnicowania komórek w rusztowaniach. Opisane metody pozwalają na ocenę biomateriałów pochodzenia roślinnego do zastosowań w inżynierii tkanki kostnej.
Artykuł metodologiczny
Bezkomórkowe rusztowania pochodzące z jabłek do inżynierii tkanki kostnej in vitro i in vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Biomateriały celulozowe pochodzenia roślinnego zostały wykorzystane w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej. Badania in vivo wykazały niezwykłą biokompatybilność rusztowań wykonanych z celulozy pochodzącej ze źródeł naturalnych. Ponadto rusztowania te posiadają cechy strukturalne, które są istotne dla wielu tkanek i sprzyjają inwazji i proliferacji komórek ssaków. Ostatnie badania z wykorzystaniem bezkomórkowej tkanki hypanthium jabłoni wykazały podobieństwo wielkości porów do kości beleczkowej, a także jej zdolność do skutecznego wspierania różnicowania osteogennego. W niniejszym badaniu zbadano ponadto potencjał rusztowań celulozowych pochodzących z jabłek do zastosowań w inżynierii tkanki kostnej (BTE) oraz oceniono ich właściwości mechaniczne in vitro i in vivo. Preosteoblasty MC3T3-E1 wysiewano w rusztowaniach celulozowych pochodzących z jabłek, które następnie oceniono pod kątem ich potencjału osteogennego i właściwości mechanicznych. Zabarwienie fosfatazą alkaliczną i czerwienią alizarynową S potwierdziło różnicowanie osteogenne w rusztowaniach hodowanych w pożywce różnicowej. Badanie histologiczne wykazało rozległą inwazję komórek i mineralizację w poprzek rusztowań. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) ujawniła agregaty mineralne na powierzchni rusztowań, a spektroskopia dyspersji energii (EDS) potwierdziła obecność pierwiastków fosforanowych i wapniowych. Jednak pomimo znacznego wzrostu modułu Younga w następstwie różnicowania komórek, pozostał on niższy niż w przypadku zdrowej tkanki kostnej. Badania in vivo wykazały infiltrację komórek i odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej w obrębie decellularizowane rusztowania pochodzące z jabłek po 8 tygodniach implantacji w kalwarii szczurów. Ponadto siła potrzebna do usunięcia rusztowań z ubytku kostnego była zbliżona do wcześniej zgłaszanego obciążenia złamaniem rodzimej kości kalwarycznej. Ogólnie rzecz biorąc, badanie to potwierdza, że celuloza pochodząca z jabłek jest obiecującym kandydatem do zastosowań zausznych. Jednak odmienność między jego właściwościami mechanicznymi a właściwościami zdrowej tkanki kostnej może ograniczać jego zastosowanie do scenariuszy o niskiej nośności. Dodatkowa reinżynieria konstrukcyjna i optymalizacja mogą być konieczne w celu poprawy właściwości mechanicznych rusztowań celulozowych pochodzących z jabłek do zastosowań nośnych.
Wprowadzenie
Duże ubytki kostne spowodowane urazem lub chorobą często wymagają przeszczepów biomateriału do pełnej regeneracji1. Obecne techniki mające na celu poprawę regeneracji tkanki kostnej regularnie wykorzystują przeszczepy autologiczne, allogeniczne, ksenogeniczne lub syntetyczne2. W przypadku autologicznego przeszczepu kości, uważanego za "złoty standard" w praktyce przeszczepiania w celu naprawy dużych ubytków kostnych, kość jest pobierana od pacjenta. Jednak ta procedura szczepienia ma kilka wad, w tym ograniczenia rozmiaru i kształtu, dostępność tkanek i chorobowość miejsca pobrania3. Co więcej, procedury przeszczepów autologicznych są podatne na infekcje miejsca operowanego, późniejsze złamania, tworzenie się krwiaków w miejscu pobrania lub zrekonstruowanym miejscu oraz ból pooperacyjny4. Inżynieria tkanki kostnej (BTE) stanowi potencjalną alternatywę dla konwencjonalnych metod przeszczepu kości5. Łączy biomateriały strukturalne i komórki w celu budowy nowej funkcjonalnej tkanki kostnej. Projektując biomateriały do aparatów zausznych, kluczowe znaczenie ma połączenie makroporowatej struktury, chemii powierzchni, która sprzyja przyłączaniu się komórek, oraz właściwości mechanicznych, które są bardzo podobne do właściwości natywnej kości 6. Wcześniejsze badania wykazały, że idealna wielkość porów i moduł sprężystości dla biomateriałów stosowanych w zausznych aparatach zausznych wynoszą około 100-200 μm7 i 0,1-20 GPa, odpowiednio, w zależności od miejsca szczepienia8. Poza tym porowatość i wzajemne połączenia porów rusztowań są krytycznymi czynnikami wpływającymi na migrację komórek, dyfuzję składników odżywczych i angiogenezę8.
BTE wykazało obiecujące wyniki z różnymi biomateriałami opracowanymi i ocenionymi jako alternatywne opcje dla przeszczepów kostnych. Niektóre z tych biomateriałów to materiały osteoindukcyjne, materiały hybrydowe i zaawansowane hydrożele8. Materiały osteoindukcyjne stymulują rozwój nowo powstałych struktur kostnych. Materiały hybrydowe składają się z polimerów syntetycznych i/lub naturalnych8. Zaawansowane hydrożele naśladują macierz zewnątrzkomórkową (ECM) i są w stanie dostarczyć niezbędne czynniki bioaktywne w celu promowania integracji tkanki kostnej8. Hydroksyapatyt jest tradycyjnym materiałem i często wybieranym do zausznych aparatów zausznych ze względu na swój skład i biokompatybilność9. Szkło bioaktywne to kolejny rodzaj biomateriału dla BTE, który, jak wykazano, stymuluje określone odpowiedzi komórek w celu aktywacji genów niezbędnych do osteogenezy10,11. Biodegradowalne polimery, w tym poli(kwas glikolowy) i poli(kwas mlekowy), są również szeroko stosowane w aplikacjach zausznych12. Wreszcie, naturalne lub pochodzenia naturalnego polimery, takie jak chitozan, chityna i celuloza bakteryjna, również wykazały zachęcające wyniki dla BTE13. Jednakże, podczas gdy zarówno polimery syntetyczne, jak i naturalne wykazują potencjał w zakresie zausznych aparatów zausznych, opracowanie funkcjonalnego rusztowania o pożądanej makrostrukturze zazwyczaj wymaga obszernych protokołów.
