Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ex vivo Multimodalne obrazowanie oczu ludzkiego dawcy oparte na OCT do badań nad zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65240

⸱

26 maja 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Alabama at Birmingham Heersink School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Zurich, 3Vitreous Retina Macula Consultants of New York, 4Department of Ophthalmology, New York University Grossman School of Medicine, 5Advancing Sight Network, 6Department of Ophthalmology, University Hospital Bonn

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Testy laboratoryjne mogą wykorzystać wartość prognostyczną z multimodalnego obrazowania zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD) opartego na podłużnej optycznej tomografii koherentnej (OCT). Ludzkie oczy dawcy z AMD i bez AMD są obrazowane za pomocą OCT, koloru, skaningowej oftalmoskopii laserowej w bliskiej podczerwieni i autofluorescencji na dwóch długościach fal wzbudzenia przed sekcją tkanki.

Streszczenie

Sekwencja progresji zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD) wyuczona na podstawie optycznej koherentnej tomografii (OCT) multimodalnego obrazowania klinicznego (MMI) może dodać wartość prognostyczną do wyników laboratoryjnych. W niniejszej pracy OCT i MMI ex vivo zastosowano do ludzkich oczu dawcy przed sekcją tkanki siatkówki. Oczy pobrano od białych dawców bez cukrzycy w wieku ≥80 lat, z czasem od śmierci do zachowania (DtoP) wynoszącym ≤6 godzin. Kule zostały odzyskane na miejscu, nacięte trepanacją o średnicy 18 mm w celu ułatwienia usunięcia rogówki i zanurzone w buforowanym 4% paraformaldehydzie. Kolorowe obrazy dna oka uzyskano po usunięciu przedniego odcinka za pomocą lunety sekcyjnej i lustrzanki jednoobiektywowej przy użyciu oświetlenia trans-, epi i flash przy trzech powiększeniach. Kule umieszczono w buforze w specjalnie zaprojektowanej komorze z soczewką o średnicy 60 dioptrii. Zostały one zobrazowane za pomocą OCT w domenie widmowej (sześcian plamki żółtej 30°, odstęp 30 μm, uśrednienie = 25), współczynnika odbicia w bliskiej podczerwieni, autofluorescencji 488 nm i autofluorescencji 787 nm. Oczy AMD wykazały zmianę w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE), z druzami lub podsiatkówkowymi złogami druzenoidowymi (SDD), z neowaskularyzacją lub bez niej i bez dowodów na inne przyczyny. Między czerwcem 2016 r. a wrześniem 2017 r. odzyskano 94 prawe oko i 90 lewe oko (DtoP: 3,9 ± 1,0 h). Spośród 184 oczu 40,2% miało AMD, w tym wczesne pośrednie (22,8%), zanikowe (7,6%) i neowaskularne (9,8%) AMD, a 39,7% miało niewyróżniające się plamki żółte. Druzy, SDD, ogniska hiperrefleksyjne, atrofia i blizny włóknisto-naczyniowe zostały zidentyfikowane za pomocą OCT. Artefakty obejmowały zmętnienie tkanek, odwarstwienia (bakcylarne, siatkówkowe, RPE, naczyniówkowe), torbielowate zmiany dołka, pofałdowane RPE i uszkodzenia mechaniczne. Aby pokierować kriosekcją, wykorzystano objętości OCT w celu znalezienia punktów orientacyjnych dołka środkowego i głowy nerwu wzrokowego oraz określonych patologii. Objętości ex vivo zarejestrowano z objętościami in vivo poprzez wybór funkcji referencyjnej do śledzenia ruchu gałek ocznych. Widoczność ex vivo patologii obserwowanej in vivo zależy od jakości zachowania. W ciągu 16 miesięcy 75 szybkich oczu dawcy DtoP we wszystkich stadiach AMD zostało odzyskanych i sklasyfikowanych pod kątem zaawansowania przy użyciu klinicznych metod MMI.

Wprowadzenie

Piętnaście lat leczenia neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD) za pomocą terapii anty-VEGF pod kierunkiem optycznej koherentnej tomografii (OCT) dostarczyło nowych informacji na temat sekwencji progresji i mikroarchitektury tej powszechnej przyczyny utraty wzroku. Kluczowym odkryciem jest to, że AMD jest trójwymiarową chorobą obejmującą siatkówkę neurosensoryczną, nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) i naczyniówkę. W wyniku obrazowania OCT pacjentów biorących udział w badaniu i innych oczu leczonych pacjentów klinicznych, cechy patologii wykraczające poza te widoczne na kolorowej fotografii dna oka, która jest standardem klinicznym od dziesięcioleci, są obecnie rozpoznawane. Należą do nich neowaskularyzacja śródsiatkówkowa (neowaskularyzacja plamki żółtej typu 31, dawniej proliferacja naczynioruchowa), podsiatkówkowe złogi druzenoidowe (SDD, zwane również siatkowatymi pseudodruzami)2, wiele ścieżek losu RPE3,4, oraz intensywnie glejowe komórki Müllera w atrofii5,6.

Modelowe systemy pozbawione plamek żółtych (komórek i zwierząt) odtwarzają niektóre wycinki tej złożonej choroby7,8,9. Dalsze sukcesy w łagodzeniu obciążenia AMD mogą wynikać z odkrycia i zbadania pierwotnej patologii w ludzkich oczach, zrozumienia unikalnego składu komórkowego plamki żółtej, a następnie translacji do systemów modelowych. Niniejszy raport przedstawia trwającą trzy dekady współpracę między akademickim laboratorium badawczym a bankiem oczu. Cele opisanych w niniejszym dokumencie metod charakterystyki tkanek są dwojakie: 1) informowanie o rozwijającej się technologii diagnostycznej poprzez zademonstrowanie podstaw wyglądu dna oka i źródeł sygnału obrazowania za pomocą mikroskopii oraz 2) klasyfikacja próbek AMD do celowanych (immunohistochemia) i niecelowanych technik odkrywania molekularnego (obrazowanie spektrometrii mas, IMS i transkryptomika przestrzenna), które zachowują dołek tylko stożek oraz bogatą w pręciki para- i peryfoveę. Takie badania mogą przyspieszyć translację na kliniczny OCT, w przypadku którego możliwa jest sekwencja progresji i obserwacja podłużna dzięki śledzeniu wzroku. Ta technologia, która została zaprojektowana do monitorowania efektów leczenia, rejestruje skany z jednej wizyty klinicznej na drugą za pomocą naczyń siatkówki. Powiązanie OCT śledzonego ruchem gałek ocznych z wynikami laboratoryjnymi uzyskanymi za pomocą technik destrukcyjnych może zapewnić nowy poziom wartości prognostycznej dla wyników badań molekularnych.

W 1993 roku laboratorium badawcze wykonało kolorowe zdjęcia pośmiertnego dna oka na kliszy10. Wysiłek ten został zainspirowany znakomitą fotomikroskopią i histologią ludzkiej siatkówki obwodowej przeprowadzoną przez Foosa i współpracowników11,12,13 oraz rozległe korelacje kliniczno-patologiczne AMD przeprowadzone przez Sarks et al.14,15. Począwszy od 2009 r., przyjęto obrazowanie multimodalne ex vivo (MMI) zakotwiczone w domenie spektralnej OCT. To przejście zostało zainspirowane podobnymi wysiłkami innych16,17, a zwłaszcza uświadomieniem sobie, że tak wiele ultrastruktury opisanej przez Sarków było z czasem dostępne w trzech wymiarach w clinic18,19. Celem było pozyskanie oczu z przyczepioną plamką żółtą w rozsądnym czasie w celu przeprowadzenia dobrze zasilanych badań fenotypów na poziomie komórkowym w siatkówce, RPE i naczyniówce. Intencją było wyjście poza statystyki "na oko" do "typu zmiany", standardu, na który wpływ miały koncepcje "wrażliwej płytki nazębnej" z chorób sercowo-naczyniowych20,21.

