Artykuł metodologiczny

Lekki implant napędowy do przewlekłych zapisów tetrody u młodych myszy

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65228

⸱

2 czerwca 2023

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, UT Southwestern Medical Center, 2Neuroscience Graduate Program, UT Southwestern Medical Center, 3O’Donnell Brain Institute, UT Southwestern Medical Center, 4Department of Psychiatry, UT Southwestern Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy projekt mikronapędu, procedurę implantacji chirurgicznej i strategię rekonwalescencji po operacji, które pozwalają na przewlekłe zapisy pola i pojedyncze jednostki z wielu regionów mózgu jednocześnie u młodocianych i dorastających myszy w krytycznym oknie rozwojowym od 20 dnia po urodzeniu (p20) do 60 dnia po urodzeniu (p60) i później.

Streszczenie

Elektrofizjologia in vivo dostarcza niezrównanego wglądu w dynamikę obwodów sub-drugiego poziomu nienaruszonego mózgu i stanowi metodę o szczególnym znaczeniu dla badania mysich modeli ludzkich zaburzeń neuropsychiatrycznych. Jednak takie metody często wymagają dużych implantów czaszkowych, których nie można stosować u myszy we wczesnych punktach rozwojowych. W związku z tym praktycznie nie przeprowadzono żadnych badań fizjologii in vivo na swobodnie zachowujących się niemowlętach lub młodocianych myszach, pomimo faktu, że lepsze zrozumienie rozwoju neurologicznego w tym krytycznym oknie prawdopodobnie dostarczyłoby unikalnych wglądów w zależne od wieku zaburzenia rozwojowe, takie jak autyzm czy schizofrenia. W tym miejscu opisano projekt mikronapędu, procedurę implantacji chirurgicznej i strategię rekonwalescencji po operacji, która pozwala na przewlekłe zapisy pola i pojedynczej jednostki z wielu regionów mózgu jednocześnie u myszy w wieku od 20 dnia po urodzeniu (p20) do 60 dnia po urodzeniu (p60) i później, okno czasowe odpowiadające w przybliżeniu wiekowi człowieka od 2 lat do dorosłości. Liczba elektrod rejestrujących i końcowych miejsc rejestracji może być łatwo modyfikowana i rozszerzana, co pozwala na elastyczną eksperymentalną kontrolę monitorowania in vivo obszarów mózgu istotnych z punktu widzenia zachowania lub choroby w całym okresie rozwoju.

Wprowadzenie

Mózg przechodzi duże zmiany podczas krytycznych okien rozwojowych w dzieciństwie i okresie dojrzewania1,2,3. Wiele chorób neurologicznych i psychiatrycznych, w tym autyzm i schizofrenia, po raz pierwszy objawia się behawioralnie i biologicznie w tym okresie rozwoju mózgu młodocianych i młodzieńczych4,5,6. Chociaż wiele wiadomo na temat zmian komórkowych, synaptycznych i genetycznych, które zachodzą we wczesnym okresie rozwoju, stosunkowo niewiele wiadomo na temat tego, jak zmieniają się procesy na poziomie obwodu lub sieci w tym oknie czasowym. Co ważne, funkcja mózgu na poziomie obwodu, która ostatecznie leży u podstaw złożonych zachowań, pamięci i funkcji poznawczych, jest nieprzewidywalną, wyłaniającą się właściwością funkcji komórkowych i synaptycznych7,8,9,10. Dlatego, aby w pełni zrozumieć funkcjonowanie mózgu na poziomie sieci, konieczne jest bezpośrednie badanie aktywności neuronalnej na poziomie nienaruszonego obwodu neuronalnego. Ponadto, aby określić, w jaki sposób aktywność mózgu zmienia się w trakcie progresji zaburzeń neuropsychiatrycznych, kluczowe znaczenie ma zbadanie aktywności sieci w prawidłowym modelu choroby w określonym oknie czasowym, w którym manifestują się fenotypy behawioralne choroby i śledzenie obserwowanych zmian, które utrzymują się w wieku dorosłym.

Jednym z najpowszechniejszych i najpotężniejszych naukowych organizmów modelowych jest mysz, z dużą liczbą unikalnych szczepów genetycznych, które modelują zaburzenia neurorozwojowe z zależnym od wieku początkiem fenotypów behawioralnych i/lub mnemonicznych11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Chociaż trudno jest skorelować precyzyjne punkty czasowe rozwoju między mózgami ludzi i myszy, porównania morfologiczne i behawioralne wskazują, że myszy p20-p21 reprezentują wiek człowieka w wieku 2-3 lat, a myszy p25-p35 reprezentują wiek człowieka w wieku 11-14 lat, przy czym myszy prawdopodobnie osiągają rozwojowy odpowiednik ludzkiego 20-letniego dorosłego o p603, 22. Tak więc, aby lepiej zrozumieć, jak rozwija się mózg młodocianego i określić, w jaki sposób sieci neuronowe mózgu stają się dysfunkcyjne w chorobach takich jak autyzm czy schizofrenia, idealnym rozwiązaniem byłoby bezpośrednie monitorowanie aktywności mózgu in vivo u myszy w wieku od 20 dni do 60 dni.

Jednak podstawowym wyzwaniem w monitorowaniu aktywności mózgu we wczesnym okresie rozwoju u myszy jest mały rozmiar i względna słabość młodych myszy. Przewlekłe wszczepianie elektrod, które jest niezbędne do badań podłużnych nad rozwojem mózgu, zazwyczaj wymaga dużej, nieporęcznej obudowy w celu ochrony cienkich drutów elektrod i płytek interfejsu23,24, a implanty muszą być mocno przymocowane do czaszki myszy, która jest cieńsza i mniej sztywna u młodych myszy ze względu na zmniejszone kostnienie. Tak więc praktycznie wszystkie badania fizjologii gryzoni in vivo przeprowadzono na dorosłych osobnikach ze względu na ich względną wielkość, siłę i grubość czaszki. Do tej pory większość badań nad fizjologią mózgu młodych gryzoni in vivo przeprowadzono na młodych szczurach typu dzikiego, co siłą rzeczy ogranicza możliwość eksperymentalnego monitorowania funkcji mózgu młodocianych w swobodnie zachowującym się modelu ludzkiego zaburzenia25,26,27,28,29,30.

Ten manuskrypt opisuje nowatorskie zastosowanie implantów, procedurę chirurgicznego wszczepienia implantu oraz strategię powrotu do zdrowia po operacji, aby przewlekle badać długoterminowe (do 4 lub więcej tygodni) funkcje mózgu in vivo u młodych myszy w krytycznym rozwojowo oknie czasowym (od p20 do p60 i dalej). Procedura implantacji pozwala na niezawodne, trwałe przymocowanie elektrod do czaszek młodych myszy. Co więcej, konstrukcja mikronapędu jest lekka, ponieważ ten mikronapęd waży ~ 4-6 g po pełnym zmontowaniu, a ze względu na minimalną przeciwwagę wymaganą do zrównoważenia ciężaru implantu, nie wpływa na wydajność behawioralną młodych myszy podczas typowych paradygmatów behawioralnych.

Protokół

Obecne badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Teksańskiego Southwestern Medical Center (protokół 2015-100867) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zarówno instytucji, jak i Narodowego Instytutu Zdrowia. Samce i samice myszy C57/Bl6 użyte w niniejszym badaniu wszczepiono w temperaturze p20 (waga 8,3-11,1 g w momencie implantacji).

