Bezkomórkowe rusztowania pochodzące z jabłek do inżynierii tkanki kostnej in vitro i in vivo

Duże ubytki kostne spowodowane urazem lub chorobą często wymagają przeszczepów biomateriału do pełnej regeneracji¹. Obecne techniki mające na celu poprawę regeneracji tkanki kostnej regularnie wykorzystują przeszczepy autologiczne, allogeniczne, ksenogeniczne lub syntetyczne². W przypadku autologicznego przeszczepu kości, uważanego za "złoty standard" w praktyce przeszczepiania w celu naprawy dużych ubytków kostnych, kość jest pobierana od pacjenta. Jednak ta procedura szczepienia ma kilka wad, w tym ograniczenia rozmiaru i kształtu, dostępność tkanek i chorobowość miejsca pobrania³. Co więcej, procedury przeszczepów autologicznych są podatne na infekcje miejsca operowanego, późniejsze złamania, tworzenie się krwiaków w miejscu pobrania lub zrekonstruowanym miejscu oraz ból pooperacyjny⁴. Inżynieria tkanki kostnej (BTE) stanowi potencjalną alternatywę dla konwencjonalnych metod przeszczepu kości⁵. Łączy biomateriały strukturalne i komórki w celu budowy nowej funkcjonalnej tkanki kostnej. Projektując biomateriały do aparatów zausznych, kluczowe znaczenie ma połączenie makroporowatej struktury, chemii powierzchni, która sprzyja przyłączaniu się komórek, oraz właściwości mechanicznych, które są bardzo podobne do właściwości natywnej kości ⁶. Wcześniejsze badania wykazały, że idealna wielkość porów i moduł sprężystości dla biomateriałów stosowanych w zausznych aparatach zausznych wynoszą około 100-200 μm⁷ i 0,1-20 GPa, odpowiednio, w zależności od miejsca szczepienia⁸. Poza tym porowatość i wzajemne połączenia porów rusztowań są krytycznymi czynnikami wpływającymi na migrację komórek, dyfuzję składników odżywczych i angiogenezę⁸.

BTE wykazało obiecujące wyniki z różnymi biomateriałami opracowanymi i ocenionymi jako alternatywne opcje dla przeszczepów kostnych. Niektóre z tych biomateriałów to materiały osteoindukcyjne, materiały hybrydowe i zaawansowane hydrożele⁸. Materiały osteoindukcyjne stymulują rozwój nowo powstałych struktur kostnych. Materiały hybrydowe składają się z polimerów syntetycznych i/lub naturalnych⁸. Zaawansowane hydrożele naśladują macierz zewnątrzkomórkową (ECM) i są w stanie dostarczyć niezbędne czynniki bioaktywne w celu promowania integracji tkanki kostnej⁸. Hydroksyapatyt jest tradycyjnym materiałem i często wybieranym do zausznych aparatów zausznych ze względu na swój skład i biokompatybilność⁹. Szkło bioaktywne to kolejny rodzaj biomateriału dla BTE, który, jak wykazano, stymuluje określone odpowiedzi komórek w celu aktywacji genów niezbędnych do osteogenezy^10,11. Biodegradowalne polimery, w tym poli(kwas glikolowy) i poli(kwas mlekowy), są również szeroko stosowane w aplikacjach zausznych¹². Wreszcie, naturalne lub pochodzenia naturalnego polimery, takie jak chitozan, chityna i celuloza bakteryjna, również wykazały zachęcające wyniki dla BTE¹³. Jednakże, podczas gdy zarówno polimery syntetyczne, jak i naturalne wykazują potencjał w zakresie zausznych aparatów zausznych, opracowanie funkcjonalnego rusztowania o pożądanej makrostrukturze zazwyczaj wymaga obszernych protokołów.