Protokół w tym raporcie odzwierciedla doświadczenia z prawie 400 parami oczu dawcy pobranych w kilku strumieniach. W latach 2011-2014 powstała strona internetowa projektu MACULA poświęcona histopatologii AMD, która zawiera grubości warstw i adnotacje ze 142 archiwalnych próbek. Oczy te zachowały się w latach 1996-2012 w utrwalaczu aldehydu glutarowego i paraformaldehydu do wysokorozdzielczej histologii żywicy epoksydowej i mikroskopii elektronowej. Wszystkie dno zostało sfotografowane w kolorze po otrzymaniu i zostało ponownie zobrazowane przez OCT tuż przed histologią. Uchwyt na oko pierwotnie zaprojektowany do badań nerwu wzrokowego22 został użyty do umieszczenia stempla tkankowego o pełnej grubości o średnicy 8 mm wyśrodkowanego na dołku środkowym. Skany OCT B przez centrum dołka i miejsce o 2 mm wyższe, odpowiadające histologii na tych samych poziomach, zostały przesłane na stronę internetową, wraz z kolorowym zdjęciem dna oka. Wybór płaszczyzn OCT był podyktowany rozpowszechnieniem patologii AMD w klasie fovea23 oraz widocznością SDD w obszarach bogatych w pręciki, wyższych niż fovea24,25.

Począwszy od 2013 roku, oczy obrazowane za pomocą MMI zakotwiczonego w OCT za życia były dostępne dla bezpośrednich korelacji kliniczno-patologicznych. Większość (7 z 10 dawców) dotyczyła pacjentów w przychodni skierowanej do siatkówki (autor: K.B.F.), która oferowała zaawansowany rejestr dyrektyw dla pacjentów zainteresowanych oddaniem swoich oczu po śmierci do celów badawczych. Oczy zostały odzyskane i zakonserwowane przez lokalny bank oczu, przeniesione do laboratorium i przygotowane w taki sam sposób, jak oczy w ramach Projektu MACULA. Przedśmiertne kliniczne tomy OCT zostały bezproblemowo odczytane w laboratorium, dopasowując w ten sposób cechy patologiczne obserwowane za życia do cech widocznych pod mikroskopem26.

Począwszy od 2014 roku, prospektywne pobieranie oczu rozpoczęło się od badań przesiewowych w kierunku AMD w oczach dawców bez historii klinicznej, ale zachowanych przez określony limit czasu (6 godzin). W tym celu uchwyt na oko został zmodyfikowany tak, aby pomieścić cały globus. Zmniejszyło to szansę na odklejenie się wokół przyciętych krawędzi wcześniej używanego stempla 8 mm. Oczy zakonserwowano w 4% buforowanym paraformaldehydzie do celów immunohistochemicznych i przeniesiono do 1% następnego dnia w celu długotrwałego przechowywania. W latach 2016-2017 (przed pandemią) odzyskano 184 oczy od 90 dawców. Statystyki i obrazy w tym raporcie są generowane na podstawie tej serii. W erze pandemii (lockdowny w 2020 r. i ich następstwa) prospektywne gromadzenie danych na potrzeby transkryptomiki i współpracy IMS było kontynuowane w ograniczonym tempie, zasadniczo przy użyciu metod z 2014 r.

Dostępne są inne metody oceny oka dawcy. System oceniania stanu Minnesota (MGS)27,28 jest oparty na systemie klinicznym AREDS do kolorowej fotografii dna oka29. Do ograniczeń tej metody należy połączenie atroficznego i neowaskularnego AMD w jedno stadium "późnego AMD". Ponadto MGS pociąga za sobą usunięcie siatkówki neurosensorycznej przed fotodokumentacją naczyniówki RPE. Ten krok usuwa SDD w różnym stopniu30,31 i usuwa przestrzenną korespondencję zewnętrznej siatkówki i jej systemu nośnego. W związku z tym wysiłki zmierzające do powiązania zapotrzebowania metabolicznego i sygnalizacji z siatkówki z patologią w naczyniówce RPE mogą być utrudnione. System Utah wdrożył MMI przy użyciu kolorowej fotografii ex vivo i OCT do kategoryzacji oczu przeznaczonych do sekcji na regiony do ekstrakcji RNA i białek32. Chociaż jest to preferowane w przypadku ekstrakcji całej muszli ocznej, obszar o średnicy 3 mm jest najbardziej narażony na progresję AMD33,34 reprezentuje tylko 25% stempla o średnicy 6 mm wyśrodkowanego na dołku. W związku z tym korzystne są techniki, które mogą lokalizować wyniki w odniesieniu do dołka centralnego, takie jak seryjne sekcje immunohistochemiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Instytucjonalna komisja rewizyjna na Uniwersytecie Alabamy w Birmingham zatwierdziła badania laboratoryjne, które przestrzegały Dobrych Praktyk Laboratoryjnych i Poziomu Bezpieczeństwa Biologicznego 2/2+. Wszystkie amerykańskie banki oczu są zgodne z ustawą Uniform Anatomical Gifts Act z 2006 r. oraz amerykańską Agencją ds. Żywności i Leków. Większość amerykańskich banków oczu, w tym Advancing Sight Network, jest zgodna ze standardami medycznymi Amerykańskiego Stowarzyszenia Banków Oczu.

Tabela materiałów zawiera listę materiałów eksploatacyjnych i sprzętu. Materiał uzupełniający 1 zawiera przegląd sekcji, kolorowej fotografii dna oka i MMI opartego na OCT. Materiał uzupełniający 2 zawiera szczegółowe informacje na temat MMI opartego na OCT.

1. Kryteria pobierania tkanek

  1. Aby zmaksymalizować wydajność oczu AMD w badaniu przesiewowym nieudokumentowanych dawców, należy ustalić następujące kryteria dla akceptowalnych dawców: wiek ≥80 lat, kolor biały, bez cukrzycy i ≤6 godzin od zgonu do zachowania (DtoP).
    UWAGA: DtoP definiuje się jako czas między śmiercią a umieszczeniem oka w dostarczonym środku konserwującym, w szpitalu lub w laboratorium.

