Artykuł metodologiczny

Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego

5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65239

⸱

22 września 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, School of Science and Engineering, Ateneo de Manila University, 2Division of Biological Sciences, Interdisciplinary Plant Group, and Missouri Maize Center, University of Missouri

W tym artykule

Podsumowanie

Zawiązki liści kukurydzy są głęboko ukryte i zwinięte, co utrudnia ich badanie. W niniejszej pracy przedstawiono metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego.

Streszczenie

U kukurydzy (Zea mays) i innych traw (Poaceae), zawiązki liści są głęboko osłonięte i zwinięte w okółku liścia, co utrudnia badanie wczesnego rozwoju liści. W tym artykule opisano metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Pierwsza metoda wykorzystuje ściągacz izolacji do usuwania górnych części starszych liści, odsłaniając wierzchołek zawiązka liścia i umożliwiając jego pomiar w celu dokładniejszego pobrania próbek przekroju poprzecznego. Druga metoda wykorzystuje przezroczystą, dwustronną taśmę nano do rozwijania i montowania zawiązków całych liści do obrazowania. Pokazujemy przydatność tych dwóch metod w wizualizacji i analizie fluorescencyjnych reporterów białkowych w kukurydzy. Metody te stanowią rozwiązanie problemów związanych z charakterystyczną morfologią zawiązków liści kukurydzy i będą przydatne do wizualizacji i ilościowego określania cech anatomicznych i rozwojowych liści kukurydzy i innych gatunków traw.

Wprowadzenie

Uprawy traw są głównym źródłem żywności i biopaliw dla światowej populacji1, a usprawnienie anatomii liści ma potencjał do zwiększenia ich produktywności2,3. Jednakże nasza obecna wiedza na temat regulacji anatomii liści u traw jest ograniczona4 i wymaga analizy primordiów liści, ponieważ wiele cech anatomicznych i fizjologicznych liścia jest zdeterminowanych na wczesnym etapie rozwoju5,6,7. Techniki obrazowania komórkowego, takie jak obrazowanie fluorescencyjne i konfokalne, są niezbędne do badania anatomii liści traw i cech komórkowych, lecz techniki te są trudne do zastosowania w przypadku primordiów liści traw, ponieważ są one głęboko osłonięte i zwinięte wewnątrz wiecha liściowego. Rozwiązaliśmy ten problem, opracowując metody przygotowywania przekrojów poprzecznych oraz preparatów całych rozwiniętych liści do analizy fluorescencyjnej i konfokalnej primordiów liści kukurydzy, która stanowi system modelowy do badania anatomii i rozwoju liści traw2,8.

Liść kukurydzy, podobnie jak liście wszystkich traw, składa się z taśmowatej blaszki z pochwą, która oplata łodygę i rozwijający się pęd9,10,11,12,13. Liście rozwijają się z merystemu wierzchołkowego pędu (SAM) w układzie dwurzędowym, w którym każdy nowy liść inicjuje się w pozycji przeciwnej do poprzedniego, co skutkuje powstaniem dwóch rzędów liści wzdłuż osi pionowej (Rysunek 1A)14. Stadium rozwojowe każdego primordium liścia jest identyfikowane na podstawie jego położenia względem SAM, przy czym najbliższe primordium oznacza się jako plastochron 1 (P1), a kolejne primordia jako P2, P3 i tak dalej (Rysunek 1B,C)2. Podczas rozwoju (Rysunek 1D), primordium liścia pojawia się najpierw jako półksiężycowata podpora u podstawy SAM (P1), a następnie przekształca się w primordium w kształcie kaptura, który rozciąga się nad merystemem (P2)9,10,11. Marginesy podstawowe kaptura rozszerzają się następnie bocznie i nakładają na siebie, podczas gdy wierzchołek rośnie w górę, tworząc stożkowate primordium (P3-P5)10. Następnie primordium szybko rośnie na długość, a granica między pochwą a blaszką u podstawy staje się bardziej wyraźna wraz z formowaniem się języczka — frędzlowatej wypustki po stronie adaksjalnej liścia (P6/P7). Ostatecznie liść rozwija się, wyłaniając z kręgu podczas wzrostu w stanie ustalonym, w którym dzielące się komórki są ograniczone do niewielkiego obszaru podstawowego blaszki, tworząc gradient z komórkami powiększającymi się i różnicującymi wzdłuż osi proksymalno-dystalnej (P7/P8)15. Wierzchołek pędu siewki kukurydzy zawiera wiele primordiów na różnych etapach rozwoju, co czyni go doskonałym modelem do badania rozwoju liści8.

Dokładna analiza wczesnego rozwoju liści wymaga etapowania lub zastosowania ustandaryzowanych kryteriów w celu zdefiniowania odrębnych stadiów rozwoju primordium w odniesieniu do innych parametrów wzrostu lub morfologicznych. Ponieważ primordia liści są ukryte w pędzie trawy, badacze zazwyczaj wykorzystują takie parametry jak wiek rośliny lub rozmiar wyłaniających się liści jako predyktory stadiów i rozmiarów primordiów liściowych9,16. W przypadku kukurydzy chronologiczny wiek rośliny określa się na podstawie liczby dni od posadzenia lub kiełkowania (DAP/DAG)17,18. Stadium wegetatywne (stadium V) określa się według najwyższego liścia z widocznym kołnierzykiem – jasną linią na stronie abaksjalnej pomiędzy blaszką a pochwą, która odpowiada położeniu liguli i uszek, czyli pary klinowatych obszarów u podstawy blaszki (Rysunek 1A,B)17,19. Między 20 a 25 DAG SAM przekształca się w merystem kwiatostanowy i przestaje wytwarzać nowe liście20. Tempo wzrostu primordiów liści kukurydzy może się różnić w zależności od środowiska i genotypu rośliny. Z tego powodu wiek rośliny i rozmiar wyłaniających się liści nie mogą precyzyjnie przewidzieć rozmiarów primordiów liściowych; jednak zastosowanie tych parametrów może pomóc w określeniu zakresu stadiów i rozmiarów primordiów na potrzeby eksperymentalne.

Analiza przekroju poprzecznego jest popularną metodą badania anatomii i rozwoju liści kukurydzy oraz innych traw, ponieważ umożliwia pobranie próbek z wielu plastochronów w jednym przekroju całego pędu21,22,23. Metoda ta jest również wygodna do obrazowania komórkowego świeżych próbek, ponieważ otaczające liście służą jako rusztowanie, które utrzymuje primordia liści na miejscu podczas krojenia i montowania24. Wadą tej metody jest jednak trudność w precyzyjnym zlokalizowaniu docelowego plastochronu i obszaru w obrębie primordium podczas wykonywania przekroju z nienaruszonego pędu. Ponadto, ponieważ wzrost liści różni się w zależności od plastochronu oraz wzdłuż osi proksymało-dystalnej2,5, nieprecyzyjne pobieranie próbek może prowadzić do błędnej interpretacji stadium rozwojowego i obszaru primordium w danym przekroju. Dlatego opracowanie metody precyzyjnego pobierania próbek z przekroju poprzecznego jest kluczowe dla zapewnienia dokładności i powtarzalności analiz anatomicznych i rozwojowych primordiów liści traw.

Analiza preparatów całych liści umożliwia kompleksowe i integracyjne badanie procesów tkankowych i komórkowych zachodzących w skali całego organu, takich jak wzrost proliferacyjny25 oraz wzorowanie żyłek26,27,28. Metoda ta zapewnia paradermalny przekrój liścia, co pozwala na odkrycie odrębnych procesów i wzorców, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia przy użyciu analizy przekrojów poprzecznych24,27. W przeciwieństwie do Arabidopsis, gdzie istnieją już opracowane metody obrazowania preparatów całych liści29,30, obecnie nie istnieje standardowa metoda obrazowania rozwiniętych preparatów całych liści u traw. Poprzedni protokół rozwijania izolowanych primordiów liści kukurydzy wymagał rzadko stosowanych materiałów i nie nadawał się do obrazowania komórkowego31. Zaawansowane techniki obrazowania, takie jak tomografia komputerowa (CT) i obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI), pozwalają na uzyskanie trójwymiarowych informacji anatomicznych bez izolowania i rozwijania primordiów11,32,33, jednak są one kosztowne i wymagają specjalistycznego sprzętu. Opracowanie techniki pozwalającej przełamać ograniczenia wynikające z zwiniętej i stożkowatej morfologii primordiów liści kukurydzy i innych traw przyczyniłoby się do postępu w badaniach nad ich cechami anatomicznymi i rozwojowymi.