Na odwrót, natywne makroskopowe struktury celulozy można łatwo uzyskać z różnych roślin, a nasza grupa badawcza wcześniej wykazała możliwość zastosowania rusztowań na bazie celulozy pochodzących z roślin do różnych rekonstrukcji tkanek. Rzeczywiście, po prostym zastosowaniu środka powierzchniowo czynnego, wykorzystaliśmy naturalną strukturę materiału roślinnego, podkreślając jego potencjał jako wszechstronnego biomateriału¹⁴. Co więcej, te rusztowania na bazie celulozy mogą być używane do hodowli komórkowych ssaków in vitro¹⁴, są biokompatybilne i wspierają spontaniczne unaczynienie podskórne^14,15,16,17. Zarówno nasza grupa badawcza, jak i inni, wykazali, że te rusztowania można uzyskać z określonych roślin w zależności od zamierzonego zastosowania^{14,15,16,17,18,19,20}. Na przykład struktura naczyniowa obserwowana w łodygach i liściach roślin wykazuje uderzające podobieństwo do struktury znajdującej się w tkankach zwierzęcych¹⁹. Dodatkowo, rusztowania celulozowe pochodzące z roślin mogą być łatwo kształtowane i poddawane modyfikacjom biochemicznym powierzchni w celu uzyskania pożądanych właściwości¹⁶. W niedawnym badaniu włączyliśmy bufor soli podczas procesu decelularyzacji, co doprowadziło do zwiększonego przyczepiania komórek obserwowanego zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo¹⁶. W tym samym badaniu wykazaliśmy możliwość zastosowania rusztowań celulozowych pochodzenia roślinnego w biomateriałach kompozytowych poprzez odlewanie hydrożeli na powierzchnię rusztowań. W ostatnich badaniach wykazano, że funkcjonalizacja rusztowań pochodzenia roślinnego zwiększa ich skuteczność¹⁸. Na przykład badanie przeprowadzone przez Fontana i in. (2017) wykazało, że adhezja ludzkich fibroblastów skórnych była wspierana przez pozbawione komórek łodygi pokryte RGD, podczas gdy niepowlekane łodygi nie wykazywały tej samej zdolności¹⁸. Co więcej, autorzy wykazali również, że zmodyfikowany symulowany płyn ustrojowy może być wykorzystany do sztucznej mineralizacji pozbawionych komórek łodyg roślin. W nowszych badaniach zbadaliśmy koncepcję mechanowrażliwej osteogenezy w rusztowaniach celulozowych pochodzenia roślinnego i oceniliśmy ich potencjał dla BTE^17,20. Ponadto Lee i in. (2019) wykorzystali rusztowania pochodzenia roślinnego do hodowli tkanek przypominających kości w warunkach in vitro²¹. Dzięki kompleksowej ocenie różnych źródeł roślinnych autorzy zidentyfikowali rusztowania pochodzące z jabłek jako najbardziej optymalne dla hodowli i różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Ponadto autorzy zasugerowali, że strukturalne i mechaniczne właściwości rusztowań pochodzących z jabłek odgrywają kluczową rolę w ich przydatności do zamierzonego celu. Będąc pierwszymi rusztowaniami pochodzenia roślinnego wdrożonymi w zastosowaniach inżynierii tkankowej, rusztowania pochodzące z jabłek wykazały, że mają uderzająco podobną architekturę do ludzkiej kości, zwłaszcza pod względem połączonych ze sobą porów o średnicy od 100 do 200 μm^14,21.

W obecnym badaniu dokładniej zbadaliśmy potencjał rusztowań celulozowych pochodzących z jabłek dla BTE i przeprowadziliśmy analizę ich właściwości mechanicznych zarówno in vitro, jak i in vivo. Chociaż przeprowadzono badania nad potencjałem rusztowań pochodzących z jabłek dla BTE^17,20,21, ich właściwości mechaniczne nie zostały zbadane. Wyniki wykazały dziką inwazję i różnicowanie osteogenne preosteoblastów MC3T3-E1 wysianych w rusztowaniach, które były hodowane w pożywce różnicującej przez 4 tygodnie. Moduł Younga tych rusztowań wynosił 192,0 ± 16,6 kPa, czyli był znacznie wyższy niż rusztowań ślepych (rusztowań bez komórek nasiennych) (31,6 ± 4,8 kPa) i rusztowań komórkowych hodowanych w podłożu nieróżnicującym (24,1 ± 8,8 kPa). Należy jednak zauważyć, że moduł Younga zdrowej ludzkiej tkanki kostnej zazwyczaj mieści się w zakresie 0,1-2 GPa dla kości beleczkowej i około 15-20 GPa dla kości korowej⁸. Niemniej jednak, po 8-tygodniowej implantacji w ubytku kalwarii gryzonia, rusztowania wysiewane komórkami wydawały się być dobrze zintegrowane z otaczającą kością, o czym świadczy średnia siła szczytowa 113,6 N ± 18,2 N w testach wypychania, co jest podobne do wcześniej zgłoszonego obciążenia złamaniem natywnej kości nazębnej²². Ogólnie rzecz biorąc, wyniki uzyskane w tym badaniu są bardzo obiecujące, szczególnie w przypadku zastosowań nienośnych. Jednak rusztowania celulozowe pochodzące z jabłek nie posiadają obecnie niezbędnych właściwości mechanicznych, aby precyzyjnie dopasować się do otaczającej tkanki kostnej w miejscu implantacji. W związku z tym konieczny jest dalszy rozwój, aby uwolnić pełny potencjał tych rusztowań.

Protokoły eksperymentalne zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie.

1. Przygotowanie rusztowania

1. Użyj krajalnicy do mandoliny, aby pokroić jabłka McIntosh (Canada Fancy) w plastry o grubości 8 mm. Pokrój tkankę hypanthium z plasterków jabłka na kwadraty o wymiarach 5 mm x 5 mm.
2. Umieść kwadratowe próbki w 0,1% dodecylosiarczanie sodu (SDS) na 2 dni.
3. Próbki pozbawione komórek należy przemyć wodą dejonizowaną i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej (RT) w 100 mM CaCl₂ w celu usunięcia pozostałego środka powierzchniowo czynnego.
4. Sterylizuj próbki (tj. rusztowania) w 70% etanolu przez 30 minut, umyj je wodą dejonizowaną i umieść na 24-dołkowej płytce hodowlanej przed wysiewem komórek.

