Method Article

Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego

DOI:

10.3791/65239

⸱

September 22nd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, School of Science and Engineering, Ateneo de Manila University, 2Division of Biological Sciences, Interdisciplinary Plant Group, and Missouri Maize Center, University of Missouri

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zawiązki liści kukurydzy są głęboko ukryte i zwinięte, co utrudnia ich badanie. W niniejszej pracy przedstawiono metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U kukurydzy (Zea mays) i innych traw (Poaceae), zawiązki liści są głęboko osłonięte i zwinięte w okółku liścia, co utrudnia badanie wczesnego rozwoju liści. W tym artykule opisano metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Pierwsza metoda wykorzystuje ściągacz izolacji do usuwania górnych części starszych liści, odsłaniając wierzchołek zawiązka liścia i umożliwiając jego pomiar w celu dokładniejszego pobrania próbek przekroju poprzecznego. Druga metoda wykorzystuje przezroczystą, dwustronną taśmę nano do rozwijania i montowania zawiązków całych liści do obrazowania. Pokazujemy przydatność tych dwóch metod w wizualizacji i analizie fluorescencyjnych reporterów białkowych w kukurydzy. Metody te stanowią rozwiązanie problemów związanych z charakterystyczną morfologią zawiązków liści kukurydzy i będą przydatne do wizualizacji i ilościowego określania cech anatomicznych i rozwojowych liści kukurydzy i innych gatunków traw.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uprawy traw są głównym źródłem żywności i biopaliw dla globalnej populacji1, a poprawa anatomii liści może potencjalnie zwiększyć ich produktywność2,3. Jednak nasza obecna wiedza na temat tego, w jaki sposób anatomia liści jest regulowana w trawach, jest ograniczona4 i wymaga analizy zawiązków liści, ponieważ wiele anatomicznych i fizjologicznych cech liścia jest z góry określonych na wczesnym etapie rozwoju5,6,7. Techniki obrazowania komórkowego, takie jak fluorescencja i obrazowanie konfokalne, są niezbędne do badania anatomii liści traw i cech komórkowych, ale techniki te są trudne do zastosowania do zawiązków liści trawy, ponieważ są one głęboko osłonięte i zwinięte w okółku liścia. Rozwiązaliśmy ten problem, opracowując metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych mocowań całych liści do analizy fluorescencyjnej i konfokalnej zawiązków liści kukurydzy, modelowego systemu do badania anatomii i rozwoju liści traw2,8.

Liść kukurydzy, podobnie jak wszystkie liście trawy, składa się z ostrza przypominającego pas z osłoną, która owija się wokół łodygi i rozwija pęd9,10,11,12,13. Liście rozwijają się z merystemu wierzchołkowego pędu (SAM) w zróżnicowany wzór, w którym każdy nowy liść rozpoczyna się w pozycji przeciwnej do poprzedniego liścia, co skutkuje dwoma rzędami liści wzdłuż osi pionowej (Rysunek 1A)14 . Stadium rozwojowe każdego zawiązka liścia jest identyfikowane na podstawie jego położenia względem SAM, przy czym najbliższe zawiązki są oznaczone jako plastochron1 (P1), a następujące po nich zawiązki są oznaczone jako P2, P3 i tak dalej (Rysunek 1B,C)2. Podczas rozwoju (Rysunek 1D), zawiązek liścia najpierw pojawia się jako półksiężycowata przypora wokół podstawy SAM (P1), a następnie wyrasta w zawiązek w kształcie kaptura, który rozciąga się nad merystemem (P2)9,10,11. Brzegi podstawy kaptura rozszerzają się następnie na boki i zachodzą na siebie, gdy końcówka rośnie w górę, tworząc zawiązek w kształcie stożka (P3-P5)10. Zawiązek następnie szybko rośnie na długość, a granica pochewka-blaszka u podstawy staje się bardziej widoczna wraz z utworzeniem języczka, przypominającego frędzle występu po stronie przyosiowej liścia (P6/P7). Wreszcie, liść rozwija się, gdy wyłania się z okółka podczas wzrostu w stanie ustalonym, w którym dzielące się komórki są ograniczone w małym obszarze podstawy blaszki, tworząc gradient z rozszerzającymi się i różnicującymi komórkami wzdłuż osi proksymalnej-dystalnej (P7/P8)15. Wierzchołek pędu siewki kukurydzy zawiera wiele zawiązków na różnych etapach rozwoju, co czyni go doskonałym modelem do badania rozwoju liści8.

Dokładna analiza wczesnego rozwoju liści wymaga oceny stopnia zaawansowania lub użycia standardowych kryteriów do zdefiniowania odrębnych etapów rozwoju primordium w stosunku do innych parametrów wzrostu lub morfologicznych. Ponieważ zawiązki liści są ukryte w pędach trawy, badacze zazwyczaj używają parametrów takich jak wiek rośliny lub wielkość pojawiających się liści jako predyktorów etapów i rozmiarów zawiązków liści9,16. W przypadku kukurydzy wiek chronologiczny rośliny zależy od liczby dni po posadzeniu lub wykiełkowaniu (DAP/DAG)17,18. Faza wegetatywna (faza V) jest określana przez najwyższy liść z widocznym kołnierzem, bladą linią po stronie abyjalnej między blaszką a pochwą, która odpowiada położeniu języczka i małżowin usznych, parę obszarów w kształcie klina u podstawy ostrza (Rysunek 1A,B)17,19 . Między 20 a 25 DAG SAM przechodzi w merystem kwiatostanowy i przestaje wytwarzać nowe liście20. Tempo wzrostu zawiązków liści kukurydzy może się różnić w zależności od środowiska i genotypu rośliny. Z tego powodu wiek roślin i wielkość pojawiających się liści nie mogą dokładnie przewidzieć wielkości zawiązków liściowych; Jednak użycie tych parametrów może pomóc w przewidywaniu zakresu stadiów i rozmiarów zawiązków do celów eksperymentalnych.

Analiza przekroju poprzecznego jest popularną metodą badania anatomii i rozwoju liści kukurydzy i innych traw, ponieważ pozwala na pobieranie próbek wielu plastochronów w jednej sekcji w poprzek pędu21,22,23. Metoda ta jest również wygodna do obrazowania komórkowego świeżych próbek, ponieważ otaczające liście służą jako rusztowanie, które utrzymuje zawiązki liści na miejscu podczas cięcia i montażu24. Jednak wadą tej metody jest to, że precyzyjne zlokalizowanie docelowego plastochronu i obszaru w zawiązkach podczas cięcia z nienaruszonego pędu może być trudne. Ponadto, ponieważ wzrost liści różni się w plastochronach i wzdłuż osi bliższej-dystalnej2,5, nieprecyzyjne pobieranie próbek może skutkować nieprawidłową interpretacją stadium rozwojowego i regionu zawiązków w danym przekroju. W związku z tym opracowanie metody precyzyjnego pobierania próbek o przekroju poprzecznym ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia dokładności i powtarzalności analiz anatomicznych i rozwojowych zawiązków liści traw.

Analiza montażu całych liści umożliwia kompleksowe i zintegrowane badanie procesów tkankowych i komórkowych zachodzących w skali całego narządu, takich jak wzrost proliferacyjny25 i wzorce żył26,27,28. Metoda zapewnia paradermalny przegląd liścia, umożliwiając odkrycie odrębnych procesów i wzorców, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia przy użyciu analizy przekroju poprzecznego24,27. W przeciwieństwie do rzodkiewnika pospolitego, gdzie istnieją już ustalone metody obrazowania wierzchowców całolistnych29,30, obecnie nie ma standardowej metody obrazowania rozwiniętych wierzchowców całolistnych u traw. Poprzedni protokół rozwijania izolowanych zawiązków liści kukurydzy obejmował rzadkie materiały i nie nadawał się do obrazowania komórkowego31. Zaawansowane techniki obrazowania, takie jak tomografia komputerowa (CT) i rezonans magnetyczny (MRI), mogą pozyskiwać informacje anatomiczne 3D bez izolowania i rozwijania zawiązków11,32,33, ale są drogie i wymagają specjalistycznego sprzętu. Opracowanie techniki przezwyciężania ograniczeń narzuconych przez falistą i stożkowatą morfologię zawiązków liści kukurydzy i innych traw posunęłoby naprzód badania nad ich cechami anatomicznymi i rozwojowymi.