W niniejszej pracy przedstawiamy metody przygotowania przekrojów poprzecznych oraz rozprostowanych preparatów całych primordiów liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Metody te wykorzystaliśmy do ilościowego określenia liczby żyłek oraz mapowania czasowo-przestrzennego rozkładu hormonów w primordiach liści kukurydzy przy użyciu białek fluorescencyjnych (FPs)24. Pierwsza metoda polega na usunięciu górnej części starszych liści z siewek kukurydzy za pomocą ściągacza do przewodów (Rysunek 1E). Dzięki odsłonięciu wierzchołka primordium (P5-P7) możliwe jest określenie jego długości bez konieczności całkowitego usuwania otaczających go starszych liści, co umożliwia łatwe i precyzyjne wykonywanie przekrojów. Druga metoda polega na rozwijaniu i montowaniu całych primordiów liści (P3-P7) za pomocą przezroczystej, dwustronnej nanotaśmy (Rysunek 1F). Metody te nadają się do wizualizacji różnych białek FP24, jednak wymagają optymalizacji w przypadku stosowania barwników fluorescencyjnych i odczynników przejrzystiających. Ponadto opisujemy procedury spłaszczania stosów z-stack, łączenia obrazów (stitching) oraz nakładania kanałów w programie ImageJ/FIJI34, które mają zastosowanie do obrazów uzyskanych obiema metodami. Opisane procedury są przydatne w rutynowym obrazowaniu fluorescencyjnym lub konfokalnym liści kukurydzy, ale mogą zostać również zaadaptowane dla innych modelowych gatunków traw, takich jak ryż, Setaria i Brachypodium.

Proces sekcjonowania i obrazowania rośliny, pokazujący stadia liści, etapy sekcjonowania i techniki obrazowania.
Rysunek 1: Organizacja i morfologia primordiów liści kukurydzy oraz przegląd metod. (A) Schematyczne przedstawienie siewki kukurydzy. Kukurydza posiada filotaksję dwuszeregową, przy której nowy liść powstaje w pozycji przeciwległej do poprzedniego liścia. Numer liścia wskazuje chronologiczną kolejność wyłaniania się liści od momentu kiełkowania (np. pierwszy liść, L1; drugi liść, L2; trzeci liść, L3; itd.). Każdy liść posiada dystalną blaszkę i bazalną pochwę, oddzielone od siebie obrączką, która odpowiada języczkowi i uszkom. Najwyższy liść z widoczną obrączką wyznacza stadium wegetatywne. Siewka w tym przykładzie znajduje się w stadium V2, z widoczną obrączką L2 (grot strzałki). Ikona nożyczek wskazuje miejsce na mesokotylu (me), w którym siewka musi zostać przecięta w celu pobrania próbki. (B) Schematyczne przedstawienie wysektrygowanego pędu z wyizolowanymi liśćmi od L1 do L4, natomiast primordia liści od L5 do L9 przedstawiono jako powiększony obraz w części (C). Numer plastochronu wskazuje pozycję primordium względem SAM, przy czym najmłodsze primordium liściowe (P1) znajduje się najbliżej SAM, a starsze primordia liściowe (P2, P3, P4 i kolejne) znajdują się sukcesywnie dalej2. (D) Schematyczne przedstawienie morfologii primordiów liści kukurydzy od P1 do P5. (E) Schematyczny przegląd metody analizy przekrojów poprzecznych primordiów liści kukurydzy. (1) Przycięcie starszych liści za pomocą ściągacza do izolacji. (2) Pomiar primordium i wycięcie przekroju pędu. (3) Osadzenie przekroju na szkiełku do obrazowania i przetwarzania (4, 5). (F) Schematyczny przegląd metody analizy całych preparatów (whole-mount) primordiów liści kukurydzy. (1) Usunięcie otaczających liści w celu wyekstrahowania primordium. (2) Przecięcie i rozprostowanie primordium na taśmie nano. (3) Osadzenie próbki do obrazowania i przetwarzania (4, 5). Skróty: L = liść; bl = blaszka; sh = pochwa; co = obrączka; me = mesokotyl; V = wegetatywny; P = plastochron; SAM = merystem wierzchołkowy pędu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

1. Określanie etapu rozwoju liścia kukurydzy i projektowanie eksperymentu

  1. Uprawa roślin i określanie etapu rozwoju liści
    1. Określ wiek i etap rozwojowy roślin, które zostaną wykorzystane w eksperymencie, oraz przeprowadź szczegółowe określanie etapów rozwoju liści.
      UWAGA: Zaleca się, aby określanie etapów przeprowadzano na roślinach o tym samym tle genetycznym co linie mutantów lub linie transgeniczne wykorzystywane w eksperymentach. SAM przestaje wytwarzać nowe liście między 20. a 25. dniem po wykiełkowaniu (DAG), w zależności od tła genetycznego i warunków wzrostu. Z tego powodu opisane tutaj metody są idealne dla siewek kukurydzy w wieku 7-14 DAG.
    2. Uprawiaj rośliny kukurydzy w szklarni lub komorze wzrostowej, stosując odpowiedni protokół pielęgnacji roślin35.
    3. Zbierz rośliny w pożądanym wieku lub stadium V, używając małego noża lub nożyczek, przecinając mezokotyle, czyli łodygę znajdującą się pod powierzchnią gleby (Rysunek 1A). Ostrożnie wprowadź narzędzie tnące w glebę obok siewki i przesuń je w dół do podstawy pod kątem 45°, aby przeciąć mezokotyle.
    4. Wyjmij siewkę z gleby i usuń pozostałe drobinki ziemi lub gleby, które mogą przylegać do rośliny. Ręcznie usuń koleoptile, czyli ochronną osłonkę pokrywającą wyłaniający się pęd w młodych siewkach.
    5. Dla każdej rośliny zapisz stadium V, liczbę liści oraz długość ostatniego liścia wyłaniającego się z rozety. Wykonaj zdjęcia roślin do późniejszego wykorzystania.
    6. Usuwaj starsze liście jeden po drugim. Aby to zrobić, przytrzymaj roślinę za pozostałości mezokotylu lub łodygi, wytnij każdy liść u podstawy osłonki i delikatnie rozwiń osłonkę kolistym ruchem za pomocą zgłębnika stomatologicznego (Rysunek 1B).
      UWAGA: Szybką metodę usuwania otaczających liści przedstawiono w kroku 2.1.
    7. Pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu około 2x ostrożnie przedyskuj resztę wierzchołka pędu na wilgotnych chusteczkach, aby zapobiec wysychaniu próbki. Delikatnie wycinaj i rozwijaj każdy prymorph liściowy za pomocą zgłębnika stomatologicznego z wygiętą igłą lub cienkich pincet, aż SAM, P1 i P2 staną się widoczne (Rysunek 1D). Zapisz wygląd i wymiary każdego plastochronu.
      UWAGA: Przykład określania etapu rozwoju liści u siewek kukurydzy znajduje się w Pliku uzupełniającym 1.
  2. Planowanie eksperymentu
    UWAGA: Staranne zaplanowanie eksperymentu może zwiększyć jego efektywność. Na przykład w analizie przekrojów poprzecznych określenie przybliżonej lokalizacji cięcia podczas obrazowania konkretnych plastochronów lub regionów może skrócić czas dyssekcji. Rysunek 2 przedstawia przykład standaryzowanego pobierania próbek. Ponadto optymalizacja parametrów obrazowania w oparciu o właściwości białek fluorescencyjnych (FP) lub sond fluorescencyjnych może poprawić wydajność eksperymentów.
    1. Wykorzystaj informacje o etapach rozwoju jako wytyczne do skupienia eksperymentu na konkretnych plastochronach, regionach prymorphów i tkankach. Użyj interesujących Cię białek FP lub innych sond fluorescencyjnych, aby przeprowadzić sekcje 2 i/lub 3 poniżej na kilku próbkach.
      UWAGA: Dostępne zasoby nasion linii markerowych FP kukurydzy 36-42 znajdują się pod adresem https://www.maizegdb.org/data_center/stock.
    2. Określ optymalne parametry akwizycji obrazu dla każdego reportera FP lub sondy, w tym odpowiedni detektor lub filtr, długości fal wzbudzenia i emisji, rozmiar otworu (pinhole) oraz inne ustawienia. Zapisz ustawienia, aby powtórzyć warunki pracy dla każdego z eksperymentów.
      UWAGA: Wytyczne techniczne dotyczące konfokalnej mikroskopii laserowej rozwijających się liści znajdują się w pracy Linh i Scarpella30.
    3. Zaplanuj czas obrazowania w oparciu o okres półtrwania i inne właściwości reportera FP43.
      ​UWAGA: Podczas planowania eksperymentu należy również uwzględnić czas między dyssekcją a obrazowaniem, ponieważ świeże próbki roślin są w tym okresie narażone na wysychanie i zmiany komórkowe.