2. Pożywka konserwująca i inne preparaty (laboratorium)

  1. Zrób 4% buforowanego fosforanem paraformaldehydu z 20% zapasu (zakupionego). Przygotować 1 l, dodając 200 ml 20% paraformaldehydu (współczynnik rozcieńczenia 5) do 800 ml 0,1 M buforu fosforanowego Sorensona. Przetestuj i dostosuj, aby upewnić się, że pH wynosi 7,2, jeśli to konieczne. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Dozuj 30 ml 4% buforowanego fosforanem paraformaldehydu do słoików o pojemności 40 ml.
  3. Pojemniki z konserwantem o pojemności 40 ml oznaczone w banku oczu, aby można było odzyskać tkankę w dowolnym momencie i każdego dnia.
  4. Do przechowywania zakonserwowanych oczu należy przygotować 1% paraformaldehydu z 4% roztworu. Przygotować 1 l, dodając 250 ml 4% paraformaldehydu (współczynnik rozcieńczenia 4) do 750 ml 0,1 M buforu fosforanowego Sorensona. Przetestuj i dostosuj pH, jeśli to konieczne. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    1. Przygotować 1 l 0,1 M roztworu z 0,2 M roztworu buforu fosforanowego Sorensona, pH 7,2, łącząc 500 ml wody destylowanej i 500 ml buforu Sorensona.
    2. Dostosuj pH kropla po kropli, używając 1 N kwasu solnego lub 1 N wodorotlenku sodu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Stwórz uchwyt, aby ustabilizować oczy podczas sekcji. Napełnij szalkę Petriego woskiem dentystycznym podgrzanym do uzyskania płynu. Gdy lekko ostygnie, zrób w nim półkulisty wycisk z dużym łożyskiem kulkowym, a następnie zamroź naczynie, aby ułatwić wyjęcie łożyska kulkowego.

3. Metody banku oczu

  1. Aby zapewnić szybki powrót do zdrowia tkanek badawczych, należy szybko odzyskać wszystkie tkanki, w tym te przeznaczone do przeszczepu.
  2. Otrzymuj skierowania na zgon, zgodnie z wymogami prawa, w ciągu 1 godziny od śmierci i śledź każdego dawcę za pomocą numeru sekwencyjnego skierowania, który podąża za tkanką.
  3. Aby znaleźć przypadki z potencjalną dokumentacją kliniczną, zadaj pytania dotyczące AMD i chorób oczu w wywiadzie oceniającym ryzyko dawcy w badaniu.
  4. Aby zminimalizować czas podróży, odzyskaj całe kule (w odróżnieniu od samych rogówek do przeszczepu) na zwartym obszarze (tj. mieście i sąsiednim hrabstwie podmiejskim).
  5. Przynieś dwa słoiki ze środkiem konserwującym (buforowanym 4% paraformaldehydu) do pokoju szpitalnego zmarłego w celu odzyskania tkanek (w przeciwieństwie do czekania na przeniesienie ciała do kostnicy).
  6. Przed i w trakcie odzyskiwania komunikuj się ze śledczymi, aby potwierdzić dostawę i czas.
  7. Odzyskaj kule na miejscu w szpitalu, otwórz je za pomocą konsekwentnych metod obchodzenia się z nimi i zanurz otwarte oko w środku konserwującym (Rysunek 1).
    1. Przytrzymaj wycięte oko dawcy na miejscu za pomocą osłonki z gazy stabilizowanej hemostatem.
    2. Aby ułatwić usunięcie rogówki z obrzeżem twardówki o szerokości 2 mm, użyj trepanacji o średnicy 18 mm do nacięcia gałki ziemskiej.
    3. Aby uwolnić rogówkę z towarzyszącym brzegiem twardówki, przetnij wzdłuż naciętego okręgu za pomocą sprężynowych nożyczek z zakrzywionymi końcówkami, jednocześnie stabilizując gałkę ziemską za pomocą gazy przyciętej hemostatem.
    4. Podnieś rogówkę z twardówki, odsłaniając tęczówkę i ciało rzęskowe.
    5. Aby ułatwić przenikanie środka konserwującego do komory ciała szklistego, należy wykonać szczelinę w tęczówce o długości 2 mm prostopadłą do brzegu źrenicy. Umieścić oczy w słoikach z próbkami z 30 ml środka konserwującego w temperaturze 4 °C i przenieść do laboratorium na mokrym lodzie.
  8. Przesyłanie zanonimizowanych informacji o dawcy drogą elektroniczną z banku oczu do bazy danych laboratorium badawczego.
    UWAGA: W bazie danych znajduje się numer skierowania, numer tkanki banku oczu i numer identyfikacyjny laboratorium do śledzenia, a także inne istotne informacje.

4. Przygotowanie tkanek do kolorowej fotografii dna oka ex vivo

  1. Użyj dwóch mikroskopów stereoskopowych, jednego do preparacji, a drugiego do kolorowej fotografii dna oka.
    UWAGA: Do transiluminacji w celu uwidocznienia zmian pigmentowych należy użyć podstawy do mikroskopii ciemnego pola.
  2. Usuń resztki przedniego segmentu (tęczówkę i soczewkę). Aby ustabilizować oko podczas sekcji, umieść je na szalce Petriego wypełnionej woskiem (materiał uzupełniający 1, slajdy 7-8). Aby zapobiec zapadaniu się ciała rzęskowego i przyczepionej siatkówki do jamy ciała szklistego, należy zminimalizować zakłócenia pierścienia grubego ciała szklistego przyczepionego do ciała rzęskowego (podstawy ciała szklistego).
  3. Zaznacz górny słupek dla orientacji. Umieść kulę ziemską przednią stroną do dołu w naczyniu. Znajdź ścięgna przyczepowe mięśnia prostego górnego i mięśni skośnych górnych. Za pomocą drewnianego aplikatora oszczędnie nakładaj tusz do znakowania w linii 10 mm w kierunku od przodu do tyłu (tj. prostopadle do ścięgnistego przyczepu mięśnia prostego górnego).
  4. Przed wykonaniem zdjęcia wypełnij dno zimnym buforem fosforanowym Sorensena.
  5. Włóż rubinowy koralik o średnicy 1 mm do dna oka jako wewnętrzną podziałkę liniową, która pojawi się na każdym obrazie27.
  6. Uzyskuj kolorowe obrazy za pomocą lustrzanki jednoobiektywowej zamontowanej na mikroskopie stereoskopowym wyposażonym w pierścieniową lampę błyskową. Użyj oświetlenia trans-, epi- i flash przy każdym z trzech standardowych powiększeń, aby uchwycić obrazy mające na celu podkreślenie określonych obszarów (Materiał uzupełniający 1, slajd 11): 1) dno do równika, 2) biegun tylny (arkady naczyniowe, głowa nerwu wzrokowego, dołek centralny) i 3) dołek w plamce żółtej (żółta plamka).

