Method Article

Ulepszone modele lipofuscyny i kwantyfikacja zdolności fagocytozy segmentu zewnętrznego w wysoce spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki

DOI:

10.3791/65242

⸱

April 14th, 2023

 ,  , 
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje model akumulacji lipofuscyny w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach ludzkiego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) oraz ulepszony test fagocytozy zewnętrznego segmentu (OS) w celu wykrycia całkowitej zdolności ZORE/degradacji OS. Metody te przezwyciężają ograniczenia poprzednich modeli lipofuscyny i klasycznych testów fagocytozy zewnętrznego segmentu z pościgiem impulsowym.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Codzienna fagocytoza zewnętrznych segmentów fotoreceptorów przez nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) przyczynia się do gromadzenia wewnątrzkomórkowego barwnika starzejącego się, zwanego lipofuscyną. Toksyczność lipofuscyny jest dobrze znana w chorobie Stargardta, najczęstszym dziedzicznym zwyrodnieniu siatkówki, ale jest bardziej kontrowersyjna w zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD), głównej przyczynie nieodwracalnej ślepoty w krajach rozwiniętych. Określenie toksyczności lipofuscyny u ludzi było trudne, a zwierzęce modele Stargardta miały ograniczoną toksyczność. W związku z tym modele in vitro, które naśladują ludzkie RPE in vivo, są potrzebne do lepszego zrozumienia wytwarzania, klirensu i toksyczności lipofuscyny. Większość dotychczasowych modeli lipofuscyny w hodowlach komórkowych znajdowała się w liniach komórkowych lub polegała na podawaniu RPE pojedynczego składnika złożonej mieszaniny lipofuscyny, a nie fragmentów/końcówek całego zewnętrznego segmentu fotoreceptora, co generuje bardziej kompletny i fizjologiczny model lipofuscyny. Opisano tutaj metodę indukowania akumulacji materiału podobnego do lipofuscyny (określanego jako niestrawny materiał autofluorescencyjny lub UAM) w wysoce zróżnicowanym pierwotnym ludzkim prenatalnym RPE (hfRPE) i indukowanym pluripotencjalnym RPE pochodzącym z pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). UAM akumulował się w kulturach poprzez wielokrotne karmienie fragmentami OS poddanymi działaniu światła ultrafioletowego, pobranymi przez RPE poprzez fagocytozę. Omówiono również kluczowe sposoby, w jakie UAM zbliża się i różni od lipofuscyny in vivo. Do tego modelu akumulacji podobnej do lipofuscyny wprowadzono metody obrazowania mające na celu odróżnienie szerokiego spektrum autofluorescencji granulek UAM od jednoczesnego barwienia przeciwciałami. Wreszcie, aby ocenić wpływ UAM na zdolność fagocytozy RPE, wprowadzono nową metodę ilościowego określania wychwytu i rozpadu fragmentów segmentów zewnętrznych/końcówek. Metoda ta, określana jako "całkowita pojemność konsumpcyjna", przezwycięża potencjalne błędne interpretacje zdolności fagocytozy RPE nieodłącznie związanej z klasycznymi testami "pogoni za impulsami" w segmencie zewnętrznym. Przedstawione tutaj modele i techniki mogą być wykorzystane do badania szlaków wytwarzania i klirensu lipofuscyny oraz przypuszczalnej toksyczności.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) zapewnia krytyczne wsparcie dla leżących nad nimi fotoreceptorów, w tym codzienne pobieranie i degradację zewnętrznych końcówek lub fragmentów segmentów fotoreceptorów (w całym tym protokole skrót OS oznacza końcówki lub fragmenty OS, a nie całe zewnętrzne segmenty). Ten codzienny wychwyt postmitotycznego RPE ostatecznie przeciąża zdolność fagolizosomalną i prowadzi do gromadzenia się niestrawnego, autofluorescencyjnego materiału wewnątrzkomórkowego, zwanego lipofuscyną. Co ciekawe, kilka badań wykazało również, że lipofuscyna RPE może kumulować się bez fagocytozy OS1,2. Lipofuscyna ma wiele składników, w tym usieciowane addukty pochodzące z retinoidów cyklu wzrokowego i może zajmować prawie 20% objętości komórek RPE u osób w wieku powyżej 80 lat3.