Schemat rozwoju struktury rośliny przedstawiający przekroje poprzeczne łodygi od SAM do P7 na różnych etapach wzrostu.
Rycina 2: Schemat pobierania próbek do analizy przekrojów poprzecznych primordiów liści kukurydzy. (A, lewo) Proksymalna część pędu siewki kukurydzy w 7 DAG, pokazująca odsłonięty czwarty liść (L4) w fazie P7. Linie przerywane wskazują siedem punktów pobierania próbek wzdłuż primordium, od 0,5 mm do 10 mm. (A, prawo) Schematyczne przedstawienie primordiów liści z projektowanym rozmiarem i pozycją każdego plastochronu: P7 (biały); P6 (magenta); P5 (niebieski); P4 (zielony) oraz P3 aż do SAM (żółty). (B-H) Obrazy fluorescencyjne przekrojów poprzecznych reprezentujących punkty pobierania próbek pokazane w części A od 10 mm (B) do 0,5 mm (H). Primordia zostały sztucznie pokolorowane zgodnie ze schematem kolorystycznym plastochronów w części (A). Przekroje obrazowano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z zastosowaniem filtra UV długoprzepustowego do detekcji autofluorescencji. Pasek skali = 200 µm (B-H). Rycina została zmodyfikowana i powielona za zgodą Robila i McSteena24. Skróty: DAG = dni po kiełkowaniu; P = plastochron; SAM = merystem wierzchołkowy pędu; † = pochwa liściowa lub właściwa część przedliguliczna; * = merystem wierzchołkowy pędu; ** = łodyga. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Obrazowanie przekrojów poprzecznych prymordiów liści kukurydzy

  1. Usuwanie starszych liści otaczających i pomiar primordium liścia
    1. Pobierz siewkę, ostrożnie odcinając ją w miejscu mesokotylu poniżej powierzchni gleby za pomocą małego noża lub nożyczek, zgodnie z opisem w krokach 1.1.3-1.1.4 (Rycina 1A).
    2. Określ odpowiedni rozmiar otworu w ściągaczu do przewodów, którego należy użyć, oraz miejsce wykonania cięcia wzdłuż pędu. Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby pomieścić docelowe primordium.
    3. Zacznij ciąć od bardziej dystalnej części pędu i stopniowo przesuwaj się w stronę podstawy, aż zostanie odsłonięty czubek primordium.
    4. Aby wykonać cięcie, trzymaj ściągacz szczękami skierowanymi w stronę pędu. Umieść pęd w wybranym otworze i zaciśnij uchwyty ściągacza, aby przeciąć krąg liści.
      UWAGA: Aby uniknąć przypadkowego przecięcia docelowego primordium, ostrożnie wyrównaj środek pędu z otworem w ściągaczu. W przypadku większych roślin zaleca się ręczne usunięcie niektórych otaczających liści przed użyciem ściągacza.
      OSTROŻNIE: Ściągacze do przewodów mają ostre szczęki, które mogą spowodować skaleczenia lub inne obrażenia, jeśli nie są używane ostrożnie.
    5. Kontynuując ściskanie uchwytów, przesuń ściągacz w stronę pędu, aby przyciąć górną część liści. Upewnij się, że obszar docelowy w primordium pozostaje osłonięty przez otaczające liście (Rycina uzupełniająca S1C,D).
      UWAGA: Po przycięciu górnych liści, pęd pozostaje z odsłoniętym czubkiem primordium (P5, P6 lub P7, w zależności od miejsca cięcia i rozmiaru otworu ściągacza; Rycina 1E). Primordium to będzie służyć jako punkt odniesienia do szacowania wielkości i stadium młodszych primordiów. P6 jest najbardziej praktycznym punktem odniesienia w siewkach kukurydzy ze względu na zakres wielkości i morfologię przypominającą szpilkę.
    6. Za pomocą linijki zmierz długość od czubka primordium do podstawy pędu. Zapisz wynik pomiaru.
      UWAGA: Długość primordium zostanie lekko zawyżona, ponieważ u podstawy primordiów znajduje się kilka milimetrów łodygi (Rycina 2A).
  2. Ręczne sekcjonowanie i obrazowanie primordium liścia
    1. Pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu około 0,8x stabilnie utrzymaj pęd na gładkiej powierzchni, takiej jak szklana deska do cięcia lub inny materiał odporny na zarysowania. Użyj żyletki lub skalpela, aby wyciąć cienkie przekroje (0,25-0,8 mm) pędu w wybranych punktach wzdłuż długości primordium.
    2. Wykonaj pierwsze cięcie nieco powyżej obszaru docelowego, aby odrzucić dystalną część pędu, a następnie pobierz cienkie przekroje wokół obszaru docelowego. Aby uzyskać czyste cięcia, trzymaj ostrze prostopadle do pędu i przesuwaj je do wewnątrz płynnym, równomiernym ruchem.
      UWAGA: W przypadku większych primordiów (P6 lub P7) dopuszczalna jest tolerancja sekcjonowania rzędu kilku milimetrów. Jednak dla mniejszych primordiów (P5 i wcześniejszych) 1 mm może mieć istotne znaczenie dla próbkowania, ponieważ primordia te są ułożone gęsto w obrębie pierwszych kilku milimetrów podstawy pędu (patrz Rycina 2A,F-H). Do dokładniejszego sekcjonowania zaleca się stosowanie dwustronnych żyletek.
      OSTROŻNIE: Zachowaj ostrożność podczas używania żyletek i skalpeli, aby uniknąć przypadkowych skaleczeń lub obrażeń.
    3. Regularnie wymieniaj żyletkę, ponieważ pochwy liściowe mogą łatwo stępić ostrze. Po każdej serii sekcjonowania przykrywaj pęd wilgotnymi chusteczkami, aby zapobiec wysychaniu próbki.
    4. Zamocuj przekrój liścia na czystym szkiełku przedmiotowym (75 mm x 25 mm), użyj pipety, aby nanieść kroplę wody (lub 50% glicerolu) bezpośrednio na przekrój, a następnie nałóż szkiełko nakrywkowe (22 mm x 22 mm).
    5. W przypadku stosowania barwnika fluorescencyjnego, nanieś roztwór barwnika na przekrój, nałóż szkiełko nakrywkowe i inkubuj zgodnie z potrzebami.
      UWAGA: W zależności od rodzaju barwnika, przed przejściem do następnego kroku konieczne mogą być dodatkowe czynności przetwarzania przekrojów liści. Publikacje te44,45,46,47 zawierają ogólne informacje i zastosowania barwników fluorescencyjnych w obrazowaniu komórek roślinnych. Barwnik fluorescencyjny do barwienia jąder, 5-etynyl-2′-deoksyurydyna (EdU), był skutecznie stosowany w przekrojach poprzecznych primordiów liści kukurydzy48. Z kolei barwniki do barwienia błony plazmatycznej, takie jak Fei Mao 4-64 (FM 4-64) i jodek propidyny, nie dają zadowalających wyników (Rycina 3A-D).
    6. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego mikroskopu skaningowego i dostosuj ostrość oraz ustawienia w celu wizualizacji fluoroforu30. Ustawienia oświetlenia i akwizycji obrazów dla wybranych linii reporterowych FP kukurydzy znajdują się w Tabeli 1.
      UWAGA: Grube przekroje mogą generować wysoki poziom tła autofluorescencji. Rozważ zastosowanie strategii obrazowania i przygotowania preparatów, które pomogą złagodzić ten problem30,49 (patrz Tabela 2).
      OSTROŻNIE: Zachowaj ostrożność i używaj okularów ochronnych podczas pracy z silnymi źródłami światła i laserami, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia wzroku.
    7. Wykonaj obrazowanie przekroju liścia przy różnych powiększeniach i kanałach detekcji (w tym przy oświetleniu w polu jasnym)30. Użyj powiększenia 4x do obrazowania całego przekroju poprzecznego oraz powiększenia 20x lub 40x do obrazowania konkretnych tkanek. W obrazowaniu epifluorescencyjnym przy wyższych powiększeniach skróć czas ekspozycji, aby chronić próbki przed szybkim fotowybielaniem (patrz Tabela 1).
    8. Przechwyć obrazy całego przekroju lub wybranych obszarów zainteresowania (ROI). W razie potrzeby wykonaj z-stack, czyli serię obrazów wykonanych na różnych głębokościach ostrości30.
    9. Aby wykonać z-stack, określ najpierw górną i dolną pozycję w preparacie, a następnie liczbę przekrojów optycznych, które muszą zostać wykonane między tymi pozycjami. Mniejsza liczba przekrojów optycznych skutkuje większym rozmiarem kroku z (z-step), czyli odległością między poszczególnymi przekrojami. W zależności od właściwości FP i użytego powiększenia, wykonaj od trzech do 25 przekrojów optycznych z rozmiarami kroku z od 1 do 12 µm dla obrazowania przekrojów poprzecznych primordiów liści kukurydzy.
      UWAGA: Aby spłaszczyć z-stack, zastosuj odpowiednią technikę renderowania wolumetrycznego50, którą można zrealizować za pomocą oprogramowania mikroskopu lub programu ImageJ/FIJI34 (patrz kroki 4.1 i 4.2).
    10. Zapisz wszystkie pliki obrazów oraz powiązane z nimi metadane, jeśli są dostępne.