Tutaj prezentujemy metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Wykorzystaliśmy te metody do ilościowego określenia liczby nerwów i mapowania przestrzenno-czasowego rozkładu hormonów w zawiązkach liści kukurydzy za pomocą białek fluorescencyjnych (FPs)24. Pierwsza metoda polega na usunięciu górnej części starszych liści z siewek kukurydzy za pomocą ściągacza izolacji (Rysunek 1E). Odsłaniając wierzchołek zawiązka (P5-P7), możliwe staje się określenie jego długości bez konieczności całkowitego usuwania starszych otaczających liści, umożliwiając w ten sposób łatwe i dokładne cięcie. Druga metoda polega na rozwinięciu i zamontowaniu zawiązków całych liści (P3-P7) za pomocą przezroczystej, dwustronnej taśmy nano (Rysunek 1F). Metody te są odpowiednie do wizualizacji różnych FPs24, ale wymagają optymalizacji pod kątem stosowania barwników fluorescencyjnych i odczynników czyszczących. Ponadto opisujemy kilka procedur spłaszczania stosów z, łączenia obrazów i scalania kanałów w ImageJ/FIJI34, które mają zastosowanie do obrazów utworzonych tymi dwiema metodami. Metody te są przydatne do rutynowego obrazowania fluorescencyjnego lub konfokalnego liści kukurydzy, ale można je również dostosować do innych modelowych gatunków traw, takich jak ryż, Setaria i Brachypodium.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Organizacja i morfologia zawiązków liści kukurydzy oraz przegląd metod. (A) Schematyczne przedstawienie siewki kukurydzy. Kukurydza ma dyferencyjną filotaksję, przy czym nowy liść rozpoczyna się w przeciwnej pozycji niż poprzedni liść. Numer liścia wskazuje chronologiczną kolejność, w jakiej liście wyłoniły się z kiełkowania (tj. pierwszy liść L1; drugi liść L2; trzeci liść L3 itd.). Każdy liść ma dystalną blaszkę i pochewkę podstawną wyznaczoną przez kołnierz, który odpowiada języczkowi i małżowinie usznej. Najwyższy liść z widocznym kołnierzem oznacza fazę wegetatywną. Sadzonka w tym przykładzie jest w fazie V2, z widocznym kołnierzem L2 (grotem strzały). Ikona nożyczek wskazuje miejsce w mezokotylu (me), w którym sadzonka musi zostać ścięta, aby mogła zostać zebrana. (B) Schematyczne przedstawienie wypreparowanego pędu pokazujące izolowane L1 do L4, z zawiązkami liści L5 do L9 pokazanymi jako powiększony obraz w (C). Numer plastochronu wskazuje położenie zawiązka względem SAM, przy czym najmłodszy zawiązek liścia (P1) znajduje się najbliżej SAM, a starsze zawiązki liści (P2, P3, P4 itd.) kolejno dalej2. (D) Schematyczne przedstawienie morfologii zawiązków liści kukurydzy od P1 do P5. (E) Schematyczny przegląd metody analizy przekroju poprzecznego zawiązków liści kukurydzy. (1) Przytnij starsze liście za pomocą ściągacza izolacji. (2) Zmierz zawiązki i przekrój pęd. (3) Zamontuj sekcję na szkiełku w celu obrazowania i przetwarzania (4, 5). (F) Schematyczny przegląd metody analizy zawiązków liści kukurydzy na całym wierzchu. (1) Usuń otaczające liście, aby usunąć zawiązek. (2) Wytnij i rozwiń primordium płasko na taśmie nano. (3) Zamontuj próbkę do obrazowania i przetwarzania (4, 5). Skróty: L = liść; BL = ostrze; sh = osłona; co = kołnierz; me = mezokotyl; V = wegetatywny; P = plastochron; SAM = merystem wierzchołkowy strzału. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Etap rozwoju liści kukurydzy i projektowanie eksperymentu

  1. Uprawa roślin i etap rozwoju liści
    1. Określ wiek i etap rozwoju roślin, które mają być użyte w eksperymencie, i przeprowadź szczegółową ocenę etapu rozwoju liści.
      UWAGA: Zaleca się, aby ocena stopnia zaawansowania została przeprowadzona na roślinach o takim samym tle genetycznym, jak zmutowane lub transgeniczne linie, które zostaną wykorzystane w doświadczeniach. SAM przestaje wytwarzać nowe liście między 20 a 25 DAG, w zależności od tła genetycznego i warunków wzrostu. Z tego powodu opisane tutaj metody są idealne dla siewek kukurydzy w wieku 7-14 DAG.
    2. Uprawiaj kukurydzę w szklarni lub komorze wzrostowej zgodnie z odpowiednim protokołem pielęgnacji roślin35.
    3. Zbierz rośliny w pożądanym wieku lub fazie V za pomocą małego noża lub nożyczek, przecinając mezokotyl, który jest łodygą pod powierzchnią gleby (Rysunek 1A). Ostrożnie włóż narzędzie tnące do gleby obok sadzonki i zsuń je do podstawy pod kątem 45°, aby przeciąć mezokotyl.
    4. Wyjmij sadzonkę z gleby i odkurz wszelkie pozostałe zanieczyszczenia lub cząstki gleby, które mogą przylegać do rośliny. Usuń ręcznie koleoptyl, osłonę ochronną pokrywającą pojawiający się pęd młodych siewek.
    5. Dla każdej rośliny zapisz etap V, liczbę liści i długość ostatniego liścia wyłaniającego się z okółka. Zrób zdjęcia roślin do wykorzystania w przyszłości.
    6. Usuń starsze liście jeden po drugim. Aby to zrobić, przytrzymaj roślinę za resztki mezokotylu lub łodygi i odetnij każdy liść od podstawy pochwy i delikatnie rozwiń pochwę w sposób okrężny za pomocą sondy dentystycznej (Rysunek 1B).
      UWAGA: Zobacz krok 2.1, aby zapoznać się z szybką metodą usuwania otaczających liści.
    7. Pod mikroskopem stereoskopowym przy około 2-krotnym powiększeniu ostrożnie wypreparuj resztę wierzchołka pędu na wilgotnych chusteczkach, aby zapobiec wyschnięciu próbki. Delikatnie wytnij i rozwiń zawiązek każdego liścia za pomocą sondy dentystycznej z wygiętą igłą lub parą cienkich kleszczy, aż SAM, P1 i P2 będą widoczne (Rysunek 1D). Zapisz wygląd i wymiary każdego plastochron.
      UWAGA: Patrz przykład etapu rozwoju liści u siewek kukurydzy w pliku uzupełniającym 1.
  2. Planowanie eksperymentu
    UWAGA: Staranne zaplanowanie eksperymentu może poprawić wydajność. Na przykład w analizie przekroju poprzecznego określenie przybliżonego miejsca do cięcia podczas obrazowania określonych plastochronów lub obszarów może skrócić czas sekcji. Rysunek 2 pokazuje przykład standardowego próbkowania. Co więcej, optymalizacja parametrów obrazowania w oparciu o właściwości FP lub sond fluorescencyjnych może poprawić wydajność eksperymentów.
    1. Wykorzystaj informacje o etapie etapu jako przewodnik, aby skoncentrować eksperyment na określonych plastochronach, obszarach zawiązków i tkankach. Użyj FP lub innych interesujących sond fluorescencyjnych, aby postępować zgodnie z sekcjami 2 i/lub 3 poniżej na kilku próbkach.
      UWAGA: Zobacz dostępne zapasy nasion kukurydzy FP linii 36-42 pod adresem https://www.maizegdb.org/data_center/stock.
    2. Określ optymalne parametry akwizycji obrazu dla każdego reportera lub sondy FP, w tym odpowiedni detektor lub filtr, długości fal wzbudzenia i emisji, rozmiar otworu i inne ustawienia. Zapisz ustawienia, aby odtworzyć warunki pracy dla każdego z eksperymentów.
      UWAGA: Zobacz Linh and Scarpella30, aby zapoznać się z wytycznymi technicznymi dotyczącymi konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej rozwijających się liści.
    3. Zaplanuj czas obrazowania w oparciu o okres półtrwania i inne właściwości FP reporter43.
      UWAGA: Planując eksperyment, należy również wziąć pod uwagę czas między preparacją a obrazowaniem, ponieważ świeże próbki roślin są w tym okresie poddawane suszeniu i zmianom komórkowym.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schemat pobierania próbek do analizy przekroju poprzecznego zawiązków liści kukurydzy. (A, po lewej) Proksymalny pęd siewki kukurydzy o sile 7 DAG, z odsłoniętym czwartym liściem (L4) na P7. Przerywane linie wskazują siedem punktów poboru próbek wzdłuż zawiązka, od 0,5 mm do 10 mm. (A, po prawej) Schematyczne przedstawienie zawiązków liści, z rzutowanym rozmiarem i położeniem każdego plastochronu: P7 (biały); P6 (magenta); P5 (niebieski); P4 (zielony); i P3 aż do SAM (żółty). (B-H) Obrazy fluorescencyjne przekrojów poprzecznych reprezentujących punkty poboru próbek pokazane w A od 10 mm (B) do 0,5 mm (H). Zawiązki są pseudozabarwione zgodnie ze schematem kolorów plastochronu w (A). Skrawki zostały zobrazowane za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy użyciu długoprzepustowego filtra UV do autofluorescencji. Podziałka = 200 μm (B-H). Ten rysunek został zmodyfikowany i powielony za zgodą Robila i McSteena24. Skróty: DAG = dni po wykiełkowaniu; P = plastochron; SAM = pęd merystem wierzchołkowy; † = pochwa liściowa lub właściwa ligula wstępna; * = pędź merystem wierzchołkowy; ** = rdzeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Obrazowanie przekrojów poprzecznych zawiązków liści kukurydzy