2. Hodowla komórkowa i siew rusztowań

1. Utrzymuj MC3T3-E1 Subklonuj 4 komórki w naczyniach poddanych hodowli komórkowej o średnicy 10 cm w warunkach hodowli komórkowej (37°C w wilgotnej atmosferze 95% powietrza i 5%_CO2).
2. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych wykonaną z minimalnej niezbędnej pożywki Eagle - modyfikacji alfa (α-MEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.
3. Odłącz komórki od szalek hodowlanych przez trypsynizację (0,05% trypsyna-EDTA), gdy osiągną 80% zbieżności.
4. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze ok. 200 x g przez 3 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w α-MEM w stężeniu 2,5 x 10⁷ komórek na ml.
5. Odpipetować 40 μl porcji zawiesiny komórkowej na powierzchni rusztowań i pozostawić komórki na przyleganie przez 1 godzinę w warunkach hodowli komórkowej. Następnie dodaj 2 ml pożywki hodowlanej do każdej studzienki hodowlanej na płytce hodowlanej.
6. Uzupełniaj pożywkę co 2-3 dni przez 14 dni.
7. Przygotować pożywkę różnicującą, dodając 50 μg/ml kwasu askorbinowego i 4 mM fosforanu sodu do wcześniej opisanej pożywki do hodowli komórkowej.
8. Indukuj różnicowanie komórek MC3T3-E1 poprzez inkubację rusztowań w pożywce różnicowej przez 4 tygodnie. Uzupełniaj podłoże co 3-4 dni. Równolegle inkubować rusztowania w pożywce nieróżnicującej (tj. pożywce bez dodatków wywołujących różnicowanie) przez ten sam czas, z tym samym harmonogramem zmiany pożywki, aby służyć jako kontrola ujemna.

3. Pomiary wielkości porów za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej

1. Umyj bezkomórkowe rusztowania pochodzące z jabłek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
2. Inkubować rusztowania w 1 ml 10% (v/v) białego barwnika kalkofluorowego przez 25 minut w ciemności w temperaturze suchej temperatury.
3. Umyć rusztowania (n = 3) PBS i zobrazować trzy losowo wybrane obszary każdego rusztowania za pomocą szybkiego rezonansowego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM) przy 10-krotnym powiększeniu, przy użyciu kanału DAPI, w następujący sposób:
   1. Konfiguracja filtra emisji laserowej: 405 nm (laser); 425-475 nm (emisja)
   2. Dostosuj moc lasera i detektor ręcznie, aby zapewnić optymalną akwizycję obrazu. Uzyskaj stos z 20 obrazami o rozmiarze kroku 5 μm.
4. Korzystając z oprogramowania ImageJ, przetwarzaj i analizuj obrazy konfokalne w następujący sposób:
   1. Użyj funkcji Z-Project to Maximum Intensity (Projekcja z do maksymalnej intensywności), aby utworzyć obraz, a następnie zastosuj funkcję Znajdź krawędzie, aby podświetlić krawędź porów.
   2. Obrysuj pory ręcznie za pomocą narzędzia Zaznaczanie odręczne.
   3. Dopasuj każdy por jako elipsę, zmierz długość osi głównej, skompiluj wszystkie pomiary (w sumie 54 w niniejszym badaniu - 6 na 3 losowo wybrane obszary dla każdego rusztowania) i oblicz średnią długość.

4. Analiza rozmieszczenia komórek za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej

1. Rusztowania wysiewane komórkami hodowane w pożywce nieróżnicującej lub różnicującej należy trzykrotnie przemyć PBS. Przymocuj rusztowania 4% paraformaldehydem przez 10 minut.
2. Dokładnie umyj każde rusztowanie wodą dejonizowaną, przepuszczaj komórki roztworem Triton-X 100 przez 5 minut i ponownie przemyj PBS.
3. Inkubuj rusztowania w 1 ml 1% kwasu okresowego przez 40 minut i spłucz wodą dejonizowaną^14,16.
4. Inkubować rusztowania w 1 ml roztworu zawierającego 100 mM pirosiarczynu sodu i 0,15 M kwasu solnego, uzupełnionego 100 μg/ml jodku propidyny. Całkowicie zanurz rusztowania w roztworze.
5. Umyć rusztowania PBS i wybarwić jądra komórkowe, inkubując rusztowania w roztworze DAPI o stężeniu 5 mg/ml przez 10 minut w ciemności. Dokładnie umyj ponownie i przechowuj rusztowania w PBS przed obrazowaniem.
6. Zobrazuj trzy losowo wybrane powierzchnie trzech różnych rusztowań komórkowych za pomocą rezonansowego CLSM o dużej prędkości przy 10-krotnym powiększeniu, przy użyciu kanałów DAPI i TRITC, w następujący sposób:
   1. Konfiguracja filtra emisji laserowej:
      DAPI: Laser: 405 nm; Emisja: 425-475 nm
      TRITC: Laser: 561 nm; Emisja: 570-620 nm
   2. Dostosuj moc lasera i detektor ręcznie, aby zapewnić optymalną akwizycję obrazu. Uzyskaj stos z 20 obrazami o rozmiarze kroku 5 μm.
7. Użyj oprogramowania ImageJ, aby przetworzyć obrazy konfokalne i utworzyć maksymalną projekcję w osi Z do analizy obrazu za pomocą funkcji Z-Project to Maximum Intensity (Projekcja Z do maksymalnej intensywności).