Tabela 1: Ustawienia oświetlenia i akwizycji obrazu zastosowane do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego wybranych reporterów FP u kukurydzy.Skróty: FP = białko fluorescencyjne; TRITC = tetrametylorodamina; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; WLL = laser białego światła; Ar-ion = laser argonowy; HyD = detektor hybrydowy; AU = jednostka Airy; Hz = Herc, linie skanowania na sekundę. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Obrazowanie rozprostowanych preparatów całych primordiów liści kukurydzy

  1. Disekcja primordiów i przygotowanie szkiełka przedmiotowego z użyciem nanotaśmy
    1. Pobierz siewkę, ostrożnie odcinając ją na poziomie mezokotylu pod powierzchnią gleby za pomocą małego noża lub nożyczek, zgodnie z opisem w krokach 1.1.3-1.1.4 (Rycina 1A).
    2. Przygotuj szkiełko przedmiotowe (75 mm x 25 mm) z przezroczystą, dwustronną taśmą nano (Rycina uzupełniająca S1H) przed przeprowadzeniem sekcji rośliny. Wytnij prostokątny kawałek nano taśmy i przyklej go do środka czystego szkiełka przedmiotowego. Nie zdejmuj ochronnej folii plastikowej z górnej strony taśmy.
      UWAGA: Dobierz rozmiar taśmy w zależności od rozmiaru próbek przeznaczonych do obrazowania (patrz: przykłady próbek o nadmiarowych wymiarach w Rycina uzupełniająca S1I,J). Nano taśma jest dostępna w wersji wykonanej z żelu akrylowego lub poliuretanowego. Oba typy są skuteczne w obrazowaniu fluorescencyjnym i konfokalnym.24Aby zapobiec odbarwieniu taśmy, należy chronić ją przed długotrwałym воздействием światła, przechowując w ciemnym pojemniku.
    3. Rozpocznij sekcję pędu, usuwając górną część starszych liści za pomocą ściągacza do przewodów, zgodnie z opisem w kroku 2.1.
    4. Przytrzymać pęd za mezokotyle i ostrożnie usunąć otaczające liście za pomocą zgłębnika stomatologicznego, aby wydobyć primordia. W tym celu usuwać liście od podstawy pędu i rozwijać je pojedynczo, aż do odsłonięcia interesującego nas primordium.
    5. Alternatywnie można użyć ściągacza do izolacji, aby bezpośrednio wyekstrahować primordia liści, wykonując cięcie w obrębie podstawy pędu (Rysunek uzupełniający S1E-G).
      UWAGA: Ta metoda wiąże się z wyższym ryzykiem odłamania prymordiów.
  2. Montaż i obrazowanie prymordium.
    1. Zdejmij folię ochronną z taśmy. Połóż odsłonięte primordium na taśmie. Za pomocą żyletki odetnij primordium u podstawy, odrzucając łodygę podstawową oraz podsadzkę (Rycina 1F).
    2. Rozwiń primordium, używając zgłębnika stomatologicznego z zakrzywioną igłą (średnica końcówki 0,25–0,6 mm). W przypadku primordiów o rozmiarze mniejszym niż 3 mm (od P3 do wczesnego P4) należy użyć mikrozgłębnika (średnica końcówki 0,15–0,2 mm).
    3. Ustaw czubek igły równolegle do powierzchni i rozprostuj zewnętrzny brzeg podstawy, delikatnie dociskając go do taśmy.
    4. Aby ułatwić rozwijanie, należy nasmarować powierzchnię wewnętrzną (adaksjalną) liścia, zanurzając końcówkę igły w 100% glicerolu.
    5. Przy zewnętrznej krawędzi przylegającej do taśmy należy ustawić czubek igły równolegle do długiej osi liścia. Następnie należy delikatnie przesunąć igłę w bok, aby rozwinąć i rozprostować liść na taśmie (Rycina 1F).
      UWAGA: Pękanie lub uszkadzanie liścia podczas rozwijania jest częstym zjawiskiem, zwłaszcza w przypadku większych primordiów z mocną żyłką środkową (patrz Rysunek 3E-G). Gwałtowne rozwijanie liścia może doprowadzić do uszkodzeń mechanicznych jego powierzchni i powstania artefaktów podczas obrazowania (Rysunek 3H). Patrz Tabela 2 oraz omówienie rekomendowanych rozwiązań tych problemów.
    6. Nanieś kroplę wody na rozwinięte primordium. Natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe na kropli wody i primordium. Delikatnie dociśnij krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby przylgnęły do taśmy.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie dużych prostokątnych szkiełek podstawowych (50 mm x 24 mm lub 60 mm x 24 mm) z dodatkowym obszarem umożliwiającym przyklejenie taśmy. Należy zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza, które mogą odkształcić liść i spowodować nierównomierną refrakcję światła (patrz Rycina 3I-K). Należy upewnić się, że szkiełko nakrywką całkowicie przylega do taśmy, ponieważ brzegi zamontowanego primordium mogą podwinąć się pod niedokładnie przylegające szkiełko (patrz Rysunek 3L).
    7. Umieść preparat na stoliku mikroskopu epifluorescencyjnego (patrz Rycina uzupełniająca S1K) lub konfokalny skaningowy mikroskop laserowy i dostosować ostrość oraz ustawienia w celu wizualizacji fluoroforu30Zobacz Tabela 1 dotyczące ustawień oświetlenia i akwizycji obrazu zastosowanych dla wybranych linii reporterowych kukurydzy z białkami FP.
    8. Wykonaj obrazowanie całego liścia lub określonego obszaru zainteresowania (ROI) przy użyciu różnych kanałów detekcji30Aby obrazować cały liść, należy albo ręcznie wykonać obrazy mozaikowe liścia, albo skorzystać z funkcji układania kafelków (tiling) mikroskopu przy niskim powiększeniu (4x lub 10x).
      UWAGA: Nawet przy najmniejszym powiększeniu prymordia liści kukurydzy mogą być zbyt duże, aby obrazować je za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego, co prowadzi do wydłużenia czasu obrazowania, które z kolei może skutkować fotobleakowaniem (patrz Rycina 3M) lub zwiększoną autofluorescencję tła. W związku z tym zaleca się stosowanie stereomikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania próbek całych liści o rozmiarach przekraczających 5 mm.
    9. W przypadku obrazowania konfokalnego konieczne będzie wykonanie serii obrazów w osi Z (z-stacks), które obejmą całą grubość liścia (patrz krok 2.2.9).
    10. Zapisz wszystkie pliki obrazów oraz powiązane z nimi metadane, jeśli są dostępne.

Tabela 2: Rozwiązywanie typowych problemów podczas obrazowania przekrojów poprzecznych i preparatów całych primordiów liści kukurydzy. Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.

Schemat etapów podziału komórek z mikroskopii fluorescencyjnej; biologia rozwoju; komórki roślinne; PIP2-1-CFP.
Rycina 3: Suboptymalny przekrój poprzeczny i preparat całego zamontowanego prymordium liścia kukurydzy. (A-D) Reprezentatywne obrazy konfokalne przekrojów poprzecznych prymordiów liści z markerem błony plazmatycznej, PIP2-1-CFP (A), oraz fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym się z błoną plazmatyczną, FM 4-64 (B), wraz z odpowiadającymi im obrazami w jasnym polu (C,D). W porównaniu do PIP2-1-CFP, FM 4-64 wykazuje suboptymalną wizualizację konturów komórek. (E-M) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne całych zamontowanych prymordiów liści wykazujące obecność rozdarć (E-G), uszkodzonych powierzchni† (H), pęcherzyków powietrza* (I-K), zawiniętych marginesów (L) oraz obszarów poddanych fotoblakaniu‡ (M). Prymordia liści ekspresują DII-Venus (E-G), GAR2-YFP (H-J), mDII-Venus (K), PIN1a-YFP (L) oraz DR5-RFP (M). Pasek skali = 200 µm (A-D); 500 µm (E-M). Rycina 3A została zmodyfikowana i powielona za zgodą Robila i McSteena24, natomiast Rycina 5B-M stanowią nieopublikowane dane autorów. Skróty: P = plastochron; YFP = żółte białko fluorescencyjne; RFP = czerwone białko fluorescencyjne; CFP = cyjanowe białko fluorescencyjne; PIP2-1-CFP = pZmPIP2-1::ZmPIP2-1:CFP; DII-Venus = pZmUbi:DII:YFP-NLS; GAR2-YFP = pZmGAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS; PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; BF = jasne pole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Przetwarzanie obrazów przy użyciu ImageJ/FIJI

