Test wysiłkowy do oceny funkcjonalnej skuteczności układu sercowo-naczyniowego świni

Summary

Obecny protokół opisuje model testu wysiłkowego na dużych zwierzętach, który ma na celu ocenę funkcjonalnej zdolności układu sercowo-naczyniowego do oceny skuteczności nowych terapii w warunkach przedklinicznych. Jest to porównywalne z klinicznym testem wysiłkowym.

Abstract

Pomimo postępu w leczeniu, choroby układu krążenia są nadal jedną z największych przyczyn śmiertelności i zachorowalności na całym świecie. Angiogeneza terapeutyczna oparta na terapii genowej jest obiecującym podejściem do leczenia pacjentów z istotnymi objawami, pomimo optymalnej terapii farmakologicznej i inwazyjnych procedur. Jednak wiele obiecujących technik terapii genowej układu sercowo-naczyniowego nie spełniło oczekiwań w badaniach klinicznych. Jednym z wyjaśnień jest niezgodność między przedklinicznymi i klinicznymi punktami końcowymi stosowanymi do pomiaru skuteczności. W modelach zwierzęcych nacisk kładziono zwykle na łatwo mierzalne punkty końcowe, takie jak liczba i powierzchnia naczyń włosowatych obliczona na podstawie odcinków histologicznych. Oprócz śmiertelności i zachorowalności, punkty końcowe w badaniach klinicznych są subiektywne, takie jak tolerancja wysiłku fizycznego i jakość życia. Jednak przedkliniczne i kliniczne punkty końcowe prawdopodobnie mierzą różne aspekty stosowanej terapii. Niemniej jednak oba rodzaje punktów końcowych są niezbędne do opracowania skutecznych podejść terapeutycznych. W klinikach głównym celem jest zawsze złagodzenie objawów pacjentów oraz poprawa ich rokowania i jakości życia. Aby uzyskać lepsze dane predykcyjne z badań przedklinicznych, pomiary punktów końcowych muszą być lepiej dopasowane do tych w badaniach klinicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół klinicznie istotnego testu wysiłkowego na bieżni u świń. Badanie to ma na celu: (1) zapewnienie wiarygodnego testu wysiłkowego u świń, który można wykorzystać do oceny bezpieczeństwa i skuteczności funkcjonalnej terapii genowej i innych nowatorskich terapii, oraz (2) lepsze dopasowanie punktów końcowych między badaniami przedklinicznymi i klinicznymi.

Introduction

Przewlekłe choroby układu krążenia są głównymi przyczynami śmiertelności i zachorowalności na całym świecie^1,2. Chociaż obecne metody leczenia są skuteczne w przypadku większości pacjentów, wielu z nich nadal nie może skorzystać z obecnych terapii, na przykład z powodu rozlanej choroby przewlekłej lub chorób współistniejących. Ponadto u niektórych pacjentów objawy sercowe nie są łagodzone przez dostępne metody leczenia, a ich choroba sercowo-naczyniowa postępuje pomimo optymalnej terapii medycznej³. W związku z tym istnieje wyraźna potrzeba opracowania nowych opcji leczenia ciężkich chorób sercowo-naczyniowych.

W ciągu ostatnich kilku lat odkryto nowe szlaki molekularne i sposoby manipulowania tymi celami, dzięki czemu terapia genowa, terapia komórkowa i inne nowatorskie terapie stały się realistyczną opcją leczenia ciężkich chorób sercowo-naczyniowych⁴. Jednak po obiecujących wynikach przedklinicznych, wiele zastosowań sercowo-naczyniowych nie spełniło oczekiwań w badaniach klinicznych. Pomimo słabej skuteczności w badaniach klinicznych, w kilku badaniach ustalono dobre profile bezpieczeństwa nowych terapii5^,6,7,8,9. W związku z tym wprowadzenie nowych terapii sercowo-naczyniowych dla pacjentów będzie wymagało ulepszonego podejścia i lepszych modeli przedklinicznych, warunków badań i punktów końcowych w badaniach przedklinicznych, które mogą przewidzieć skuteczność kliniczną.