5. Analiza fosfatazy alkalicznej

1. Rusztowania wysiewane komórkami hodowane w pożywce nieróżnicującej lub różnicującej należy trzykrotnie przemyć PBS. Przymocuj rusztowania 10% neutralną buforowaną formaliną przez 30 minut. Zamocuj puste rusztowania (rusztowania bez komórek zasianych), aby służyły jako kontrola negatywna.
2. Przygotować roztwór barwiący 5-bromo-4-chloro-3'-indolifosforan i nitro-niebieski tetrazolowy (BCIP/NBT), rozpuszczając jedną tabletkę BCIP/NBT w 10 ml wody dejonizowanej.
3. Umyj rusztowania stałe 0,05% roztworem Tween i zabarwij roztworem BCIP/NBT przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj poplamione rusztowania 0,05% roztworem Tween i przechowuj je w PBS przed obrazowaniem.
4. Sfotografuj poplamione rusztowania za pomocą 12-megapikselowego aparatu cyfrowego.

6. Analiza osadzania się wapnia

1. Rusztowania wysiewane komórkami hodowane w pożywce nieróżnicującej lub różnicującej należy trzykrotnie przemyć PBS. Przymocuj rusztowania 10% neutralną buforowaną formaliną przez 30 minut. Zamocuj puste rusztowania (rusztowania bez komórek zasianych), aby służyły jako kontrola negatywna.
2. Przygotować 2% (w/v) roztwór barwiący czerwienią alizarynową S (ARS).
3. Umyć rusztowania stałe wodą dejonizowaną i zabarwić je roztworem ARS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyć poplamione rusztowania wodą dejonizowaną i przechowywać je w PBS przed obrazowaniem.
4. Sfotografuj poplamione rusztowania za pomocą 12-megapikselowego aparatu cyfrowego.

7. Analiza mineralizacji

1. Rusztowania wysiewane komórkami hodowane w pożywce nieróżnicującej lub różnicującej należy trzykrotnie przemyć PBS. Przymocuj rusztowania 4% paraformaldehydem przez 48 godzin. Zamocuj puste rusztowania (rusztowania bez komórek zasianych), aby służyły jako kontrola negatywna.
2. Odwodnić próbki w roztworach zawierających stężenie etanolu wzrastające od 50% do 100%, zgodnie z wcześniejszym opisem²³.
3. Wykonaj skaningową mikroskopię elektronową (SEM) i spektroskopię dyspersyjną energii (EDS) w celu analizy agregatów mineralnych w następujący sposób:
   1. Wysuszyć próbki za pomocą osuszacza do punktów krytycznych, postępując zgodnie z protokołem producenta²⁴.
   2. Nałożyć złotą powłokę 5 nm na rusztowania za pomocą napylarki do złota, postępując zgodnie z protokołem producenta²⁵.
   3. Zobrazuj powierzchnię rusztowań za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego ustawionego na 3 kV, przy 85-krotnym powiększeniu.
   4. Wykonać EDS, ustawiając skaningowy mikroskop elektronowy na 15 kV. Na trzech losowo wybranych obszarach na rusztowanie należy pobrać widma EDS do analizy składu kruszyw mineralnych.

8. Pomiary modułu Younga

1. Usunąć rusztowania nasienne komórkami z odpowiedniego podłoża inkubacyjnego i natychmiast przebadać próbki.
2. Korzystając ze specjalnie skonstruowanego jednoosiowego aparatu do ściskania, wyposażonego w ogniwo obciążnikowe 1,5 N, należy ściskać rusztowania (n = 3 na warunek) ze stałą szybkością 3 mm·^min-1 do maksymalnego odkształcenia ściskającego wynoszącego 10% wysokości rusztowania.
3. Określ moduł Younga na podstawie nachylenia części liniowej krzywych naprężenie-odkształcenie. W niniejszym badaniu moduł określono między 9% a 10% odkształcenia.