5. Przygotowanie do kolorowej fotografii dna oka ex vivo

  1. Włącz aparat i monitor. Podłącz zdalną migawkę i zwolnij siłownik w kamery/telewizora (TV) i wyświetlacza interfejsu multimedialnego wysokiej rozdzielczości (HDMI).
  2. Ustaw w ustawieniach aparatu ręczną funkcję ISO i pozycję blokady lustra (zablokowane w celu zmniejszenia wibracji).
    UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją obsługi producenta, aby uzyskać informacje na temat ustawień używanego aparatu. Naucz się wyświetlać ustawienia nadmiernego/niedoświetlenia w stosunku do odczytów histogramu i ekspozycji.
  3. Ustaw dwa źródła światła, każde z dwoma elastycznymi światłowodami ustawionymi prostopadle do siebie, aby oświetlić w czterech głównych kierunkach na stoliku mikroskopu (Materiał uzupełniający 1, strona 10).
  4. Włącz źródła światła epi-illumination do pełnej mocy.
    UWAGA: Pomocne jest, ale nie jest konieczne, aby wokół sceny znajdowała się filcowa osłona, aby ograniczyć rozproszenie światła/lampy błyskowej dla fotografa.
  5. Pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą kleszczy włóż tylny słupek do tygla kwarcowego o pojemności 30 ml wypełnionego buforem. Pozwól chusteczce opaść na dno. Umieścić usztywnienie, takie jak gąbka tkankowa, między oko a ścianę tygla, aby zapobiec ruchom. Włóż rubinowy koralik o średnicy 1 mm do tylnego bieguna.
    UWAGA: Koralik może wpaść do miseczki nerwu wzrokowego.
  6. Ostrożnie umieść kulę ziemską w tyglu na stoliku mikroskopu stereoskopowego i obserwuj wewnętrzne dno oka przez okulary mikroskopu. Używając najmniejszego powiększenia, zorientuj oko, identyfikując znak tkankowy w pozycji godziny 12, głowę nerwu wzrokowego (ONH) i dołek 5° poniżej ONH. Obrócić oko tak, aby dołek środkowy znajdował się poniżej linii przechodzącej przez ONH o 5°.
    UWAGA: Jeśli jest to prawe oko, ONH znajduje się po prawej stronie dołka centralnego, widzianego przez okulary mikroskopu. Jeśli jest to lewe oko, ONH znajduje się po lewej stronie dołka środkowego.
  7. Włącz zdalny monitor view z kamery. Upewnij się, że suwak rozdzielacza wiązki mikroskopu jest ustawiony na obserwację przez port fotograficzny, a nie przez port okularów. W zależności od ścieżki światła i lustra należy być przygotowanym na obrócenie tkanki o 180° na stoliku, aby uzyskać prawidłową orientację.

6. Akwizycja obrazu za pomocą kolorowej fotografii dna oka ex vivo

  1. Przy włączonym epi-illumination ustaw powiększenie tak, aby całe 18 mm nacięcie trepanacji zajmowało całe pole widzenia. Zwiększ powiększenie, aby możliwe było ustawienie ostrości na dnie dołka dołkowego. Zmniejsz powiększenie do poprzedniego ustawienia.
  2. Dostosuj ustawienia ISO w zakresie 1,600-3,000 tak, aby czasy ekspozycji mieściły się w środkowym zakresie miernika w aparacie.
  3. Naciśnij spust zdalnej migawki. Posłuchaj, czy lustro zablokuje się w górnej pozycji. Ponownie naciśnij spust, aby naświetlić ekspozycję.
  4. Obserwuj obraz na monitorze, z wstępnie ustawionymi metadanymi pokazującymi kolor czerwony, zielony, niebieski (RGB) i kolorowym histogramem dla prawidłowej ekspozycji. Jeśli narażenie jest akceptowalne, kontynuuj; Jeśli nie, usuń, ponownie oceń parametry i ponownie zobrazuj.
  5. Wyłącz lampy na gęsiej szyi, aby uzyskać epi-oświetlenie, aby podświetlić druzy, i włącz lampę błyskową z ekspozycją 1/4 s, czasem otwarcia migawki aparatu 1/250 s i ISO 100-320. Ustaw domyślną szybkość błysku lub zmodyfikuj ją podczas początkowej konfiguracji aparatu. Zrób zdjęcie i sprawdź, czy histogram jest prawidłowo naświetlony.
  6. Wyłącz lampę błyskową i włącz źródło światła z oświetleniem przezroczystym. Zresetuj czułość ISO do wartości powyżej 5,000 i upewnij się, że czas naświetlania nie spadnie poniżej 1/30 s z powodu potencjalnych wibracji w systemie fotograficznym. Zrób zdjęcie i sprawdź, czy histogram jest prawidłowo naświetlony.
  7. Zwiększ powiększenie, aby view zarówno ONH, jak i dołek centralny w polu view. Włącz lampy epi-illumination. Ustaw zakres ISO na 1,600-3,000. Upewnij się, że czasy naświetlania mieszczą się w środkowym zakresie aparatu.
  8. Wyłącz lampy epi-illumination i włącz lampę błyskową z ekspozycją 1/4 s, wstępnie ustawionym czasem otwarcia migawki aparatu na 1/250 s i ISO ustawionym na 400-800. Zrób zdjęcie i sprawdź, czy histogram jest prawidłowo naświetlony.
  9. Wyłącz lampę błyskową i włącz trans-oświetlenie za pomocą podstawy ciemnego pola. Zresetuj ISO do wartości powyżej 5,000. Upewnij się, że czas naświetlania nie jest dłuższy niż 1/30 s ze względu na potencjalne wibracje w systemie fotograficznym. Uzyskaj obraz i sprawdź, czy histogram jest prawidłowy.
  10. Wyłącz transillumination i ponownie włącz lampy epi-illumination.
  11. Zwiększ powiększenie do wartości użytej w kroku 6.7. W razie potrzeby ponownie ustaw ostrość.
  12. Zwiększ czułość ISO w zakresie 3,000-6,000 i dostosuj czas naświetlania, aby mieścił się w odpowiednim zakresie ekspozycji aparatu. Pobieranie pliku image.
    UWAGA: Koralik rubinowy może już nie pojawiać się w polu view. Jeśli tak, zrób osobne obrazy koralika w tym powiększeniu w celach informacyjnych.
  13. Wyłącz lampy epi-illumination. Włącz lampę błyskową z ekspozycją 1/4 s i czasem otwarcia migawki aparatu na 1/250 s. Ustaw domyślną szybkość błysku lub zmień ją podczas początkowej konfiguracji aparatu i ustaw czułość ISO na 500-1,000. Uzyskaj obraz. Sprawdź histogram pod kątem prawidłowej ekspozycji.
  14. Wyłącz lampę błyskową i włącz lampy oświetlenia trans-illumining. Zresetuj czułość ISO do wartości powyżej 8 000, aby uzyskać szybszy czas naświetlania przy bardziej czułym przetworniku obrazu. Upewnij się, że czas naświetlania nie spada poniżej 1/30 s z powodu potencjalnych wibracji w systemie fotograficznym. Zdobądź obraz.
  15. Wyeksportuj obrazy z aparatu do komputera. Review obrazy przed wyjęciem próbki ze stolika mikroskopowego na wypadek, gdyby trzeba było je ponownie uchwycić.

7. Przegląd akwizycji obrazów dla OCT ex vivo i skaningowej oftalmoskopii laserowej (SLO)

  1. W przypadku domeny widmowej OCT umieść kule w buforze fosforanowym w niestandardowym uchwycie na oko z komorą z soczewką 60 dioptrii35. Zamontuj uchwyt na oko na wsporniku na klinicznym urządzeniu do obrazowania OCT i przymocuj go do miejsca, w którym pacjent oparłby czoło. Urządzenie OCT automatycznie wstawia podziałkę liniową do każdego obrazu.
  2. W tym samym czasie, za pomocą tego samego urządzenia i z okiem nadal w uchwycie, zobrazuj kule za pomocą skaningowego oftalmoskopu laserowego (SLO) przy użyciu współczynnika odbicia w bliskiej podczerwieni (NIR, używany jako obraz lokalizacyjny przez oprogramowanie na miejscu), autofluorescencji dna oka wzbudzenia 488 nm (FAF) i współczynnika odbicia bez czerwieni (RF).
    UWAGA: Wzbudzenie FAF 787 nm w tym urządzeniu jest odpowiednie tylko sporadycznie, ponieważ rozdzielacz wiązki zmniejsza przepuszczalność światła do SLO. Z tego powodu używane jest drugie urządzenie do obrazów FAF 787 nm (patrz następny punkt).
  3. Oddzielnie, ale z okiem nadal w uchwycie na oczy, zobrazuj kule za pomocą FAF 787 nm w celu wykrycia zakłóceń RPE36 za pomocą oddzielnego urządzenia, które dobrze wyświetla tę modalność.