W modelach zwierzęcych nacisk kładziono zazwyczaj na łatwo mierzalne punkty końcowe, takie jak liczba i powierzchnia naczyń włosowatych obliczona na podstawie wycinków histologicznych lub parametry z obrazowania lewej komory w spoczynku i pod wpływem stresu farmakologicznego. W badaniach klinicznych wiele punktów końcowych było bardziej subiektywnych, takich jak tolerancja wysiłku fizycznego lub łagodzenie objawów⁴. W związku z tym prawdopodobne jest, że punkty końcowe w badaniach przedklinicznych i próbach klinicznych mierzą różne aspekty stosowanej terapii. Na przykład wzrost liczby naczyń krwionośnych nie zawsze koreluje z lepszą perfuzją, czynnością serca lub tolerancją wysiłku. Niemniej jednak, oba typy punktów końcowych są wymagane do opracowania skutecznych podejść terapeutycznych¹⁰. Jednak głównym celem jest zawsze złagodzenie objawów oraz poprawa rokowania i jakości życia pacjenta. Aby to osiągnąć, pomiary punktów końcowych muszą być lepiej dopasowane między badaniami przedklinicznymi i klinicznymi⁴.

Sprawność krążeniowo-oddechowa odzwierciedla zdolność układu krążenia i oddechowego do dostarczania tlenu podczas długotrwałej aktywności fizycznej, a tym samym określa ilościowo zdolność funkcjonalną jednostki. Zdolność funkcjonalna jest kluczowym markerem prognostycznym, ponieważ jest silnym niezależnym predyktorem ryzyka śmiertelności sercowo-naczyniowej i śmiertelności z jakiejkolwiek przyczyny¹¹. Poprawa wydolności krążeniowo-oddechowej wiąże się ze zmniejszonym ryzykiem śmiertelności¹². Testy wysiłkowe są odpowiednie do oceny wydolności tlenowej i odpowiedzi na leczenie w chorobach sercowo-naczyniowych. W zależności od dostępności badania wykonywane są na ergometrze rowerowym lub bieżni. Zwykle stosuje się stopniowy wzrost obciążenia na minutę i unika się nagłych wzrostów; Prowadzi to do liniowej reakcji fizjologicznej. Najważniejszymi zmiennymi w testach wysiłkowych są całkowity czas ćwiczeń, osiągnięte ekwiwalenty metaboliczne (MET), tętno oraz zmiany na linii elektrokardiogramu (EKG) między zespołem QRS (załamki Q, R i S) a załamkiem T (odcinek ST). Kliniczne testy warunków skrajnych mają niskie koszty i są łatwo dostępne¹³. Z tych powodów testy wysiłkowe, takie jak test 6-minutowego marszu, są szeroko stosowane w klinikach i powinny być również stosowane w przedklinicznej ocenie nowych terapii.

O ile nam wiadomo, nie ma dobrze opisanych dużych modeli zwierzęcych do oceny funkcjonalnej skuteczności terapii genowej lub innych nowatorskich terapii. W związku z tym klinicznie istotny test wysiłkowy stanowi doskonałą perspektywę do oceny skuteczności tych nowych terapii w warunkach przedklinicznych.

Protocol

Wszystkie eksperymenty są zatwierdzane przez Radę ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Wschodniej Finlandii. Protokół ten opisuje klinicznie istotny test wysiłkowy na bieżni dla świń w celu oceny bezpieczeństwa i skuteczności nowych terapii chorób serca. Do badań wykorzystano samice świń domowych o wadze 25-80 kg. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).