Na odwrót, natywne makroskopowe struktury celulozy można łatwo uzyskać z różnych roślin, a nasza grupa badawcza wcześniej wykazała możliwość zastosowania rusztowań na bazie celulozy pochodzących z roślin do różnych rekonstrukcji tkanek. Rzeczywiście, po prostym zastosowaniu środka powierzchniowo czynnego, wykorzystaliśmy naturalną strukturę materiału roślinnego, podkreślając jego potencjał jako wszechstronnego biomateriału14. Co więcej, te rusztowania na bazie celulozy mogą być używane do hodowli komórkowych ssaków in vitro14, są biokompatybilne i wspierają spontaniczne unaczynienie podskórne14,15,16,17. Zarówno nasza grupa badawcza, jak i inni, wykazali, że te rusztowania można uzyskać z określonych roślin w zależności od zamierzonego zastosowania14,15,16,17,18,19,20. Na przykład struktura naczyniowa obserwowana w łodygach i liściach roślin wykazuje uderzające podobieństwo do struktury znajdującej się w tkankach zwierzęcych19. Dodatkowo, rusztowania celulozowe pochodzące z roślin mogą być łatwo kształtowane i poddawane modyfikacjom biochemicznym powierzchni w celu uzyskania pożądanych właściwości16. W niedawnym badaniu włączyliśmy bufor soli podczas procesu decelularyzacji, co doprowadziło do zwiększonego przyczepiania komórek obserwowanego zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo16. W tym samym badaniu wykazaliśmy możliwość zastosowania rusztowań celulozowych pochodzenia roślinnego w biomateriałach kompozytowych poprzez odlewanie hydrożeli na powierzchnię rusztowań. W ostatnich badaniach wykazano, że funkcjonalizacja rusztowań pochodzenia roślinnego zwiększa ich skuteczność18. Na przykład badanie przeprowadzone przez Fontana i in. (2017) wykazało, że adhezja ludzkich fibroblastów skórnych była wspierana przez pozbawione komórek łodygi pokryte RGD, podczas gdy niepowlekane łodygi nie wykazywały tej samej zdolności18. Co więcej, autorzy wykazali również, że zmodyfikowany symulowany płyn ustrojowy może być wykorzystany do sztucznej mineralizacji pozbawionych komórek łodyg roślin. W nowszych badaniach zbadaliśmy koncepcję mechanowrażliwej osteogenezy w rusztowaniach celulozowych pochodzenia roślinnego i oceniliśmy ich potencjał dla BTE17,20. Ponadto Lee i in. (2019) wykorzystali rusztowania pochodzenia roślinnego do hodowli tkanek przypominających kości w warunkach in vitro21. Dzięki kompleksowej ocenie różnych źródeł roślinnych autorzy zidentyfikowali rusztowania pochodzące z jabłek jako najbardziej optymalne dla hodowli i różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Ponadto autorzy zasugerowali, że strukturalne i mechaniczne właściwości rusztowań pochodzących z jabłek odgrywają kluczową rolę w ich przydatności do zamierzonego celu. Będąc pierwszymi rusztowaniami pochodzenia roślinnego wdrożonymi w zastosowaniach inżynierii tkankowej, rusztowania pochodzące z jabłek wykazały, że mają uderzająco podobną architekturę do ludzkiej kości, zwłaszcza pod względem połączonych ze sobą porów o średnicy od 100 do 200 μm14,21.
W obecnym badaniu dokładniej zbadaliśmy potencjał rusztowań celulozowych pochodzących z jabłek dla BTE i przeprowadziliśmy analizę ich właściwości mechanicznych zarówno in vitro, jak i in vivo. Chociaż przeprowadzono badania nad potencjałem rusztowań pochodzących z jabłek dla BTE17,20,21, ich właściwości mechaniczne nie zostały zbadane. Wyniki wykazały dziką inwazję i różnicowanie osteogenne preosteoblastów MC3T3-E1 wysianych w rusztowaniach, które były hodowane w pożywce różnicującej przez 4 tygodnie. Moduł Younga tych rusztowań wynosił 192,0 ± 16,6 kPa, czyli był znacznie wyższy niż rusztowań ślepych (rusztowań bez komórek nasiennych) (31,6 ± 4,8 kPa) i rusztowań komórkowych hodowanych w podłożu nieróżnicującym (24,1 ± 8,8 kPa). Należy jednak zauważyć, że moduł Younga zdrowej ludzkiej tkanki kostnej zazwyczaj mieści się w zakresie 0,1-2 GPa dla kości beleczkowej i około 15-20 GPa dla kości korowej8. Niemniej jednak, po 8-tygodniowej implantacji w ubytku kalwarii gryzonia, rusztowania wysiewane komórkami wydawały się być dobrze zintegrowane z otaczającą kością, o czym świadczy średnia siła szczytowa 113,6 N ± 18,2 N w testach wypychania, co jest podobne do wcześniej zgłoszonego obciążenia złamaniem natywnej kości nazębnej22. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki uzyskane w tym badaniu są bardzo obiecujące, szczególnie w przypadku zastosowań nienośnych. Jednak rusztowania celulozowe pochodzące z jabłek nie posiadają obecnie niezbędnych właściwości mechanicznych, aby precyzyjnie dopasować się do otaczającej tkanki kostnej w miejscu implantacji. W związku z tym konieczny jest dalszy rozwój, aby uwolnić pełny potencjał tych rusztowań.
Protokół
Protokoły eksperymentalne zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie.
1. Przygotowanie rusztowania
- Użyj krajalnicy do mandoliny, aby pokroić jabłka McIntosh (Canada Fancy) w plastry o grubości 8 mm. Pokrój tkankę hypanthium z plasterków jabłka na kwadraty o wymiarach 5 mm x 5 mm.
- Umieść kwadratowe próbki w 0,1% dodecylosiarczanie sodu (SDS) na 2 dni.
- Próbki pozbawione komórek należy przemyć wodą dejonizowaną i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej (RT) w 100 mM CaCl2 w celu usunięcia pozostałego środka powierzchniowo czynnego.
- Sterylizuj próbki (tj. rusztowania) w 70% etanolu przez 30 minut, umyj je wodą dejonizowaną i umieść na 24-dołkowej płytce hodowlanej przed wysiewem komórek.
2. Hodowla komórkowa i siew rusztowań
- Utrzymuj MC3T3-E1 Subklonuj 4 komórki w naczyniach poddanych hodowli komórkowej o średnicy 10 cm w warunkach hodowli komórkowej (37°C w wilgotnej atmosferze 95% powietrza i 5%CO2).
- Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych wykonaną z minimalnej niezbędnej pożywki Eagle - modyfikacji alfa (α-MEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.
- Odłącz komórki od szalek hodowlanych przez trypsynizację (0,05% trypsyna-EDTA), gdy osiągną 80% zbieżności.
- Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze ok. 200 x g przez 3 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w α-MEM w stężeniu 2,5 x 107 komórek na ml.
- Odpipetować 40 μl porcji zawiesiny komórkowej na powierzchni rusztowań i pozostawić komórki na przyleganie przez 1 godzinę w warunkach hodowli komórkowej. Następnie dodaj 2 ml pożywki hodowlanej do każdej studzienki hodowlanej na płytce hodowlanej.
- Uzupełniaj pożywkę co 2-3 dni przez 14 dni.
- Przygotować pożywkę różnicującą, dodając 50 μg/ml kwasu askorbinowego i 4 mM fosforanu sodu do wcześniej opisanej pożywki do hodowli komórkowej.