To, czy lipofuscyna jest toksyczna, było przedmiotem gorących dyskusji. Choroba Stargardta jest autosomalnym recesywnym zwyrodnieniem fotoreceptorów i RPE, w którym mutacja w ABCA4 wyzwala nieprawidłowe przetwarzanie retinoidów cyklu wzrokowego zawartych w zewnętrznych segmentach fotoreceptorów. Niewłaściwe przetwarzanie retinoidów prowadzi do nieprawidłowego sieciowania i powstawania gatunków bis-retinoidów, w tym bis-retinoidu N-retinyliden-N-retinyloetanoloaminy (A2E). Badania wykazały wiele mechanizmów toksyczności A2E4,5. Lipofuscyna przyczynia się do sygnałów autofluorescencji dna oka podczas obrazowania klinicznego, a zarówno pacjenci Stargardta, jak i modele zwierzęce wykazują zwiększoną autofluorescencję dna oka przed zwyrodnieniem siatkówki, co sugeruje korelację między poziomem lipofuscyny a toksycznością6,7. Jednak z wiekiem lipofuscyna gromadzi się u wszystkich ludzi, nie wywołując zwyrodnienia RPE. Co więcej, w zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD), gdzie zwyrodnienie RPE występuje tylko u pacjentów w podeszłym wieku, osoby z wczesnymi i pośrednimi postaciami choroby mają mniej sygnałów autofluorescencji dna oka niż niechorzy ludzie w tym samym wieku8. Te wyniki kliniczne zostały zweryfikowane również na poziomie histologicznym9,10.

Modele zwierzęce akumulacji lipofuscyny RPE również pozostawiły pewne niejasności co do toksyczności lipofuscyny. Mysz z nokautem ABCA4 nie wyświetla zwyrodnienia siatkówki na pigmentowanym tle, podczas gdy na tle albinosów lub pod wpływem niebieskiego światła11,12. Co więcej, toksyczność lipofuscyny pochodzącej z nokautu ABCA4 prawdopodobnie różni się od wolniej kumulującej się lipofuscyny, która występuje wraz z naturalnym starzeniem się, jak widać w AMD13.

Modele in vitro akumulacji lipofuscyny stanowią alternatywę dla badania wpływu akumulacji lipofuscyny na zdrowie RPE. Takie modele pozwalają na manipulowanie składnikami lipofuscyny, od karmienia pojedynczymi składnikami retinoidu po karmienie OS, i umożliwiają badanie na ludziach, a nie zwierzętach. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano wiele metod modelowania lipofuscyny RPE w hodowli. Wraz z innymi grupami, grupa dr Boultona karmiła bydlęcy OS codziennie przez okres do trzech miesięcy na przejściu od 4 do 7 ludzkich pierwotnych komórek RPE od dawców w wieku od 4 do 85 lat14. Alternatywnie, hamowanie autofagii doprowadziło również do akumulacji lipofuscyny w przejściach od 3 do 7 pierwotnych ludzkich kultur RPE15. Jednak subletalne hamowanie lizosomów w wysoce zróżnicowanych, pasażowych 1, pierwotnych ludzkich prenatalnych hodowlach RPE (hfRPE) nie indukowało lipofuscyny, nawet przy wielokrotnym dodawaniu OS codziennie16.

Jako bardziej redukcjonistyczne podejście, inni wprowadzili do hodowli pojedyncze składniki lipofuscyny, zwłaszcza bis-retinoid A2E4,17. Takie badania są cenne, ponieważ definiują potencjalne bezpośrednie mechanizmy toksyczności dla poszczególnych składników lipofuscyny, implikując na przykład homeostazę cholesterolu lizosomalnego i ceramidów18. W tym samym czasie toczy się debata na temat toksyczności A2E19, a podawanie go bezpośrednio do komórek omija typową ścieżkę akumulacji lipofuscyny, która obejmuje fagocytozę fotoreceptora OS. Próbując dostarczyć wszystkie składniki lipofuscyny do kultur RPE, Boulton i Marshall oczyścili lipofuscynę z ludzkich oczu i podali ją do przejścia od 4 do 7 ludzkich pierwotnych kultur RPE pochodzących zarówno od płodów, jak i starszych dawców ludzkich20. Chociaż metoda ta jest innowacyjna, stanowi ograniczone źródło lipofuscyny do powtarzanych eksperymentów.