1. Ustawianie bieżni

1. Ustaw bieżnię tak, aby zwierzęta mogły poruszać się tylko w jedną stronę. Użyj bram i włazów, aby uniemożliwić zwierzętom cofanie się. Plan bieżni jest pokazany w Rysunek 1, a przykład bieżni znajduje się w Rysunek 2.
2. Upewnij się, że bieżnia (patrz tabela materiałów) ma wystarczająco dużo miejsca, aby umożliwić zmianę nachylenia.
3. Upewnij się, że bieżnia ma regulowaną szerokość, aby zwierzę nie obracało się podczas biegu.
4. Użyj przezroczystego plastiku, aby wykonać przednią ścianę bieżni. Zapobiega to ucieczce zwierzęcia z bieżni, ale nadal pozwala mu widzieć przez ścianę.
   UWAGA: Ważne jest, aby zwierzęta mogły widzieć przez przednią ścianę, ponieważ z naszego doświadczenia wynika, że świnie są bardziej zmotywowane do ucieczki, jeśli widzą swoje inne świnie po drugiej stronie ściany.
5. Umieść monitor EKG i defibrylator (patrz tabela materiałów) obok bieżni.
   UWAGA: Podczas testu wysiłkowego mogą wystąpić śmiertelne zaburzenia rytmu serca, zwłaszcza jeśli świnia ma niedokrwienie mięśnia sercowego^14,15,16.
6. Upewnij się, że na bieżni znajduje się punkt z wodą, w którym zwierzęta mogą się napić i ochłodzić po biegu.

2. Okres aklimatyzacji świń przed testem

1. Trzymaj zwierzęta w domu przez 2 tygodnie przed rozpoczęciem eksperymentów.
2. W pierwszym tygodniu aklimatyzacji upewnij się, że zwierzęta przyzwyczaiły się do swoich opiekunów i nowego środowiska utrzymania, z wyłączeniem bieżni.
3. W 2 tygodniu okresu aklimatyzacji upewnij się, że zwierzęta przyzwyczaiły się do bieżni.
4. Zacznij się przyzwyczajać, aby zwierzęta zapoznały się z bieżnią. Po pierwsze, pozostaw wszystkie bramy otwarte, aby zwierzęta mogły swobodnie chodzić po torze i eksplorować otoczenie.
5. Kiedy zwierzęta są bardziej zaznajomione z torem, włącz bieżnię i pozwól zwierzęciu biegać przez krótkie okresy, na przykład 7 minut. Długość czasu pracy musi być codziennie wydłużana.
   UWAGA: Pamiętaj, aby nagradzać zwierzęta w okresie aklimatyzacji. Na przykład, świnie zostały nagrodzone niesolonym popcornem w niniejszym badaniu.

3. Test wysiłkowy

UWAGA: Świnie powinny być poszczone co najmniej 2 godziny przed testem wysiłkowym lub powinny otrzymać tylko niewielką porcję jedzenia przed biegiem.

1. Włącz bieżnię i ustaw nachylenie na 5%-10%.
2. Gdy tylko zwierzę znajdzie się na bieżni, uruchom bieżnię z prędkością początkową 2 km/h.
3. Zwiększaj prędkość o 0,5 km/h co 60 s, aż do osiągnięcia 5 km/h. Całkowity czas trwania wynosi 15 min.
4. W przypadku, gdy zwierzę nie może biec przez cały czas z maksymalną prędkością, wykonaj poniższe czynności.
   1. Jeśli świnia nie biegnie tak szybko, jak wybrana prędkość, delikatnie popchnij ją od tyłu, ponieważ może to dać zwierzęciu poczucie, że musi biec szybciej, nie zwalniając.
   2. Spróbuj delikatnie popchnąć zwierzę maksymalnie trzy razy, a następnie zmniejsz prędkość o 0,5 km/h za każdym razem, aż świnia poradzi sobie z tą prędkością. Nie zwalniaj poniżej 2 km/h.
   3. Jeśli zwierzę odmawia biegania nawet przy niskiej prędkości, wyłącz bieżnię i przerwij test.