- Indukuj różnicowanie komórek MC3T3-E1 poprzez inkubację rusztowań w pożywce różnicowej przez 4 tygodnie. Uzupełniaj podłoże co 3-4 dni. Równolegle inkubować rusztowania w pożywce nieróżnicującej (tj. pożywce bez dodatków wywołujących różnicowanie) przez ten sam czas, z tym samym harmonogramem zmiany pożywki, aby służyć jako kontrola ujemna.
3. Pomiary wielkości porów za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej
- Umyj bezkomórkowe rusztowania pochodzące z jabłek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
- Inkubować rusztowania w 1 ml 10% (v/v) białego barwnika kalkofluorowego przez 25 minut w ciemności w temperaturze suchej temperatury.
- Umyć rusztowania (n = 3) PBS i zobrazować trzy losowo wybrane obszary każdego rusztowania za pomocą szybkiego rezonansowego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM) przy 10-krotnym powiększeniu, przy użyciu kanału DAPI, w następujący sposób:
- Konfiguracja filtra emisji laserowej: 405 nm (laser); 425-475 nm (emisja)
- Dostosuj moc lasera i detektor ręcznie, aby zapewnić optymalną akwizycję obrazu. Uzyskaj stos z 20 obrazami o rozmiarze kroku 5 μm.
- Korzystając z oprogramowania ImageJ, przetwarzaj i analizuj obrazy konfokalne w następujący sposób:
- Użyj funkcji Z-Project to Maximum Intensity (Projekcja z do maksymalnej intensywności), aby utworzyć obraz, a następnie zastosuj funkcję Znajdź krawędzie, aby podświetlić krawędź porów.
- Obrysuj pory ręcznie za pomocą narzędzia Zaznaczanie odręczne.
- Dopasuj każdy por jako elipsę, zmierz długość osi głównej, skompiluj wszystkie pomiary (w sumie 54 w niniejszym badaniu - 6 na 3 losowo wybrane obszary dla każdego rusztowania) i oblicz średnią długość.
4. Analiza rozmieszczenia komórek za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej
- Rusztowania wysiewane komórkami hodowane w pożywce nieróżnicującej lub różnicującej należy trzykrotnie przemyć PBS. Przymocuj rusztowania 4% paraformaldehydem przez 10 minut.
- Dokładnie umyj każde rusztowanie wodą dejonizowaną, przepuszczaj komórki roztworem Triton-X 100 przez 5 minut i ponownie przemyj PBS.
- Inkubuj rusztowania w 1 ml 1% kwasu okresowego przez 40 minut i spłucz wodą dejonizowaną14,16.
- Inkubować rusztowania w 1 ml roztworu zawierającego 100 mM pirosiarczynu sodu i 0,15 M kwasu solnego, uzupełnionego 100 μg/ml jodku propidyny. Całkowicie zanurz rusztowania w roztworze.
- Umyć rusztowania PBS i wybarwić jądra komórkowe, inkubując rusztowania w roztworze DAPI o stężeniu 5 mg/ml przez 10 minut w ciemności. Dokładnie umyj ponownie i przechowuj rusztowania w PBS przed obrazowaniem.
- Zobrazuj trzy losowo wybrane powierzchnie trzech różnych rusztowań komórkowych za pomocą rezonansowego CLSM o dużej prędkości przy 10-krotnym powiększeniu, przy użyciu kanałów DAPI i TRITC, w następujący sposób:
- Konfiguracja filtra emisji laserowej:
DAPI: Laser: 405 nm; Emisja: 425-475 nm
TRITC: Laser: 561 nm; Emisja: 570-620 nm - Dostosuj moc lasera i detektor ręcznie, aby zapewnić optymalną akwizycję obrazu. Uzyskaj stos z 20 obrazami o rozmiarze kroku 5 μm.
- Konfiguracja filtra emisji laserowej:
- Użyj oprogramowania ImageJ, aby przetworzyć obrazy konfokalne i utworzyć maksymalną projekcję w osi Z do analizy obrazu za pomocą funkcji Z-Project to Maximum Intensity (Projekcja Z do maksymalnej intensywności).
5. Analiza fosfatazy alkalicznej
- Rusztowania wysiewane komórkami hodowane w pożywce nieróżnicującej lub różnicującej należy trzykrotnie przemyć PBS. Przymocuj rusztowania 10% neutralną buforowaną formaliną przez 30 minut. Zamocuj puste rusztowania (rusztowania bez komórek zasianych), aby służyły jako kontrola negatywna.
- Przygotować roztwór barwiący 5-bromo-4-chloro-3'-indolifosforan i nitro-niebieski tetrazolowy (BCIP/NBT), rozpuszczając jedną tabletkę BCIP/NBT w 10 ml wody dejonizowanej.
- Umyj rusztowania stałe 0,05% roztworem Tween i zabarwij roztworem BCIP/NBT przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj poplamione rusztowania 0,05% roztworem Tween i przechowuj je w PBS przed obrazowaniem.
- Sfotografuj poplamione rusztowania za pomocą 12-megapikselowego aparatu cyfrowego.
6. Analiza osadzania się wapnia
- Rusztowania wysiewane komórkami hodowane w pożywce nieróżnicującej lub różnicującej należy trzykrotnie przemyć PBS. Przymocuj rusztowania 10% neutralną buforowaną formaliną przez 30 minut. Zamocuj puste rusztowania (rusztowania bez komórek zasianych), aby służyły jako kontrola negatywna.
- Przygotować 2% (w/v) roztwór barwiący czerwienią alizarynową S (ARS).
- Umyć rusztowania stałe wodą dejonizowaną i zabarwić je roztworem ARS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyć poplamione rusztowania wodą dejonizowaną i przechowywać je w PBS przed obrazowaniem.
- Sfotografuj poplamione rusztowania za pomocą 12-megapikselowego aparatu cyfrowego.
7. Analiza mineralizacji
- Rusztowania wysiewane komórkami hodowane w pożywce nieróżnicującej lub różnicującej należy trzykrotnie przemyć PBS. Przymocuj rusztowania 4% paraformaldehydem przez 48 godzin. Zamocuj puste rusztowania (rusztowania bez komórek zasianych), aby służyły jako kontrola negatywna.
- Odwodnić próbki w roztworach zawierających stężenie etanolu wzrastające od 50% do 100%, zgodnie z wcześniejszym opisem23.
- Wykonaj skaningową mikroskopię elektronową (SEM) i spektroskopię dyspersyjną energii (EDS) w celu analizy agregatów mineralnych w następujący sposób:
- Wysuszyć próbki za pomocą osuszacza do punktów krytycznych, postępując zgodnie z protokołem producenta24.
- Nałożyć złotą powłokę 5 nm na rusztowania za pomocą napylarki do złota, postępując zgodnie z protokołem producenta25.
- Zobrazuj powierzchnię rusztowań za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego ustawionego na 3 kV, przy 85-krotnym powiększeniu.
- Wykonać EDS, ustawiając skaningowy mikroskop elektronowy na 15 kV. Na trzech losowo wybranych obszarach na rusztowanie należy pobrać widma EDS do analizy składu kruszyw mineralnych.
8. Pomiary modułu Younga
- Usunąć rusztowania nasienne komórkami z odpowiedniego podłoża inkubacyjnego i natychmiast przebadać próbki.