1. Projektowanie i budowa mikronapędów

  1. Cyfrowe projektowanie i drukowanie mikronapędu (Rysunek 1)
    1. Pobierz szablony modeli mikronapędów (https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive).
    2. Zidentyfikuj stereotaktyczne lokalizacje docelowych obszarów mózgu w odpowiednim atlasie stereotaktycznym.
    3. Korzystając z trójwymiarowego oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD 3D), załaduj szablon kaniuli mikronapędu (Rysunek 1B).
    4. W razie potrzeby zmodyfikuj lokalizacje wyjściowe kaniuli wyjściowej w modelu kaniuli mikronapędu, aby celować w żądane obszary mózgu.
      UWAGA: Każde wytłoczenie otworu kaniuli powinno mieć co najmniej 2 mm długości, aby zapewnić, że tetroda wyłoni się z otworu kaniuli, celując prosto w cel. Szablon kaniuli mikronapędowej jest przeznaczony do obustronnego celowania w przednią korę obręczy (jedna tetroda na półkulę), obszar hipokampa CA1 (cztery tetrody na półkulę) i obszar hipokampa CA3 (dwie tetrody na półkulę), z jedną tetrodą referencyjną na półkulę umieszczoną w istocie białej powyżej obszaru hipokampa CA1.
    5. W razie potrzeby zmodyfikuj korpus mikrodysku (Rysunek 1A), aby dostosować go do mocowania karty interfejsu elektronicznego (EIB).
    6. Wydrukuj korpus mikronapędu, kaniulę, stożek i pokrywę w wysokiej rozdzielczości na drukarce 3D (najlepiej o rozdzielczości lepszej niż 25 μm) i przygotuj wydrukowane materiały zgodnie z protokołami producenta. Używaj żywic do drukarek o dużej sztywności.
  2. Montaż niestandardowych i mocowań (Rysunek 2A, B)
    1. Korzystając z oprogramowania CAD 3D, załaduj modele mocowania (Rysunek 1E).
    2. Wydrukuj mocowania śrubowe w wysokiej rozdzielczości na drukarce 3D (najlepiej o rozdzielczości co najmniej 25 μm), a wydrukowane materiały przygotuj zgodnie z protokołami producenta. Używaj żywic do drukarek o dużej sztywności.
    3. Przymocuj do każdej posuwającej tetrodę (Rysunek 1F) (posuwające tetrody są produkowane na zamówienie w warsztacie mechanicznym przed budową mikronapędów).
      1. Przymocuj dwie do każdej, jedną powyżej i jedną poniżej grzbietu. Upewnij się, że spód każdej styka się z grzbietem. Przytrzymaj nasadki śrubowe razem z żelem cyjanoakrylan.
      2. Po zamocowaniu upewnij się, że mocowania śrubowe nie poruszają się w osi wzdłużnej, ale obracają się swobodnie z minimalnym oporem.
  3. Montaż korpusu mikronapędu (Rysunek 2C, D)
    1. Za pomocą cienkich, ostrych nożyczek pokrój duże rurki poliimidowe (średnica zewnętrzna: 0,2921 mm, średnica wewnętrzna: 0,1803 mm) na odcinki o długości ~6 cm.
    2. Przełóż duże odcinki poliimidu przez otwory wyjściowe w kaniuli mikronapędu tak, aby każda rurka wystawała poza spód kaniuli na kilka milimetrów.
    3. Za pomocą czystej igły 30 G przymocuj poliimid do kaniuli, nakładając niewielkie ilości płynnego cyjanoakrylanu. Uważaj, aby cyjanoakrylan nie dostał się do wnętrza probówki poliimidowej.
      UWAGA: Kapiący płynny cyjanoakrylan do kaniuli przez górną część korpusu napędu może przyspieszyć ten proces, ale będzie wymagał późniejszego ponownego oczyszczenia otworów prowadzących za pomocą wiertła z drobną końcówką.
    4. Przełóż duże rurki poliimidowe od góry kaniuli mikronapędu przez odpowiednie duże otwory poliimidowe w korpusie mikronapędu.
    5. Powoli dociśnij kaniulę mikronapędu i korpus mikronapędu do siebie, aż będą się przylegać, a zaczepy mocujące kaniulę/korpus zablokują się. Uważaj, aby nie zgiąć ani nie uszkodzić rurek poliimidowych w tym procesie.
      UWAGA: Każda rurka poliimidowa powinna płynnie przechodzić od dołu kaniuli na zewnątrz przez górną część korpusu mikronapędu. Lekkie zginanie jest normalne, ale nadmierne zginanie rurki poliimidowej może wypaczyć tetrodę i uniemożliwić jej przejście prosto do mózgu.
    6. Przymocuj korpus mikronapędu i kaniulę mikronapędu razem za pomocą cyjanoakrylanu.
    7. Za pomocą nowej, ostrej żyletki odetnij duże końce rurki poliimidowej, które wystają z dna otworów wyjściowych kaniuli. Upewnij się, że nacięcie znajduje się dokładnie u podstawy kaniuli, dzięki czemu rurki i dno kaniuli są ze sobą zlicowane.
    8. Za pomocą ostrych nożyczek przeciąć dużą rurkę poliimidową tuż nad krawędzią wewnętrznej krawędzi korpusu napędu pod kątem ~45°.
  4. Ładowanie zmontowanych niestandardowych ( Rysunek 2E)
    1. Wkręć każdą zmontowaną niestandardową w zewnętrzne otwory korpusu mikronapędu. Upewnij się, że śrubowy słupek prowadzący przechodzi przez duży otwór w mocowaniach śrubowych. Przesuń każdą do końca, aż przestanie się przesuwać. Zaleca się wstępne nasmarowanie olejem mineralnym lub smarem do osi.
    2. Za pomocą niezwykle ostrych nożyczek pokrój małe rurki poliimidowe (średnica zewnętrzna: 0,1397 mm, średnica wewnętrzna: 0,1016) na odcinki o długości ~4 cm.
    3. Przełóż małe odcinki poliimidu przez duże rurki poliimidowe już zamontowane w mikronapędzie. Upewnij się, że nadmiar małych rurek poliimidowych wystaje z góry i z dołu każdej dużej rurki poliimidowej.
    4. Przymocuj małe rurki poliimidowe do za pomocą cyjanoakrylanu, uważając, aby cyjanoakrylan nie dostał się ani do dużych, ani do małych rurek poliimidowych.
    5. Za pomocą nowej, ostrej żyletki odetnij małe końce rurki poliimidowej, które wystają z dna otworów kaniuli. Upewnij się, że nacięcie znajduje się dokładnie u podstawy kaniuli i że nacięcie jest czyste, a nic nie blokuje otworu rurki poliimidowej.
    6. Za pomocą ostrych nożyczek odetnij górną część małego poliimidu kilka milimetrów powyżej górnej części mocowania śrubowego pod kątem ~45°. Upewnij się, że cięcie jest czyste, a nic nie blokuje otworu rurki poliimidowej.
  5. Ładowanie tetrod
    1. Przygotuj tetrody (o długości ~6 cm) przy użyciu wcześniej opisanych metod31.
    2. Za pomocą kleszczyków z ceramiczną lub gumową końcówką ostrożnie przełóż tetrodę przez jedną z małych rurek poliimidowych, pozostawiając ~2 cm wystające z górnej części małej rurki poliimidowej.
    3. Przymocuj tetrodę do górnej części małej rurki poliimidowej za pomocą ciekłego cyjanoakrylanu, uważając, aby nie łączyć ze sobą małych i dużych probówek poliimidowych w tym procesie.
    4. Cofnij, aż znajdzie się w pobliżu górnej części napędu.
    5. Chwyć drut tetrodowy wystający z dolnej części napędu i delikatnie zagnij go w miejscu, w którym wyłania się z kaniuli.
    6. Wsuń całkowicie z powrotem do napędu.
    7. Za pomocą bardzo ostrych nożyczek przetnij drut tetrody tuż nad załamaniem. Pod mikroskopem upewnij się, że cięcie jest czyste i że metal wszystkich czterech tetrod jest odsłonięty.
    8. Cofnij, aż tetroda zostanie zamocowana w kaniuli.
    9. Powtórz kroki 1.5.2-1.5.8 dla wszystkich.
    10. Przymocuj EIB do platformy nośnej EIB za pomocą małych jubilerskich.
    11. Podłącz każdą elektrodę każdej tetrody do odpowiedniego portu w EIB.
  6. Przygotowanie mikronapędu do zabiegu
    1. Elektrycznie pokryj tetrody, aby zmniejszyć impedancję elektryczną przy użyciu wcześniej opisanych metod31.
    2. Po poszyciu upewnij się, że każda tetroda jest umieszczona w kaniuli w taki sposób, aby końcówka tetrody była zlicowana z dnem każdego otworu kaniuli.
    3. Przesuń stożek mikronapędu wokół gotowego mikronapędu. Przymocuj pokrywę mikronapędu do stożka mikronapędu, wsuwając drążek mocujący stożek do portu pokrywy.
    4. Ustaw stożek tak, aby złącza EIB swobodnie przechodziły przez otwory przepustowe połączenia EIB, gdy pokrywa jest zamknięta, i przyklej stożek cyjanoakrylanem umieszczonym wokół podstawy stożka, uważając, aby cyjanoakrylan nie dostał się do żadnego z otworów wyjściowych kaniuli. Zdejmij pokrywę.
    5. Ostrożnie wypełnij każdy otwór kaniuli sterylnym olejem mineralnym, aby zapobiec przedostawaniu się płynów ustrojowych do otworów poliimidowych po implantacji chirurgicznej.
    6. Ostrożnie pokryj podstawę kaniuli sterylną wazeliną. Będzie to służyć jako bariera zapobiegająca przedostawaniu się środków chemicznych (np. cementu dentystycznego) do odsłoniętego mózgu podczas operacji.
    7. Zważ w pełni zmontowany mikronapęd, pokrywę i cztery kostne, aby przygotować przeciwwagę o równej wadze.
    8. Opcjonalnie, przed operacją, należy wycisnąć tetrody na odległość odpowiednią do dotarcia do docelowych obszarów mózgu, gdy napęd jest zlicowany z czaszką.
      UWAGA: Przed wszczepieniem implantu chirurgicznego należy wysterylizować implant poprzez sterylizację gazową w tlenku etylenu (500-1200 mg/L, 2-4 godziny). Wszystkie kostne i narzędzia chirurgiczne należy wysterylizować w autoklawie (121°C, 30 minut).