  1. Spłaszczanie stosów z za pomocą projekcji maksymalnej intensywności (MIP)
    1. Uruchom program ImageJ/FIJI i otwórz stos obrazów lub utwórz nowy stos z wielu oddzielnych obrazów, wybierając z menu opcję Image | Stacks | Images to Stack.
    2. Wybierz stos obrazów. Z menu wybierz Image | Stacks | Z-Project.... W oknie dialogowym Z-Project z rozwijanego menu Projection type wybierz Max Intensity. Kliknij OK, aby utworzyć z-projekcję maksymalnej intensywności.
      UWAGA: Spłaszczony obraz jest 2D-projekcją pikseli o najwyższej intensywności w obrębie stosów z50. Metoda ta nadaje się do wizualizacji fluoroforu, ale nie cech anatomicznych w obrazach w jasnym polu grubych przekrojów poprzecznych i preparatów całych liści.
    3. Zapisz obraz w formacie TIFF (Tagged Image File Format), wybierając File | Save As | Tiff. Wprowadź nazwę pliku i kliknij Save.
      UWAGA: Do przechowywania obrazów fluorescencyjnych i konfokalnych zaleca się stosowanie formatu TIFF, ponieważ zachowuje on jakość i szczegóły podczas zapisywania obrazu.
  2. Spłaszczanie stosów z za pomocą wtyczki Extended Depth of Field (EDF)51​
    1. Zainstaluj wtyczkę EDF52. Pobierz plik Extended_Depth_Field.jar (wersja 17.05.2021) ze strony http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ i umieść go w folderze „plugins” programu ImageJ/FIJI.
    2. Uruchom program ImageJ/FIJI i otwórz stos obrazów lub utwórz nowy stos z wielu oddzielnych obrazów, wybierając z menu opcję Image | Stacks | Images to Stack.
    3. Wybierz stos obrazów. Z menu wybierz Plugins | Extended Depth of Field | EDF Easy Mode. W oknie dialogowym Extended Depth of Field użyj suwaków w sekcji Speed/Quality, aby ustawić żądaną jakość i prędkość przetwarzania, oraz Height-map reg, aby ustawić poziom wygładzenia topografii. Kliknij Run, aby utworzyć zrekonstruowany obraz.
      UWAGA: EDF łączy stos w ostry, złożony obraz 2D poprzez projektowanie najlepszego ostrzenia51. Technika ta jest przydatna do pokonania ograniczonej głębi ostrości i nadaje się do rekonstrukcji obrazów w jasnym polu grubych przekrojów poprzecznych lub preparatów całych liści. Należy zachować ostrożność podczas stosowania tego filtra do wizualizacji fluoroforu, ponieważ w przeciwieństwie do MIP, EDF dostosowuje kontrast obrazu, co wpływa na intensywność pikseli.
    4. Zapisz obraz jako plik TIFF, wybierając File | Save As | Tiff. Wprowadź nazwę pliku i kliknij Save.
  3. Łączenie obrazów za pomocą wtyczki Grid/Collection Stitching53
    1. Zapisz kolekcję obrazów lub stosów obrazów do połączenia w jednym katalogu.
    2. Uruchom program ImageJ/FIJI i wybierz z menu Plugins | Stitching | Grid/Collection Stitching. W oknie dialogowym Grid/Collection Stitching z rozwijanego menu Type wybierz Unknown position, a następnie z menu Order wybierz All files in directory. Kliknij OK.
    3. W oknie dialogowym Grid Stitching: Unknown position, All files in directory określ lokalizację obrazów, wpisując lub wklejając ścieżkę katalogu w polu tekstowym Directory lub klikając Browse…, aby zlokalizować katalog. Kliknij OK, aby rozpocząć proces łączenia.
      UWAGA: Opcja Unknown Position w wtyczce Grid/Collection Stitching rekonstruuje obraz złożony z zestawu sąsiadujących obrazów poprzez analizę ich obszarów nakładania się. Dlatego opcja ta jest przydatna do łączenia mozaik obrazów przekrojów poprzecznych lub preparatów całych liści, które nie zostały uzyskane za pomocą operacji skanowania kafelkowego.
    4. Po zakończeniu łączenia pojawi się nowe okno z połączonym obrazem. Zapisz obraz jako plik TIFF, wybierając File | Save As | Tiff. Wprowadź nazwę pliku i kliknij Save.
      UWAGA: Łączenie dużych montaży obrazów 2D i 3D można również przeprowadzić za pomocą komend rekonstrukcji obrazu w oprogramowaniu mikroskopu lub poprzez Bio-Formats Import Options w ImageJ/FIJI.
  4. Łączenie wielu kanałów za pomocą polecenia Merge Channels
    1. Uruchom ImageJ/FIJI i otwórz obrazy lub stosy obrazów do połączenia.
      UWAGA: Stosy obrazów można najpierw spłaszczyć, stosując kroki 4.1 lub 4.2. Do spłaszczania kanałów fluoroforowych zazwyczaj zaleca się MIP, natomiast EDF lepiej nadaje się do spłaszczania kanałów w jasnym polu lub innych kanałów o zmiennej głębi ostrości.
    2. Dostosuj jasność i kontrast obrazów za pomocą Image | Adjust | Brightness/Contrast. Użyj suwaków lub pól wprowadzania, aby dostosować parametry, a następnie kliknij Apply. Alternatywnie można zastosować liniową metodę rozciągania histogramu, wybierając Process | Enhance Contrast…. Ustaw procent Saturated pixels, zaznacz Normalize, a następnie kliknij OK.
      ​UWAGA: Przy ilościowym określaniu lub porównywaniu intensywności sygnału fluoroforu między obrazami zazwyczaj najlepiej jest nie dostosowywać jasności ani kontrastu, ponieważ może to zmienić względne intensywności pikseli w obrazie, co może wpłynąć na pomiary i porównania.
    3. Aby rozróżnić kanały, przypisz pseudokolory do określonych obrazów za pomocą tabeli wyszukiwania (LUT). W tym celu wybierz obraz, a następnie z menu ImageJ/FIJI wybierz Image, kliknij Lookup Tables i wybierz odpowiednią tabelę LUT z listy rozwijanej.
    4. Z menu wybierz Image | Color | Merge Channels. Dla każdego kanału (C1, C2, C3…) użyj listy rozwijanej, aby wybrać obraz, który ma zostać przypisany do tego kanału. Kliknij OK, aby połączyć kanały.
    5. Zapisz nowy obraz w formacie TIFF, wybierając File | Save As | Tiff. Wprowadź nazwę pliku i kliknij Save.

Wyniki

Analiza przekrojów poprzecznych prymordiów liści kukurydzy
Wykorzystaliśmy sekcję 2 protokołu do ilościowego określenia liczby żyłek i charakterystyki wzorców odpowiedzi hormonalnej w przekrojach poprzecznych prymordiów liści kukurydzy z FP (Rysunek 4)24. Aby ocenić rolę hormonu roślinnego auksyny we wzroście liści i tworzeniu żyłek, policzyliśmy liczbę żyłek w prymordiach liści mutanta kukurydzy z niedoborem auksyny, vanishing tassel254. W wczesnych plastochronach rozwijające się żyłki wykazują wyraźną komórkowość w środkowej warstwie komórek prymordium liścia kukurydzy21,22. Jednak identyfikacja i liczenie żyłek przy użyciu konwencjonalnych technik histologicznych22 może być pracochłonne i czasochłonne. Dlatego w celu ilościowego określenia liczby żyłek wykorzystaliśmy marker białka eksportującego auksynę u kukurydzy pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (dalej określany jako PIN1a-YFP), który znakuje rozwijające się żyłki i pasma procambium (PCS; Rysunek 4A). Dzięki sekcji 2 protokołu udało nam się ustandaryzować pobieranie przekrojów poprzecznych poprzez pomiar prymordiów przed cięciem (Rysunek 4B,C). Odkryliśmy tendencję, zgodnie z którą vt2 posiada szersze prymordium i więcej żyłek niż rośliny normalne (Rysunek 4D,E)24, co jest zgodne z danymi z w pełni rozwiniętych liści55 i wskazuje, że defekt w vt2 pojawia się wcześnie w rozwoju liścia. Korzystając z sekcji 2 protokołu, mogliśmy również systematycznie badać wzorce ekspresji reporterów FP odpowiedzi hormonalnej w prymordiach liści (przykłady obrazów znajdują się na Rysunku 4F-I). Poprzez ustandaryzowany schemat pobierania przekrojów poprzecznych zmapowaliśmy rozkład odpowiedzi na auksynę, cytokininę (CK) i kwas giberelowy (GA) w różnych plastochronach i regionach prymordiów liści oraz odkryliśmy nowe wzorce odpowiedzi, które w naszej hipotezie mają znaczenie dla wzrostu liści i tworzenia żyłek24. Zatem te reprezentatywne wyniki demonstrują użyteczność sekcji 2 protokołu w analizie przekrojów poprzecznych prymordiów liści kukurydzy.