Podczas gdy wielokrotne karmienie OS do kultur RPE wytwarza lipofuscynę w wielu systemach, nie udaje się to w wysoce zróżnicowanych pierwotnych kulturach RPE16. Fotoutleniający OS indukuje reakcje sieciowania, takie jak tworzenie bis-retinoidów, które naturalnie zachodzi podczas tworzenia lipofuscyny in vivo. Może to przyspieszyć tworzenie się granulek podobnych do lipofuscyny w systemach hodowli RPE, nawet tych, które są wysoce zróżnicowane i odporne na akumulację lipofuscyny16. Tutaj wprowadzono metodę indukowania akumulacji granulek podobnych do lipofuscyny w wysoce zróżnicowanych hfRPE i ludzkim iPSC-RPE, zmodyfikowaną w stosunku do opublikowanego protokołu Wihlmarka21. Zaletą tej metody jest indukowanie granulek podobnych do lipofuscyny wykorzystujących to samo źródło (fotoreceptor OS) i szlak (wychwyt fagolizosomalnego systemu operacyjnego), co ma to miejsce w przypadku lipofuscynogenezy in vivo. Co więcej, odbywa się to na ludzkich kulturach RPE, które są wysoce zróżnicowane i potwierdzone w wielu badaniach w celu replikacji ludzkiego RPE in vivo22,23,24. Te granulki podobne do lipofuscyny są określane jako niestrawny materiał autofluorescencyjny (UAM) i dostarczają danych i dyskusji w tym protokole porównując UAM z lipofuscyną in vivo. Wraz z metodami budowania i oceny kultur obciążonych UAM w wysoce zróżnicowanych ludzkich RPE, wprowadzono również zaktualizowaną metodę oceny fagocytozy RPE OS. Wprowadzono wiele doskonałych metod pościgu za pulsem do ilościowego określania fagocytozy OS, w tym Western blot, immunocytochemię i FACS25,26,27. Jednak na wczesnym etapie pogoni za impulsem systemu operacyjnego warunki, które prowadzą do słabego wychwytu systemu operacyjnego, można połączyć z warunkami, które sprzyjają szybkiej degradacji zinternalizowanego systemu operacyjnego. Przedstawiona tutaj metoda mierzy całkowitą ilość wprowadzonego systemu operacyjnego, która jest w pełni zużywana/degradowana przez RPE ("Total Consumptive Capacity"), pomagając wyeliminować tę niejednoznaczność. Przewiduje się, że wgląd w toksyczność lipofuscyny przy użyciu tych protokołów, w tym wpływ na wskaźniki fagocytozy OS przy użyciu metody "całkowitej pojemności konsumpcyjnej", zostanie wykorzystany do rzucenia światła na toksyczność lipofuscyny in vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół dotyczący pozyskiwania i wykorzystywania tkanek ludzkich został sprawdzony i zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Michigan (HUM00105486).

1. Przygotowanie fotooksydowanych końcówek i fragmentów segmentów zewnętrznych

UWAGA: Siatkówki bydlęce przystosowane do ciemności zostały zakupione i wysłane na lodzie (zobacz Tabelę Materiałów). Z tych siatkówek system operacyjny został oczyszczony zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem23.