2. Implantacja chirurgiczna

  1. Znieczulenie myszy i zamontowanie jej w aparacie stereotaktycznym
    1. Umieść mysz w małym pudełku z wystarczającą ilością miejsca do poruszania się i znieczul mysz 3%-4% izofluranem.
      UWAGA: Można stosować inne środki znieczulające, ale należy zachować ostrożność ze względu na wiek, rozmiar i wagę młodocianej myszy.
    2. Gdy mysz przestanie reagować (brak reakcji na szczypanie ogona, szybkość wentylacji ~60 oddechów na minutę), wyjmij ją z pudełka i szybko zamontuj na aparacie stereotaktycznym.
    3. Szybko umieść maskę stereotaktyczną na pysku myszy i utrzymuj znieczulenie na poziomie 1-3% izofluranu. Przed pierwszym nacięciem chirurgicznym należy zastosować wszelkie zatwierdzone przez weterynarza środki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu (0,05-0,5 mg/kg podskórnie) lub środki przeciwzapalne, takie jak karprofen (5-10 mg/kg podskórnie).
    4. Całkowicie zabezpiecz głowę myszy w aparacie stereotaktycznym za pomocą nauszników. Upewnij się, że czaszka jest wypoziomowana i nieruchoma, bez wywierania niepotrzebnego nacisku na kanały słuchowe myszy. Ze względu na ograniczone kostnienie kości czaszki młodocianych możliwe jest spowodowanie trwałego uszkodzenia podczas fiksacji głowy.
  2. Przygotowanie myszy do operacji i odsłonięcie czaszki
    1. Chroń oczy myszy, umieszczając niewielką ilość syntetycznego żelu łzowego na każdym oku i przykrywając każde oko autoklawowanym plastrem folii.
      UWAGA: Syntetyczne łzy utrzymają nawilżenie oczu, a folia zapobiegnie długotrwałym uszkodzeniom przez jakiekolwiek źródło światła. Preferowane są gęstsze syntetyczne roztwory łez, ponieważ mogą one również służyć jako bariera przed przypadkowym wprowadzeniem innych potencjalnie toksycznych roztworów chirurgicznych (etanol, akryl dentystyczny itp.) do oczu.
    2. Za pomocą sterylnych wacików z bawełnianą końcówką nałóż krem do depilacji na obszar operacyjny, aby usunąć włosy ze skóry głowy. Uważaj, aby krem nie znalazł się w pobliżu oczu. Po usunięciu włosów umieść sterylną serwetkę na skórze głowy, aby zabezpieczyć obszar operacyjny.
    3. Za pomocą sterylnych wacików z bawełnianą końcówką oczyść skórę głowy przez trzy kolejne płukania roztworem jodu powidonu (10%), a następnie alkoholem izopropylowym (100%).
    4. Za pomocą sterylnego skalpela lub cienkich nożyczek usuń skórę głowy.
    5. Za pomocą sterylnych wacików z bawełnianą końcówką i sterylnych roztworów roztworu soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i nadtlenku wodoru dokładnie oczyść czaszkę.
    6. Zidentyfikuj bregmę i za pomocą aparatu stereotaktycznego ostrożnie zaznacz docelowe miejsca nagrania na czaszce trwałym markerem.
  3. Otwieranie otworu kaniuli i mocowanie kotew kostnych
    1. Usuń czaszkę pokrywającą miejsca nagrywania. # Ze względu na cienkość czaszki w tym wieku, przetnij czaszkę ostrzem skalpela; Eliminuje to konieczność używania wiertła, które może uszkodzić leżącą pod spodem oponę twardą. Utrzymuj odsłoniętą oponę twardą w wilgoci po zastosowaniu sterylnego roztworu soli fizjologicznej (0,9% NaCl) lub sterylnego oleju mineralnego. Nie usuwaj ani nie nakłuwaj opony twardej na tym etapie, ponieważ jest ona wystarczająco cienka u młodych myszy, aby tetrody mogły przejść w przyszłych krokach.
    2. Ostrożnie wywierć otwory prowadzące na cztery kostne.
      1. Umieść kostne w skrajnych bocznych i rostralnych lub ogonowych częściach czaszki, gdzie kość jest najgrubsza, a kostne znajdują się wystarczająco daleko od implantu z mikronapędem. Do kostnych należy używać sterylnych, delikatnych jubilerskich (np. gwint UNM 120, 1,5 mm).
      2. Mocno nawiń jedną kostną cienkim, wysoce przewodzącym drutem, który posłuży jako uziemienie i zostanie przymocowany do EIB w kroku 2.4.6.
    3. Używając ostrza skalpela lub ostrożnie używając wiertła, naciąć czaszkę w pobliżu miejsc, w których znajdują się otwory na kostną. Nacinanie jest ważne, aby zapewnić wystarczająco chropowatą powierzchnię, aby ciekły cyjanoakrylan mógł się związać w kroku 2.3.5.
    4. Za pomocą sterylnego śrubokręta i sterylnego zacisku śrubowego wkręć każdą sterylnej kości na miejsce, uważając, aby nie przebić opony twardej znajdującej się pod spodem.
    5. Za pomocą sterylnej igły 30 G umieść płynny cyjanoakrylan wokół każdej kostnej. To skutecznie pogrubia czaszkę, w której zostały przymocowane kostne. Należy uważać, aby cyjanoakrylan nie dostał się do odsłoniętej opony twardej powyżej miejsc nagrywania.
  4. Opuszczanie i podłączanie mikronapędu (Rysunek 2G)
    1. Zamontuj gotowy mikronapęd na aparacie stereotaktycznym, aby ostrożnie opuścić go na czaszkę myszy. Upewnij się, że kaniula mikronapędu będzie znajdować się w odpowiednich współrzędnych po opuszczeniu.
    2. Opuszczaj mikronapęd powoli, poruszając się tylko w kierunku grzbietowym/brzusznym. Opuścić mikronapęd z tetrodami już wysuniętymi z otworów kaniuli (krok 1.6.6), aby uwidocznić ich wejście do mózgu; Każdy ruch przyśrodkowy/boczny lub rostralny/ogonowy, gdy tetrody dotykają myszy, może zgiąć tetrody i spowodować, że przegapią one swój ostateczny cel.
    3. Po całkowitym opuszczeniu mikronapędu upewnij się, że podstawa kaniuli styka się z czaszką/oponą twardą. Warstwa wazeliny i/lub oleju mineralnego posłuży jako bariera do pokrycia odsłoniętej opony twardej. W razie potrzeby dodaj sterylną wazelinę lub sterylny wosk kostny, aby pokryć nadmiar odsłoniętej opony twardej.
    4. Trzymając mikronapęd na miejscu za pomocą aparatu stereotaktycznego, pokryj czaszkę cementem dentystycznym, aby przymocować podstawę mikronapędu do wszczepionych kostnych.
      UWAGA: Cement dentystyczny powinien całkowicie obejmować wszystkie kostne i powinien zakrywać półkę kotwiącą cementu dentystycznego na kaniuli mikronapędu.
    5. Podczas gdy cement dentystyczny twardnieje, ostrożnie go ukształtuj, aby zapobiec ostrym rogom lub krawędziom, które mogą uszkodzić mysz lub uszkodzić mikronapęd. Upewnij się, że jest wystarczająca ilość cementu dentystycznego, aby utrzymać mikronapęd, ale wyeliminuj nadmiar cementu dentystycznego, który niepotrzebnie zwiększy ciężar.
    6. Ostrożnie przeciągnij przewód uziemiający przez mikronapęd i podłącz go do odpowiedniego gniazda w EIB.
    7. Gdy cement dentystyczny jest w pełni osadzony, ostrożnie odłącz mikronapęd od aparatu stereotaktycznego. Umieść pokrywę na mikronapędzie.
    8. Za pomocą sterylnego wacika z bawełnianą końcówką i sterylnego roztworu soli fizjologicznej wyczyść mysz.
    9. Za pomocą sterylnego wacika z bawełnianą końcówką nałóż cienką warstwę maści z antybiotykiem na odsłoniętą skórę głowy w pobliżu miejsca implantacji.
    10. Usuń folię z oczu myszy.
    11. Wyjmij mysz z aparatu stereotaktycznego, uważając, aby utrzymać dodatkowy ciężar mikronapędu podczas transportu myszy do czystej klatki.