Wzrost prymordium rośliny, PIN1a-YFP, wykresy, obrazy z mikroskopii, analiza danych w badaniu botanicznym.
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki analizy przekrojów poprzecznych prymordiów liści kukurydzy. (A-E) Ilościowe oznaczenie liczby żyłek i szerokości prymordium w prymordiach liści rośliny normalnej oraz vanishing tassel2 z zastosowaniem markera białka eflluksu auksyny PIN1a-YFP. (A) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne przekrojów poprzecznych od P5 do P7 wykazujących ekspresję PIN1a-YFP w rozwijających się żyłkach i pasmach procambialnych. Przekroje poprzeczne obrazowano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z wykorzystaniem filtra FITC (pobudzenie 495-519 nm). Liczbę żyłek oraz szerokość prymordium wyznaczono odpowiednio za pomocą narzędzi wielopunktowych i linii rysowanej ręcznie w programie FIJI/ImageJ. (B) Siewka kukurydzy z usuniętymi górnymi kręgami liści za pomocą ściągacza do przewodów w celu odsłonięcia wierzchołka czwartego liścia (L4). Nawias obejmuje projektowaną długość prymordium, a linia przerywana wskazuje połowę długości. (C) Schemat różnych kształtów prymordium od P5 do P7, ilustrujący, jak liczba żyłek i szerokość prymordium w połowie długości (pozioma linia przerywana) mogą różnić się w zależności od stadium rozwoju prymordium. (D,E) Pomiar szerokości prymordium (D) i liczby żyłek (E) w przekroju w połowie długości L4 roślin normalnych i vt2. Linia trendu przedstawia średnie kroczące z 10 mm pomiarów ± błąd standardowy średniej (SEM). (F-I) Reprezentatywne obrazy konfokalne przekrojów poprzecznych prymordiów liści wykazujących ekspresję kombinacji PIN1a-YFP, reportera odpowiedzi na auksynę DR5-RFP, reportera odpowiedzi na cytokininę TCS-Tomato, markera odpowiedniego na kwas giberelinowy GAR2-YFP oraz mDII-Venus, zmutowanej wersji reportera sygnału wejściowego auksyny DII-Venus. Kanały FP nałożono na kanał jasnego pola na każdym obrazie. Pasek skali = 200 µm (A); 10 mm (B); 100 µm (F-I). Rycina ta została zmodyfikowana i powielona za zgodą Robila i McSteena24. Skróty: DAG = dni po kiełkowaniu; P = plastochron; vt2 = vanishing tassel2; PCS = pasmo procambialne; YFP = żółte białko fluorescencyjne; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; RFP = czerwone białko fluorescencyjne; PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato; GAR2-YFP = pZmGAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza całych preparatów prymordiów liści kukurydzy
Zastosowano sekcję 3 protokołu w celu wizualizacji i analizy ekspresji FP w całych preparatach prymordiów liści kukurydzy (Rycina 5). Poprzez wizualizację wzorców żyłkowania za pomocą PIN1a-YFP stwierdzono, że formowanie żyłek zachodzi w całym prymordium podczas wczesnych plastochronów, jednak proces ten ogranicza się do obszarów proksymalnych w późniejszym etapie rozwoju (Rycina 5A)24. Uzupełniająco do analiz przekrojów poprzecznych, analizy całych preparatów liści ujawniły tkankowe i etapowo specyficzne wzorce odpowiedzi hormonalnej podczas formowania żyłek24. Przykładem jest wzorzec ekspresji raportera odpowiedzi na CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato) w odniesieniu do ekspresji PIN1a-YFP (Rycina 5B)24. Postępując zgodnie z sekcją 3 protokołu, możliwe było przeprowadzenie zarówno jakościowych, jak i ilościowych analiz ekspresji FP w prymordiach liści (Rycina 5D-F; niepublikowane dane). Zbadano wzorce ekspresji raportera odpowiedzi na auksynę, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), oraz markera reagującego na GA, pZmGAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), w całych preparatach liści pojedynczych i podwójnych mutantów vt2 oraz dwarf plant3 (d3), który jest mutantem z niedoborem GA56 (Rycina 5D). Porównano również względne poziomy proliferacji komórek między normalnymi a vt2 prymordiami liści przy użyciu pZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), który jest markerem przejścia G1/S w cyklu komórkowym57 (Rycina 5E,F). Choć nie stwierdzono istotnej różnicy między roślinami normalnymi a vt2, ekspresja Cyclin-D2B-YFP była zgodna ze znanym profilem proliferacji komórek we wczesnych plastochronach31. Wyciągnięto wniosek, że sekcja 3 protokołu jest skuteczną metodą analizy całych preparatów prymordiów liści kukurydzy, które są trudne do obrazowania ze względu na ich zwiniętą morfologię.

Rozwój roślin, analiza lokalizacji białek, PIN1a-YFP, DR5-RFP, GAR2-YFP, mikroskopia fluorescencyjna.
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki analizy całego preparatu primordiów liści kukurydzy. (A) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne primordiów liści siewek kukurydzy w wieku 7 DAG, wykazujące rozwijające się żyłki i wiązki procambialne, znakowane markerem białka efleksu auksyny PIN1a-YFP. Primordia P3-P6 zostały wycięte z podstawy, rozwinięte i spłaszczone stroną adaksjalną do góry. Wstawki pokazują powiększenia P3 i P4. W P5 i P6 linie przerywane wyznaczają dystalny koniec stref proliferacyjnych, gdzie większość wiązek procambialnych wciąż się rozwija i wydłuża. (B,C) Reprezentatywne obrazy konfokalne pokazujące ekspresję PIN1a-YFP i reportera odpowiedzi na cytokininę, TCS-Tomato, w proksymalnym regionie brzegowym primordium P5. (D) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne primordiów P4 wykazujące ekspresję reportera odpowiedzi na auksynę, DR5-RFP, oraz markera reagującego na kwas giberelowy, GAR2-YFP, w roślinach prawidłowych oraz pojedynczych i podwójnych mutantach vanishing tassel2 i dwarf plant3. (E) Reprezentatywne obrazy konfokalne P3 i/lub P4 wykazujące ekspresję Cyclin-D2B-YFP, reportera przejścia G1/S w cyklu komórkowym. (F) Względne poziomy proliferacji komórek w primordiach liści P3/P4 roślin prawidłowych i vt2, określone poprzez pomiar zintegrowanej gęstości sygnału Cyclin-D2B-YFP na obszarze primordium przy użyciu ImageJ/FIJI. Słupki reprezentują średnie pomiary ± błąd standardowy średniej. Pasek skali = 500 µm (A,D,E); 200 µm (B); 100 µm (C). Rysunek 4A-C został zmodyfikowany i powielony za zgodą Robila i McSteena24, natomiast Rysunek 4D-F przedstawia nieopublikowane dane autorów. Skróty: DAG = dni po wykiełkowaniu; P = plastochron; vt2 = vanishing tassel2; d3 = dwarf plant3; YFP = żółte białko fluorescencyjne; RFP = czerwone białko fluorescencyjne; PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = pZmGAR2::ZmGAR2:YFP; Cyclin-D2B-YFP = pZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP; ns = brak istotnej różnicy; au = jednostka arbitralna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Przykłady określania stadium rozwoju liści u siewek kukurydzy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca S1: Próbki roślin i materiały użyte w protokołach. (A,B) Siewka kukurydzy w 7-8 DAG po usunięciu górnego kręgu liści za pomocą ściągacza do przewodów. (B) Wstawka przedstawia zbliżenie pędu z odsłoniętym primordium P6. (C-G) Pędy siewek kukurydzy z usuniętymi górnymi kręgami do analizy w przekroju poprzecznym (C,D) oraz z całkowicie usuniętymi liśćmi otaczającymi do analizy całego preparatu (E-G). (H) Rolka przezroczystej dwustronnej nano taśmy z żelu poliuretanowego. (I,J) Primordium liścia P6 (I) oraz region proksymalny liścia P8 (J) rozwinięte i zamocowane na szkiełkach przedmiotowych za pomocą nano taśmy. (K) Szkiełko przedmiotowe z rozwiniętym primordium liścia umieszczone na stole mikroskopu epifluorescencyjnego. Skrót: DAG = dni po kiełkowaniu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawiamy dwie metody przygotowania zawiązków liści kukurydzy do obrazowania komórkowego. Pierwsza metoda (sekcja protokołu 2) umożliwia pomiar zawiązków do analizy przekroju poprzecznego, podczas gdy druga metoda (sekcja protokołu 3) umożliwia rozwinięcie i spłaszczenie zawiązka do analizy całego montażu. Metody te ułatwiają obrazowanie komórkowe FP w zawiązkach liści kukurydzy24 (jak pokazano na rys. 4 i ryc. 5) i zapewniają proste rozwiązania problemów związanych z obrazowaniem rozwijających się liści kukurydzy. Sekcja 2 protokołu skraca czas preparacji i poprawia dokładność pobierania próbek poprzez pomiar zawiązków przed sekcją, zamiast polegać wyłącznie na parametrach stopnia zaawansowania 9,16. Dzięki dostępnej na rynku taśmie nano, sekcja protokołu 3 rozwiązuje długotrwały problem obrazowania zawiązków całych liści w kukurydzy. Protokół ten jest lepszy od poprzedniej metody, w której wykorzystano rurki do dializy31 i jest znacznie tańszą alternatywą dla tomografii komputerowej i rezonansu magnetycznego 11,32,33. Jednak jeśli chodzi o wizualizację cech anatomicznych liści i uzyskiwanie optymalnych wyników, oba protokoły mają pewne ograniczenia, które przedstawiono w tabeli 2 i omówiono bardziej szczegółowo poniżej.