4. Monitorowanie EKG podczas testu wysiłkowego

1. Umieść elektrody EKG (patrz tabela materiałów) w miejscach anatomicznych, które mają minimalny ruch podczas biegu, takich jak łopatki lub klatka piersiowa.
   UWAGA: Używaj elektrod EKG przeznaczonych do testów wysiłkowych, aby uzyskać lepszą przyczepność do skóry. Pamiętaj, aby zgolić włosy z miejsca, w którym zostaną umieszczone elektrody EKG.
2. Rejestruj zmiany tętna podczas biegu.
   UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że analizy odcinków ST są często skomplikowane ze względu na ruch i inne artefakty. Monitorowanie rytmu można również wykonać za pomocą wszczepialnego rejestratora pętli lub rozrusznika serca.

5. Zbieranie danych

1. Rejestruj dystans biegu, całkowity czas i prędkość za każdym razem, gdy prędkość jest zmieniana.
   UWAGA: Nowoczesne bieżnie mogą gromadzić wiele innych danych, dlatego konieczne jest zapoznanie się z instrukcją bieżni, aby w pełni wykorzystać potencjał sprzętu.
2. Zwróć uwagę na możliwe zmiany w zachowaniu zwierząt, takie jak utykanie.
   UWAGA: W razie potrzeby skontaktuj się z weterynarzem i upewnij się, że zwierzę otrzymało niezbędne znieczulenie. Usuń zwierzę z przyszłych ćwiczeń, aż w pełni wyzdrowieje.

6. Opieka pozabiegowa

1. Upewnij się, że zwierzę ma dostęp do punktu poboru wody.
2. Nagradzaj zwierzę, na przykład smakołykami lub zabawkami.
3. Monitoruj zwierzę przez 30 minut po wybiegu pod kątem możliwych działań niepożądanych.

Results

Aby odnieść sukces w pracy z dużymi zwierzętami, trzeba mieć doświadczenie w pracy z tym protokołem. Naukowcy muszą być w stanie ocenić, czy zwierzę przestaje biegać z powodu zmęczenia lub braku motywacji. Rejestrowanie prędkości i dystansu może pomóc w ocenie tego, ponieważ zwykle zwierzęta pozbawione motywacji całkowicie przestają biec, podczas gdy zmęczone zwierzęta kontynuują bieg po zmniejszeniu prędkości (Rysunek 3). W razie potrzeby protokół można powtórzyć następnego dnia, jeśli wyni...

Discussion

Ten duży test wysiłkowy na zwierzętach naśladuje test stosowany w klinikach, zmniejszając lukę w punktach końcowych między badaniami przedklinicznymi a badaniami klinicznymi. Może być stosowany do oceny skuteczności nowych metod leczenia ciężkich chorób sercowo-naczyniowych, takich jak miażdżyca, niewydolność serca i choroby niedokrwienne serca. Punkty czasowe stosowane w tym protokole mogą się różnić w zależności od badanego zabiegu. Protokół ten został ustandaryzowany w oparciu o wieloletnie doświadczenie w pracy z duż...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Defibrylator	Zoll serii M	TO9K116790	Wszystkie przenośne defiryllatory będą działać
Elektrody defibrylatora	Philips	M3713A	Wszystkie elektrody działają, o ile są kompatybilne z elektrodami EKG defibrylatora
	Kilku dostawców		Preferuj elektrody EKG przeznaczone do testów wysiłkowych
Rejestrator pętli	Abbott Oy	DM3500	Opcjonalnie do monitorowania rytmu
Monitor pacjenta	Schiller Argus LCM Plus	7,80,05,935	Wszystkie przenośne monitory EKG będą działać
Świnie	Bieżnia Emolandia Oy
	NordicTrack		Wszystkie bieżnie z regulowanym nachyleniem i prędkością są odpowiednie do testu wysiłkowego.  Bieżnia powinna być jak najdłuższa i szeroka.
System ultradźwiękowy	Philips EPIQ 7 ultradźwięki
Różne materiały budowlane	Kilku dostawców		Do budowy ogrodzeń, ramp i bram zgodnie z rysunkiem 1 i rysunkiem 2
Różne smakołyki dla zwierząt