3. Rekonwalescencja pooperacyjna

  1. Natychmiastowa rekonwalescencja
    1. Przed zabiegiem należy przygotować system przeciwwagi, podłączając rurę PVC o średnicy 0,75 cala, jak pokazano na rysunku Rysunek 2G. Jedno ramię systemu przechodzi przez otwory wywiercone w pokrywie klatki, drugie ramię spoczywa na pokrywie klatki, a trzecie ramię wystaje ponad i poza klatkę. Najwyższe ramię jest zakryte.
    2. Ostrożnie przymocuj mikronapęd do układu przeciwwagi (Rysunek 2G-I) i użyj ciężarka przeciwwagi identycznego z wagą mikronapędu i kostnych. Poprowadź mocną nić lub żyłkę wędkarską od łącznika przymocowanego do EIB przez trzy ramiona systemu przeciwwagi do ciężarka przeciwwagi, który wisi nad najwyższym ramieniem.
    3. Upewnij się, że przeciwwaga jest silnie połączona z EIB mikronapędu i że jest wystarczająca linia, aby zapewnić myszowi pełny dostęp do całej klatki.
    4. Zapewnij bogaty w składniki odżywcze żel w klatce wraz z wilgotną, normalną karmą dla gryzoni, aby zapewnić nawodnienie i regenerację.
    5. Monitoruj mysz, aż w pełni wyzdrowieje po znieczuleniu chirurgicznym.
  2. Długotrwała rekonwalescencja
    1. Przez cały czas, gdy nie jest podłączony do urządzenia rejestrującego, należy upewnić się, że mikronapęd jest obsługiwany przez układ przeciwwagi. Z czasem zmniejsz przeciwwagę, ale nigdy nie usuwaj jej całkowicie, aby uniknąć nieoczekiwanego naprężenia myszy lub momentu obrotowego kostnych.
    2. Aby zapobiec uszkodzeniu implantu i systemu przeciwwagi, mysz powinna być trzymana bez możliwości bezpośredniej interakcji z innymi myszami na czas trwania eksperymentu.
    3. Dostarczaj bogaty w składniki odżywcze żel przez co najmniej 3 dni po zabiegu, w którym to momencie wystarczy sam pokarm stały.
      1. Ze względu na wymagania dotyczące napowietrznych systemu przeciwwagi, nie podawaj jedzenia i wody w napowietrznej siatce drucianej; umieść żywność na podłodze klatki i dostarczaj wodę przez bok klatki. Aby zapobiec zepsuciu, żywność należy wymieniać całkowicie codziennie.
    4. Codziennie upewnij się, że mysz ma swobodny dostęp do całej klatki i że przeciwwaga jest solidnie i mocno przymocowana do mikronapędu.

Wyniki

Opisany powyżej protokół został wykorzystany do jednoczesnej rejestracji sygnałów lokalnych potencjałów polowych oraz pojedynczych jednostek z wielu obszarów mózgu u myszy, przy czym codzienne pomiary przeprowadzano u tych samych osobników od p20 do p60. Przedstawiono tutaj reprezentatywne rejestracje elektrofizjologiczne z dwóch myszy oraz histologię poeksperymentalną potwierdzającą końcowe lokalizacje rejestracji.

Chirurgiczna implantacja mikro-napędu u myszy p20
Mikro-napęd (Rysunek 1) został skonstruowany (Rysunek 2) i chirurgicznie zaimplantowany myszy p20 zgodnie z powyższym opisem. Bezpośrednio po operacji mysz przymocowano do systemu przeciwwagi (Rysunek 2G-I) i pozostawiono do rekonwalescencji. Po odzyskaniu przez mysz pełnej mobilności, mikro-napęd podłączono do systemu rejestracji elektrofizjologicznej in vivo. Kable łączące mikro-napęd z urządzeniem rejestrującym zawieszono nad myszą. Rejestracje elektrofizjologiczne (32 kHz) uzyskano we wszystkich kanałach przez 1 h, podczas gdy mysz przejawiała naturalne zachowania w swojej klatce domowej. Po zakończeniu rejestracji mysz odłączono od systemu rejestracji, ponownie przymocowano do systemu przeciwwagi i zwrócono do wiwarium z wolnym dostępem do wody i karmy.

Codzienne rejestrowanie aktywności neuronalnej
Rejestracje elektrofizjologiczne przeprowadzano codziennie przez kilka tygodni, aby umożliwić chroniczny monitoring tego samego obszaru mózgu w krytycznych oknach rozwojowych od p20 do p60. Przykładowe surowe potencjały polowe (LFP) z chronicznych rejestracji przedstawiono na rysunku 3A,C. Jednostki pojedyncze izolowano jednocześnie z wielu tetrod (rysunek 3B). Jednostki o podobnych kształtach fal zidentyfikowano w ciągu wielu dni (rysunek 3B, środek i prawo), jednak ze względu na potencjalny dryf elektrody rejestrującej nie można było jednoznacznie stwierdzić, że w poszczególne dni identyfikowano tę samą jednostkę. U osobnej myszy, u której implantację wykonano w p20 i u której prowadzono codzienne rejestracje przez kilka tygodni, badano aktywność neuronalną za pomocą tetrody skierowanej na grzbietową część obszaru CA1. Każdego dnia rejestracji zidentyfikowano ripple o dużej amplitudzie oraz dobrze odizolowane jednostki pojedyncze (rysunek 4). Dane te wskazują, że stabilne, wysokiej jakości rejestracje elektrofizjologiczne in vivo mogą być prowadzone u tej samej myszy w trakcie wczesnego rozwoju.

Histologiczne potwierdzenie miejsc rejestracji oraz wpływ przewlekłej implantacji na rozwój
Po ostatnim dniu rejestracji mysz została poddana głębokiej anestezji poprzez zastosowano znieczulenie izofluranem, po którym nastąpił wstrzyknięcie śmiertelnej dawki pentobarbitalu sodowego, a następnie przez końcówki elektrod przepuszczono prąd w celu utworzenia niewielkich uszkodzeń w miejscach rejestracji. Posteksperymentalne przygotowanie skrawków histologicznych mózgu myszy pozwoliło na wizualizację końcowych miejsc rejestracji (Rysunek 5A,B). W oddzielnej kohorcie trzem samcom i trzem samicom myszy w 20. dniu postnatalnym (p20) dokonano implantacji chirurgicznej zgodnie z powyższym opisem. Równą liczbę myszy z tych samych miotów pozostawiono bez implantów i utrzymywano w identycznych warunkach bytowych. Myszy uśmiercono w 62. dniu postnatalnym (p62, co odpowiadało 6 tygodniom po operacji w kohorcie z implantami). Czaszki starannie oczyszczono, a następnie dokonano pomiarów zewnętrznych odległości od bregmy do lambdy (Rysunek 5C, góra po lewej) oraz zewnętrzna maksymalna szerokość czaszki na poziomie lambda (Rycina 5C, góra po prawej). Wzdłuż linii środkowej czaszki wykonano nacięcie, a następnie usunięto połowę czaszki, aby wyciąć mózg w celu pomiaru jego masy (Rycina 5C, prawy dolny róg). Wysokość jamy czaszki na poziomie bregmy zmierzono w nienaruszonej połowie czaszki (Rysunek 5C, lewy dolny róg). Żaden z parametrów nie różnił się istotnie statystycznie między kohortą z implantami a kohortą bez implantów (test sum rang Wilcoxona), co wskazuje, że długoterminowa implantacja rozpoczynąca się w dniu p20 nie wywiera znaczącego wpływu na naturalny rozwój czaszki ani objętość mózgu.