  1. Usuwanie starszych otaczających liści i pomiar zawiązków liści
    1. Zbierz sadzonkę, ostrożnie przecinając ją na mezokotylu pod powierzchnią gleby za pomocą małego noża lub nożyczek, jak opisano w krokach 1.1.3-1.1.4 (Rysunek 1A).
    2. Określ prawidłowy rozmiar otworu do ściągania izolacji, który ma być użyty, i miejsce, w którym zostanie wykonane cięcie wzdłuż pędu. Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby zmieścić się w docelowej zawiązce.
    3. Rozpocznij cięcie od bardziej dystalnej części pędu i stopniowo kieruj się w stronę podstawy, aż wierzchołek zawiązka zostanie odsłonięty.
    4. Aby wykonać cięcie, przytrzymaj ściągacz izolacji szczękami skierowanymi w stronę pędu. Umieść pęd w wybranym otworze i ściśnij uchwyty zgarniacza, aby przeciąć okółek liści.
      UWAGA: Aby uniknąć przypadkowego przecięcia docelowego zawiązka, ostrożnie wyrównaj środek pędu z otworem w ściągaczu izolacji. W przypadku większych roślin zaleca się ręczne usunięcie części otaczających liści przed użyciem strippera.
      UWAGA: Szczypce do ściągania izolacji mają ostre szczęki, które mogą powodować skaleczenia lub inne obrażenia, jeśli nie są używane ostrożnie.
    5. Kontynuując ściskanie uchwytów razem, odsuń ściągacz od pędu, aby przyciąć górną część liści. Upewnij się, że obszar docelowy w zawiązku pozostaje otoczony przez otaczające liście (rysunek uzupełniający S1C,D).
      UWAGA: Po przycięciu górnych liści pęd pozostawia się z odsłoniętą końcówką zawiązka (P5, P6 lub P7, w zależności od położenia cięcia i wielkości użytego otworu do ściągania izolacji; Rysunek 1E). Zawiązki te posłużą jako punkt odniesienia do oszacowania wielkości i stadium młodszych zawiązków. P6 jest najbardziej praktycznym odniesieniem do stosowania w siewkach kukurydzy ze względu na swój zakres wielkości i szpilkowatą morfologię.
    6. Użyj linijki, aby zmierzyć długość od czubka zawiązka do podstawy pędu. Zapisz pomiar.
      UWAGA: Długość zawiązka będzie nieco zawyżona, ponieważ u podstawy zawiązków znajduje się kilka milimetrów łodygi (Ryc. 2A).
  2. Odręczne cięcie i obrazowanie zawiązka liścia
    1. Pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu około 0,8x trzymaj pęd stabilnie na gładkiej powierzchni, takiej jak szklana deska do krojenia lub inny materiał odporny na zarysowania. Za pomocą żyletki lub skalpela wyciąć cienkie odcinki (0,25-0,8 mm) pędu w żądanych punktach na całej długości zawiązka.
    2. Wykonaj początkowe cięcie nieco powyżej obszaru docelowego, aby odrzucić dystalną część pędu, a następnie uzyskaj cienkie odcinki wokół obszaru docelowego. Aby wykonać czyste cięcia, trzymaj ostrze prostopadle do pędu i wsuń je do środka płynnym, równomiernym ruchem.
      UWAGA: W przypadku większych zawiązków (P6 lub P7) może istnieć kilka milimetrów swobody cięcia. Jednak w przypadku mniejszych zawiązków (P5 i wcześniejszych) 1 mm może mieć znaczące znaczenie w pobieraniu próbek, ponieważ zawiązki te są ułożone w stos w ciągu pierwszych kilku milimetrów od podstawy pędu (patrz Rysunek 2A,F-H). Zaleca się używanie obosiecznej żyletki do drobniejszego krojenia.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas używania żyletek i skalpeli, aby uniknąć przypadkowych skaleczeń lub obrażeń.
    3. Regularnie wymieniaj żyletkę, ponieważ osłony liści mogą łatwo stępić ostrze. Przykryj pęd wilgotnymi chusteczkami po każdej rundzie cięcia, aby zapobiec wyschnięciu próbki.
    4. Zamontuj część liścia na czystym szkiełku podstawowym (75 mm x 25 mm), za pomocą pipety nanieś kroplę wody (lub 50% glicerolu) bezpośrednio na sekcję, a na wierzch umieść szkiełko nakrywkowe (22 mm x 22 mm).
    5. Jeśli używasz barwnika fluorescencyjnego, nałóż roztwór barwnika na sekcję, umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i inkubuj go w razie potrzeby.
      UWAGA: W zależności od rodzaju barwnika, przed przejściem do następnego kroku mogą być konieczne dodatkowe etapy obróbki odcinków liścia. Te referencje44,45,46,47 zawierają ogólne informacje i zastosowania barwników fluorescencyjnych w obrazowaniu komórek roślinnych. Barwnik fluorescencyjny barwiący jądro, 5-etynylo-2′-deoksyurydyna (EdU), został skutecznie zastosowany na poprzecznych odcinkach zawiązków liści kukurydzy primordia48. Natomiast barwniki barwiące błonę plazmatyczną, takie jak Fei Mao 4-64 (FM 4-64) i jodek propidyny, nie dają zadowalających wyników (Rysunek 3A-D).
    6. Umieść szkiełko na stoliku epifluorescencyjnego lub konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego i dostosuj ostrość i ustawienia zgodnie z potrzebami, aby uwidocznić fluorofor30. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z ustawieniami oświetlenia i akwizycji obrazu stosowanymi dla wybranych linii reporterowych FP kukurydzy.
      UWAGA: Grube sekcje mogą wytwarzać wysoki poziom autofluorescencji tła. Rozważ kilka strategii obrazowania i przygotowania próbek, które mogą pomóc złagodzić ten problem30,49 (patrz Tabela 2).
      UWAGA: Zachowaj ostrożność i noś okulary ochronne podczas pracy z silnymi źródłami światła i laserami, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia oczu.
    7. Obraz przez przekrój skrzydła przy różnych powiększeniach i kanałach detekcji (w tym w oświetleniu jasnego pola)30. Użyj 4-krotnego powiększenia, aby zobrazować cały przekrój poprzeczny oraz 20-krotnego lub 40-krotnego powiększenia, aby zobrazować określone tkanki. Skróć czas naświetlania przy większych powiększeniach do obrazowania epifluorescencyjnego, aby chronić próbki przed szybkim fotowybielaniem (patrz Tabela 1).
    8. Przechwytuj obrazy całej sekcji lub określonych obszarów zainteresowania (ROI). Jeśli to konieczne, zdobądź z-stack, który jest serią obrazów wykonanych na różnych głębokościach ogniskowych30.
    9. Aby uzyskać stos z, najpierw określ górną i dolną pozycję w próbce, a następnie liczbę sekcji optycznych, które należy uchwycić między tymi pozycjami. Mniejsza liczba przekrojów optycznych skutkuje większym rozmiarem kroku Z, czyli odległością między każdą sekcją. W zależności od właściwości FP i zastosowanego powiększenia, należy uchwycić od trzech do 25 przekrojów optycznych o rozmiarach kroku z od 1 do 12 μm w celu zobrazowania przekrojów poprzecznych zawiązków liści kukurydzy.
      UWAGA: Aby spłaszczyć stos z, należy użyć odpowiedniej techniki renderowania objętości50, którą można wykonać za pomocą oprogramowania mikroskopu lub za pomocą ImageJ/FIJI34 (patrz kroki 4.1 i 4.2).
    10. Zapisz wszystkie pliki obrazów i skojarzone z nimi metadane, jeśli są dostępne.