8. Protokół akwizycji obrazu dla ex vivo OCT/ SLO (patrz slajdy w Materiałach uzupełniających 2)

  1. Wskaż mięsień prosty górny za pomocą barwnika znakującego tkanki. Włącz laser (niebieska strzałka, materiał uzupełniający 2, strona 1).
  2. Odnosząc się do strony 2 materiału uzupełniającego 2, ustaw głowicę OCT, przesuwając całe urządzenie w dwóch osiach w stosunku do podstawy (zielona strzałka), a następnie podnosząc wysokość (y), obracając joystick zgodnie z ruchem wskazówek zegara/przeciwnie do ruchu wskazówek zegara (cw/ccw, niebieskie strzałki). Ustaw ostrość obrazu, obracając pokrętłem (pomarańczowa strzałka), trzymając czarną dźwignię w pozycji R (*). Zablokuj urządzenie, dokręcając skrzydełkową (fioletowa strzałka).
  3. Włóż oko do uchwytu i ustabilizuj od tylnej strony za pomocą podkładek dystansowych (Materiał uzupełniający 1, strona 13). Wywieraj jak najmniejszy nacisk, aby uniknąć wgniecenia twardówki. Zorientuj się tak, aby znak tkankowy mięśnia prostego górnego był skierowany do góry.
    UWAGA: Przybliżona odległość od przedniej części uchwytu na oczy do urządzenia OCT wynosi 25 mm.
  4. Otwórz zastrzeżone oprogramowanie do wizualizacji i analizy dla urządzenia OCT. W lewej kolumnie pojawi się lista pacjentów. Dawcy oczu oznaczeni wewnętrznym numerem kodowym to "pacjenci". Zapoznaj się z instrukcją obsługi producenta.
  5. Wybierz ikonę nowego pacjenta. W razie potrzeby uzupełnij informacje o danych pacjenta. Wybierz przycisk OK. Użyj logicznie uporządkowanego systemu numeracji dla poszczególnych oczu, takiego jak YYYYNNNL,R_agesex. Na przykład może to być 2017016R_97F.
  6. Po kontynuowaniu wprowadzania danych w następnym oknie naciśnij przycisk OK. Wybierz operatora i badanie z menu rozwijanego.
    UWAGA: Wprowadzone informacje pojawią się w metadanych, które można wyeksportować.
  7. Po wyświetleniu pustego ekranu dotknij żółtego przycisku, aby rozpocząć pobieranie obrazu.
  8. Naciśnij IR + OCT (odbicie w bliskiej podczerwieni + OCT). Pozwól laserowi uzyskać obraz SLO na żywo dna oka i skan B OCT.
    1. Sfinalizuj prawidłową pozycję anatomiczną na podstawie ONH i dołka środkowego i użyj drewnianego aplikatora, aby wyregulować pozycję oka w uchwytzie. Na panelu sterowania obróć okrągły przycisk, aby dostosować intensywność.
    2. Naciśnij ten sam przycisk, aby uzyskać średnią 9-100 klatek (czerwone strzałki; 9 wystarczy, 100 wygląda kremowo). Jeśli urządzenie jest prawidłowo zorientowane, dno oka powinno być ostre, a skan OCT B powinien pojawić się w górnej jednej trzeciej wyświetlacza (Materiał uzupełniający 2, strona 9, podwójna czerwona strzałka).
    3. Na obrazie dna oka użyj kursora, aby przesunąć niebieską linię, aby wyśrodkować dołek (Materiał uzupełniający 2, strona 9, biała strzałka). Naciśnij przycisk Acquire.
      UWAGA: Inne domyślne przyciski to Retina, EDI (wyłączone) i Skanowanie linii.
  9. Naciśnij RF + OCT, aby uzyskać następną akwizycję. Ponownie sprawdź położenie, aby upewnić się, że obraz nie przesunął się ani nie uległ degradacji. Naciśnij przycisk, aby uśrednić. Naciśnij przycisk Pobierz.
  10. Przełącz wewnętrzną kostkę do obrazowania autofluorescencyjnego na długości fal wzbudzenia 488 nm i 787 nm (materiał uzupełniający 2, strona 10).
    UWAGA: Pokazana jest pozycja kostki za przełącznikiem.
  11. Wybierz tryb autofluorescencji. Ponownie sprawdź wyrównanie. Naciśnij przycisk Pobierz.
  12. W przypadku podejrzenia zaburzenia i atrofii RPE należy wybrać ICGA (angiografia zieleni indocyjaninowej) dla autofluorescencji 787 nm. Sprawdź ponownie położenie oka, a następnie naciśnij przycisk Acquire.
    UWAGA: Obraz dna oka często nie pojawia się w tej modalności, ponieważ wewnętrzny sześcian tłumi wiązkę.
  13. Przełącz wewnętrzną kostkę z powrotem na R, aby uzyskać obrazowanie w podczerwieni i czerwone wolne od akwizycji objętości.
    UWAGA: Pozycja kostki za przełącznikiem jest pokazana na stronie 13 Materiału Uzupełniającego 2.
  14. Aby uzyskać woluminy OCT, wybierz IR i ustawienie głośności. Dopasuj wszystkie ustawienia na stronie 14 materiału dodatkowego 2, przełączając odpowiednie przyciski na module sterującym (sześcian plamki żółtej 30°, odstęp 30 μm, uśrednianie w zależności od wymagań eksperymentalnych).
  15. Zwróć uwagę, że widok dna oka odbicia w bliskiej podczerwieni jest pokryty niebieskimi liniami B-skan. Ponownie sprawdź pozycję OCT w górnej jednej trzeciej prawego okna. Naciśnij przycisk Acquire na module sterującym i poczekaj 5 minut na zakończenie skanowania woluminu. Po zakończeniu akwizycji obrazowania wybierz opcję EXIT. Obrazy zostaną zapisane (czerwona strzałka).
    UWAGA: Niebieskie linie wyznaczają odległości pokazane w poprzednim widoku w mikrometrach. Skany rozpoczynają numerację od dołu (dolnego) i idą w górę. Zwróć uwagę na progresję czerwonej linii.
  16. Pozwól komputerowi przetworzyć uzyskane obrazy, które pojawią się na ekranie (Materiał uzupełniający 2, strona 16).
  17. Podczas obrazowania innych oczu jednego dawcy nie należy zmieniać położenia wspornika montażowego między oczami. Jeśli najpierw zostanie zobrazowane lewe oko, wyniki pojawią się w kolumnie OD (prawe oko). Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zaznaczyć wszystkie obrazy, a następnie wybierz polecenie wymiany systemu operacyjnego/OD. Obrazy zostaną przeniesione do kolumny System operacyjny.
  18. Naciśnij Wybierz > Okno > Baza danych. Na ekranie domyślnie wyświetlany jest panel 6 z dodaniem oka dawcy pokazanego w prawej kolumnie (Materiał uzupełniający 2, strona 18). Kliknij prawym przyciskiem myszy pacjenta w menu rozwijanym, wybierz opcję Partia i wyeksportuj plik E2E.
  19. Przejdź do wstępnie ustalonego folderu utworzonego na pulpicie w celu przesyłania plików. Wybierz przycisk OK. Folder zawiera pliki E2E, które mają zostać skopiowane na zewnętrzny dysk twardy i zarchiwizowane.
  20. Przyłóż oko w uchwycie do skaningowego oftalmoskopu laserowego, który jest głównie używany do autofluorescencji 787 nm.
    UWAGA: zapoznaj się z instrukcją obsługi producenta, aby uzyskać informacje na temat pozyskiwania i archiwizowania obrazów.
  21. Włącz komputer i laser.
  22. Wybierz ikonę Nowy pacjent. W razie potrzeby uzupełnij dane pacjenta.
  23. Aby zachować ten sam arkusz danych oka, naciśnij OK. Ponieważ krzywa C pozostaje taka sama, naciśnij przycisk Kontynuuj.
  24. Wybierz tryb nauki i wprowadź hasło, jeśli jest to wymagane. Utrzymuj krzywą C na poziomie 7,7 mm. Naciśnij OK.
  25. Wybierz opcję Kontynuuj, aby sprawdzić krzywą C. Wybierz żółty wskaźnik, aby uruchomić kamerę.
  26. Wybierz pozycję R. Wyrównaj i zorientuj kulę ziemską. Wybierz tryb IR, aby ustawić ostrość i orientację jak powyżej.
  27. Ustaw głowicę kamery, przesuwając całe urządzenie w dwóch osiach względem podstawy (Materiał uzupełniający 2, strona 28, zielona strzałka), a następnie podnosząc wysokość (y) jednostki (niebieskie strzałki). Ustaw ostrość obrazu, obracając pokrętło (pomarańczowa strzałka). dźwignia znajduje się w położeniu R (*). Po ustawieniu tej głowicy na swoim miejscu zablokuj urządzenie, przekręcając skrzydełkową (fioletowa strzałka).
  28. Zwróć uwagę, że ekran wygląda tak, jak pokazano na stronie 29 Materiałów dodatkowych 2.
  29. Przesuń pokrętło wyboru z R na A. Wybierz ICGA (aby osiągnąć autofluorescencję 787 nm) w kolorze niebieskim, 100% intensywności, polu widzenia 30° i obrazowaniu jednofazowym.
    UWAGA: Podobnie jak barwnik zieleń indocyjaninowa, melanina jest wzbudzana przez światło o długości fali 787 nm.
  30. Zwróć uwagę, że ekran wygląda tak, jak pokazano na stronie 31 Materiałów Uzupełniających 2. Naciśnij dysk, aby dokonać uśrednienia, a następnie wybierz opcję Pobierz.
  31. Wybierz opcję Okno > Baza danych. Wybierz opcję Importuj pliki E2E z urządzenia SLO; Pliki te są przechowywane na zewnętrznym dysku twardym i przesyłane na pulpit.
  32. Wybierz pozycję Otwórz. Sprawdź, czy znaczniki są domyślne, a następnie wybierz przycisk OK.
  33. Zauważ, że pacjent ma teraz dwie zakładki: jedną pokazującą obrazy uzyskane z SLO (niebieska strzałka), a drugą zakładkę pokazującą obrazy uzyskane z urządzenia OCT (czerwona strzałka) (Materiał uzupełniający 2, strona 34).
  34. Kliknij prawym przyciskiem myszy obraz 786 nm (ICGA) i wyeksportuj obraz do pliku oznaczonego jako SLO 786 na pulpicie.
  35. Aby zapisać obraz SLO autofluorescencji 786 nm, wybierz pacjenta i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wyeksportować obrazy jako pliki RAW (dla plików .vol) do folderu na pulpicie.
  36. Aby wyeksportować obrazy z urządzenia OCT w celu przesłania do komputera archiwum, skopiuj/wklej z RAWEXPORT do folderu o nazwie RAW.