Schematy zestawu mikronapędu; anatomia części, otwory na śruby, połączenia EIB dla układów neuronowych.
Rysunek 1: Komponenty mikronapędu. Trójwymiarowe rendery (A) korpusu mikronapędu, (B) kaniuli, (C) stożka, (D) pokrywy, (E) mocowań śrubowych oraz (F) śruby posuwającej tetrodę. Wskazano kluczowe cechy każdego komponentu. Szczegóły pomiarowe można pobrać z plików modelu dostępnych pod adresem https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive/. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Technika druku 3D w mikro-skali; wyraźne struktury form i precyzyjne wstawienie igieł do mikroprzepływów.
Rycina 2: Konstrukcja mikropopychacza. (A) Widok z boku i (B) widok z góry śruby przesuwającej tetrodę z podłączonymi górnym i dolnym mocowaniem śruby. (C) Widok z boku i (D) widok z góry mikropopychacza z przymocowanym korpusem i kaniulą, z dużą rurką polimidową przebiegającą przez każdy otwór kaniuli i przyciętą do dolnej krawędzi kaniuli. (E) Widok z boku mikropopychacza z zamontowanymi śrubami i małymi rurkami polimidowymi. Górne końce małych rurek polimidowych są przycinane bezpośrednio przed załadowaniem tetrody. (F) Gotowy mikropopychacz przymocowany do aparatu stereotaktycznego. Stożek ochronny, który normalnie otacza mikropopychacz, został usunięty w celu lepszej wizualizacji. Należy zauważyć, że niektóre mocowania śrub w tym mikropopychaczu zostały wydrukowane z czarnej żywicy. (G) System wsparcia przeciwwagi. (H) Widok z boku i (I) widok z góry klatki dla myszy z przymocowanym systemem wsparcia przeciwwagi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dane elektrofizjologiczne, kształty fal LFP, obszary CA1 i CA3, szeregi czasowe, analiza aktywności neuronalnej.
Rycina 3: Reprezentatywne zapisy elektrofizjologiczne. Myszy w 20. dniu postnatalnym (p20) wszczepiono mikroprzesuwnik zgodnie z powyższym opisem. Od 21. dnia (p21) i codziennie przez kolejne 2 tygodnie mysz podłączano do aparatury rejestrującej i zapisywano aktywność neuronalną przez co najmniej 1 h. (A) Surowe zapisy lokalnego potencjału polowego (LFP) z obustronnej (L = lewa; R = prawa) przedniej kory zakrętu obręczy (ACC), obszaru CA3 hipokampa (CA3) oraz obszaru CA1 hipokampa (CA1). Dane zbierano codziennie; dla przejrzystości wyświetlono dane tylko z dni nieparzystych. Wszystkie zapisy wykonano podczas okresów bezruchu w klatce domowej. Pasek skali: 1 mV, 2 s. (B) Reprezentatywne pojedyncze jednostki wyizolowane z obszaru CA3 hipokampa (lewo) i CA1 (prawo) dla zapisów przedstawionych w panelu A. Wszystkie surowe kształty fal na każdej elektrodzie są pokazane na czarno; średnia jest zaznaczona na czerwono. Pasek skali: 50 µV, 0,2 ms. (C) Reprezentatywne surowe ślady LFP dla każdego 10. dnia aż do końcowego dnia rejestracji w p60 dla drugiej myszy, której implantację przeprowadzono w p20. Dane zbierano codziennie; dla przejrzystości wyświetlono dane tylko z każdego 10. dnia. Wszystkie ślady wykonano podczas okresów bezruchu w klatce domowej. Pasek skali: 1 mV, 2 s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza sygnałów neuronalnych; wykres EEG, wzorce kształtu fali, wiek p21-p40, wykres autokorelogramu.
Rysunek 4. Stabilność rejestracji chronicznych. Myszy p20 zaimplantowano mikro-napęd (micro-drive), zgodnie z powyższym opisem. Począwszy od p21 i następnie przez 4 tygodnie, mysz była podłączana do aparatury rejestrującej, a aktywność neuronalna była rejestrowana przez co najmniej 1 h. Przedstawiono dane z tetrod skierowanych na grzbietową część obszaru CA1 hipokampa. (A) Surowe (góra) i przefiltrowane pod kątem ripples (dół) LFP dla zidentyfikowanych zdarzeń ripple w dniach p21, p30 i p40. W celu identyfikacji zdarzeń ripple, surowe LFP poddano filtracji pasmowo-przepustowej w zakresie od 125 Hz do 300 Hz, a zdarzenia ripple zidentyfikowano jako przejściowe wzrosty mocy w pasmie ripple przekraczające średnią o więcej niż 3 odchylenia standardowe. Początek i koniec każdego ripple zdefiniowano jako punkt, w którym moc pasma ripple powróciła do wartości średniej. Zidentyfikowane ripples zaznaczono na czerwono. Pasek skali: 100 ms, od góry do dołu: 1,000 µV, 140 µV, 1,800 µV, 180 µV, 9,000 µV, 1,200 µV, 10,000 µV, 1,000 µV. (B) Reprezentatywna pojedyncza jednostka (single unit) z każdego dnia z tetrody skierowanej na CA1 dla rejestracji przedstawionych na panelu A. Wszystkie surowe kształty fal na każdej elektrodzie pokazano na czarno; średnia jest zaznaczona na czerwono. Pasek skali 0.2 ms, od góry do dołu: 50 µV, 100 µV, 100 µV. (C) Autokorelogram wszystkich kolców dla pojedynczych jednostek z panelu B. Dane te wykazują stabilne rozmieszczenie elektrod w warstwie piramidowej hipokampa w ciągu kilku tygodni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Histologia morfologii mózgu z wykresami słupkowymi statystycznymi; ocena wpływu implantów na parametry czaszki.
Rycina 5: Reprezentatywna histologia i wpływ na rozwój czaszki. Myszy p20 zaimplantowano mikro-napęd, zgodnie z powyższym opisem. Po ostatnim dniu rejestracji w dniu p60, w miejscach rejestracji wywołano uszkodzenia elektrolityczne, a mózg perfumowano 4% paraformaldehydem. W celu zidentyfikowania miejsc rejestracji wykonano przekroje o grubości 50 µm. (A) Uszkodzenia w obszarach CA1 i CA3 hipokampa. Grot strzałki oznacza miejsce rejestracji w CA3; podwójny grot strzałki oznacza miejsce rejestracji w CA1. Pasek skali: 0.5 mm. (B) Uszkodzenia w obustronnym ACC. Groty strzałek oznaczają miejsca rejestracji w ACC. Pasek skali: 0.5 mm. (C) Pomiary wielkości czaszki i masy mózgu myszy p62 zaimplantowanych mikro-napędem w dniu p20 (szary) oraz niezaimplantowanych myszy z tego samego miotu (biały). Dla każdego pomiaru podano wartość p z testu suma rang Wilcoxona. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Nowoczesne eksperymenty badające in vivo funkcję obwodów nerwowych u gryzoni często wykorzystują elektrofizjologię zewnątrzkomórkową za pomocą elektrod wszczepionych na stałe do monitorowania aktywności pojedynczych neuronów (tj. pojedynczych jednostek) lub lokalnych populacji (za pomocą lokalnych potencjałów pola, LFP), ale takie metody są rzadko stosowane u młodych myszy ze względu na wyzwania techniczne. Niniejszy manuskrypt opisuje metodę uzyskiwania zapisów elektrofizjologicznych in vivo u myszy w krytycznych rozwojowo oknach od p20 do p60 i dalej. Metodologia ta obejmuje proces produkcyjny do drukowania i konstruowania implantu z mikronapędem, procedurę implantacji chirurgicznej oraz strategię rekonwalescencji po operacji, z których wszystkie są specjalnie dostosowane do stosowania u młodych myszy. Na opracowanie tego protokołu wpłynęło kilka czynników, w tym mały rozmiar i względna słabość młodych myszy w porównaniu z ich dorosłymi odpowiednikami, a także zmniejszone kostnienie czaszki młodocianych myszy, do których trzeba było przymocować mikronapęd.