- Korzystając ze specjalnie skonstruowanego jednoosiowego aparatu do ściskania, wyposażonego w ogniwo obciążnikowe 1,5 N, należy ściskać rusztowania (n = 3 na warunek) ze stałą szybkością 3 mm·min-1 do maksymalnego odkształcenia ściskającego wynoszącego 10% wysokości rusztowania.
- Określ moduł Younga na podstawie nachylenia części liniowej krzywych naprężenie-odkształcenie. W niniejszym badaniu moduł określono między 9% a 10% odkształcenia.
9. Analiza infiltracji i mineralizacji komórek za pomocą histologii: Rusztowania in vitro
- Rusztowania wysiewane komórkami hodowane w pożywce nieróżnicującej lub różnicującej należy trzykrotnie przemyć PBS.
- Przymocuj rusztowania wysiane komórkami za pomocą 4% paraformaldehydu przez 48 godzin przed ponownym zawieszeniem w 70% etanolu do przechowywania.
- Histologia:
UWAGA: W niniejszym badaniu całe przygotowanie histologiczne (osadzanie, cięcie i barwienie) opisane w kolejnych krokach zostało przeprowadzone przez Louise Pelletier Histology Core Facility (University of Ottawa).- Po odwodnieniu i zatopieniu w parafinie należy pociąć próbki na odcinki seryjne o grubości 5 μm, zaczynając od 1 mm wewnątrz rusztowań, a następnie zamontować skrawki na szkiełkach mikroskopowych.
- Wybarwić skrawki barwnikami hematoksyliną i eozyną (H&E) lub von Kossa (VK).
- Zobrazuj skrawki za pomocą mikroskopu ze skanerem slajdów przy 40-krotnym powiększeniu (n = 1 rusztowanie w ośrodku nieróżnicującym i n = 2 rusztowania w ośrodku różnicującym w niniejszym badaniu).
- Korzystając z oprogramowania ImageJ, można wizualnie ocenić infiltrację komórek (barwienie H&E) i mineralizację (barwienie VK).
10. Model wady kalwarii u szczura
- Uzyskaj przegląd i zatwierdzenie protokołów eksperymentalnych przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami.
- Przygotować okrągłe (o średnicy 5 mm i grubości 1 mm) rusztowania bezkomórkowe zgodnie z sekcją 1 opisaną powyżej i za pomocą stempla do biopsji o średnicy 5 mm.
- Wykonaj obustronną kraniotomię zgodnie z ustalonym protokołem26, w następujący sposób:
- Samce szczurów Sprague-Dawley należy znieczulić izofluranem, najpierw w dawce 3% do utraty przytomności, a następnie w dawce 2-3% przez cały czas trwania zabiegu.
- Odsłoń okostną i czaszkę, przecinając leżącą nad nią skórę za pomocą ostrza skalpela. Usuń okostną.
- Twórz obustronne ubytki w obu kościach ciemieniowych po każdej stronie szwu strzałkowego za pomocą wiertła dentystycznego wyposażonego w trepanację o średnicy 5 mm pod stałym nawadnianiem 0,9% NaCl.
- Oczyść otaczającą kość za pomocą 0,9% NaCl, aby usunąć wszelkie fragmenty kości.
- Umieść okrągłe, pozbawione komórek rusztowania w ubytkach.
- Zamknij leżącą nad nią skórę za pomocą szwów 4-0.
- Daj szczurom nieograniczony dostęp do pożywienia i wody oraz monitoruj je codziennie.
- Po 8 tygodniach od implantacji należy poddać szczury eutanazji przez wdychanie CO2 i perforację klatki piersiowej jako wtórny środek eutanazji.
- Aby odsłonić czaszkę i odzyskać implanty, usuń skórę pokrywającą czaszkę za pomocą ostrza skalpela.
- Przeciąć czaszkę na kościach czołowych i potylicznych oraz z boku obu kości ciemieniowych za pomocą wiertła dentystycznego, aby całkowicie usunąć górną część czaszki.
11. Test wypychania
- Podłącz jednoosiowe urządzenie kompresyjne (z ogniwem obciążnikowym 445 N) do modułu akwizycji danych USB.
- Podłącz moduł akwizycji danych do komputera wyposażonego w aplikację do akwizycji danych.
- Natychmiast po ekstrakcji czaszki umieścić każdą próbkę (n = 7 implantów od 4 zwierząt w niniejszym badaniu) na uchwycie próbki jednoosiowego urządzenia uciskowego, tak aby grzbietowa strona kości była skierowana do góry.
- Opuścić tłok z prędkością 0,5 mm/min, aż lekko dotknie pobranego implantu.
- Rozpocznij badanie, opuszczając tłok przez implant aż do całkowitego wypchnięcia, jednocześnie stosując ucisk ze stałą prędkością 0,5 mm/min za pomocą oprogramowania do gromadzenia danych.
- Zapisz siłę szczytową na krzywej siły w funkcji przemieszczenia za pomocą oprogramowania do akwizycji danych.
12. Analiza infiltracji i mineralizacji komórek za pomocą histologii: Rusztowania in vivo
- Utrwalić wyekstrahowaną kalwarię i implanty w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 72 godziny przed ponownym zawieszeniem w 70% etanolu w celu przechowywania.
- Histologia:
UWAGA: W niniejszym badaniu wszystkie przygotowania histologiczne (osadzanie, cięcie i barwienie) opisane w kolejnych krokach zostały wykonane przez Accel Labs (Montreal, QC, Kanada).- Pociąć próbki (zatopione w metakrylanie metylu) na sekcje o grubości 6 μm na trzech różnych poziomach (góra, dół i w kierunku środka) i zamontować je na szkiełkach mikroskopowych.
- Zabarwić sekcje za pomocą H&E lub trichromu Massona-Goldnera (MGT).
- Zobrazuj skrawki za pomocą mikroskopu ze skanerem slajdów przy 40-krotnym powiększeniu (4 eksplantaty od 2 zwierząt w niniejszym badaniu).
- Korzystając z oprogramowania ImageJ, można wizualnie ocenić infiltrację komórek (barwienie H&E) i osadzanie kolagenu (barwienie MGT).
Wyniki
Pomiar wielkości porów, rozkład komórek i mineralizacja in vitro (Rycina 1 i Rycina 2)
Całkowite usunięcie natywnych komponentów komórkowych z rusztowań z tkanki jabłka osiągnięto po potraktowaniu rusztowań SDS i CaCl2 (Rycina 1A). Rusztowania wykazały wysoką porowatość struktury, co potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ilościowa analiza obrazów wykazała średnią wielkość porów wynoszącą 154 µm ± 40 µm. Rozkład wielkości porów mieścił się w przedziale od 73 µm do 288 µm. Większość porów miała jednak wielkość od 100 µm do 200 µm (Rycina 1C).
Po 4-tygodniowym okresie hodowli w medium różnicującym, rusztowania zasiane komórkami wykazały rozległe białe osady mineralne (Rycina 1A). Rusztowania zawierające komórki wykazywały nieprzezroczyste białe zabarwienie, co sugerowało mineralizację, której nie zaobserwowano w rusztowaniach pustych (rusztowaniach bez zasianych komórek). Co więcej, analiza z wykorzystaniem konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej ujawniła jednorodny rozkład komórek w obrębie rusztowań (Rycina 1B).