9. Przegląd obrazowania

  1. Zbierz obrazy (kolor, plik .vol, obrazy SLO) w folderach dla każdego dawcy z podfolderami dla każdego oka i indeksuj foldery kolejno według identyfikatora laboratorium.
  2. Rejestruj wyciski tkanek (jakość, patologia) w bazie danych w celu uzyskania ustandaryzowanego raportu.
  3. Przejrzyj wyeksportowane woluminy OCT za pomocą wewnętrznej wtyczki ImageJ.
    1. Znajdź środek dołka, który można rozpoznać po środku zagłębienia dołka, wzniesieniu do wewnątrz zewnętrznych pasm siatkówki lub najcieńszym punkcie. W większości przypadków będą się one pokrywać, ale nie zawsze, ponieważ zależy to od zachowania dołka, indywidualnej zmienności i obecności patologii.
    2. Znajdź standardowy skan w górnym perydołku (2 mm/67 B-skanów w kierunku górnym; tj. zwiększając liczbę skanów).
    3. Zapisz stos .tif całego woluminu, aby mieć do niego szybki dostęp w przyszłości.
    4. Przewiń wolumin OCT w całości, zaczynając od skanu 1 (dolnego), jednocześnie rejestrując numery skanów, w których rozpoznawane są obiekty.
    5. Sprawdź obszar obwodu brodawkowatego oprócz plamki żółtej.
      UWAGA: Okołobrodawkowaty zanik błony śmówkowo-siatkówkowej u starszych oczu obejmuje charakterystyczny podstawowy depozyt laminarny i neowaskularyzację. Jest to częsty obszar zmian pigmentowych w krótkowzroczności oczu i jaskrze, a także w starzeniu się i AMD37.
  4. Sprawdź kolorowe zdjęcia i połącz wszelkie wyniki z tymi widzianymi przez OCT, jeśli to możliwe.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, łatwiej jest najpierw zobaczyć większość wyników według OCT. Kolorowe fotografie zapewniają duży widok obszaru poza obszarem na SLO, pigmentację naczyniówki, w tym znamiona, obecność hemu i twardych wysięków oraz pigment w neowaskularnym AMD. Ciemny pigment w dołku centralnym może reprezentować luźne melanosomy z przedniego odcinka i należy go delikatnie zmyć buforem za pomocą pipety.
  5. Sprawdź obrazy SLO i połącz wszelkie wyniki z tymi widzianymi przez OCT, jeśli to możliwe.
  6. Zapisz standardowe skany B na dołku centralnym i okołodołkowym, dodatkowe skany B z zauważalną patologią lub innymi cechami oraz obrazy SLO w raporcie patologicznym.
  7. Kategoryzuj oczy w następujący sposób: Niezwykłe, Wątpliwe, Wczesne-pośrednie AMD, Zanikowe AMD, Neowaskularne AMD, Inne, Nieznane, Nieocenione, Nie zarejestrowane. "Wątpliwe" jest używane, jeśli nie jest jasne, czy zmiany są wystarczająco poważne, aby można je było sklasyfikować inaczej. "Nieocenione" jest zarezerwowane dla oczu, które nie mają przydatnych skanów OCT, takich jak te z poważnie odklejonymi siatkówkami. "Niezarejestrowane" jest zarezerwowane dla oczu, które są przetwarzane natychmiast po otrzymaniu bez fotografowania.
  8. Użyj tych kryteriów dla AMD: ciężka zmiana RPE z druzowymi lub podsiatkówkowymi złogami druzenoidowymi, z lub bez objawów neowaskularyzacji, takich jak płyn lub zwłóknienie, oraz bez dowodów na inne przyczyny (zaktualizowano z Curcio et al.10 w celu uwzględnienia SDD).
    UWAGA: Ostateczna diagnoza potwierdzana jest analizą histologiczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tabela 1 pokazuje, że w latach 2016-2017 pobrano 184 gałki oczne od 94 białych dawców bez cukrzycy w wieku >80 lat. Średni czas od śmierci do konserwacji wynosił 3,9 h (zakres: 2,0-6,4 h). Z 184 ocenionych oczu 75 (40,2%) wykazywało pewne AMD. Zidentyfikowano następujące kategorie: bez zmian (39,7%), wątpliwe (11,4%), wczesne-pośrednie AMD (22,8%), zanikowe (7,6%), naczyniowe (9,8%), inne (8,7%) oraz nieznane/niezarejestrowane/niemożliwe do oceny (<1%). Rysunek 2,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stosując populacyjne badania przesiewowe w okresie 16 miesięcy w erze przed COVID, udało się pozyskać 75 oczu dawców z AMD. Wszystkie zostały odzyskane za pomocą krótkiego DtoP i zainscenizowane przy użyciu MMI zakotwiczonego w OCT. Kryterium wieku (>80 lat) wykracza poza typowy przedział wiekowy dla odzyskiwania tkanek przeznaczonych do przeszczepiania rogówki. Pomimo zaawansowanego wieku, nasze kryteria zaowocowały oczami we wszystkich stadiach AMD. Wiele fenotypów RPE jest wspólnych dla wszystkich stadiów AMD, a niekt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