Tabela 1: Ustawienia oświetlenia i akwizycji obrazu używane do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego wybranych reporterów FP kukurydzy. Skróty: FP = białko fluorescencyjne; TRITC = tetrametylorodamina; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; WLL = laser ze światłem białym; Ar-ion = laser argonowo-jonowy; HyD = detektor hybrydowy; AU = jednostka przewiewna; Hz = Hertz, linia skanowania na sekundę. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Obrazowanie rozwiniętych całych wierzchołków zawiązków liści kukurydzy

  1. Wypreparowanie zawiązków i przygotowanie szkiełka za pomocą nanotaśmy
    1. Zbierz sadzonkę, ostrożnie przecinając ją na mezokotylu pod powierzchnią gleby za pomocą małego noża lub nożyczek, jak opisano w krokach 1.1.3-1.1.4 (Rysunek 1A).
    2. Przygotuj szkiełko podstawowe (75 mm x 25 mm) za pomocą przezroczystej, dwustronnej taśmy nano (rysunek uzupełniający S1H) przed przystąpieniem do preparowania rośliny. Wytnij prostokątny kawałek nanotaśmy i przyklej go do środka czystego szkiełka podstawowego. Nie usuwaj plastikowej folii ochronnej z górnej strony taśmy.
      UWAGA: Określ rozmiar taśmy do użycia w zależności od rozmiaru próbek do zobrazowania (patrz przykłady próbek o dużych rozmiarach na rysunku uzupełniającym S1I,J). Taśma nano jest dostępna w wersji akrylowej lub żelowej poliuretanowej. Oba typy są skuteczne w obrazowaniu fluorescencyjnym i konfokalnym24. Aby zapobiec odbarwieniu taśmy, należy chronić ją przed długotrwałym działaniem światła, przechowując ją w ciemnym pojemniku.
    3. Rozpocznij preparowanie pędu od usunięcia górnej części starszych liści za pomocą ściągacza izolacji, jak opisano w kroku 2.1.
    4. Przytrzymaj pęd za mezokotyl i ostrożnie usuń otaczające liście za pomocą sondy dentystycznej, aby wydobyć zawiązki. Aby to zrobić, usuń liście z podstawy pędu i rozwijaj je pojedynczo, aż odsłonięte zostanie zawiązki, które
      5. Cię interesują.
    5. Alternatywnie, użyj ściągacza izolacji, aby bezpośrednio usunąć zawiązki liści, wykonując nacięcie w podstawowej części pędu (rysunek uzupełniający S1E-G).
      UWAGA: Ta metoda niesie ze sobą większe ryzyko pęknięcia zawiązków.
  2. Montaż i obrazowanie zawiązka.
    1. Usuń folię ochronną z taśmy. Połóż odsłonięte zawiązki na taśmie. Użyj żyletki, aby przeciąć zawiązek u podstawy, odrzucając podstawową łodygę i hipokotyl (Rysunek 1F).
    2. Rozwiń zawiązek za pomocą sondy dentystycznej z wygiętą igłą (średnica końcówki 0,25-0,6 mm). Użyj mikrosondy (średnica końcówki 0,15-0,2 mm) dla zawiązków mniejszych niż 3 mm (od P3 do wczesnej P4).
    3. Ustawić końcówkę igły równolegle do powierzchni i rozwinąć zewnętrzny brzeg podstawy, delikatnie dociskając go do taśmy.
    4. Aby uzyskać płynniejsze rozwijanie, nasmaruj wewnętrzną powierzchnię (adaksyjną) liścia, zanurzając końcówkę igły w 100% glicerolu.
    5. Tak aby zewnętrzny brzeg przylegał do taśmy, wyrównaj końcówkę igły równolegle do długiej osi liścia. Delikatnie przesuń igłę na boki, aby rozwinąć i spłaszczyć liść na taśmie (Rysunek 1F).
      UWAGA: Łamanie lub uszkadzanie liścia podczas rozwijania jest powszechne, szczególnie w większych zawiązkach z mocnym nerwem środkowym (patrz Rysunek 3E-G). Energiczne rozwijanie liścia może spowodować obtłuczenie jego powierzchni i wytworzenie artefaktów podczas obrazowania (Rysunek 3H). Tabela 2 i dyskusja zawierają zalecane rozwiązania tych problemów.
    6. Nanieś kroplę wody na rozwinięte zawiązki. Natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe na kropli wody i zawiązku. Delikatnie dociśnij krawędzie szkiełka nakrywkowego, tak aby przylegały do taśmy.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie dużych prostokątnych szkiełek nakrywkowych (50 mm x 24 mm lub 60 mm x 24 mm) z dodatkowymi obszarami do przylegania do taśmy. Zminimalizuj tworzenie się pęcherzyków powietrza, które mogą zniekształcać liść i powodować nierównomierne załamanie światła (patrz Rysunek 3I-K). Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe całkowicie przylega do taśmy, ponieważ brzegi zamontowanego primordium mogą się ponownie zwinąć pod luźno przylegającym szkiełkiem nakrywkowym (patrz Rysunek 3L).
    7. Umieść szkiełko na stoliku epifluorescencji (patrz rysunek uzupełniający S1K) lub konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego i dostosuj ostrość i ustawienia zgodnie z potrzebami, aby uwidocznić fluorofor30. W Tabeli 1 przedstawiono ustawienia oświetlenia i akwizycji obrazu stosowane dla wybranych linii reporterowych FP kukurydzy.
    8. Zobrazuj cały liść lub określony zwrot z inwestycji za pomocą różnych kanałów wykrywania30. Aby zobrazować cały liść, należy ręcznie wykonać mozaikowe obrazy liścia lub użyć operacji układania w mikroskopie przy małym powiększeniu (4x lub 10x).
      UWAGA: Nawet przy najmniejszym powiększeniu zawiązki liści kukurydzy mogą być zbyt duże, aby można je było zobrazować za pomocą epifluorescencji lub konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, co skutkuje dłuższym czasem obrazowania, co może skutkować fotowybielaniem (patrz Rysunek 3M) lub zwiększoną autofluorescencję tła. Dlatego zaleca się stosowanie stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania próbek całych liści większych niż 5 mm.
    9. W przypadku obrazowania konfokalnego konieczne będzie uzyskanie z-stacków, które obejmują grubość liścia (patrz krok 2.2.9).
    10. Zapisz wszystkie pliki obrazów i skojarzone z nimi metadane, jeśli są dostępne.

Tabela 2: Rozwiązywanie typowych problemów z obrazowaniem przekrojów poprzecznych i całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Nieoptymalna preparacja poprzeczna i całościowe przygotowanie zawiązków liści kukurydzy. (A-D) Reprezentatywne obrazy konfokalne przekrojów poprzecznych zawiązków liści ze znacznikiem błony komórkowej, PIP2-1-CFP (A), i barwnikiem fluorescencyjnym wiążącym błonę plazmatyczną, FM 4-64 (B), z odpowiadającymi im obrazami jasnego pola (C,D). W porównaniu do PIP2-1-CFP, FM 4-64 wyświetla nieoptymalną wizualizację konturów komórek. (E-M) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne całych wierzchowców zawiązków liści wykazujące obecność rozdarć (E-G), posiniaczonych powierzchni† (H), pęcherzyków powietrza* (I-K), odchylonych do tyłu brzegów (L) i obszarów wybielonych fotometrem‡ (M). Zawiązki liści wyrażają DII-Venus (E-G), GAR2-YFP (H-J), mDII-Venus (K), PIN1a-YFP (L) i DR5-RFP (M). Podziałka = 200 μm (A-D); 500 μm (E-M). Rysunek 3A został zmodyfikowany i powielony za zgodą Robila i McSteena24, natomiast Rysunek 5B-M to niepublikowane dane od autorów. Skróty: P = plastochron; YFP = żółte białko fluorescencyjne; RFP = czerwone białko fluorescencyjne; CFP = cyjan fluorescencyjne białko; PIP2-1-CFP = pZmPIP2-1::ZmPIP2-1:CFP; DII-Wenus = pZmUbi:DII:YFP-NLS; GAR2-YFP = pZmGAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Wenus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS; PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; BF = jasne pole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przetwarzanie obrazów za pomocą ImageJ/FIJI