9. Analiza infiltracji i mineralizacji komórek za pomocą histologii: Rusztowania in vitro

1. Rusztowania wysiewane komórkami hodowane w pożywce nieróżnicującej lub różnicującej należy trzykrotnie przemyć PBS.
2. Przymocuj rusztowania wysiane komórkami za pomocą 4% paraformaldehydu przez 48 godzin przed ponownym zawieszeniem w 70% etanolu do przechowywania.
3. Histologia:
   UWAGA: W niniejszym badaniu całe przygotowanie histologiczne (osadzanie, cięcie i barwienie) opisane w kolejnych krokach zostało przeprowadzone przez Louise Pelletier Histology Core Facility (University of Ottawa).
   1. Po odwodnieniu i zatopieniu w parafinie należy pociąć próbki na odcinki seryjne o grubości 5 μm, zaczynając od 1 mm wewnątrz rusztowań, a następnie zamontować skrawki na szkiełkach mikroskopowych.
   2. Wybarwić skrawki barwnikami hematoksyliną i eozyną (H&E) lub von Kossa (VK).
   3. Zobrazuj skrawki za pomocą mikroskopu ze skanerem slajdów przy 40-krotnym powiększeniu (n = 1 rusztowanie w ośrodku nieróżnicującym i n = 2 rusztowania w ośrodku różnicującym w niniejszym badaniu).
   4. Korzystając z oprogramowania ImageJ, można wizualnie ocenić infiltrację komórek (barwienie H&E) i mineralizację (barwienie VK).

10. Model wady kalwarii u szczura

1. Uzyskaj przegląd i zatwierdzenie protokołów eksperymentalnych przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami.
2. Przygotować okrągłe (o średnicy 5 mm i grubości 1 mm) rusztowania bezkomórkowe zgodnie z sekcją 1 opisaną powyżej i za pomocą stempla do biopsji o średnicy 5 mm.
3. Wykonaj obustronną kraniotomię zgodnie z ustalonym protokołem²⁶, w następujący sposób:
   1. Samce szczurów Sprague-Dawley należy znieczulić izofluranem, najpierw w dawce 3% do utraty przytomności, a następnie w dawce 2-3% przez cały czas trwania zabiegu.
   2. Odsłoń okostną i czaszkę, przecinając leżącą nad nią skórę za pomocą ostrza skalpela. Usuń okostną.
   3. Twórz obustronne ubytki w obu kościach ciemieniowych po każdej stronie szwu strzałkowego za pomocą wiertła dentystycznego wyposażonego w trepanację o średnicy 5 mm pod stałym nawadnianiem 0,9% NaCl.
   4. Oczyść otaczającą kość za pomocą 0,9% NaCl, aby usunąć wszelkie fragmenty kości.
   5. Umieść okrągłe, pozbawione komórek rusztowania w ubytkach.
   6. Zamknij leżącą nad nią skórę za pomocą szwów 4-0.
4. Daj szczurom nieograniczony dostęp do pożywienia i wody oraz monitoruj je codziennie.
5. Po 8 tygodniach od implantacji należy poddać szczury eutanazji przez wdychanie CO₂ i perforację klatki piersiowej jako wtórny środek eutanazji.
6. Aby odsłonić czaszkę i odzyskać implanty, usuń skórę pokrywającą czaszkę za pomocą ostrza skalpela.
7. Przeciąć czaszkę na kościach czołowych i potylicznych oraz z boku obu kości ciemieniowych za pomocą wiertła dentystycznego, aby całkowicie usunąć górną część czaszki.

11. Test wypychania

1. Podłącz jednoosiowe urządzenie kompresyjne (z ogniwem obciążnikowym 445 N) do modułu akwizycji danych USB.
2. Podłącz moduł akwizycji danych do komputera wyposażonego w aplikację do akwizycji danych.
3. Natychmiast po ekstrakcji czaszki umieścić każdą próbkę (n = 7 implantów od 4 zwierząt w niniejszym badaniu) na uchwycie próbki jednoosiowego urządzenia uciskowego, tak aby grzbietowa strona kości była skierowana do góry.
4. Opuścić tłok z prędkością 0,5 mm/min, aż lekko dotknie pobranego implantu.
5. Rozpocznij badanie, opuszczając tłok przez implant aż do całkowitego wypchnięcia, jednocześnie stosując ucisk ze stałą prędkością 0,5 mm/min za pomocą oprogramowania do gromadzenia danych.
6. Zapisz siłę szczytową na krzywej siły w funkcji przemieszczenia za pomocą oprogramowania do akwizycji danych.

12. Analiza infiltracji i mineralizacji komórek za pomocą histologii: Rusztowania in vivo

1. Utrwalić wyekstrahowaną kalwarię i implanty w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 72 godziny przed ponownym zawieszeniem w 70% etanolu w celu przechowywania.
2. Histologia:
   UWAGA: W niniejszym badaniu wszystkie przygotowania histologiczne (osadzanie, cięcie i barwienie) opisane w kolejnych krokach zostały wykonane przez Accel Labs (Montreal, QC, Kanada).
   1. Pociąć próbki (zatopione w metakrylanie metylu) na sekcje o grubości 6 μm na trzech różnych poziomach (góra, dół i w kierunku środka) i zamontować je na szkiełkach mikroskopowych.
   2. Zabarwić sekcje za pomocą H&E lub trichromu Massona-Goldnera (MGT).
3. Zobrazuj skrawki za pomocą mikroskopu ze skanerem slajdów przy 40-krotnym powiększeniu (4 eksplantaty od 2 zwierząt w niniejszym badaniu).
4. Korzystając z oprogramowania ImageJ, można wizualnie ocenić infiltrację komórek (barwienie H&E) i osadzanie kolagenu (barwienie MGT).