C.A.C. otrzymuje wsparcie badawcze od Heidelberg Engineering i jest konsultantem dla firm Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience i Osanni. T.A. otrzymuje wsparcie badawcze od Novartis i konsultuje się z firmami Roche, Novartis, Bayer, Nidek i Apellis. K.B.F. jest konsultantem firm Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer i Novartis.

Podziękowania

Dziękujemy firmie Heidelberg Engineering za oprzyrządowanie i projekt oryginalnego uchwytu na oko, dr Richardowi F. Spaide za wprowadzenie do obrazowania multimodalnego opartego na OCT, Christopherowi Girkinowi za ułatwienie dostępu do urządzeń do obrazowania klinicznego oraz Davidowi Fisherowi za rysunek 1. Odzyskanie ludzkich oczu dawcy do badań było wspierane przez granty National Institutes of Health (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) i U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), EyeSight Foundation of Alabama, International Retinal Research Foundation (C.A.C.), Arnold and Mabel Beckman Initiative for Macular Research (C.A.C.) oraz Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zlewki, butelki 250 mlFisher# 02-540K
, 1 l, Pyrex Fisher# 10-462-719schowek na konserwant
Palnik Bunsena lub źródło ciepłaEisco# 17-12-818Do topienia wosku
Aparat, cyfrowyNikon D7200D7200
Komputer i pamięć masowaAppleiMac Pro; Zewnętrzny dysk twardy 14 TBPrzechowywanie obrazów
Pojemnik, izolowanyFisher# 02-591-45Do mokrego lodu
Pojemniki, 2 na dawcę, 40 mlFisherSameco Bio-Tite  40 ml # 13-711-86Do konserwantu
Tygiel, kwarcowy 30 mlFisher# 08-072DTrzymaj globus do fotografii
Butla, podziałka, 250 mlFisher# 08-549G
Środki czyszczące do dezynfekcji   https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Uchwyt na oko z soczewką i uchwytem montażowymkontakt J. Messingerjeffreymessinger@uabmc.eduniestandardową modyfikacją oryginalnego projektu Heidelberg Engineering
Maski ochronnena twarz Fisher# 19-910-667
Kleszcze, Harmon FixRoboz # RS-8247
Kleszcze, Micro AdsonRoboz # RS-5232
Kleszcze, TissueRoboz# RS-5172
Szklana szalka Petriego, KimaxFisher23064
Rękawice Diamond GripFisher# MF-300
Fartuchy GenProFisher# 19-166-116
Oprogramowanie do edycji obrazówAdobePhotoshop 2021, Creative Suite
KimWipesFisher# 06-666
Lampy, 3 gęsia szyjaSchott Imaging# A20800
Mikroskop, stereoNikonSMZ 1000do mikroskopu preparacyjnego
, stereoOlympus SZX9kolorowa fotografia dna oka
Paraformaldehyd, 20% EMS# 15713-Sdla środka konserwującego; rozcieńczony do przechowywania
pH-metrFisher # 01-913-806
Bufor fosforanowy, Sorenson' s, 0,2 M pH 7,2 EMS#11600-10
Lampa pierścieniowaB & H Zdjęcie WideoSigma EM-140 DG 
Koralik rubinowy, średnica 1 mmMeller Optics# MRB10MD
Okulary ochronne 3MFisher# 19-070-940
Skanujący oftalmoskop laserowyHeidelberg EngineeringHRA2
Nożyczki, zakrzywiona sprężynaRoboz# RS-5681
Pojemnik na ostre przedmiotyFisher# 1482763
Przewód migawkowy, zdalneNikonMC-DC2
Spectral Domain OCTHeidelberg EngineeringSpectralis HRA& OCThttps://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Łożysko kulkowe ze stali nierdzewnej, średnica 25,4 mmMcMaster-Carr# 9529K31
Barwnik do znakowania tkanek,Cancer Diagnostics Inc# 0727-1
Ostrza do krajalnicy tkanekThomas Scientific# 6767C18
Trephine, Monitor telewizyjny Stratis Healthcare# 6718L
(HDMI) i przewód do aparatu cyfrowegoB& H Photo VideoBH # COHD18G6PROBdo podglądu na żywo i zdalnego wyświetlania kamer
Wosk, różowy stomatologicznyEMS # 72670
Aplikatory drewnianePuritan# 807-12
# urządzenie o średnicy 18 mm