  1. Sieciowanie segmentu zewnętrznego lampą UV
    1. Zanurz szkiełka pokryte politetrafluoroetylenem (patrz Tabela materiałów) całkowicie w 70% etanolu na 10 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu sterylizacji szkiełek. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu w sterylnym naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm.
    2. Umieścić każde szkiełko w jednym nowym naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm i dodać 200 μl pożywki do hodowli komórkowych zawierających surowicę (niezależnie od tego, jaka pożywka jest zwykle używana do hodowli RPE) do każdego prostokąta, a następnie umieścić ręczne światło UV o długości fali 254 nm (patrz tabela materiałów) na naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm (bez pokrywki) z żarówką skierowaną bezpośrednio w stronę szkiełka, i naświetlać przez 20 minut. Nośniki używane specjalnie w tym badaniu oraz konkretne numery produktów dla komponentów nośników zostały wcześniej opublikowane22, 23. W całym protokole nośnik ten jest określany jako "nośnik RPE".
      UWAGA: Obróbka UV nośnika blokuje powierzchnię szkła i zapobiega przywieraniu OS podczas kolejnych kroków.
    3. Rozmrozić zamrożone podwielokrotności OS w temperaturze 37 °C (ręcznie lub w kąpieli wodnej). Ilość wymaganego systemu operacyjnego zależy od aplikacji. Ogólnie rzecz biorąc, można leczyć do 500 μL 2 x 108 OS/ml na prostokąt na szkiełku.
    4. Po rozmrożeniu wiruj OS z prędkością 2400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Natychmiast zassać supernatant w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą pipety, a nie podciśnienia, aby zapobiec przypadkowej utracie osadu.
    5. Delikatnie zawiesić granulat za pomocą sterylnego PBS.
      UWAGA: Śledź objętość ponownie zawieszoną i oczekiwane stężenie. np. ponowne zawieszenie osadu z probówki o pojemności 1 ml 1 x10 8 OS/ml z 500 μl PBS daje 2 x 108 OS/ml. Maksymalna objętość i stężenie na prostokąt na szkiełku pokrytym politetrafluoroetylenem wynosi 500 μl 2 x 108 OS/ml.
    6. Odessać pożywkę ze szkiełek i umieścić do 500 μl roztworu 2 x 108 OS/ml PBS na każdym prostokącie szkiełka. Umieść ręczną lampę UV nad naczyniem do hodowli komórkowej (bez pokrywki) tak, aby żarówka była skierowana bezpośrednio w stronę systemu operacyjnego. Wystaw roztwór OS na działanie światła o długości fali 254 nm przez 40 minut
      UWAGA: Podczas 40-minutowej ekspozycji przykryj lampę UV i naczynie ręcznikiem lub podkładką chłonną, zamknij skrzydło szafy bezpieczeństwa biologicznego i wyłącz dmuchawę. Zapobiegnie to wystąpieniu znacznego parowania. Jeśli lampa UV użyta w tym protokole nie jest dostępna dla badacza, istnieją dwie alternatywy, aby zapewnić osiągnięcie odpowiedniej ilości usieciowania. Pierwszym z nich jest przestrzeganie ilościowej ekspozycji na promieniowanie UV opisanej w kroku 1.2, za pomocą urządzenia opisanego w kroku 1.2 lub innego urządzenia, które może zapewnić taką samą ilościową ekspozycję na promieniowanie jak wspomniane urządzenie w kroku 1.2. Inną alternatywą jest wystawienie OS na promieniowanie UV przez czas, który indukuje stopień usieciowania na barwie Coomassie widoczny na Rysunek 1C.
    7. Zebrać poddane działaniu PBS roztwory OS PBS do sterylnych probówek do mikrowirówek, przemyć ponownie prostokąt powlekanego szkiełka 200-500 μl PBS (2-3x) i zebrać każde popłuczynie do probówki do mikrowirówki. Po zakończeniu spójrz na szkiełko pod mikroskopem w pomieszczeniu do hodowli tkankowej, aby upewnić się, że prawie wszystkie systemy operacyjne zostały usunięte ze szkiełka.
    8. Odwirować roztwór PBS OS o stężeniu 2400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zassać PBS w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą pipetora i ponownie zawiesić w 500 μl standardowych pożywkach, które będą używane do hodowli RPE (np. "pożywka RPE" zdefiniowana w sekcji 1.1.2). Objętość reprodukcji można regulować w oparciu o pożądane stężenie fotoutlenionego OS (OxOS).
    9. Umieścić 10 μl zawiesiny w nowej probówce do mikrowirówki, rozcieńczyć 50-100x większą ilością pożywki do hodowli komórkowych i policzyć OS za pomocą hemocytometru.