Dwie podstawowe metody powszechnie stosowane do wykonywania elektrofizjologii in vivo to matryce elektrod (np. tetrody) i sondy krzemowe. Sondy krzemowe są lekkie, mogą zapewnić dużą liczbę miejsc rejestracji na jednostkę masy i były wcześniej stosowane u młodych szczurów25. Jednak sondy krzemowe są stosunkowo drogie w przeliczeniu na jednostkę. W przeciwieństwie do tego, mikronapęd opisany w tym manuskrypcie może być zbudowany przy użyciu surowców za mniej niż 50 USD, co czyni go opłacalną opcją do nagrywania in vivo . Ponadto sondy krzemowe muszą być często umieszczane w stałych liniach, co uniemożliwia rejestrowanie przestrzennie zróżnicowanych obszarów mózgu. W przeciwieństwie do tego, konstrukcja mikronapędu opisana w tym manuskrypcie wykorzystuje niezależnie regulowane tetrody, aby pomieścić jednoczesne nagrania w maksymalnie 16 różnych lokalizacjach, praktycznie bez ograniczeń dotyczących relacji przestrzennych między tymi lokalizacjami. Tę konstrukcję mikronapędu można łatwo zmodyfikować, aby umożliwić celowanie w inne lokalizacje niż opisane tutaj, przesuwając wytłoczenia otworu kaniuli do dowolnej pożądanej lokalizacji przedniej/tylnej i przyśrodkowej/dystalnej. Celując w alternatywne obszary mózgu, ważne jest, aby pamiętać, że chociaż tetrody często poruszają się prosto, możliwe jest, że te cienkie druty lekko się ugięją, gdy wychodzą z kaniuli mikronapędu. Tak więc, im mniejszy lub bardziej brzuszny jest obszar mózgu, tym trudniej będzie skutecznie celować w ten obszar za pomocą tetrod.

Implant mikronapędu opisany w tym manuskrypcie jest zasadniczo podobny do kilku wcześniejszych projektów mikronapędów opartych na tetrodach 23,32,33,34,35 w tym, że poszczególne tetrody są przymocowane do, co pozwala na precyzyjną kontrolę głębokości zapisu każdej tetrody. Podczas gdy kilka cech obecnego projektu mikronapędów jest unikalnych, w tym łatwość celowania w przestrzennie rozmieszczone obszary mózgu, główną nowością obecnego manuskryptu jest opis chirurgicznej implantacji i strategii rekonwalescencji po operacji, które pozwalają na przewlekłe badania aktywności sieci u wciąż rozwijających się młodych myszy. Rzeczywiście, opisane tutaj metodologie chirurgii i rekonwalescencji można dostosować do obsługi innych implantów u młodych myszy.

Aby utrzymać spójny zapis przez wiele dni, druty lub sondy muszą być sztywno przymocowane do czaszki. Podczas gdy ogólna struktura czaszki myszy ulega tylko niewielkim zmianom po p20, czaszka znacznie pogrubia się w wieku p20 i p4536. Rzeczywiście, czaszka na p20 nie jest wystarczająco sztywna, aby utrzymać przymocowany implant bez uszkodzenia. Aby przezwyciężyć to biologiczne ograniczenie, protokół ten sztucznie pogrubia czaszkę za pomocą cyjanoakrylanu podczas operacji implantacji. Implantacja u myszy młodszych niż p20 jest prawdopodobnie możliwa przy użyciu tej strategii, ale czaszka myszy ulega znacznym zmianom rozmiaru i kształtu do około p2036. W związku z tym implantacja przez dłuższy czas u myszy młodszych niż p20 nie jest zalecana, ponieważ cyjanoakrylan i stałe kostne w wciąż rozwijającej się czaszce mogą znacząco wpływać na naturalny wzrost czaszki i rozwój leżącej u jej podstaw tkanki mózgowej. Co ważne, w tym badaniu nie zaobserwowano wpływu na ogólne wymiary czaszki lub wielkości mózgu po przewlekłej implantacji rozpoczynającej się od p20 (ryc. 5C).

Krytycznym krokiem w metodzie opisanej w tym manuskrypcie jest strategia rekonwalescencji po operacji; Zgodnie z tą strategią, ciężar implantu powinien być stale równoważony w miarę dojrzewania myszy i rozwoju układu mięśniowego i mięśniowo-szkieletowego. Wcześnie po implantacji myszy nie są w stanie skutecznie udźwignąć ciężaru implantu bez przeciwwagi, co prowadzi do niedożywienia i odwodnienia, ponieważ mysz nie może odpowiednio dotrzeć do źródeł pożywienia i wody w klatce. System przeciwwagi jest łatwy i niedrogi w budowie, prosty do wdrożenia i pozwala myszom w każdym wieku implantowalnym swobodnie eksplorować całą klatkę domową, zapewniając w ten sposób odpowiednie odżywianie i nawodnienie. Wraz z wiekiem myszy ilość przeciwwagi może być zmniejszana, aż będzie można ją całkowicie usunąć u dorosłych myszy; Jednakże zaleca się dalsze stosowanie systemu przeciwwagi przez cały czas trwania eksperymentu, z dołączoną co najmniej nominalną przeciwwagą przez cały czas. Podczas gdy dorosła mysz może być w stanie z czasem udźwignąć rozmiar i ciężar mikronapędu, ciągły naturalny ruch podczas swobodnego zachowania bez poprawiającej przeciwwagi wytwarza moment obrotowy i siłę ścinającą na kostnych, które zakotwiczają mikronapęd w czaszce, co zwiększa prawdopodobieństwo odłączenia się, zwłaszcza podczas dłuższych, przewlekłych eksperymentów.

W niniejszym badaniu należy zwrócić uwagę na dwa ważne ograniczenia. Po pierwsze, aby ocenić wpływ implantacji w p20 na rozwój czaszki i mózgu, kilka kohort myszy zostało uśmierconych po długotrwałej implantacji (Figura 5C). Chociaż analizy te nie wykazały znaczącego wpływu implantacji na rozmiar jamy czaszki lub masę mózgu (Figura 5C), w obecnym badaniu nie zbadano rozmiaru czaszki ani masy mózgu w wielu punktach czasowych we wczesnym okresie rozwojowym p20-p60. Podczas gdy wcześniejsze prace pokazują, że rozwój jamy mózgowej jest zakończony przez p2036, możliwe jest, że implantacja w tym wczesnym oknie może powodować nieoczekiwane zmiany, które są korygowane lub kompensowane przez wiek dorosłych, który był tutaj oceniany. Po drugie, eksperymenty, które dostarczyły danych elektrofizjologicznych pokazanych na rysunku 3 i rysunku 4 , nie były zaprojektowane tak, aby zmaksymalizować wydajność komórek. Tak więc, chociaż przedstawione tutaj dane wskazują na stabilne, przewlekłe zapisy i dobrze izolowane pojedyncze jednostki, nie należy ich traktować jako reprezentatywnych dla maksymalnej potencjalnej wydajności dla tego urządzenia.