Pomiar wielkości porów, rozmieszczenie komórek i mineralizacja in vitro (Rysunek 1 i Rysunek 2)
Całkowite usunięcie natywnych składników komórkowych rusztowań tkanki jabłoni osiągnięto po potraktowaniu rusztowań SDS i CaCl2 (Rysunek 1A). Rusztowania wykazywały wysoce porowatą strukturę, co zostało potwierdzone za pomocą mikroskopii konfokalnej. Kwantyfikacja obrazów wykazała średnią wielkość porów wynoszącą 154 μm ± 40 μm. Rozkład wielkości porów wahał się od 73 μm do 288 μm. Jednak większość porów mieściła się w zakresie od 100 μm do 200 μm (Rysunek 1C).

Po 4-tygodniowym okresie hodowli w pożywce różnicującej, rusztowania zasiane komórkami wykazywały rozległe białe osady mineralne (Rysunek 1A). Rusztowania zawierające komórki wykazywały nieprzezroczyste białe zabarwienie, sugerujące mineralizację, której nie zaobserwowano w rusztowaniach pustych (rusztowaniach bez komórek wysiewanych). Co więcej, analiza przy użyciu konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej ujawniła jednorodny rozkład komórek w rusztowaniach (Rysunek 1B).

Rusztowania obsiane lub nie z komórkami zostały wybarwione odpowiednio BCIP/NBT i ARS w celu analizy aktywności i mineralizacji ALP (Rysunek 1D). Barwienie BCIP/NBT wykazało znaczny wzrost aktywności ALP (reprezentowany przez silny fioletowy kolor) w rusztowaniach komórkowych hodowanych w pożywce różnicującej, w przeciwieństwie do rusztowań ślepych lub rusztowań komórkowych hodowanych w pożywce nieróżnicującej. Podobnie, rusztowania nasienne komórkami hodowane w pożywce różnicującej wykazywały intensywniejszy czerwony kolor po barwieniu ARS, co wskazuje na większą mineralizację w porównaniu z rusztowaniami ślepymi lub rusztowaniami komórkowymi hodowanymi w pożywce nieróżnicowej. W rusztowaniach ślepych zaobserwowano barwienie tła, prawdopodobnie z powodu obecności CaCl2 w protokole decelularyzacji.

Barwienie (H&E i VK) przeprowadzono na rusztowaniach w celu analizy infiltracji i mineralizacji komórek, a SEM i EDS użyto do dalszej oceny mineralizacji (Rysunek 2). Barwienie H&E (Rysunek 2A) wykazało dobrą infiltrację komórek w rusztowaniach wysiewanych komórkami, hodowanych w pożywce nieróżnicującej lub różnicującej. Liczne jądra były widoczne na obrzeżach i na wszystkich rusztowaniach. Obecność kolagenu zaobserwowano również w rusztowaniach w kolorze bladoróżowym. Ponadto barwienie VK przeprowadzone na rusztowaniach po 4 tygodniach hodowli w pożywce różnicującej wykazało, że ściany porów były wybarwione, podczas gdy złogi wapnia wykryto wyłącznie wzdłuż zewnętrznych krawędzi ścianek porów w rusztowaniach hodowanych w pożywce nieróżnicującej i mogły one wynikać z wchłaniania wapnia podczas zabiegu decelularyzacji. Zlokalizowaną mineralizację na powierzchni rusztowań wysiewanych komórkami hodowanych w pożywce różnicującej przez 4 tygodnie zaobserwowano za pomocą analizy SEM (Rysunek 2B). Dokładniej rzecz ujmując, na obrzeżach porów zaobserwowano osady mineralne przypominające agregaty sferoidalne. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano żadnych agregatów mineralnych na rusztowaniach półfabrykatów lub rusztowaniach komórkowych hodowanych przez 4 tygodnie w pożywce nieróżnicującej. Wyraźne charakterystyczne piki odpowiadające fosforowi (P) i wapniowi (Ca) zaobserwowano w widmach EDS wybranych regionów zainteresowania, w szczególności w osadach mineralnych obserwowanych na rusztowaniach nasiennych komórkami hodowanych przez 4 tygodnie w pożywce różnicującej (Figura 2B).