    10. Na podstawie liczby OS rozcieńczyć zawiesinę OxOS do końcowego stężenia podstawowego. Do karmienia wysoce dojrzałych kultur RPE w 24-dołkowych Transwellach (powierzchnia 0,33cm2; patrz Tabela materiałów), zalecane jest końcowe stężenie pożywki 2 x 107 OS/ml.
      1. Aby to osiągnąć, należy rozprowadzić OxOS w 25 μl podwielokrotności o stężeniu 5,6 x 107 OS/ml, zawieszonych w standardowych pożywkach hodowlanych RPE. Po rozmrożeniu podwielokrotności o objętości 25 μl, wymieszać całą podwielokrotność z 45 μl standardowej pożywki hodowlanej RPE, uzyskując końcową objętość pożywki 70 μl i stężenie OS 2 x 107 OS/ml dla każdego karmienia OxOS Transwell.
    11. Przed podaniem porcji OxOS dodać ligandy łączące fagocytozę (białko S i MFG-E8, patrz tabela materiałów), które ułatwiają wychwyt OS i akumulację lipofuscyny. Stężenia robocze ligandów mostkujących w 24-dołkowym Transwell wynoszą 4 μg/ml dla ludzkiego oczyszczonego białka S i 1,5 μg/ml dla ludzkiego rekombinowanego MFG-E8. Tak więc dla 25 μl podwielokrotności OxOS przy 5,6 x 107 OS/ml stężenie podstawowe dla białka S wynosi 11,2 μg/ml, a dla MFG-E8 wynosi 4,2 μg/ml.
      UWAGA: Stężenia ligandów mostkowych zostały zoptymalizowane dla kultur hfRPE na 24-dołkowych Transwellach, z przybliżoną liczbą komórek 320 000 komórek na 0,33 cm2 dołk. Stężenia ligandów mogą wymagać dostosowania do innych typów RPE i gęstości komórek, ponieważ ligandy obecne w nadmiarze dostępności receptora fagocytozy mogą paradoksalnie blokować wychwyt OS 28.
    12. Zamrozić podwielokrotności w ciekłym azocie.
      UWAGA: Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie jest wysoce szkodliwe dla integralności systemu operacyjnego.
  2. Sieciowanie segmentu zewnętrznego za pomocą urządzenia sieciującego UV
    UWAGA: Wykonaj kroki 1.1, z wyjątkiem poniższych kroków, które zastępują odpowiednio kroki 1.1.2 i 1.1.6:
    1. (zastępuje krok 1.1.2) Umieścić każde szkiełko w jednym nowym naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm i dodać 200 μl pożywki do hodowli komórkowych zawierających surowicę (np. -"pożywki RPE" lub innego substytutu) do każdego prostokąta, a następnie umieścić szkiełka w urządzeniu sieciującym ultrafioletem (patrz tabela materiałów), poddając je działaniu promieniowania UV o długości 254 nm przy ekspozycji na promieniowanie 3-6 J/cm2, aby zablokować powierzchnię szkła i zapobiec przywieraniu OS podczas następnych kroków.
    2. (zastępuje krok 1.1.6) Odessać pożywkę ze szkiełek i umieścić do 500 μl 2 x 108 OS/ml w sterylnym PBS na każdym prostokącie szkiełka. Umieść szkiełka w urządzeniu do sieciowania ultrafioletowego, ustaw ekspozycję na promieniowanie zabiegowe zgodnie z potrzebami (3-9 J/cm2) i traktuj przy 254 nm.
      UWAGA: Wymaganą ekspozycję na promieniowanie można dokładnie określić, miareczkując ekspozycję na promieniowanie w zakresie 3-9 J/cm2, aż do osiągnięcia stopnia autofluorescencji i sieciowania białek (jak widać na Rysunek 1B i Rysunek 1C).
      UWAGA: Obchodzenie się z systemem operacyjnym poza komorą bezpieczeństwa biologicznego może spowodować zanieczyszczenie. Po wystawieniu OS na działanie urządzenia sieciującego UV, należy pobrać OS za pomocą sterylnych końcówek pipet, przenieść do sterylnych probówek do mikrowirówek i wykonać wszystkie dalsze kroki w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Charakterystyka utlenionego systemu operacyjnego
    1. Ilościowe określanie widma emisji autofluorescencji za pomocą obrazowania
      1. Umieścić 20-50 μl roztworu podstawowego z niepoddanych działaniu substancji OS i OxOS w dwóch oddzielnych probówkach do mikrowirówek. Wirować przy 2400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ponownie zawiesić osad w buforowanym (np. PBS) 4% paraformaldehydzie i utrwalić na 15 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Po utrwaleniu odwirować jak powyżej, przemyć PBS x 2 (odwirowując między praniami), a następnie ponownie zawiesić w mniej niż 30 μl PBS.
      3. Umieścić kilka mikrolitrów zawiesiny na szkiełku mikroskopowym, dodać podłoże montażowe (patrz tabela materiałów), a na koniec szkiełko nakrywkowe.