Wiele zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych u ludzi objawia się we wczesnych okresach rozwoju lub w okresie dojrzewania, w tym autyzm i schizofrenia. Jednak niewiele wiadomo na temat dysfunkcji na poziomie obwodu, która może leżeć u podstaw tych chorób, pomimo mnóstwa dostępnych modeli myszy. Identyfikacja tych początkowych zmian w sieci ma kluczowe znaczenie dla tworzenia strategii wczesnego wykrywania i paradygmatów leczenia. Jednak ze względu na wyzwania techniczne nie jest jasne, w jaki sposób funkcja sieci jest zakłócana w rozwoju mysich modeli chorób neuropsychiatrycznych. Opisana tutaj strategia mikronapędu i odzyskiwania ma na celu wspieranie badań nad rozwojem wieloregionalnej sieci mózgowej w mózgu myszy, a tym samym umożliwienie naukowcom pomiaru zdrowego rozwoju mózgu, a także identyfikacji zmian w tym rozwoju w mysich modelach choroby.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health R01 NS104829 (B.E.P.), R01 MH117149 (L.J.V.) i F99NS12053 (L.D.Q.) oraz UT Southwestern GSO Endowment Award (R.J.P. i L.D.Q.). Autorzy dziękują Jenny Scaria (Texas Tech University, Health Sciences Center, School of Pharmacy) za pomoc techniczną oraz dr Brendonowi Watsonowi (University of Michigan) za sugestie metodologiczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Diody LED do śledzenia wideo 10 VNeuralynxHS-LED-Red/Green-omni-10VDo użytku z przedwzmacniaczami headstage, które zawierają gniazda LED do śledzenia ruchu
Płyta 16TT EIBNeuralynxEIB-36-16TTElektroniczna płytka interfejsu - złącze omnetyczne
Przedwzmacniacz czołowy 16TTNeuralynxHS-36-LEDWzmacniacz sygnału Omnetics 44 gniazdo pomiędzy płytą EIB a tether do zastosowań nagraniowych; zawiera złącza do diod LED sceny czołowej do śledzenia ruchu
Drobno zakrzywiony hemostat
Śruba kotwiąca kostnaStoelting51457Służy do mocowania płyty EIB do korpusu napędu głównego
BurpenorphineZooPharm Lot#BERLAB0.5-221207ilość Burpenorfina (0,5 mg/mL) 5mL
Linka mocującaNeuralynxHS-36 Litz TetherLekka linka ekranowana do głowic omnetics; opcje długości 1 m/2 m/3 m/5 m
Carprofen/RimadylBio-ServeMD150-2Pooperacyjny środek przeciwzapalny
Przezroczysta żywica v4FormlabsFLGPGR04Płynna żywica, która jest fotopolimeryzowana przez drukarkę 3D podczas procesu drukowania 3D
Niestandardowa (wahadłowa) śrubaZaawansowana obróbka i oprzyrządowanie, Inc.Niestandardoweobrabiane maszynowo i gwintowane śruby
niestandardowe Akrylowy składnik płynnydentystyczny Materiał protezy Materiał protezyPartia #329801 płyn  składnik materiału protezy (patrz wyżej)
Składnik proszku akrylowegodentystycznego Materiał protezy TeetsParti# 583987"zimnoutwardzany" materiał do protez, metakrylan metylu; zmieszany ze składnikiem płynnym do aplikacji w celu zabezpieczenia urządzenia rejestrującego na miejscu
DietGel BoostClearH2O72-04-5022Wysokokaloryczny suplement diety dla młodych/rekonwalescencyjnych myszy
Digital Lynx 16SXNeuralynxDigitalLynx 16SX Base Głównyaparat nagrywający z 16 gniazdami na kartę combo dla maksymalnie 512 kanałów nagrywania
Nożyczki do rozgałęziania - ciężkie ostrzaFST14082-09Różne
kleszcze Dumont #5 z powłoką ceramicznąFST11252-50Obsługa tetrody/nawlekanie/przypinanie
Kleszczyki do #5SF DumontFST11252-00Uniwersalne zastosowanie montażowe
Kleszczyki do #5SFDumont FST11252-00Uniwersalne zastosowanie chirurgiczne
Kleszczyki drobnoziarniste Dumont #7 (zakrzywione)FST11274-20Różne
kleszczyki Dumont #7 (zakrzywione)FST11274-20Uniwersalne zastosowanie chirurgiczne
EIB-36 adapter do poszyciaAdapter do poszycia Neuralynx EIB-36Zastosowanie w poszyciu/montażu
Adapter do poszycia EIB-36Adapter do poszycia Neuralynx EIB-36Akcesorium stereotaktyczne do opuszczania napędu na czaszkę podczas operacji
EuthasolVirbac710101Pentobarbital sodowy do eutanazji
Bardzo drobne Nożyczki BonnFST14083-38Różne
Bardzo drobne Kleszcze GraefeFST11150-10Małe kleszcze ząbkowane
Bardzo cienkie kleszcze GraefeFST11150-10Małe kleszcze proste ząbkowane
Cienkie hemostatykiFST13006-12Cienkie hemostatyki
Cienkie nożyczki - CeramaCutFST14958-09Cięcie tetrody
Cienkie nożyczki - ToughCutFST14058-09Różne
Form 3+FormlabsPKG-F3-P-WS-SVC-BASICdo wytwarzania wszystkich drukowanych części/materiałów; stereolitografia o niskiej sile Drukarka 3D (LFS)
Żel super klejLoctite1363589Różne kroki
Kleszcze GraefeFST11049-10Małe kleszcze ząbkowane kątowe
Przewód uziemiającySystemy AMPartia# 582335Goły drut ze stali nierdzewnej, średnica .005", wyżarzany, 100 stóp
Żel do depilacjiOgólny Dostępnyw handluDo przedoperacyjnego usuwania włosów z czubka głowy myszy
OpalarkaDewaltD26960KFuzja tetrody po przędzeniu
Zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowejFST18010-00Do stosowania z woskiem kostnym, jeśli dotyczy
Sterylizator gorących kulekFST18000-45Elektryczne urządzenie do sterylizacji narzędzi do doraźnej sterylizacji narzędzi podczas zabiegów chirurgicznych
IsofluraneCovetrus11695067771Standardowe znieczulenie płynne izofluranem do stosowania w parowniku izofluranu do max 5%
Alkohol izopropylowy 91%OgólnyDostępny w handluDo standardowej procedury sterylizacji przedoperacyjnej
Śruba jubilerska (kostne dla młodych myszy)Dostawa komponentów co.MX-000120-02SFLŚruba maszynowa S / S #000-120 x 1/8 '' z filisterowym, napęd szczelinowy
Nożyczki LaGrangeFST14173-12Różne
duże rurki poliamidoweNordson medicalLot # 13564Rurki poliamidowe - średnica wewnętrzna 0,0071"; średnica zewnętrzna 0,0115"; długość 36"
Płynny super klejLoctite1365882Różne kroki
Micro wiertarkaForedomK.1070K.1070 zestaw mikrosilnika obrotowego o dużej prędkości; ze skrzynką sterowniczą, tuleją zaciskową 3/32", sterownikiem nożnym o zmiennej prędkości, kołyską rękojeści; dopasowany stereotaktycznie; 100– 115 V użyj
Frez Micro Drill (0,5 mm+)FST19007-05/07/09Kraniotomia
Olej mineralnySigmaPcode 1002076577; M5904-500mLRóżne kroki
Olej mineralnySigmaPcode 1002076577; M5904-500mLDo użytku przy otwartych otworach kraniotomii
Miniaturowy śrubokręt płaskiFST30051-10Wkładanie/dokręcanie kostnych
Maść z potrójnym antybiotykiem NeosporinJohnson & Johnson512373700Maść antybiotykowa
Omnetics 44 gniazdo nano złączeNeuralynxNeuralynx część #A70427-801NIESTANDARDOWY PRZEDMIOT - Omnetics 44 gniazdo (żeńskie) dwurzędowe złącze nano z prostą nogą z 2 kołkami prowadzącymi (męskie) do użytku z aparatem przeciwwagi wykonane na zamówienie
Platynowy drut irydowy 10%Cienki drut kalifornijskiMO# M374710Drobny drut nagrywający przędzony w tetrody do użytku podczas nagrywania za pomocą stacji montażowej terody i kołpaka 2.0 (patrz poniżej); POWŁOKA WIĄZANA HML NATRL VG; ROZMIAR .0007 X 200FT
Roztwór do powlekania w kolorze platynowej czerniNeuralynxPlatynowe rozwiązanie do powlekania
Powłoka Dno klatki z poliwęglanuThomas Scientific/Maryland plastics1113M35; nr mfr. E0270Standardowe dno klatki; może być wyposażony w aparat z siatki drucianej na górze, który zawiera karmę + butelkę na wodę dla myszy nieimplantowanych
Górna część klatki z poliwęglanu z mikrofiltrem N10AncareN/AStandardowa górna część klatki do modyfikacji rurą PVC do aparatury przeciwwagi
Jod powidonu 10%OgólnyDostępny w handluDo standardowej procedury sterylizacji przedoperacyjnej
RuraPVC Rura Charlotte N/ A1/2 "x 600 PSI harmonogram 40 biała rura PVC; do użycia/montażu w aparacie przeciwwagi podczas rekonwalescencji myszy
Ostrza skalpela - #4FST10060-00Nacięcie użyj
Rękojeść skalpela - #4 anatomia bruttoFST10060-13Zastosowanie nacięcia
Samotrzymające kleszczyki do trzpieniowych i kostnychFST26100-00Uchwyt do kostnych i uziemiających podczas wkładania do czaszki
Małe szpilki EIBNeuralynxMałe kołkiEIB Mocowanie drutów tetrodowych do płyty EIB
Małe rurki poliamidoweNordson medicalLot # 19102423Rurka poliamidowa - średnica wewnętrzna 0,004''; średnica zewnętrzna 0,0044''; długość 36"
SolidWorksDassault Systèmes, program CAD SolidWorks3D do projektowania mikronapędów
Szpatułka i sondaFST1090-13Aplikator do wazeliny/oleju mineralnego + opcjonalne zastosowanie do doraźnego prostowania tetrody
Nożyczki sprężynowe - 8 mmFST15024-10Nożyczki do nacinania tkanek czaszkowych
Nożyczki sprężynowe - 8 mmFST15024-10Początkowe nacięcia
Kleszcze standardoweFST11000-12Kleszcze duże ząbkowane
Nożyczki chirurgiczne - ostre-FST14001-12Różne
Nożyczki chirurgiczne - ToughCutFST14054-13Różne
stanowiska montażowe tetrodNeuralynxStacja montażowaTetrody Montaż Tetrody
Spinner 2.0Kołpak Tetrode Neuralynx2.0Montaż tetrody
Dwuczęściowy 4200102 epoksydowymarki GorillaRóżne kroki
ilość Burpenorphine ZooPharm (0,5 mg/mL) 5mL proste Drukarka 3D