  1. Spłaszczanie stosów Z przy użyciu projekcji o maksymalnej intensywności (MIP)
    1. Uruchom ImageJ/FIJI i otwórz stos obrazów lub utwórz nowy stos z wielu oddzielnych obrazów, wybierając pozycję Obraz | Stosy | Obrazy do ułożenia w stos z menu.
    2. Zaznacz stos obrazów. Z menu wybierz Obraz | Stosy | Projekt Z.... W oknie dialogowym Z-Project wybierz opcję Max Intensity (Maksymalna intensywność) z menu rozwijanego Projection type (Typ projekcji). Kliknij przycisk OK, aby utworzyć projekcję z o maksymalnej intensywności.
      UWAGA: Spłaszczony obraz jest projekcją 2D pikseli o największej intensywności w całym polu z-stacks50. Metoda ta jest odpowiednia do wizualizacji fluoroforu, ale nie cech anatomicznych na obrazach w jasnym polu grubych przekrojów poprzecznych i mocowań całych liści.
    3. Zapisz obraz w formacie TIFF (Tagged Image File Format), wybierając Plik | Zapisz jako | Niedźwięczny. Wprowadź nazwę pliku i kliknij przycisk Zapisz.
      UWAGA: Zaleca się używanie formatu TIFF do przechowywania obrazów fluorescencyjnych i konfokalnych, ponieważ zachowuje on jakość i szczegóły po zapisaniu obrazu.
  2. Spłaszczanie stosów z użyciem wtyczki EDF (Extended Depth of Field)51
    1. Zainstaluj wtyczkę EDF52. Pobierz plik Extended_Depth_Field.jar (wersja 17.05.2021) z http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ i umieść go w folderze "plugins" w ImageJ/FIJI.
    2. Uruchom ImageJ/FIJI i otwórz stos obrazów lub utwórz nowy stos z wielu oddzielnych obrazów, wybierając pozycję Obraz | Stosy | Obrazy do ułożenia w stos z menu.
    3. Zaznacz stos obrazów. Z menu wybierz Wtyczki | Rozszerzona głębia ostrości | Tryb łatwy EDF. W oknie dialogowym Rozszerzona głębia ostrości użyj suwaków w obszarze Szybkość/Jakość, aby ustawić żądaną jakość i szybkość przetwarzania, oraz Reg mapy wysokości, aby ustawić poziom gładkości topografii. Kliknij przycisk Uruchom, aby utworzyć zrekonstruowany obraz.
      UWAGA: EDF łączy stos w ostry, złożony obraz 2D, wyświetlając najlepszy obraz focus51. Technika ta jest przydatna do przezwyciężania ograniczonej głębi ostrości i nadaje się do rekonstrukcji obrazów w jasnym polu o grubych przekrojach poprzecznych lub mocowań całych liści. Należy zachować ostrożność podczas stosowania tego filtra w celu wizualizacji fluoroforu, ponieważ, w przeciwieństwie do MIP, EDF dostosowuje kontrast obrazu, wpływając na intensywność pikseli.
    4. Zapisz obraz jako plik TIFF, wybierając kolejno opcje Plik | Zapisz jako | Niedźwięczny. Wprowadź nazwę pliku i kliknij przycisk Zapisz.
  3. Łączenie obrazów za pomocą wtyczki Grid/Collection Stitching53
    1. Zapisz kolekcję obrazów lub stosów obrazów, aby zszyć je w jednym katalogu.
    2. Uruchom ImageJ/FIJI i wybierz Wtyczki | Szwy | Zszywanie siatki/kolekcji z menu. W oknie dialogowym Zszywanie siatki/kolekcji wybierz opcję Nieznana pozycja z menu rozwijanego Typ, a następnie pozycję Wszystkie pliki w katalogu z listy Kolejność. Kliknij przycisk OK.
    3. W oknie dialogowym Łączenie siatki: Nieznane, w oknie dialogowym Wszystkie pliki w katalogu określ położenie obrazów, wpisując lub wklejając ścieżkę katalogu w polu tekstowym Katalog lub klikając przycisk Przeglądaj..., aby zlokalizować katalog. Kliknij przycisk OK, aby rozpocząć proces zszywania.
      UWAGA: Opcja Nieznana pozycja we wtyczce Grid/Collection Stitching rekonstruuje obraz kompozytowy z zestawu ciągłych obrazów, analizując ich nakładające się obszary. Dlatego ta opcja jest przydatna do zszywania mozaik obrazów przekrojów poprzecznych lub mocowań całych liści, które nie są uzyskiwane za pomocą operacji skanowania płytek.
    4. Po zakończeniu zszywania pojawi się nowe okno ze zszytym obrazem. Zapisz obraz jako plik TIFF, wybierając kolejno opcje Plik | Zapisz jako | Niedźwięczny. Wprowadź nazwę pliku i kliknij przycisk Zapisz.
      UWAGA: Łączenie dużych montaży obrazów 2D i 3D można również wykonać za pomocą poleceń rekonstrukcji obrazu w oprogramowaniu mikroskopu lub za pomocą opcji importu formatów biologicznych w ImageJ/FIJI.
  4. Łączenie wielu kanałów za pomocą polecenia Scal kanały
    1. Uruchom ImageJ/FIJI i otwórz obrazy lub stosy obrazów do scalenia.
      UWAGA: Stosy obrazów można najpierw spłaszczyć, wykonując kroki 4.1 lub 4.2. MIP jest ogólnie zalecany do spłaszczania kanałów fluoroforowych, podczas gdy EDF lepiej nadaje się do spłaszczania kanałów jasnego pola lub innych kanałów o różnej głębokości ostrości.
    2. Dostosuj jasność i kontrast obrazów za pomocą opcji Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast. Użyj suwaków lub pól wejściowych, aby dostosować parametry, a następnie kliknij przycisk Zastosuj. Alternatywnie można użyć metody rozciągania histogramu liniowego, wybierając punkt menu Proces | Zwiększ kontrast.... Ustaw wartość procentową Nasyconych pikseli, wybierz opcję Normalizuj, a następnie kliknij przycisk OK.
      UWAGA: Podczas ilościowego określania lub porównywania intensywności sygnału fluoroforu między obrazami generalnie najlepiej nie regulować jasności ani kontrastu, ponieważ może to zmienić względną intensywność pikseli na obrazie, co może wpłynąć na pomiary i porównania.
    3. Aby rozróżnić kanały, zastosuj pseudokolory do określonych obrazów za pomocą tabeli przeglądowej (LUT). Aby to zrobić, wybierz obraz, a następnie z menu ImageJ/FIJI wybierz Obraz, kliknij Tabele przeglądowe i wybierz odpowiednią tablicę LUT z listy rozwijanej.
    4. Z menu wybierz Obraz | Kolor | Scalanie kanałów. Dla każdego kanału (C1, C2, C3...) użyj listy rozwijanej, aby wybrać obraz, który ma zostać przypisany do tego kanału. Kliknij przycisk OK, aby scalić kanały.
    5. Zapisz nowy obraz w formacie TIFF, wybierając pozycję Plik | Zapisz jako | Niedźwięczny. Wprowadź nazwę pliku i kliknij przycisk Zapisz.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza przekroju poprzecznego zawiązków liści kukurydzy
Wykorzystaliśmy sekcję protokołu 2 do ilościowego określenia liczby żył i scharakteryzowania wzorców odpowiedzi hormonalnej w przekrojach poprzecznych zawiązków liści kukurydzy z FP ( Rysunek 4) < klasa sup = "xref">24. Aby ocenić rolę hormonu roślinnego auksyny we wzroście liści i tworzeniu nerwów, określiliśmy ilościowo liczbę żył w zawiązkach liści mutanta kukurydzy z niedoborem auksyny, znikającego chwost254. We wczesnych plastochronach rozwijające się żyły wykazują wyraźną celularyzację w środkowej warstwie komórkowej primordium liści kukurydzy21,22. Jednak identyfikacja i liczenie żył przy użyciu konwencjonalnych technik histologicznych22 może być pracochłonne i czasochłonne. Tak więc, aby określić ilościowo żyły, wykorzystaliśmy marker białka wypływu auksyny kukurydzianej pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP dalej), który oznacza rozwijające się żyły i nici prokambialne (PCS; Rysunek 4A). Korzystając z sekcji 2 protokołu, byliśmy w stanie ustandaryzować pobieranie próbek przekroju poprzecznego, mierząc zawiązki przed przekrojem (Rysunek 4B,C). Odkryliśmy trend, w którym vt2 ma szersze zawiązki i więcej żyłek niż normalnie (Figure 4D,E)24, co jest zgodne z danymi z w pełni rozwiniętych liści55, co wskazuje, że wada vt2 rozpoczęła się na wczesnym etapie rozwoju liści. Korzystając z sekcji 2 protokołu, byliśmy również w stanie systematycznie badać wzorce ekspresji reporterów odpowiedzi hormonalnej FP w zawiązkach liści (patrz przykłady obrazów w Rysunek 4F-I). Poprzez standaryzowany schemat pobierania próbek przekroju poprzecznego zmapowaliśmy rozkład odpowiedzi auksyny, cytokininy (CK) i kwasu giberelinowego (GA) w różnych plastochronach i regionach zawiązków liści i odkryliśmy nowe wzorce odpowiedzi, które, jak przypuszczamy, mają wpływ na wzrost liści i tworzenie się nerwów24. W związku z tym te reprezentatywne wyniki wskazują na przydatność sekcji 2 protokołu do analizy przekroju poprzecznego zawiązków liści kukurydzy.