      4. Obraz OxOS w mikroskopie konfokalnym (patrz tabela materiałów).
        UWAGA: Autofluorescencja OxOS może być wzbudzana przez szeroki zakres długości fal lasera, ale zwykle stosuje się linię laserową 405 nm lub 488 nm. Emisja jest podobnie szeroka, ale typowy zestaw filtrów wzbudzenia/emisji GFP/FITC jest wystarczający do obserwacji autofluorescencji.
      5. Aby zmierzyć widmo emisyjne OxOS, użyj skanowania λ w mikroskopie konfokalnym. Typowe ustawienia skanowania λ obejmują wzbudzenie z 405 nm lub 488 nm oraz wykrywanie emisji w zakresie od 10 nm przesuniętych ku czerwieni od linii wzbudzenia lasera aż do około 800 nm, z krokiem λ wynoszącym 10 nm. Każdy system mikroskopowy ma swoje własne wskazówki dotyczące korzystania z trybu λ, a czytelnik musi zapoznać się z instrukcją obsługi, aby uzyskać informacje na temat konkretnego konfokala.
    2. Alternatywnie należy określić ilościowo autofluorescencję za pomocą cytometrii przepływowej.
      1. Odwirować 2 x 107 nieobrobionych OS i oddzielnie 2 x 107 OxOS w probówkach do mikrowirówek i ponownie zawiesić w 1 ml PBS.
        UWAGA: Utrwalanie nie jest wymagane, jeśli cytometria przepływowa jest wykonywana bezpośrednio po rozmrożeniu.
      2. Załadować niepoddane działaniu substancji próbki OS i OxOS do cytometru przepływowego (patrz tabela materiałów). Dostosuj rozproszenie do przodu (FSC) i rozproszenie boczne (SSC) do akceptowalnego rozrzutu na wykresie punktowym FSC-SSC. Użyj PBS jako kontroli, aby wykluczyć wszelkie zanieczyszczające małe cząstki. Zauważ, że systemy operacyjne są znacznie mniejsze niż komórki.
      3. Użyj standardowego kanału FITC cytometru przepływowego do ilościowego oznaczania autofluorescencji. Policz co najmniej 10 000 zdarzeń. Użyj wartości obszaru impulsu na histogramie FITC, aby przedstawić intensywność fluorescencji.
        UWAGA: W niniejszym badaniu wszystkie dane są analizowane za pomocą oprogramowania do analizy cytometru przepływowego (patrz tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Oceń stopień sieciowania w OxOS
      1. Odwirować 2 x 107 nieobrobionych OS i oddzielnie 2 x 107 OxOS w probówkach do mikrowirówek. Usunąć supernatant i bezpośrednio lizować osad, dodając 1,2x Laemmli Sample Buffer (wystarczający do przykrycia; patrz Tabela Materiałów). Wirować, przechowywać w temperaturze pokojowej przez 30 minut, odwirowywać w temperaturze pokojowej równej lub większej niż 12000 x g przez 10 minut i zebrać supernatant.
        UWAGA: Ocena stopnia usieciowania białek w OxOS daje poczucie adekwatności leczenia UV. Porównuje się nieleczony OS i OxOS, a odpowiednie sieciowanie występuje, gdy monomeryczne pasmo rodopsyny, które dominuje barwienie Coomassie (Rysunek 1C, strzałka) jest po prostu zauważalne, z pojawieniem się agregatów wyższego rzędu i rozmazem białka na górze żelu.
        UWAGA: W przypadku używania bufora próbki do lizy systemu operacyjnego, nie należy następnie podgrzewać roztworu do lizy, ponieważ może to wywołać agregację rodopsyny. Unikaj również chłodzenia lizowanego systemu operacyjnego, dopóki nie będzie gotowy do przechowywania, ponieważ spowoduje to wytrącenie SDS. Niewykorzystane lizaty można przechowywać w temperaturze -20 °C. W przypadku ponownego rozmrażania przed użyciem upewnij się, że lizaty są całkowicie rozmrożone w temperaturze pokojowej.
      2. Określ ilościowo stężenie białka za pomocą testu białkowego, który jest tolerancyjny na wysokie stężenia SDS i reduktorów29. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać sugestie dotyczące odpowiednich odczynników do oznaczania białek i postępuj zgodnie z protokołem producenta dla tych odczynników.
      3. Uruchom niepoddane działaniu próbek OS i OxOS za pomocą elektroforezy SDS-PAGE30 na żelu o gradiacji 4%-15%, stosując standardowy bufor SDS tris-glicyny. Żel jest podawany pod napięciem 80 V, aż próbki trafią do stosu, a następnie pod napięciem 120 V przez 50-60 minut w temperaturze pokojowej.
      4. Zabarwić żel kolorem Coomassie na niebiesko, korzystając ze standardowych protokołów31. Barwienie Coomassie wykaże adekwatność sieciowania wywołanego przez obróbkę UV.