Analiza biomechaniczna in vitro (Rysunek 3)
Moduł Younga rusztowań wysiewanych komórkami mierzono po 4 tygodniach hodowli w pożywce nieróżnicującej lub różnicującej (n = 3 dla każdego warunku eksperymentalnego). Porównano go z modułem Younga dla rusztowań ślepych (rusztowań bez komórek zasianych) (Rysunek 3). Nie zaobserwowano istotnej różnicy w module pomiędzy rusztowaniami ślepej próby (31,6 kPa ± 4,8 kPa) a rusztowaniami komórkowymi hodowanymi w pożywce nieróżnicującej (24,1 kPa ± 8,8 kPa; p = 0,88). Natomiast istotną różnicę stwierdzono między modułem rusztowań ślepej próby (31,6 kPa ± 4,8 kPa) a modułem rusztowań wysiewanych komórkowo hodowanych w pożywce różnicującej (192,0 kPa ± 16,6 kPa; p < 0,001). Dodatkowo zaobserwowano istotną różnicę (p < 0,001) między modułami Younga rusztowań komórkowych hodowanych w pożywkach nieróżnicujących i różnicujących. Rysunek uzupełniający 1 przedstawia typową krzywą naprężenie-odkształcenie dla obliczeń modułu Younga.

Wydajność biomechaniczna in vivo i regeneracja kości (Rysunek 4 i Rysunek 5)
Kraniotomię chirurgiczną przeprowadzono w sumie na 6 szczurach Sprague-Dawley. Obustronne ubytki o średnicy 5 mm zostały utworzone w obu kościach ciemieniowych czaszki za pomocą wiertła trepanacyjnego, a rusztowania celulozowe pochodzące z jabłek bez komórek nasiennych zostały wszczepione w ubytki kalwaryjne (Figura 4A). Po 8 tygodniach od implantacji zwierzęta zostały poddane eutanazji, a górna część ich czaszek została pobrana i przetworzona do badań mechanicznych lub analizy histologicznej.

Na podstawie oceny wizualnej, rusztowania wydawały się dobrze zintegrowane z tkankami otaczającymi czaszkę. Przeprowadzono mechaniczne testy wypychania w celu ilościowej oceny integracji rusztowań (n = 7) w kalwarii gospodarza. Pomiary przeprowadzono przy użyciu jednoosiowego urządzenia kompresyjnego (Rysunek 4B) bezpośrednio po eutanazji zwierząt. Wyniki wykazały, że siła szczytowa wynosiła 113,6 N ± 18,2 N (tabela 1).

Przeprowadzono analizę histologiczną w celu oceny infiltracji komórek i odkładania się macierzy zewnątrzkomórkowej w obrębie wszczepionych rusztowań (Rysunek 5). Barwienie H&E ujawniło naciek komórkowy w porach rusztowania i dowody unaczynienia, na co wskazuje obecność naczyń krwionośnych w rusztowaniach. Dodatkowo barwienie MGT wykazało obecność kolagenu w rusztowaniach.