Bibliografia

  1. Konrad, K., Firk, C., Uhlhaas, P. J. Brain development during adolescence. Deutsches Arzteblatt International. 110 (25), 425-431 (2013).
  2. Silbereis, J. C., Pochareddy, S., Zhu, Y., Li, M., Sestan, N. The cellular and molecular landscapes of the developing human central nervous system. Neuron. 89 (2), 248-268 (2016).
  3. Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Progress in Neurobiology. 106-107, 1-16 (2013).
  4. Volk, L., Chiu, S. -L., Sharma, K., Huganir, R. L. Glutamate synapses in human cognitive disorders. Annual Review of Neuroscience. 38, 127-149 (2015).
  5. Lord, C., et al. Autism spectrum disorder. Nature Reviews Disease Primers. 6, 5(2020).
  6. McCutcheon, R. A., Reis Marques, T., Howes, O. D. Schizophrenia - An overview. JAMA Psychiatry. 77 (2), 201-210 (2020).
  7. Hopfield, J. J. Neural networks and physical systems with emergent collective computational abilities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (8), 2554-2558 (1982).
  8. Heeger, D. J. Theory of cortical function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (8), 1773-1782 (2017).
  9. Pouget, A., Dayan, P., Zemel, R. Information processing with population codes. Nature Reviews Neuroscience. 1, 125-132 (2000).
  10. Averbeck, B. B., Latham, P. E., Pouget, A. Neural correlations, population coding and computation. Nature Reviews Neuroscience. 7 (5), 358-366 (2006).
  11. Bey, A. L., Jiang, Y. -H. Overview of mouse models of autism spectrum disorders. Current Protocols in Pharmacology. 66, 1-26 (2014).
  12. Kazdoba, T. M., et al. Translational mouse models of autism: Advancing toward pharmacological therapeutics. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 28, 1-52 (2016).
  13. Mendoza, M. L., Quigley, L. D., Dunham, T., Volk, L. J. KIBRA regulates activity-induced AMPA receptor expression and synaptic plasticity in an age-dependent manner. iScience. 25 (12), 105623(2022).
  14. Bernardet, M., Crusio, W. E. Fmr1 KO mice as a possible model of autistic features. The Scientific World Journal. 6, 1164-1176 (2006).
  15. Weaving, L. S., Ellaway, C. J., Gécz, J., Christodoulou, J. Rett syndrome: Clinical review and genetic update. Journal of Medical Genetics. 42 (1), 1-7 (2005).
  16. Krawczyk, M., et al. Hippocampal hyperexcitability in fetal alcohol spectrum disorder: Pathological sharp waves and excitatory/inhibitory synaptic imbalance. Experimental Neurology. 280, 70-79 (2016).
  17. Jaramillo, T. C., et al. Altered striatal synaptic function and abnormal behaviour in Shank3 exon4-9 deletion mouse model of autism. Autism Research. 9 (3), 350-375 (2016).
  18. Suh, J., Foster, D. J., Davoudi, H., Wilson, M. A., Tonegawa, S. Impaired hippocampal ripple-associated replay in a mouse model of schizophrenia. Neuron. 80 (2), 484-493 (2013).
  19. Altimus, C., Harrold, J., Jaaro-Peled, H., Sawa, A., Foster, D. J. Disordered ripples are a common feature of genetically distinct mouse models relevant to schizophrenia. Molecular Neuropsychiatry. 1 (1), 52-59 (2015).
  20. Marcotte, E. R., Pearson, D. M., Srivastava, L. K. Animal models of schizophrenia: A critical review. Journal of Psychiatry and Neuroscience. 26 (5), 395-410 (2001).
  21. Makuch, L., et al. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71 (6), 1022-1029 (2011).
  22. Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
  23. Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: Drive fabrication. Journal of Visualized Experiments. (26), e1094(2009).
  24. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
  25. Farooq, U., Dragoi, G. Emergence of preconfigured and plastic time-compressed sequences in early postnatal development. Science. 363 (6423), 168-173 (2019).
  26. Langston, R. F., et al. Development of the spatial representation system in the rat. Science. 328 (5985), 1576-1580 (2010).
  27. Wills, T. J., Cacucci, F., Burgess, N., O'Keefe, J. Development of the hippocampal cognitive map in preweanling rats. Science. 328 (5985), 1573-1576 (2010).
  28. Bjerknes, T. L., Moser, E. I., Moser, M. B. Representation of geometric borders in the developing rat. Neuron. 82 (1), 71-78 (2014).
  29. Bjerknes, T. L., Dagslott, N. C., Moser, E. I., Moser, M. -B. Path integration in place cells of developing rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), E1637-E1646 (2018).
  30. Jansen, N. A., et al. Impaired θ-γ coupling indicates inhibitory dysfunction and seizure risk in a Dravet syndrome mouse model. Journal of Neuroscience. 41 (3), 524-537 (2021).
  31. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: Tetrode assembly. Journal of Visualized Experiments. (26), e1098(2009).
  32. Voigts, J., Siegle, J., Pritchett, D. L., Moore, C. I. The flexDrive: An ultra-light implant for optical control and highly parallel chronic recording of neuronal ensembles in freely moving mice. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 8(2013).
  33. Voigts, J., Newman, J. P., Wilson, M. A., Harnett, M. T. An easy-to-assemble, robust, and lightweight drive implant for chronic tetrode recordings in freely moving animals. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026044(2020).
  34. Guardamagna, M., et al. The Hybrid Drive: A chronic implant device combining tetrode arrays with silicon probes for layer-resolved ensemble electrophysiology in freely moving mice. Journal of Neural Engineering. 19 (3), (2022).
  35. Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
  36. Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, 417(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Elektrofizjologia in vivoimplant mikropopychaczaaktywność sieci mózgowejzaburzenia neurorozwojoweimplantacja elektrodoscylacje theta w hipokampierejestracja pojedynczych jednosteksystem przeciwwagi
Lekki implant napędowy do przewlekłych zapisów tetrody u młodych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.