Bibliografia

  1. Spaide, R. F., et al. Consensus nomenclature for reporting neovascular age-related macular degeneration data: Consensus on neovascular age-related macular degeneration nomenclature study group. Ophthalmology. 127 (5), 616-636 (2020).
  2. Spaide, R. F., Ooto, S., Curcio, C. A. Subretinal drusenoid deposits a.k.a. pseudodrusen. Survey of Ophthalmology. 63 (6), 782-815 (2018).
  3. Curcio, C. A., Zanzottera, E. C., Ach, T., Balaratnasingam, C., Freund, K. B. Activated retinal pigment epithelium, an optical coherence tomography biomarker for progression in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (6), 211-226 (2017).
  4. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, OCT progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (10), 34(2021).
  5. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, S12-S25 (2016).
  6. Edwards, M. M., et al. Subretinal glial membranes in eyes with geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1352-1367 (2017).
  7. Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2(2022).
  8. Jiang, M., et al. Microtubule motors transport phagosomes in the RPE, and lack of KLC1 leads to AMD-like pathogenesis. Journal of Cell Biology. 210 (4), 595-611 (2015).
  9. Collin, G. B., et al. Disruption of murine Adamtsl4 results in zonular fiber detachment from the lens and in retinal pigment epithelium dedifferentiation. Human Molecular Genetics. 24 (24), 6958-6974 (2015).
  10. Curcio, C. A., Medeiros, N. E., Millican, C. L. The Alabama Age-related Macular Degeneration Grading System for donor eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 39 (7), 1085-1096 (1998).
  11. Bastek, J. V., Siegel, E. B., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Pigmentary patterns of the peripheral fundus. Ophthalmology. 89 (12), 1455-1463 (1982).
  12. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y., Lightfoot, D. O. Reticular degeneration of the pigment epithelium. Ophthalmology. 92 (11), 1485-1495 (1985).
  13. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Multiple extramacular drusen. Ophthalmology. 93 (8), 1098-1112 (1986).
  14. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of geographic atrophy of the retinal pigment epithelium. Eye. 2 (5), 552-577 (1988).
  15. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of soft drusen in age-related macular degeneration. Eye. 8 (3), 269-283 (1994).
  16. Ghazi, N. G., Dibernardo, C., Ying, H. S., Mori, K., Gehlbach, P. L. Optical coherence tomography of enucleated human eye specimens with histological correlation: Origin of the outer "red line". American Journal of Ophthalmology. 141 (4), 719-726 (2006).
  17. Brown, N. H., et al. Developing SDOCT to assess donor human eyes prior to tissue sectioning for research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (8), 1069-1080 (2009).
  18. Helb, H. M., et al. Clinical evaluation of simultaneous confocal scanning laser ophthalmoscopy imaging combined with high-resolution, spectral-domain optical coherence tomography. Acta Ophthalmologica. 88 (8), 842-849 (2010).
  19. Spaide, R. F., Curcio, C. A. Drusen characterization with multimodal imaging. Retina. 30 (9), 1441-1454 (2010).
  20. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part 1. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  21. Garcia-Garcia, H. M., Gonzalo, N., Regar, E., Serruys, P. W. Virtual histology and optical coherence tomography: from research to a broad clinical application. Heart. 95 (16), 1362-1374 (2009).
  22. Strouthidis, N. G., et al. Comparison of clinical and spectral domain optical coherence tomography optic disc margin anatomy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (10), 4709-4718 (2009).
  23. Sarks, S. H. Ageing and degeneration in the macular region: A clinico-pathological study. British Journal of Ophthalmology. 60 (5), 324-341 (1976).
  24. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (13), 19(2020).
  25. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (1), 33(2021).
  26. Litts, K. M., et al. Clinicopathological correlation of outer retinal tubulation in age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 133 (5), 609-612 (2015).
  27. Olsen, T. W., Feng, X. The Minnesota grading system of eye bank eyes for age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4484-4490 (2004).
  28. Mano, F., Sprehe, N., Olsen, T. W. Association of drusen phenotype in age-related macular degeneration from human eye-bank eyes to disease stage and cause of death. Ophthalmology Retina. 5 (8), 743-749 (2021).
  29. Age-related eye disease study research group. The Age-Related Eye Disease Study system for classifying age-related macular degeneration from stereoscopic color fundus photographs: The Age-Related Eye Disease Study Report Number 6. American Journal of Ophthalmology. 132 (5), 668-681 (2001).
  30. Arnold, J. J., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Reticular pseudodrusen. A risk factor in age-related maculopathy. Retina. 15 (3), 183-191 (1995).
  31. Olsen, T. W., Bottini, A. R., Mendoza, P., Grossniklausk, H. E. The age-related macular degeneration complex: linking epidemiology and histopathology using the Minnesota grading system (the inaugural Frederick C. Blodi Lecture). Transactions of the American Ophthalmological Society. 113, (2015).
  32. Owen, L. A., et al. The Utah protocol for postmortem eye phenotyping and molecular biochemical analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (4), 1204-1212 (2019).
  33. Wang, J. J., et al. Ten-year incidence and progression of age-related maculopathy: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 114 (1), 92-98 (2007).
  34. Joachim, N., Mitchell, P., Burlutsky, G., Kifley, A., Wang, J. J. The incidence and progression of age-related macular degeneration over 15 years: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 122 (12), 2482-2489 (2015).
  35. Pang, C., Messinger, J. D., Zanzottera, E. C., Freund, K. B., Curcio, C. A. The onion sign in neovascular age-related macular degeneration represents cholesterol crystals. Ophthalmology. 122 (11), 2316-2326 (2015).
  36. Keilhauer, C. N., Delori, F. C. Near-infrared autofluorescence imaging of the fundus: Visualization of ocular melanin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3556-3564 (2006).
  37. Curcio, C. A., Saunders, P. L., Younger, P. W., Malek, G. Peripapillary chorioretinal atrophy: Bruch's membrane changes and photoreceptor loss. Ophthalmology. 107 (2), 334-343 (2000).
  38. Curcio, C. A. Imaging maculopathy in the post-mortem human retina. Vision Research. 45 (28), 3496-3503 (2005).
  39. Brinkmann, M., et al. Histology and clinical lifecycle of acquired vitelliform lesion, a pathway to advanced age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 240, 99-114 (2022).
  40. Ramtohul, P., et al. Bacillary layer detachment: Multimodal imaging and histologic evidence of a novel optical coherence tomography terminology. Literature review and proposed theory. Retina. 41 (11), 2193-2207 (2021).
  41. Wilson, J. D., Foster, T. H. Mie theory interpretations of light scattering from intact cells. Optics Letters. 30 (18), 2442-2444 (2005).
  42. Ghazi, N. G., Green, W. R. Pathology and pathogenesis of retinal detachment. Eye. 16 (4), 411-421 (2002).
  43. Berlin, A., et al. Correlation of optical coherence tomography angiography of type 3 macular neovascularization with corresponding histology. JAMA Ophthalmology. 140 (6), 628-633 (2022).
  44. Berlin, A., et al. Histology of type 3 macular neovascularization and microvascular anomalies in anti-VEGF treated age-related macular degeneration. Ophthalmology Science. 3 (3), 100280(2023).
  45. Schaal, K. B., et al. Outer retinal tubulation in advanced age-related macular degeneration: optical coherence tomographic findings correspond to histology. Retina. 35 (7), 1339-1350 (2015).
  46. Chen, L., et al. Histology and clinical imaging lifecycle of black pigment in fibrosis secondary to neovascular age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 214, 108882(2022).
  47. Balaratnasingam, C., et al. Histologic and optical coherence tomographic correlations in drusenoid pigment epithelium detachment in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 124 (1), 644-656 (2017).
  48. Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: Morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
  49. Owsley, C., et al. Biologically guided optimization of test target location for rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration: ALSTAR2 baseline. Ophthalmology Science. 3 (2), 100274(2023).
  50. Anderson, D. M. G., et al. The molecular landscape of the human retina and supporting tissues by high resolution imaging mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (12), 2426-2436 (2020).
  51. Lee, J., Yoo, M., Choi, J. Recent advances in spatially resolved transcriptomics: challenges and opportunities. BMB Reports. 55 (3), 113-124 (2022).
  52. Diabetes. Alabama Public Health. , Available from: https://www.alabamapublichealth.gov/healthrankings/diabetes.html (2022).
  53. Francis, J. H., et al. Swept-source optical coherence tomography features of choroidal nevi. American Journal of Ophthalmology. 159 (1), 169-176 (2015).
  54. Inoue, M., Dansingani, K. K., Freund, K. B. Progression of age-related macular degeneration overlying a large choroidal vessel. Retina Cases Brief Reports. 10 (1), 22-25 (2016).
  55. Jaffe, G. J., et al. Imaging features associated with progression to geographic atrophy in age-related macular degeneration: CAM Report 5. Ophthalmology Retina. 5 (9), 855-867 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie ex vivooptyczna koherentna tomografiasekcjonowanie tkanki siatk wkikolorowa fotografia dna okaOCT w domenie widmowejodbicie w bliskiej podczerwienipodsiatk wkowe z ogi druzenoidalne
Ex vivo Multimodalne obrazowanie oczu ludzkiego dawcy oparte na OCT do badań nad zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.