Rysunek 1: Obrazy rusztowań, rozkład wielkości porów i mineralizacja in vitro. (A) Reprezentatywne fotografie rusztowania celulozowego pochodzącego z jabłek po usunięciu komórek natywnych i środka powierzchniowo czynnego (po lewej) oraz rusztowania wysianego komórkami MC3T3-E1 po 4 tygodniach hodowli w pożywce różnicującej osteogennej (po prawej). Podziałka skali wynosi 2 mm. (B) Reprezentatywne obrazy z konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego przedstawiające komórki nasienne w rusztowaniach celulozowych pochodzących z jabłek po 4 tygodniach hodowli w pożywce nieróżnicującej ("ND") lub pożywce różnicującej osteogennej ("D"). Podziałka skali reprezentuje 50 μm. Barwienie przeprowadzono na rusztowaniach dla celulozy (kolor czerwony) przy użyciu jodku propidyny oraz dla jąder komórkowych (kolor niebieski) przy użyciu DAPI. (C) Rozkład wielkości porów zdecelularyzowanych rusztowań celulozowych pochodzących z jabłek, przed zasianiem komórkami MC3T3-E1, od maksymalnych projekcji w osi z obrazów konfokalnych. Analizę przeprowadzono łącznie na 54 porach w 3 różnych rusztowaniach (6 porów w 3 losowo wybranych obszarach zainteresowania na rusztowanie). (D) Reprezentatywne obrazy rusztowań barwionych 5-bromo-4-chloro-3'-indolilofosforanem i nitro-niebieskim tetrazolem (BCIP/NBT) w celu oceny aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP) oraz czerwienią alizarynową S (ARS) w celu wizualizacji odkładania się wapnia, wskazującego na mineralizację (podziałka = 2 mm - dotyczy wszystkich). Rusztowania oznaczone jako "ślepe" (rusztowania bez komórek nasiennych) nie wykazywały barwienia BCIP/NBT, co wskazuje na brak aktywności ALP. Z drugiej strony, rusztowania nasienne komórkami hodowane w pożywce różnicującej ("D") wykazywały wyższą aktywność ALP, na co wskazuje intensywniejszy niebieski kolor, w porównaniu z rusztowaniami wysiewanymi komórkami hodowanymi w pożywce nieróżnicującej ("ND"). W przypadku barwienia ARS zarówno rusztowania półfabrykatów, jak i rusztowania hodowane w pożywce nieróżnicującej ("ND") wykazywały jaśniejszy odcień czerwieni w porównaniu z rusztowaniami hodowanymi w pożywce różnicującej ("D"). Obecność osadzania się wapnia w rusztowaniach hodowanych w pożywce różnicującej ("D") ilustrowała intensywna ciemnoczerwona barwa. Każda analiza została przeprowadzona na trzech różnych rusztowaniach (n = 3). Ten rysunek został zaadaptowany za zgodą Leblanc Latour (2023)27. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Histologia, skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i spektroskopia dyspersyjna (EDS) analiza rusztowań in vitro. (A) Reprezentatywne obrazy górnych przekrojów histologicznych rusztowań. Rusztowania osadzone w parafinie pocięto na sekcje o grubości 5 μm, które wybarwiono hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu wizualizacji infiltracji komórek lub von Kossa (VK) w celu wizualizacji mineralizacji w rusztowaniach. Rusztowania były infiltrowane komórkami MC3T3-E1, o czym świadczą niebieskie (jądra) i różowe (cytoplazma) zabarwienie widoczne na obrzeżach i na wszystkich rusztowaniach. Widoczny był również kolagen (bladoróżowy) (powiększona wstawka "H&E - D"). Mineralizację obserwowano jedynie na obrzeżach ścian porów w rusztowaniach hodowanych w pożywce nieróżnicującej ("ND"). Ściany porów w rusztowaniach hodowanych w pożywce różnicującej ("D") były całkowicie zabarwione na czarno. Analizę przeprowadzono na jednym rusztowaniu hodowanym w podłożu nieróżnicującym ("ND") oraz na dwóch rusztowaniach hodowanych w podłożu różnicującym ("D") (podziałka skali dla obrazów o mniejszym powiększeniu = 1 mm, podziałka dla obrazów o większym powiększeniu = 50 μm). (B) Reprezentatywne mikrofotografie uzyskane za pomocą widm SEM oraz EDS. Rusztowania zostały pokryte napylaniem złotem i zostały zobrazowane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z emisją polową pod napięciem 3,0 kV (podziałka skali = 100 μm - dotyczy wszystkich). Widma EDS zostały pozyskane na każdym rusztowaniu. Piki fosforu (2,013 keV) i wapnia (3,69 keV) są oznaczone w każdym widmie EDS. Zarówno SEM, jak i EDS wykonano na trzech różnych rusztowaniach. Puste: rusztowania bez komórek zasianych. Ten rysunek został zaadaptowany za zgodą Leblanc Latour (2023)27. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Moduły Younga rusztowań in vitro po 4 tygodniach hodowli w pożywce nieróżnicującej ("ND") lub pożywce różnicującej ("D"). Dane przedstawiono jako średni błąd ± standardowy średniej (SEM) trzech powtórzonych próbek dla każdego warunku. Istotność statystyczną (* oznacza p<0,05) określono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) i testu post-hoc Tukeya. Puste: rusztowania bez komórek zasianych. Ten rysunek został zaadaptowany za zgodą Leblanc Latour (2023)27. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zdjęcie rusztowania przed implantacją i test wypychania po 8 tygodniach od implantacji: (A) Reprezentatywne zdjęcie rusztowania przed implantacją; (B) Jednoosiowe urządzenie ściskające stosowane do badań wypychania, z ogniwem obciążnikowym oznaczonym gwiazdką (*) i próbką oznaczoną strzałką. Ten rysunek został zaadaptowany za zgodą Leblanc Latour (2023)27. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Analiza histologiczna rusztowań in vitro. Reprezentatywne obrazy przekrojów histologicznych z rusztowań bez nasion po 8 tygodniach od implantacji. Sekcje wybarwiono albo hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu wizualizacji komórek, albo trichromem Massona-Goldnera (MGT) w celu uwidocznienia kolagenu. Strzałka wskazuje czerwone krwinki. Widoczna jest obecność kolagenu (podziałka = 1 mm i 200 μm odpowiednio dla lewej i prawej wstawki). Ten rysunek został zaadaptowany za zgodą Leblanc Latour (2023)27. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Zmierzona siła szczytowa z testów wypychania.

Rysunek uzupełniający 1: Typowa krzywa naprężenie-odkształcenie do obliczeń modułu Younga. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Oświadczenie o konflikcie interesów: M.L.L., M.T. R.J.H., C.M.C., I.C. i A.P. są wynalazcami we wnioskach patentowych złożonych przez Uniwersytet w Ottawie i Spiderwort Inc. dotyczących wykorzystania celulozy pochodzenia roślinnego do zastosowań zausznych. M.L.L., R.J.H., C.M.C. i A.P. mają udziały finansowe w Spiderwort Inc.