figure-results-1
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki analizy przekroju poprzecznego zawiązków liści kukurydzy. (A-E) Kwantyfikacja liczby nerwów i szerokości zawiązków w zawiązkach liści prawidłowego i zanikającego frędzla2 za pomocą markera białka wypływu auksyny PIN1a-YFP. (A) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne przekrojów poprzecznych od P5 do P7 wyrażających PIN1a-YFP w rozwijających się żyłach i niciach prokambialnych. Przekroje poprzeczne zobrazowano mikroskopem epifluorescencyjnym z użyciem filtra FITC (wzbudzenie 495-519 nm). Liczbę żył i szerokość zawiązka określono ilościowo za pomocą narzędzi do linii wielopunktowej i odręcznej odpowiednio w FIJI/ImageJ. (B) Sadzonka kukurydzy z usuniętymi okółkami górnych liści za pomocą drucianego ściągacza izolacji w celu odsłonięcia wierzchołka czwartego liścia (L4). Nawias obejmuje rzutowaną długość zawiązków, z linią przerywaną wskazującą środkową długość. (C) Schemat ideowy przedstawiający różne kształty zawiązków od P5 do P7, ilustrujący, jak liczba żył i szerokość zawiązków w połowie długości (pozioma linia przerywana) mogą się różnić w zależności od stadium rozwojowego zawiązka. (D,E) Pomiar szerokości zawiązka (D) i liczby żył (E) w środkowym odcinku długości L4 normalnej i vt2. Linia trendu przedstawia 10 mm średnie kroczące pomiarów ± błędem standardowym średniej (SEM). (F-I) Reprezentatywne obrazy konfokalne poprzecznych odcinków zawiązków liści wyrażających kombinacje PIN1a-YFP, reportera odpowiedzi auksyny, DR5-RFP, reportera odpowiedzi cytokininy, TCS-Tomato, markera reagującego na kwas giberelinowy, GAR2-YFP i mDII-Venus, zmutowanej wersji reportera sygnału wejściowego auksyny DII-Venus. Kanały FP są nakładane na kanał jasnego pola na każdym obrazie. Podziałka = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Ten rysunek został zmodyfikowany i powielony za zgodą Robila i McSteena24. Skróty: DAG = dni po wykiełkowaniu; P = plastochron; vt2 = znikający frędzle2; PCS = pasmo prokambialne; YFP = żółte białko fluorescencyjne; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; RFP = czerwone białko fluorescencyjne; PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Pomidor = TCSv2::NLS-tdPomidor; GAR2-YFP = pZmGAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Wenus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Całościowa analiza zawiązków liści kukurydzy
Postępowaliśmy zgodnie z sekcją 3 protokołu, aby zwizualizować i przeanalizować ekspresję FP w zawiązkach całych liści zawiązków liści kukurydzy ( Rysunek 5). Wizualizując wzory żył za pomocą PIN1a-YFP, stwierdziliśmy, że tworzenie się żył zachodzi w całym zawiązku podczas wczesnych plastochronów, ale proces ten zostaje ograniczony w obszarach proksymalnych w późniejszym okresie rozwoju (Rysunek 5A)24. Uzupełnienie analiz przekroju poprzecznego, analizy montażu całych liści ujawniły specyficzne dla tkanek i etapów wzorce odpowiedzi hormonalnej podczas tworzenia nerwów24. Jednym z przykładów jest wzorzec wyrażenia reportera odpowiedzi CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), względem wyrażenia PIN1a-YFP (Rysunek 5B)24. Postępując zgodnie z sekcją 3 protokołu, byliśmy w stanie przeprowadzić zarówno jakościowe, jak i ilościowe analizy ekspresji FP w zawiązkach liści (Rysunek 5D-F; dane niepublikowane). Zbadaliśmy wzorce ekspresji reportera odpowiedzi auksyny, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP) i markera reagującego na GA, pZmGAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), w całolistnych montowaniach pojedynczych i podwójnych mutantów vt2 i rośliny karłowatej 3 (d3), mutanta z niedoborem GA56 (Rysunek 5D). Porównaliśmy również względne poziomy proliferacji komórek między prawidłowymi a vt2 zawiązkami liści za pomocą pZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), który jest markerem przejścia G1/S w cyklu komórkowym57 (Rysunek 5E,F). Chociaż nie było znaczącej różnicy między normą a vt2, ekspresja cykliny-D2B-YFP była zgodna ze znanym profilem proliferacji komórek wczesnych plastochronów31. Dochodzimy do wniosku, że sekcja 3 protokołu jest skuteczną metodą analizy całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy, które są trudne do zobrazowania ze względu na ich fałdowaną morfologię.

figure-results-2
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki dla analizy całego zawiązka liści kukurydzy. (A) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne zawiązków liści 7 siewek kukurydzy DAG pokazujące rozwijające się żyłki i pasma prokambialne, oznaczone markerem białka wypływu auksyny PIN1a-YFP. Zawiązki P3-P6 wycięto z podstawy, rozwinięto i spłaszczono stroną adaksjalną do góry. Wstawki pokazują zbliżenia P3 i P4. W P5 i P6 linie przerywane wyznaczają dystalny koniec stref proliferacyjnych, w których większość nici prokambialnych nadal się rozwija i rozciąga. (B,C) Reprezentatywne obrazy konfokalne pokazujące ekspresję PIN1a-YFP i reportera odpowiedzi cytokininy, TCS-Tomato, w bliższym obszarze brzeżnym zawiązka P5. (D) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne zawiązków P4 pokazujące ekspresję reportera odpowiedzi auksynowej, DR5-RFP i markera reagującego na kwas giberelinowy, GAR2-YFP w normalnych oraz pojedynczych i podwójnych mutantach znikającego frędzla2 i rośliny karłowatego3. (E) Reprezentatywne obrazy konfokalne P3 i/lub P4 pokazujące ekspresję cykliny-D2B-YFP, reportera przejścia G1/S w cyklu komórkowym. (F) Względne ilości proliferacji komórek w zawiązkach liści P3/P4 normalnych i vt2, określone ilościowo przez pomiar zintegrowanej gęstości sygnału Cyclin-D2B-YFP na obszarze zawiązków za pomocą ImageJ/FIJI. Słupki reprezentują średnie pomiary ± błąd standardowy średniej. Podziałka = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (C). Rysunek 4A-C został zmodyfikowany i powielony za zgodą Robila i McSteena24, podczas gdy Rysunek 4D-F to niepublikowane dane od autorów. Skróty: DAG = dni po wykiełkowaniu; P = plastochron; vt2 = znikający frędzel2; d3 = roślina karłowata3; YFP = żółte białko fluorescencyjne; RFP = czerwone białko fluorescencyjne; PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Pomidor = TCSv2::NLS-tdPomidor; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = pZmGAR2::ZmGAR2:YFP; Cyklina-D2B-YFP = pZmCyklina-D2B::ZmCyklina-D2B:YFP; ns = brak znaczącej różnicy; au = dowolna jednostka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Przykłady etapów rozwoju liści u siewek kukurydzy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S1: Próbki roślin i materiały użyte w protokołach. Panie przewodniczący, panie i panowie! Sadzonka kukurydzy 7-8 DAG z usuniętym górnym okółkiem liści za pomocą ściągacza izolacji. (B) Wstawka przedstawia zbliżenie pędu z odsłoniętym zawiązkiem P6. (C-G) Pędy siewek kukurydzy z usuniętymi górnymi okółkami w celu analizy przekroju poprzecznego (C,D) i całkowicie usuniętymi otaczającymi liśćmi w celu analizy całego montażu (E-G). (H) Rolka przezroczystej dwustronnej taśmy nano z żelem poliuretanowym. (I,J) Zawiązek (I) liścia P6 i obszar proksymalny liścia P8 (J) rozwinięte i zamontowane na szkiełkach za pomocą taśmy nano. (K) Szkiełko podstawowe z rozwiniętym zawiązkiem liści zamontowane na stoliku mikroskopu epifluorescencyjnego. Skrót: DAG = dni po wykiełkowaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy dwie metody przygotowania zawiązków liści kukurydzy do obrazowania komórkowego. Pierwsza metoda (sekcja protokołu 2) umożliwia pomiar zawiązków do analizy przekroju poprzecznego, podczas gdy druga metoda (sekcja protokołu 3) umożliwia rozwinięcie i spłaszczenie zawiązka do analizy całego montażu. Metody te ułatwiają obrazowanie komórkowe FP w zawiązkach liści kukurydzy24 (jak pokazano na rys. 4 i ryc. 5) i zapewniają proste rozwiązania problemów związanych z obrazowaniem rozwijających się liści kukurydzy. Sekcja 2 protokołu skraca czas preparacji i poprawia dokładność pobierania próbek poprzez pomiar zawiązków przed sekcją, zamiast polegać wyłącznie na parametrach stopnia zaawansowania 9,16. Dzięki dostępnej na rynku taśmie nano, sekcja protokołu 3 rozwiązuje długotrwały problem obrazowania zawiązków całych liści w kukurydzy. Protokół ten jest lepszy od poprzedniej metody, w której wykorzystano rurki do dializy31 i jest znacznie tańszą alternatywą dla tomografii komputerowej i rezonansu magnetycznego 11,32,33. Jednak jeśli chodzi o wizualizację cech anatomicznych liści i uzyskiwanie optymalnych wyników, oba protokoły mają pewne ograniczenia, które przedstawiono w tabeli 2 i omówiono bardziej szczegółowo poniżej.