W sekcji 2 protokołu napotkaliśmy trudności z wizualizacją konturów komórek w grubych poprzecznych odcinkach zawiązków liści, a barwienie przeciwstawne barwnikami fluorescencyjnymi wiążącymi ścianę komórkową lub błonę plazmatyczną nie przyniosło zadowalających wyników. Na przykład FM 4-64 dawał nieoptymalne wyniki w porównaniu z markerem FP błony komórkowej, pZmPIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Rysunek 3A-D). Aby przezwyciężyć to ograniczenie, zalecamy użycie wibratomu do wytworzenia cieńszych odcinków tkanek (~0,1 mm)58, co pozwoli na żywe obrazowanie konturów komórek w jasnym polu lub optymalizację protokołu barwienia przeciwdziałającego barwieniu47,59.

W sekcji 3 protokołu głównym ograniczeniem jest trudność w zamontowaniu skrzydła bez rozdarcia, uszkodzenia lub pęcherzyków powietrza, jak opisano w krokach protokołu 3.2.5-3.2.6 (Rysunek 3E-K). Ponieważ liść kukurydzy jest obustronnie symetryczny, do wizualizacji 9 może wystarczyć montaż na połowie liścia, a nie na całym liściu. Aby to zrobić, zawiązek można przeciąć żyletką wzdłuż osi podłużnej po rozwinięciu go do nerwu środkowego, umożliwiając zamontowanie tylko połowy liścia. Kolejnym ograniczeniem sekcji 3 protokołu jest to, że grubość liścia może ograniczać rozdzielczość optyczną sygnału fluoroforowego podczas głębokiego obrazowania. Aby rozwiązać ten problem, możliwe jest zastosowanie techniki oczyszczania tkanek60. Odkryliśmy jednak, że ClearSee61, powszechnie stosowany odczynnik czyszczący do obrazowania tkanek roślinnych, nie jest zgodny z protokołem, ponieważ powoduje oderwanie próbki i szkiełka nakrywkowego od taśmy nano. Potencjalnym rozwiązaniem tego problemu może być nałożenie półprzepuszczalnej membrany31 na próbkę liścia, co pozwoli na potraktowanie jej roztworem czyszczącym, jednocześnie utrzymując ją na miejscu przez nanotaśmę. Taka metoda, która pozwala na nałożenie płynnych roztworów na rozwinięty liść, może być również wykorzystana do technik hybrydyzacji i immunolokalizacji całego RNA in situ, które wcześniej zostały zoptymalizowane pod kątem rozwoju kwiatostanów kukurydzy, ale nie dla zawiązków całych liści62,63.

Opisaliśmy protokoły dla kukurydzy, która ma duże zawiązki liści już na etapie siewki. Inne gatunki traw ze znacznie mniejszymi zawiązkami liści, takie jak ryż, jęczmień, pszenica, Setaria i Brachypodium 16,23,64,65,66, mogą wymagać użycia dodatkowych precyzyjnych narzędzi, aby skutecznie zastosować te protokoły. Co więcej, protokoły te nie były przeznaczone do obrazowania żywych komórek, które rejestruje dynamiczne procesy tworzenia tkanek i odpowiedzi komórkowych w czasie rzeczywistym. Jednak w miarę postępów w dziedzinie obrazowania żywych komórek 67 sond fluorescencyjnych, technologii obrazowania i możliwości obliczeniowych67 roślin, przyszłe badania mogą opierać się na tych protokołach w celu opracowania strategii obrazowania żywych komórek dostosowanych do unikalnych cech zawiązków liści trawy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Maize Genetics Cooperation, The Maize Cell Genomics Project, Dave'owi Jacksonowi (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrei Gallavotti (Rutgers University, NJ) i Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) za dostarczenie zmutowanych i transgenicznych zasobów, a także Robertowi F. Bakerowi i Alexandrowi Jurkiewiczowi z Advanced Light Microscopy Core w University of Missouri-Columbia za pomoc w mikroskopii konfokalnej. JMR był wspierany przez J. William Fulbright Fellowship, The Diane P. and Robert E. Sharp Fund oraz National Science Foundation's Plant Genome Research Program (IOS-1546873) do PM. CDTC, CMRV, EDCDP i RJRR są wspierane przez program stypendialny Ateneo College. CDTC, EDCDP i RJRR są wspierane przez stypendium licencjackie DOST-SEI S&T. DODL jest wspierany przez Stypendium Naukowe im. ks. Thomasa Steinbuglera SJ. RJRR jest wspierany przez Aiducation International – Stypendium Pathways to Higher Education. Prace te były wspierane przez Szkołę Nauki i Inżynierii oraz Bibliotekę Rizal Uniwersytetu Ateneo de Manila.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Akrylowa żel przezroczysty dwustronna taśma nano Tape 16,5 stopy x 1,2 cala, grubość 2 mmSklep EZlifego (AmazonkaB07YB1ZXG61 rolka
Bellucci Pick Zakrzywiona mikrosonda 16,8 cm, 6,6 calaBausch & LombN1692 9 1szt
Mikrosonda prowadząca Clayman Hak Sinskey kątowy wałek, 11,6 cm, 4,6 calaStorz Opthalmic InstrumentsE05421 szt
Sonda dentystyczna, wygięta igła, 14 cm (5,5 cala)Ted Pella135531 szt
DOWELL 10-22 AWG Ściągacz izolacjiDowell Store (Amazonka)10-22 AWG1 szt
Pióra Ostrza ze stali węglowej o podwójnej krawędziTed Pella121-9pakiet pakietowy/10; do precyzyjnego cięcia
szkiełka mikroskopowe z matowym szkłem, 75 mm x 25 mm x 1-1,2 mmTed Pella260442opakowanie/144
GEM Jednokrawędziowe, niepowlekane ostrza ze stali nierdzewnejTed Pella121-1pudełko/200; do ogólnego cięcia/cięcia
GlycerolThermo ScientificPI179041 litr
ImageJ/FIJI z wtyczką EDF (wersja 17.05.2021) i wtyczkąGrid/Collection StitchingNational Institutes of Health (NIH) USAwersja 2.9.0/1.54sWtyczka EDF została opracowana przez Alexa Prudencio, Jesse Berenta i Daniela Sage'a dla Biomedical Imaging Group, É cole Polytechnique Fé dé rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). Oprogramowanie do zszywania siatki/kolekcji zostało opracowane przez Stephana Preibischa dla Instytutu Molekularnej Biologii Komórki i Genetyki im. Maxa Plancka (MPI-CBG).
Kimwipes Ex-L Małe 111,76 mm x 213,36 mmKimtech Science34155pudełko/280-warstwowe
okulary Micro Cover Glasses, grubość 22 mm x 22 mm x 0,13 - 0,16 mmTed Pella2601401 uncja
dwustronnej taśmy nano Gel PU o wymiarach 29,5 stopy x 1,18 cala, grubość 1 mmSklep Yecaye (Amazon)L354 W1.182 rolki okularów
nakrywkowych Superslip, Grubość 24 mm x 50 mm x 0,13 - 0,16 mm TedPella2601661 uncja
Okulary Superslip, grubość 24 mm x 60 mm x 0,13 - 0,16 mmTed Pella2601681 uncja
deska do krojenia ze szkła hartowanegoHacaroa (AmazonkaB09XMXBT5S4 szt