Rusztowania, z zasianymi lub bez zasianych komórek, barwiono BCIP/NBT oraz ARS w celu analizy odpowiednio aktywności ALP oraz mineralizacji (Rycina 1D). Barwienie BCIP/NBT wykazało znaczny wzrost aktywności ALP (widoczny jako intensywny fioletowy kolor) w rusztowaniach z zasianymi komórkami hodowanymi w pośrodku różnicującym, w przeciwieństwie do pustych rusztowań lub rusztowań z zasianymi komórkami hodowanymi w pośrodku nieróżnicującym. Podobnie, rusztowania z zasianymi komórkami hodowane w pośrodku różnicującym wykazywały bardziej intensywny czerwony kolor po barwieniu ARS, co wskazuje na większą mineralizację w porównaniu do pustych rusztowań lub rusztowań z zasianymi komórkami hodowanymi w pośrodku nieróżnicującym. W pustych rusztowaniach zaobserwowano barwienie tła, co potencjalnie wynika z obecności CaCl2 w protokole decelularyzacji.
W celu analizy infiltracji komórek i mineralizacji wykonano barwienie rusztowań (H&E oraz VK), natomiast do dalszej oceny mineralizacji wykorzystano SEM i EDS (Rysunek 2). Barwienie H&E (Rysunek 2A) wykazało dobrą infiltrację komórek w rusztowaniach zasianych komórkami i hodowanych w pożywce niediferencjującej lub różnicującej. Liczne jądra komórkowe były widoczne na obwodzie oraz w całej objętości rusztowań. W rusztowaniach zaobserwowano również obecność kolagenu w kolorze bladoróżowym. Dodatkowo barwienie VK wykonane na rusztowaniach po 4 tygodniach hodowli w pożywce różnicującej wykazało zabarwienie ścian porów, podczas gdy w rusztowaniach hodowanych w pożywce niediferencjującej osady wapnia wykryto wyłącznie wzdłuż zewnętrznych krawędzi ścian porów, co mogło być wynikiem absorpcji wapnia podczas procesu decelularyzacji. Analiza SEM wykazała lokalną mineralizację na powierzchni rusztowań zasianych komórkami i hodowanych w pożywce różnicującej przez 4 tygodnie (Rysunek 2B). W szczególności na obwodzie porów zaobserwowano osady mineralne przypominające agregaty sferoidalne. W przeciwieństwie do tego, nie stwierdzono obecności agregatów mineralnych w pustych rusztowaniach ani w rusztowaniach zasianych komórkami i hodowanych przez 4 tygodnie w pożywce niediferencjującej. W widmach EDS wybranych obszarów zainteresowania, a konkretnie w obrębie osadów mineralnych zaobserwowanych w rusztowaniach zasianych komórkami i hodowanych przez 4 tygodnie w pożywce różnicującej, stwierdzono wyraźne charakterystyczne piki odpowiadające fosforowi (P) i wapniowi (Ca) (Rysunek 2B).
In vitro analiza biomechaniczna (Rycina 3)
Moduł Younga rusztowań zasiedlonych komórkami mierzono po 4 tygodniach hodowli w medium niediferencjującym lub różnicującym (n = 3 dla każdego warunku eksperymentalnego). Wyniki porównano z modułem Younga rusztowań pustych (rusztowania bez zasiedlonych komórek) (Rycina 3). Nie zaobserwowano istotnej różnicy w module między rusztowaniami pustymi (31,6 kPa ± 4,8 kPa) a rusztowaniami zasiedlonymi komórkami i hodowanymi w medium niediferencjującym (24,1 kPa ± 8,8 kPa; p = 0,88). W przeciwieństwieństwie do powyższego, odnotowano istotną różnicę między modułem rusztowań pustych (31,6 kPa ± 4,8 kPa) a modułem rusztowań zasiedlonych komórkami i hodowanych w medium różnicującym (192,0 kPa ± 16,6 kPa; p < 0,001). Ponadto zaobserwowano istotną różnicę (p < 0,001) pomiędzy modułami Younga rusztowań zasiedlonych komórkami hodowanych w mediach niediferencjujących i różnicujących. Rycina uzupełniająca 1 przedstawia typową krzywą naprężenie-odkształcenie służącą do obliczenia modułu Younga.
In vivo charakterystyka biomechaniczna i regeneracja kości (Rysunek 4 i Rysunek 5)
Przeprowadzono kraniotomie chirurgiczne u łącznie 6 szczurów rasy Sprague-Dawley. W obu kościach ciemieniowych czaszki, przy użyciu trepanatora, wykonano obustronne defekty o średnicy 5 mm, a następnie w ubytkach kalwarianych zaimplantowano rusztowania celulozowe pochodzenia jabłkowego bez zasiewu komórek (Rysunek 4A). Po 8 tygodniach od implantacji zwierzęta zostały uśpione, a górna część ich czaszek została pobrana i przygotowana do testów mechanicznych lub analizy histologicznej.
Na podstawie oceny wizualnej rusztowania wydawały się dobrze zintegrowane z otaczającymi tkankami czaszki. Przeprowadzono mechaniczne testy wypychania (push-out), aby ilościowo ocenić integrację rusztowań (n = 7) w kalwarii gospodarza. Pomiary wykonano przy użyciu urządzenia do ściskania jednowymiarowego (Rysunek 4B) bezpośrednio po eutanazji zwierząt. Wyniki wykazały, że siła szczytowa wyniosła 113.6 N ± 18.2 N (Tabela 1).
Przeprowadzono analizę histologiczną w celu oceny infiltracji komórkowej oraz odkładania macierzy pozakomórkowej wewnątrz implantowanych rusztowań (Rysunek 5). Barwienie H&E ujawniło infiltrację komórkową w porach rusztowania oraz dowody unaczynienia, o czym świadczyła obecność naczyń krwionośnych wewnątrz rusztowań. Dodatkowo barwienie MGT wykazało obecność kolagenu w rusztowaniach.