W sekcji 2 protokołu napotkaliśmy trudności z wizualizacją konturów komórek w grubych poprzecznych odcinkach zawiązków liści, a barwienie przeciwstawne barwnikami fluorescencyjnymi wiążącymi ścianę komórkową lub błonę plazmatyczną nie przyniosło zadowalających wyników. Na przykład FM 4-64 dawał nieoptymalne wyniki w porównaniu z markerem FP błony komórkowej, pZmPIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Rysunek 3A-D). Aby przezwyciężyć to ograniczenie, zalecamy użycie wibratomu do wytworzenia cieńszych odcinków tkanek (~0,1 mm)58, co pozwoli na żywe obrazowanie konturów komórek w jasnym polu lub optymalizację protokołu barwienia przeciwdziałającego barwieniu47,59.

W sekcji 3 protokołu głównym ograniczeniem jest trudność w zamontowaniu skrzydła bez rozdarcia, uszkodzenia lub pęcherzyków powietrza, jak opisano w krokach protokołu 3.2.5-3.2.6 (Rysunek 3E-K). Ponieważ liść kukurydzy jest obustronnie symetryczny, do wizualizacji 9 może wystarczyć montaż na połowie liścia, a nie na całym liściu. Aby to zrobić, zawiązek można przeciąć żyletką wzdłuż osi podłużnej po rozwinięciu go do nerwu środkowego, umożliwiając zamontowanie tylko połowy liścia. Kolejnym ograniczeniem sekcji 3 protokołu jest to, że grubość liścia może ograniczać rozdzielczość optyczną sygnału fluoroforowego podczas głębokiego obrazowania. Aby rozwiązać ten problem, możliwe jest zastosowanie techniki oczyszczania tkanek60. Odkryliśmy jednak, że ClearSee61, powszechnie stosowany odczynnik czyszczący do obrazowania tkanek roślinnych, nie jest zgodny z protokołem, ponieważ powoduje oderwanie próbki i szkiełka nakrywkowego od taśmy nano. Potencjalnym rozwiązaniem tego problemu może być nałożenie półprzepuszczalnej membrany31 na próbkę liścia, co pozwoli na potraktowanie jej roztworem czyszczącym, jednocześnie utrzymując ją na miejscu przez nanotaśmę. Taka metoda, która pozwala na nałożenie płynnych roztworów na rozwinięty liść, może być również wykorzystana do technik hybrydyzacji i immunolokalizacji całego RNA in situ, które wcześniej zostały zoptymalizowane pod kątem rozwoju kwiatostanów kukurydzy, ale nie dla zawiązków całych liści62,63.

Opisaliśmy protokoły dla kukurydzy, która ma duże zawiązki liści już na etapie siewki. Inne gatunki traw ze znacznie mniejszymi zawiązkami liści, takie jak ryż, jęczmień, pszenica, Setaria i Brachypodium 16,23,64,65,66, mogą wymagać użycia dodatkowych precyzyjnych narzędzi, aby skutecznie zastosować te protokoły. Co więcej, protokoły te nie były przeznaczone do obrazowania żywych komórek, które rejestruje dynamiczne procesy tworzenia tkanek i odpowiedzi komórkowych w czasie rzeczywistym. Jednak w miarę postępów w dziedzinie obrazowania żywych komórek 67 sond fluorescencyjnych, technologii obrazowania i możliwości obliczeniowych67 roślin, przyszłe badania mogą opierać się na tych protokołach w celu opracowania strategii obrazowania żywych komórek dostosowanych do unikalnych cech zawiązków liści trawy.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Maize Genetics Cooperation, The Maize Cell Genomics Project, Dave'owi Jacksonowi (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrei Gallavotti (Rutgers University, NJ) i Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) za dostarczenie zmutowanych i transgenicznych zasobów, a także Robertowi F. Bakerowi i Alexandrowi Jurkiewiczowi z Advanced Light Microscopy Core w University of Missouri-Columbia za pomoc w mikroskopii konfokalnej. JMR był wspierany przez J. William Fulbright Fellowship, The Diane P. and Robert E. Sharp Fund oraz National Science Foundation's Plant Genome Research Program (IOS-1546873) do PM. CDTC, CMRV, EDCDP i RJRR są wspierane przez program stypendialny Ateneo College. CDTC, EDCDP i RJRR są wspierane przez stypendium licencjackie DOST-SEI S&T. DODL jest wspierany przez Stypendium Naukowe im. ks. Thomasa Steinbuglera SJ. RJRR jest wspierany przez Aiducation International – Stypendium Pathways to Higher Education. Prace te były wspierane przez Szkołę Nauki i Inżynierii oraz Bibliotekę Rizal Uniwersytetu Ateneo de Manila.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Akrylowa żel przezroczysty dwustronna taśma nano Tape 16,5 stopy x 1,2 cala, grubość 2 mmSklep EZlifego (AmazonkaB07YB1ZXG61 rolka
Bellucci Pick Zakrzywiona mikrosonda 16,8 cm, 6,6 calaBausch & LombN1692 9 1szt
Mikrosonda prowadząca Clayman Hak Sinskey kątowy wałek, 11,6 cm, 4,6 calaStorz Opthalmic InstrumentsE05421 szt
Sonda dentystyczna, wygięta igła, 14 cm (5,5 cala)Ted Pella135531 szt
DOWELL 10-22 AWG Ściągacz izolacjiDowell Store (Amazonka)10-22 AWG1 szt
Pióra Ostrza ze stali węglowej o podwójnej krawędziTed Pella121-9pakiet pakietowy/10; do precyzyjnego cięcia
szkiełka mikroskopowe z matowym szkłem, 75 mm x 25 mm x 1-1,2 mmTed Pella260442opakowanie/144
GEM Jednokrawędziowe, niepowlekane ostrza ze stali nierdzewnejTed Pella121-1pudełko/200; do ogólnego cięcia/cięcia
GlycerolThermo ScientificPI179041 litr
ImageJ/FIJI z wtyczką EDF (wersja 17.05.2021) i wtyczkąGrid/Collection StitchingNational Institutes of Health (NIH) USAwersja 2.9.0/1.54sWtyczka EDF została opracowana przez Alexa Prudencio, Jesse Berenta i Daniela Sage'a dla Biomedical Imaging Group, É cole Polytechnique Fé dé rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). Oprogramowanie do zszywania siatki/kolekcji zostało opracowane przez Stephana Preibischa dla Instytutu Molekularnej Biologii Komórki i Genetyki im. Maxa Plancka (MPI-CBG).
Kimwipes Ex-L Małe 111,76 mm x 213,36 mmKimtech Science34155pudełko/280-warstwowe
okulary Micro Cover Glasses, grubość 22 mm x 22 mm x 0,13 - 0,16 mmTed Pella2601401 uncja
dwustronnej taśmy nano Gel PU o wymiarach 29,5 stopy x 1,18 cala, grubość 1 mmSklep Yecaye (Amazon)L354 W1.182 rolki okularów
nakrywkowych Superslip, Grubość 24 mm x 50 mm x 0,13 - 0,16 mm TedPella2601661 uncja
Okulary Superslip, grubość 24 mm x 60 mm x 0,13 - 0,16 mmTed Pella2601681 uncja
deska do krojenia ze szkła hartowanegoHacaroa (AmazonkaB09XMXBT5S4 szt