Bibliografia

  1. McSteen, P., Kellogg, E. A. Molecular, cellular, and developmental foundations of grass diversity. Science. 377 (6606), 599-602 (2022).
  2. Wang, P., Vlad, D., Langdale, J. A. Finding the genes to build C4 rice. Current Opinion in Plant Biology. 31, 44-50 (2016).
  3. Wang, P., et al. Candidate regulators of early leaf development in maize perturb hormone signalling and secondary cell wall formation when constitutively expressed in rice. Scientific Reports. 7 (1), 4535(2017).
  4. Perico, C., Tan, S., Langdale, J. A. Developmental regulation of leaf venation patterns: Monocot versus eudicots and the role of auxin. New Phytologist. 234 (3), 783-803 (2022).
  5. Wang, P., Kelly, S., Fouracre, J. P., Langdale, J. A. Genome-wide transcript analysis of early maize leaf development reveals gene cohorts associated with the differentiation of C4 Kranz anatomy. The Plant Journal. 75 (4), 656-670 (2013).
  6. Liu, W. Y., et al. Regulators of early maize leaf development inferred from transcriptomes of laser capture microdissection (LCM)-isolated embryonic leaf cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (35), e2208795119(2022).
  7. Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (10), 3979-3984 (2013).
  8. Strable, J., Nelissen, H. The dynamics of maize leaf development: Patterned to grow while growing a pattern. Current Opinion in Plant Biology. 63, 102038(2021).
  9. Reynolds, J. O., Eisses, J. F., Sylvester, A. W. Balancing division and expansion during maize leaf morphogenesis: Analysis of the mutant, warty-1. Development. 125 (2), 259-268 (1998).
  10. Richardson, A. E., et al. Evolution of the grass leaf by primordium extension and petiole-lamina remodeling. Science. 374 (6573), 1377-1381 (2021).
  11. Johnston, R., Leiboff, S., Scanlon, M. J. Ontogeny of the sheathing leaf base in maize (Zea mays). New Phytologist. 205 (1), 306-315 (2015).
  12. Sharman, B. C. Developmental anatomy of the shoot of Zea mays L. Annals of Botany. 6 (22), 245-282 (1942).
  13. Johnston, R., et al. Transcriptomic analyses indicate that maize ligule development recapitulates gene expression patterns that occur during lateral organ initiation. The Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  14. Sharman, B. C. Leaf and bud initiation in the Gramineae. Botanical Gazette. 106 (3), 269-289 (1945).
  15. Nelissen, H., et al. A local maximum in gibberellin levels regulates maize leaf growth by spatial control of cell division. Current Biology. 22 (13), 1183-1187 (2012).
  16. Itoh, J., et al. Rice plant development: From zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  17. Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Iowa State University of Science and Technology. , (1986).
  18. Freeling, M., Walbot, V. The Maize Handbook. , Springer Science & Business Media. (2013).
  19. Freeling, M., Hake, S. Developmental genetics of mutants that specify knotted leaves in maize. Genetics. 111 (3), 617-634 (1985).
  20. Durbak, A. R., et al. Transport of boron by the tassel-less1 aquaporin is critical for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 26 (7), 2978-2995 (2014).
  21. Langdale, J. A., Lane, B., Freeling, M., Nelson, T. Cell lineage analysis of maize bundle sheath and mesophyll cells. Developmental Biology. 133 (1), 128-139 (1989).
  22. Bosabalidis, A. M., Evert, R. F., Russin, W. A. Ontogeny of the vascular bundles and contiguous tissues in the maize leaf blade. American Journal of Botany. 81 (6), 745-752 (1994).
  23. Junqueira, N. E. G., et al. Anatomy and ultrastructure of embryonic leaves of the C4 species Setaria viridis. Annals of Botany. 121 (6), 1163-1172 (2018).
  24. Robil, J. M., McSteen, P. Hormonal control of medial-lateral growth and vein formation in the maize leaf. New Phytologist. 238 (1), 125-141 (2023).
  25. Donnelly, P. M., Bonetta, D., Tsukaya, H., Dengler, R. E., Dengler, N. G. Cell cycling and cell enlargement in developing leaves of Arabidopsis. Developmental Biology. 215 (2), 407-419 (1999).
  26. Govindaraju, P., Verna, C., Zhu, T., Scarpella, E. Vein patterning by tissue-specific auxin transport. Development. 147 (13), (2020).
  27. Linh, N. M., Scarpella, E. Leaf vein patterning is regulated by the aperture of plasmodesmata intercellular channels. PLoS Biology. 20 (9), e3001781(2022).
  28. Verna, C., Ravichandran, S. J., Sawchuk, M. G., Linh, N. M., Scarpella, E. Coordination of tissue cell polarity by auxin transport and signaling. eLife. 8, e51061(2019).
  29. Sawchuk, M. G., Head, P., Donner, T. J., Scarpella, E. Time-lapse imaging of Arabidopsis leaf development shows dynamic patterns of procambium formation. New Phytologist. 176 (3), 560-571 (2007).
  30. Linh, N. M., Scarpella, E. Confocal imaging of developing leaves. Current Protocols. 2 (1), e349(2022).
  31. Poethig, R. S., Szymkowiak, E. J. Clonal analysis of leaf development in maize. Maydica. 40, 67-76 (1995).
  32. Sprangers, K., Thys, S., van Dusschoten, D., Beemster, G. T. S. Gibberellin enhances the anisotropy of cell expansion in the growth zone of the maize leaf. Frontiers in Plant Science. 11, 1163(2020).
  33. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 cofactors, BLH12 and BLH14, regulate internode patterning and vein anastomosis in maize. The Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  34. Schindelin, J., et al. FIJI: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Plant Care Protocols - Maize. The Donald Danforth Plant Science Center's Plant Growth Facility. , Available from: https://www.danforthcenter.org/our-work/core-facilities/plant-growth/ (2019).
  36. Mir, R., et al. A DII domain-based auxin reporter uncovers low auxin signaling during telophase and early G1. Plant Physiology. 173 (1), 863-871 (2017).
  37. DeBlasio, S. L., Sylvester, A. W., Jackson, D. Illuminating plant biology: Using fluorescent proteins for high-throughput analysis of protein localization and function in plants. Briefings in Functional Genomics. 9 (2), 129-138 (2010).
  38. Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: Generation and applications. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 535-543 (2013).
  39. Mohanty, A., et al. Advancing cell biology and functional genomics in maize using fluorescent protein-tagged lines. Plant Physiology. 149 (2), 601-605 (2009).
  40. Baker, R. F., et al. Sucrose transporter ZmSut1 expression and localization uncover new insights into sucrose phloem loading. Plant Physiology. 172 (3), 1876-1898 (2016).
  41. Gallavotti, A., Yang, Y., Schmidt, R. J., Jackson, D. The relationship between auxin transport and maize branching. Plant Physiology. 147 (4), 1913-1923 (2008).
  42. Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), 12(2015).
  43. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: A cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  44. Geng, Y., Zhou, Y. Confocal live imaging of shoot apical meristems from different plant species. Journal of Visualized Experiments. (145), e59369(2019).
  45. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell Biology. 139, Elsevier. 203-223 (2017).
  46. Fodor, E., Ayaydin, F. Fluorescent probes and live imaging of plant cells. Advances in Plant Ecophysiology Techniques. , Springer. 241-251 (2018).
  47. Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. The Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
  48. Conklin, P. A., Johnston, R., Conlon, B. R., Shimizu, R., Scanlon, M. J. Plant homeodomain proteins provide a mechanism for how leaves grow wide. Development. 147 (20), (2020).
  49. Shaw, S. L. Imaging the live plant cell. The Plant Journal. 45 (4), 573-598 (2006).
  50. Klaus, A. V., Schawaroch, V., Frischmann, K. J. Confocal imaging and three-dimensional visualization of thick autofluorescent specimens. Methods in Molecular Biology. 1075, 213-225 (2014).
  51. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Extended depth-of-focus for multi-channel microscopy images: a complex wavelet approach. 2004 2nd IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: Nano to Macro (IEEE Cat No. 04EX821). IEEE. , 660-663 (2004).
  52. Extended Depth of Field. EPFL Biomedical Imaging Group. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2022).
  53. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  54. Phillips, K. A., et al. vanishing tassel2 encodes a grass-specific tryptophan aminotransferase required for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 23 (2), 550-566 (2011).
  55. Robil, J. M., et al. GrasVIQ: An image analysis framework for automatically quantifying vein number and morphology in grass leaves. The Plant Journal. 107 (2), 629-648 (2021).
  56. Helliwell, C. A., Chandler, P. M., Poole, A., Dennis, E. S., Peacock, W. J. The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 2065-2070 (2001).
  57. Gutierrez, R., Quiroz-Figueroa, F., Vazquez-Ramos, J. M. Maize cyclin D2 expression, associated kinase activity and effect of phytohormones during germination. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 166-173 (2005).
  58. Atkinson, J. A., Wells, D. M. An updated protocol for high throughput plant tissue sectioning. Frontiers in Plant Science. 8, 1721(2017).
  59. Lux, A., Morita, S., Abe, J., Ito, K. An improved method for clearing and staining free-hand sections and whole-mount samples. Annals of Botany. 96 (6), 989-996 (2005).
  60. Heriche, M., Arnould, C., Wipf, D., Courty, P. E. Imaging plant tissues: Advances and promising clearing practices. Trends in Plant Science. 27 (6), 601-615 (2022).
  61. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  62. Chuck, G., Muszynski, M., Kellogg, E., Hake, S., Schmidt, R. J. The control of spikelet meristem identity by the branched silkless1 gene in maize. Science. 298 (5596), 1238-1241 (2002).
  63. Tran, T. M., et al. An optimized whole-mount immunofluorescence method for shoot apices. Current Protocols. 1 (4), e101(2021).
  64. O'Connor, D. L. PINs Lost and PINs Gained: Auxin-Transport Mediated Patterning in the Grasses. University of California, Berkeley. , Doctoral Dissertation (2012).
  65. Sharman, B. C., Hitch, P. A. Initiation of procambial strands in leaf primordia of bread wheat, Triticum aestivum L. Annals of Botany. 31 (2), 229-243 (1967).
  66. Serra, L., Tan, S., Robinson, S., Langdale, J. A. Flip-flap: A simple dual-view imaging method for 3D reconstruction of thick plant samples. Plants. 11 (4), 506(2022).
  67. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie fluorescencyjnerozwój liściarozwijanie się primordiumreportery białek fluorescencyjnychmorfologia liści trawsekcjonowanie tkanek
Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.