Rysunek 1: Obrazy rusztowania, rozkład wielkości porów i mineralizacja in vitro. (A) Reprezentatywne fotografie rusztowania z celulozy pochodzenia jabłoniowego po usunięciu natywnych komórek i surfaktanta (lewo) oraz rusztowania zasianego komórkami MC3T3-E1 po 4 tygodniach hodowli w medium różnicowania osteogennego (prawo). Pasek skali reprezentuje 2 mm. (B) Reprezentatywne obrazy z konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego przedstawiające zasiane komórki w rusztowaniach z celulozy pochodzenia jabłoniowego po 4 tygodniach hodowli w medium nieróżnicującym („ND”) lub medium różnicowania osteogennego („D”). Pasek skali reprezentuje 50 µm. Barwienie rusztowań wykonano na celulozę (czerwony) przy użyciu jodku propidyny oraz na jądra komórkowe (niebieski) przy użyciu DAPI. (C) Rozkład wielkości porów w decelularyzowanych rusztowaniach z celulozy pochodzenia jabłoniowego, przed zasiaeniem komórek MC3T3-E1, na podstawie maksymalnych projekcji w osi z obrazów konfokalnych. Analizę przeprowadzono na łącznej liczbie 54 porów w 3 różnych rusztowaniach (6 porów w 3 losowo wybranych obszarach zainteresowania na każde rusztowanie). (D) Reprezentatywne obrazy rusztowań barwionych 5-bromo-4-chloro-3'-indolofosforanem i nitro-błękitem tetrazoliowym (BCIP/NBT) w celu oceny aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP) oraz alizaryną czerwoną S (ARS) w celu wizualizacji depozycji wapnia, wskazującej na mineralizację (pasek skali = 2 mm – dotyczy wszystkich obrazów). Rusztowania oznaczone jako „blank” (rusztowania bez zasianych komórek) nie wykazały barwienia BCIP/NBT, co wskazuje na brak aktywności ALP. Z kolei rusztowania zasiane komórkami i hodowane w medium różnicującym („D”) wykazały wyższą aktywność ALP, wskazaną przez intensywniejszy kolor niebieski, w porównaniu do rusztowań zasianych komórkami i hodowanych w medium nieróżnicującym („ND”). W przypadku barwienia ARS zarówno rusztowania kontrolne (blank), jak i rusztowania hodowane w medium nieróżnicującym („ND”) wykazały jaśniejszy odcień czerwieni w porównaniu do rusztowań hodowanych w medium różnicującym („D”). Obecność depozycji wapnia w rusztowaniach hodowanych w medium różnicującym („D”) została zilustrowana intensywnym, głębokim kolorem czerwonym. Każda analiza została przeprowadzona na trzech różnych rusztowaniach (n = 3). Rysunek zaadaptowano za zgodą Leblanc Latour (2023)27. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Analiza histologiczna, skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) oraz spektroskopia dyspersyjna z energią (EDS) rusztowań in vitro. (A) Reprezentatywne obrazy górnych przekrojów histologicznych rusztowań. Zatopione w parafinie rusztowania pocięto na sekcje o grubości 5 µm, które zabarwiono hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu wizualizacji infiltracji komórek lub metodą von Kossa (VK) w celu wizualizacji mineralizacji w obrębie rusztowań. Rusztowania zostały zinfiltrowane przez komórki MC3T3-E1, co potwierdza niebieskie (jądra) i różowe (cytoplazma) barwienie widoczne na obwodzie i w całej strukturze rusztowań. Widoczny był również kolagen (bladoróżowy) (powiększony wstawka w „H&E - D”). Mineralizację zaobserwowano jedynie na obwodzie ścian porów w rusztowaniach hodowanych w medium niedróżnicującym („ND”). Ściany porów w rusztowaniach hodowanych w medium różnicującym („D”) były w całości zabarwione na czarno. Analizę przeprowadzono na jednym rusztowaniu hodowanym w medium niedróżnicującym („ND”) oraz na dwóch rusztowaniach hodowanych w medium różnicującym („D”) (Pasek skali dla zdjęć o mniejszym powiększeniu = 1 mm, pasek skali dla zdjęć o większym powiększeniu = 50 µm). (B) Reprezentatywne mikrografie uzyskane za pomocą SEM oraz spektra EDS. Rusztowania poddano napylaniu złotem i obrazowano przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego z emisją polową przy napięciu 3,0 kV (pasek skali = 100 μm – dotyczy wszystkich). Spektra EDS pozyskano z każdego rusztowania. Pik fosforu (2,013 keV) i wapnia (3,69 keV) są oznaczone na każdym widmie EDS. Zarówno SEM, jak i EDS wykonano na trzech różnych rusztowaniach. Blank: rusztowania bez zasianych komórek. Rycina ta została opracowana za zgodą Leblanc Latour (2023)27. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Moduły Younga rusztowań in vitro po 4 tygodniach hodowli w pożywce niedróżnicującej („ND”) lub pożywce różnicującej („D”). Dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM) dla trzech próbek powtórzonych dla każdego warunku. Istotność statystyczną (* oznacza p<0,05) określono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) i testu post-hoc Tukeya. Blank: rusztowania bez zasianych komórek. Rycina została opracowana za zgodą Leblanc Latour (2023)27. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Fotografia rusztowania przed implantacją oraz test wypychania po 8 tygodniach implantacji: (A) Reprezentatywna fotografia rusztowania przed implantacją; (B) Urządzenie do jednowymiarowego ściskania wykorzystane w testach wypychania, gdzie ogniwo pomiarowe zaznaczono gwiazdką (*), a próbkę strzałką. Rysunek opracowano za zgodą Leblanc Latour (2023)27. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Analiza histologiczna rusztowań in vitro. Reprezentatywne obrazy przekrojów histologicznych z niezasiedlonych rusztowań po 8 tygodniach implantacji. Przekroje barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu wizualizacji komórek lub trójbarwną metodą Massona-Goldnera (MGT) w celu wizualizacji kolagenu. Strzałka wskazuje erytrocyty. Widoczna jest obecność kolagenu (pasek skali = 1 mm i 200 μm odpowiednio dla lewego i prawego powiększenia). Rycina została zaadaptowana za zgodą Leblanc Latour (2023)27. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
| Numer próbki | Siła szczytowa (N) |
| 1 | 92.8 |
| 2 | 162.7 |
| 3 | 140.3 |
| 4 | 135.7 |
| 5 | 37.7 |
| 6 | 157.8 |
| 7 | 67.9 |
| Średnia | 113.6 |
| SEM (Skaningowa mikroskopia elektronowa) | 18.2 |
Tabela 1: Zmierzona siła szczytowa w testach wypychania (push-out).
Rycina uzupełniająca 1: Typowa krzywa naprężenie-odkształcenie do obliczenia modułu Younga. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Kilka badań in vitro i in vivo wykazało biokompatybilność celulozy pochodzenia roślinnego i jej potencjalne zastosowanie w inżynierii tkankowej 14,15,16,18,19,20, a dokładniej do organizowania różnicowania osteogennego 20,21. Celem niniejszego badania było dalsze zbadanie potencjału rusztowań celulozowych pochodzących z jabłek dla zausznych aparatów zausznych oraz ocena właściwości mechanicznych tych rusztowań zarówno in vitro, jak i in vivo.
W badaniach in vitro komórki preosteoblasty (MC3T3-E1) wysiewano w rusztowaniach po wyeliminowaniu komórek natywnych z tkanki jabłka. Komórki MC3T3-E1 są powszechnie stosowane do badania biomineralizacji macierzy zewnątrzkomórkowej 28,29,30. Rusztowania były następnie hodowane przez 4 tygodnie w pożywce różnicującej kościopochodnej lub nieróżnicującej. Wyniki wykazały, że komórki namnażają się i różnicują w obrębie rusztowań, zwłaszcza gdy są hodowane w pożywce różnicowej, podkreślając w ten sposób potencjał rusztowań celulozowych pochodzących z jabłek do wspierania rozwoju tkanki kostnej. Jądra komórkowe zaobserwowano w dużych ilościach w porach rusztowania, potwierdzając obserwacje zgłoszone we wcześniejszych badaniach 14,15,16,17,20,21. Ponadto, podobnie jak w przypadku naszych poprzednich ustaleń14 i innych grup21, średnia średnica porów rusztowania wynosiła ~154 μm, przy czym większość porów miała średnicę od 100 μm do 200 μm (ryc. 1C). Wymiary te są zgodne z idealnym zakresem wielkości porów (100–200 μm), o którym wiadomo, że ułatwia wzrost kości7.