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McSteen, P., Kellogg, E. A. Molecular, cellular, and developmental foundations of grass diversity. Science. 377 (6606), 599-602 (2022).
  2. Wang, P., Vlad, D., Langdale, J. A. Finding the genes to build C4 rice. Current Opinion in Plant Biology. 31, 44-50 (2016).
  3. Wang, P., et al. Candidate regulators of early leaf development in maize perturb hormone signalling and secondary cell wall formation when constitutively expressed in rice. Scientific Reports. 7 (1), 4535(2017).
  4. Perico, C., Tan, S., Langdale, J. A. Developmental regulation of leaf venation patterns: Monocot versus eudicots and the role of auxin. New Phytologist. 234 (3), 783-803 (2022).
  5. Wang, P., Kelly, S., Fouracre, J. P., Langdale, J. A. Genome-wide transcript analysis of early maize leaf development reveals gene cohorts associated with the differentiation of C4 Kranz anatomy. The Plant Journal. 75 (4), 656-670 (2013).
  6. Liu, W. Y., et al. Regulators of early maize leaf development inferred from transcriptomes of laser capture microdissection (LCM)-isolated embryonic leaf cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (35), e2208795119(2022).
  7. Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (10), 3979-3984 (2013).
  8. Strable, J., Nelissen, H. The dynamics of maize leaf development: Patterned to grow while growing a pattern. Current Opinion in Plant Biology. 63, 102038(2021).
  9. Reynolds, J. O., Eisses, J. F., Sylvester, A. W. Balancing division and expansion during maize leaf morphogenesis: Analysis of the mutant, warty-1. Development. 125 (2), 259-268 (1998).
  10. Richardson, A. E., et al. Evolution of the grass leaf by primordium extension and petiole-lamina remodeling. Science. 374 (6573), 1377-1381 (2021).
  11. Johnston, R., Leiboff, S., Scanlon, M. J. Ontogeny of the sheathing leaf base in maize (Zea mays). New Phytologist. 205 (1), 306-315 (2015).
  12. Sharman, B. C. Developmental anatomy of the shoot of Zea mays L. Annals of Botany. 6 (22), 245-282 (1942).
  13. Johnston, R., et al. Transcriptomic analyses indicate that maize ligule development recapitulates gene expression patterns that occur during lateral organ initiation. The Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  14. Sharman, B. C. Leaf and bud initiation in the Gramineae. Botanical Gazette. 106 (3), 269-289 (1945).
  15. Nelissen, H., et al. A local maximum in gibberellin levels regulates maize leaf growth by spatial control of cell division. Current Biology. 22 (13), 1183-1187 (2012).
  16. Itoh, J., et al. Rice plant development: From zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  17. Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Iowa State University of Science and Technology. , (1986).
  18. Freeling, M., Walbot, V. The Maize Handbook. , Springer Science & Business Media. (2013).
  19. Freeling, M., Hake, S. Developmental genetics of mutants that specify knotted leaves in maize. Genetics. 111 (3), 617-634 (1985).
  20. Durbak, A. R., et al. Transport of boron by the tassel-less1 aquaporin is critical for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 26 (7), 2978-2995 (2014).
  21. Langdale, J. A., Lane, B., Freeling, M., Nelson, T. Cell lineage analysis of maize bundle sheath and mesophyll cells. Developmental Biology. 133 (1), 128-139 (1989).
  22. Bosabalidis, A. M., Evert, R. F., Russin, W. A. Ontogeny of the vascular bundles and contiguous tissues in the maize leaf blade. American Journal of Botany. 81 (6), 745-752 (1994).
  23. Junqueira, N. E. G., et al. Anatomy and ultrastructure of embryonic leaves of the C4 species Setaria viridis. Annals of Botany. 121 (6), 1163-1172 (2018).
  24. Robil, J. M., McSteen, P. Hormonal control of medial-lateral growth and vein formation in the maize leaf. New Phytologist. 238 (1), 125-141 (2023).
  25. Donnelly, P. M., Bonetta, D., Tsukaya, H., Dengler, R. E., Dengler, N. G. Cell cycling and cell enlargement in developing leaves of Arabidopsis. Developmental Biology. 215 (2), 407-419 (1999).
  26. Govindaraju, P., Verna, C., Zhu, T., Scarpella, E. Vein patterning by tissue-specific auxin transport. Development. 147 (13), (2020).
  27. Linh, N. M., Scarpella, E. Leaf vein patterning is regulated by the aperture of plasmodesmata intercellular channels. PLoS Biology. 20 (9), e3001781(2022).
  28. Verna, C., Ravichandran, S. J., Sawchuk, M. G., Linh, N. M., Scarpella, E. Coordination of tissue cell polarity by auxin transport and signaling. eLife. 8, e51061(2019).
  29. Sawchuk, M. G., Head, P., Donner, T. J., Scarpella, E. Time-lapse imaging of Arabidopsis leaf development shows dynamic patterns of procambium formation. New Phytologist. 176 (3), 560-571 (2007).
  30. Linh, N. M., Scarpella, E. Confocal imaging of developing leaves. Current Protocols. 2 (1), e349(2022).
  31. Poethig, R. S., Szymkowiak, E. J. Clonal analysis of leaf development in maize. Maydica. 40, 67-76 (1995).
  32. Sprangers, K., Thys, S., van Dusschoten, D., Beemster, G. T. S. Gibberellin enhances the anisotropy of cell expansion in the growth zone of the maize leaf. Frontiers in Plant Science. 11, 1163(2020).
  33. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 cofactors, BLH12 and BLH14, regulate internode patterning and vein anastomosis in maize. The Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  34. Schindelin, J., et al. FIJI: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Plant Care Protocols - Maize. The Donald Danforth Plant Science Center's Plant Growth Facility. , Available from: https://www.danforthcenter.org/our-work/core-facilities/plant-growth/ (2019).
  36. Mir, R., et al. A DII domain-based auxin reporter uncovers low auxin signaling during telophase and early G1. Plant Physiology. 173 (1), 863-871 (2017).
  37. DeBlasio, S. L., Sylvester, A. W., Jackson, D. Illuminating plant biology: Using fluorescent proteins for high-throughput analysis of protein localization and function in plants. Briefings in Functional Genomics. 9 (2), 129-138 (2010).
  38. Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: Generation and applications. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 535-543 (2013).
  39. Mohanty, A., et al. Advancing cell biology and functional genomics in maize using fluorescent protein-tagged lines. Plant Physiology. 149 (2), 601-605 (2009).
  40. Baker, R. F., et al. Sucrose transporter ZmSut1 expression and localization uncover new insights into sucrose phloem loading. Plant Physiology. 172 (3), 1876-1898 (2016).
  41. Gallavotti, A., Yang, Y., Schmidt, R. J., Jackson, D. The relationship between auxin transport and maize branching. Plant Physiology. 147 (4), 1913-1923 (2008).
  42. Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), 12(2015).
  43. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: A cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  44. Geng, Y., Zhou, Y. Confocal live imaging of shoot apical meristems from different plant species. Journal of Visualized Experiments. (145), e59369(2019).
  45. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell Biology. 139, Elsevier. 203-223 (2017).
  46. Fodor, E., Ayaydin, F. Fluorescent probes and live imaging of plant cells. Advances in Plant Ecophysiology Techniques. , Springer. 241-251 (2018).
  47. Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. The Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
  48. Conklin, P. A., Johnston, R., Conlon, B. R., Shimizu, R., Scanlon, M. J. Plant homeodomain proteins provide a mechanism for how leaves grow wide. Development. 147 (20), (2020).
  49. Shaw, S. L. Imaging the live plant cell. The Plant Journal. 45 (4), 573-598 (2006).
  50. Klaus, A. V., Schawaroch, V., Frischmann, K. J. Confocal imaging and three-dimensional visualization of thick autofluorescent specimens. Methods in Molecular Biology. 1075, 213-225 (2014).
  51. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Extended depth-of-focus for multi-channel microscopy images: a complex wavelet approach. 2004 2nd IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: Nano to Macro (IEEE Cat No. 04EX821). IEEE. , 660-663 (2004).
  52. Extended Depth of Field. EPFL Biomedical Imaging Group. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2022).
  53. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  54. Phillips, K. A., et al. vanishing tassel2 encodes a grass-specific tryptophan aminotransferase required for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 23 (2), 550-566 (2011).
  55. Robil, J. M., et al. GrasVIQ: An image analysis framework for automatically quantifying vein number and morphology in grass leaves. The Plant Journal. 107 (2), 629-648 (2021).
  56. Helliwell, C. A., Chandler, P. M., Poole, A., Dennis, E. S., Peacock, W. J. The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 2065-2070 (2001).
  57. Gutierrez, R., Quiroz-Figueroa, F., Vazquez-Ramos, J. M. Maize cyclin D2 expression, associated kinase activity and effect of phytohormones during germination. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 166-173 (2005).
  58. Atkinson, J. A., Wells, D. M. An updated protocol for high throughput plant tissue sectioning. Frontiers in Plant Science. 8, 1721(2017).
  59. Lux, A., Morita, S., Abe, J., Ito, K. An improved method for clearing and staining free-hand sections and whole-mount samples. Annals of Botany. 96 (6), 989-996 (2005).
  60. Heriche, M., Arnould, C., Wipf, D., Courty, P. E. Imaging plant tissues: Advances and promising clearing practices. Trends in Plant Science. 27 (6), 601-615 (2022).
  61. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  62. Chuck, G., Muszynski, M., Kellogg, E., Hake, S., Schmidt, R. J. The control of spikelet meristem identity by the branched silkless1 gene in maize. Science. 298 (5596), 1238-1241 (2002).
  63. Tran, T. M., et al. An optimized whole-mount immunofluorescence method for shoot apices. Current Protocols. 1 (4), e101(2021).
  64. O'Connor, D. L. PINs Lost and PINs Gained: Auxin-Transport Mediated Patterning in the Grasses. University of California, Berkeley. , Doctoral Dissertation (2012).
  65. Sharman, B. C., Hitch, P. A. Initiation of procambial strands in leaf primordia of bread wheat, Triticum aestivum L. Annals of Botany. 31 (2), 229-243 (1967).
  66. Serra, L., Tan, S., Robinson, S., Langdale, J. A. Flip-flap: A simple dual-view imaging method for 3D reconstruction of thick plant samples. Plants. 11 (4), 506(2022).
  67. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Maize Leaf PrimordiaTransverse SectionsWhole MountsFluorescence ImagingConfocal ImagingLeaf DevelopmentPrimordium UnrollingFluorescent Protein ReportersGrass Leaf MorphologyTissue Sectioning

Related Articles