Analiza barwienia wykazała wyższą aktywność ALP po 4-tygodniowym okresie hodowli w pożywce różnicowej. Zaobserwowano więcej złogów wapnia na powierzchni rusztowań wysiewanych komórkowo hodowanych w pożywce różnicującej w porównaniu zarówno z rusztowaniami ślepymi, jak i rusztowaniami wysiewanymi komórkowo hodowanymi w pożywce nieróżnicowej. Podobne wyniki zaobserwowano w przypadku zróżnicowanych hiPSC w rusztowaniach pochodzących z jabłek21. Podczas gdy obecność ALP została oceniona jakościowo w niniejszym badaniu, można było przeprowadzić dodatkowe testy do analizy ilościowej. Ocena histologiczna rusztowań potwierdziła ponadto, że naciekane osteoblasty mineralizowały rusztowania po różnicowaniu. Warto zauważyć, że peryferie konstruktów hodowanych w pożywce nieróżnicującej były również zabarwione VK. Szczątkowy CaCl2 w rusztowaniach mógł spowodować to niespecyficzne zabarwienie obserwowane na obrzeżach po decelularyzacji. Przeprowadzono analizę jakościową obrazów SEM w celu dalszej oceny mineralizacji. Po hodowli w pożywce różnicującej, rusztowania wysiewane komórkami wykazywały oznaki mineralizacji ECM. Kruszywa mineralne były widoczne na powierzchni rusztowania, szczególnie na krawędziach porów. Obserwacje te są zgodne z wcześniejszymi badaniami z użyciem ECM30 i rusztowań pochodzenia roślinnego21. Agregaty te były nieobecne na powierzchni rusztowań bez komórek zasianych. Analiza EDS agregatów wykazała obecność wysokich poziomów P i Ca, co sugeruje obecność apatytu. Warto zauważyć, że chociaż protokół opisany w niniejszym badaniu pozwala na wizualizację infiltracji komórkowej i obecności mineralizacji, nie pozwala na ocenę ich progresji w czasie. Analiza histologiczna w wielu punktach czasowych byłaby konieczna, aby w pełni ocenić tę progresję. Ponadto konieczna byłaby dalsza analiza w celu ilościowego określenia infiltracji i mineralizacji komórkowej na powierzchni, a także na całym rusztowaniu. Wreszcie, podczas gdy skład pierwiastkowy złóż mineralnych został określony przez EDS, inne techniki charakteryzacji, takie jak dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego (XRD), mogą być wymagane w celu dostarczenia informacji na temat struktury krystalicznej obserwowanych osadów.
Moduł Younga w rusztowaniach był istotnie wyższy po posiewie w pożywce różnicującej (około 8-krotnie). W przeciwieństwie do tego, moduł rusztowań hodowanych w pożywce nieróżnicującej przypominał moduł rusztowań ślepych (rusztowań bez komórek nasiennych), podobnie jak wyniki zgłoszone w poprzednim badaniu z rusztowaniami pochodzącymi z jabłek20. Pomimo wyższego modułu Younga rusztowań hodowanych w pożywce różnicowej, pozostał on znacznie niższy niż w przypadku kości naturalnej (0,1 do 2 GPa dla kości beleczkowej i 15 do 20 GPa dla kości korowej)8, alloprzeszczepu gąbczastego (3,78 GPa)31, przeszczepów alloplastycznych wykonanych z polieteroeteroketonu (3,84 GPa)31, tytanu (50,20 GPa)31, oraz implanty ze stopu kobaltu i chromu (53,15 GPa)31 . W związku z tym rusztowania w obecnym składzie mogą nie nadawać się do zastosowań nośnych. Warto zauważyć, że moduł Younga dostarcza informacji o sztywności materiału. Jednak granica plastyczności może być również brana pod uwagę, aby zapewnić szersze zrozumienie właściwości mechanicznych rusztowania.
Bezkomórkowe rusztowania jabłkowe wszczepiono następnie w 5-milimetrowe obustronne krytycznej wielkości ubytki kalwaryczne u szczurów (n = 6 zwierząt). Testy wypychania (na 7 eksplantatach), przeprowadzone w celu oceny integracji rusztowań w kalwarii gospodarza, wykazały, że średnia siła szczytowa wynosiła 113,6 N ± 18,2 N, co jest podobne do obciążenia złamania wcześniej zgłoszonego dla kości nazębnej (127,1 ± 9,6 N)22, co sugeruje, że rusztowania dobrze integrują się z otaczającą tkanką kostną. Należy jednak zauważyć, że test wypychania dostarcza jedynie informacji na temat granicy faz między rusztowaniem a otaczającą tkanką. W poprzednich badaniach połączono testy wypychania z testami wgnieceń, aby zapewnić szersze zrozumienie właściwości mechanicznych interfejsu kość-implant i samego rusztowania22. Dodatkowo, wady obustronne są bardziej podatne na niewspółosiowość z tłokiem32. Właściwe umieszczenie eksplantatu czaszkowego, modelu z pojedynczą wadą lub dodatkowego systemu mocowania na uniwersalnym urządzeniu testującym może potencjalnie uniknąć niewspółosiowości32.
Podsumowując, badanie to potwierdziło, że rusztowania celulozowe pochodzące z jabłek mogą sprzyjać adhezji i proliferacji preosteoblastów. Ponadto mineralizacja zaszła w rusztowaniach komórkowych hodowanych w pożywce różnicowej, co prowadziło do wzrostu modułu Younga rusztowania. Jednak moduł pozostał znacznie niższy niż w przypadku naturalnej kości. Co ciekawe, siła potrzebna do przemieszczenia wszczepionych rusztowań celulozowych pochodzących z jabłek była porównywalna z obciążeniem złamaniowym kości nazębnej i innych typów rusztowań stosowanych wcześniej w BTE22. W końcu, podobnie jak w poprzednich raportach, komórki infiltrowały wszczepione rusztowania i deponowały kolagen. Ogólnie rzecz biorąc, badanie to pokazuje potencjał rusztowań celulozowych pochodzących z roślin do zastosowań w aparatach zausznych. Wyniki te są zgodne z wcześniejszym badaniem przeprowadzonym przez inną grupę badawczą, co dodatkowo potwierdza przydatność rusztowań celulozowych pochodzenia roślinnego do celów zausznych21. Niemniej jednak rozbieżność w sztywności rusztowań w porównaniu z kością beleczkową lub korową podkreśla znaczenie opracowania biomateriałów kompozytowych, które mogą bardziej odpowiadać właściwościom mechanicznym naturalnej kości. W związku z tym, pomimo rosnącego zainteresowania wykorzystaniem rusztowań pochodzenia roślinnego do celów zausznych, ich zastosowanie może pozostać ograniczone do zastosowań nienośnych. Jak wykazaliśmy wcześniej16, przeprojektowanie rusztowań celulozowych pochodzenia roślinnego poprzez modyfikację chemiczną lub opracowanie kompozytów z innymi polimerami biologicznymi/syntetycznymi może być niezbędne w zastosowaniach nośnych.
Oświadczenia
Oświadczenie o konflikcie interesów: M.L.L., M.T. R.J.H., C.M.C., I.C. i A.P. są wynalazcami we wnioskach patentowych złożonych przez Uniwersytet w Ottawie i Spiderwort Inc. dotyczących wykorzystania celulozy pochodzenia roślinnego do zastosowań zausznych. M.L.L., R.J.H., C.M.C. i A.P. mają udziały finansowe w Spiderwort Inc.
Podziękowania
Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (Discovery Grant) oraz przez Li Ka Shing Foundation. M.L.L. otrzymał wsparcie od Ontario Centers of Excellence TalentEdge, a R.J.H. otrzymał stypendium podyplomowe NSERC i Ontario Graduate Scholarship (OGS).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4&,6-diamidino-2-fenyloindol | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
| Alizaryn czerwony S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
| Kwas askorbinowy | Sigma-Aldrich | A4403 | Hodowla komórkowa |
| Chlorek wapnia | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| Wiertło | Narzędzie chirurgiczne | ||
| Etanol | ThermoFisher | 615095000 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Laboratoria Hyclone SH30396 | FBS | |
| Formalina | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% Formalina |
| Trójchromowa plama Goldnera | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
| Hematoksylina i barwnik eozynowy | Fisher Scientific | NC1470670 | H& E |
| Szybki rezonansowy konfokalny laserowy mikroskop skaningowy | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
| Kwas solny | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| oprogramowanie ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Sól fizjologiczna do nawadniania | Baxter | JF7123 | 0,9% NaCl |
| MC3T3-E1 Subklon 4 komórki | ATCC CRL-2593 | Komórki pre-osteoblastów | |
| Jabłka | Kanada Fantazyjny | ||
| metakrylan metylu | Sigma-Aldrich | M55909 | Osadzanie histologiczne |
| Minimum Niezbędne podłoże | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
| Paraformaldehyd | Fisher Scientific | O4042 | 4%; PFA |
| Penicylina/Streptomycyna | Hyclone Laboratories | SV30010 | Hodowla komórkowa |
| Kwas okresowy | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Laboratoria Hyclone | 2810305 | PBS; bez Ca2+ i Mg2+ |
| Propidium jodek | Invitrogen | p3566 | |
| Skanowanie mikroskop elektronowy | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM i EDS |
| Mikroskop ze skanerem slajdów | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| Dodecylosiarczan sodu | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
| Pirosiarczyn sodu | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Fosforan sodu | ThermoFisher | BP329 | |
| Szczury Sprague-Dawley | Charles-River Laboratories | 400 | Męskie |
| szwy | Ethicon | J494G | 4-0 |
| Trephine | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | Średnica 5 mm |
| Triton-X 100 | ThermoFisher | 807423 | |
| Trypsin | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | Hodowla komórkowa |
| Tween | Fisher Scientific | BP337 | |
| Uniwersalne urządzenie uciskowe | CellScale | UniVert | |
| Von Kossa barwnik | Sigma-Aldrich | 1.00362 | Histologia |
Bibliografia
- Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
- Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
- Parikh, S. N. Bone graft substitutes: Past, present, future. Journal of Postgraduate Medicine. 48 (2), 142-148 (2002).
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (6), 570-575 (2000).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
- Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30 (10), 546-554 (2012).
- Yoshikawa, H., Myoui, A. Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics. Journal of Artificial Organs. 8 (3), 131-136 (2005).
- Fu, Q., Saiz, E., Rahaman, M. N., Tomsia, A. P. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 31 (7), 1245-1256 (2011).
- Xynos, I. D., Edgar, A. J., Buttery, L. D. K., Hench, L. L., Polak, J. M. Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276 (2), 461-465 (2000).
- Kroeze, R., Helder, M., Govaert, L., Smit, T. Biodegradable polymers in bone tissue engineering. Materials. 2 (3), 833-856 (2009).
- Venkatesan, J., Vinodhini, P. A., Sudha, P. N. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration. Advances in Food and Nutrition Research. 73, 59-81 (2014).
- Modulevsky, D. J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z., Pelling, A. E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS One. 9 (5), e97835(2014).
- Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Biocompatibility of subcutaneously implanted plant-derived cellulose biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894(2016).
- Hickey, R. J., Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Customizing the shape and microenvironment biochemistry of biocompatible macroscopic plant-derived cellulose scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3726-3736 (2018).
- Hickey, R. J., Leblanc Latour, M., Harden, J. L., Pelling, A. E. Designer scaffolds for interfacial bioengineering. Advanced Engineering Materials. 25, 2201415(2023).
- Fontana, G., et al. Biofunctionalized plants as diverse biomaterials for human cell culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601225(2017).
- Gershlak, J. R., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
- Leblanc Latour, M., Pelling, A. E. Mechanosensitive osteogenesis on native cellulose scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics. 135, 111030(2022).
- Lee, J., Jung, H., Park, N., Park, S. H., Ju, J. H. Induced osteogenesis in plants decellularized scaffolds. Scientific Reports. 9 (1), 20194(2019).
- Zhao, J., et al. Enhanced healing of rat calvarial defects with sulfated chitosan-coated calcium-deficient hydroxyapatite/bone morphogenetic protein 2 scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 18 (1-2), 185-197 (2012).
- Murtey, M. D., Ramasamy, P. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. In: Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , 161-186 (2016).
- tousimis Critical Point Dryers - Samdri®-PVT-3D. , https://tousimis.com/critical_point_dryers/detail.html?Pid=8755B (2022).
- Leica EM ACE200 Vacuum Coater. , https://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-ace200/ (2023).
- Spicer, P. P. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nature Protocols. 7 (10), 1918-1929 (2012).
- Leblanc Latour, M. Cellulose biomaterials for bone tissue engineering [dissertation]. , Department of Physics, Faculty of Science, University of Ottawa, Ottawa, Canada. (2023).
- Kodama, H. -A., Amagai, Y., Sudo, H., Kasai, S., Yamamoto, S. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Japanese Journal of Oral Biology. 23 (4), 899-901 (1981).
- Wang, D., et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (6), 893-903 (1999).
- Addison, W. N., et al. Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone. 71, 244-256 (2015).
- Heary, R. F., Parvathreddy, N., Sampath, S., Agarwal, N. Elastic modulus in the selection of interbody implants. Journal of Spine Surgery. 3 (2), 163-167 (2017).
- Lawson, Z. T., et al. Methodology for performing biomechanical push-out tests for evaluating the osseointegration of calvarial defect repair in small animal models. MethodsX. 8, 101541(2021).
Przedruki i uprawnienia