2. Budowanie granulek podobnych do lipofuscyny (UAM) w kulturach RPE

  1. Karmienie OxOS: ilość, częstotliwość i ligandy łączące fagocytozę
    UWAGA: Karmienie odbywa się na ludzkich kulturach iPSC-RPE lub hfRPE w przejściu 1, hodowanych zgodnie z protokołem nakreślonym przez laboratorium Bharti (dla iPSC-RPE)32 lub naszym wcześniej opisanym protokole dla hfRPE, zaadaptowanym z Sheldon Miller lab22,23. Wszystkie poniższe obliczenia opierają się na podawaniu OxOS lub OS do jednego 24-dołkowego Transwella (średnica 6,5 mm, 0,33cm2 powierzchni wzrostu).
    1. Rozmrozić 25 μl 5,6 x 107 OxOS/ml w temperaturze 37 °C i dodać 45 μl pożywki do hodowli komórkowych do podwielokrotności OxOS, otrzymując końcową objętość 70 μl.
      UWAGA: Podwielokrotności OxOS przygotowane w kroku 1 będą zawierały ligandy łączące fagocytozę MFG-E8 i białko S. Jeżeli jednak ligandy te nie zostały dodane do podwielokrotności przed zamrożeniem, można je dodać na tym etapie, zapewniając, że końcowe stężenie ligandów w pożywce, która ma być karmiona komórkami, wynosi 4 μg/ml dla białka S i 1,5 μg/ml dla MFG-E8. Jak stwierdzono w kroku 1.1.11, może być konieczna zmiana stężeń ligandów mostkowych dla innych typów RPE lub gęstości komórek.
    2. Usunąć pożywkę wierzchołkową z Transwell i dodać 70 μl 2 x 107 OxOS/ml z ligandami łączącymi fagocytozę do komory wierzchołkowej. Po 24 godzinach usuń i zastąp nowym podawaniem OxOS. Karmienie odbywa się codziennie w dni powszednie, z pominięciem weekendów, aż do zakończenia 20 karmień (~1 miesiąc). Zmieniaj podstawno-boczne podłoża do hodowli komórkowych (400-550 μl) 2-3 razy w tygodniu.
    3. Po zakończeniu 20 karmień wznów normalne zmiany pożywki dla studzienki.
      UWAGA: Potrzeba kilku dodatkowych zmian podłoża, aby zmyć lepki OxOS z powierzchni wierzchołkowej RPE, więc eksperymenty z kulturami obciążonymi UAM muszą być przeprowadzone co najmniej 1-2 tygodnie po zakończeniu karmienia OxOS.
      UWAGA: Ważne jest, aby mieć odpowiednią kontrolę nad gromadzeniem się UAM za pośrednictwem kanałów OxOS. Ponieważ codzienne zmiany pożywki mogą wpływać na biologię RPE, zaleca się następujące studzienki kontrolne: Kontrola 1: Wymieniaj pożywkę codziennie w dni powszednie dla takiej samej liczby karmień, jak w grupie leczonej OxOS. Kontrola 2: Podawaj nieleczony OS RPE codziennie w dni powszednie w tym samym stężeniu i objętości, co karmienie OxOS, dla tej samej liczby karmień.
  2. Monitorowanie stanu zdrowia kultur obciążonych granulkami podobnymi do lipofuscyny za pomocą trans-nabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) i testów śmierci komórkowej
    UWAGA: W trakcie i po karmieniu OxOS, zdrowie kultur RPE można zmierzyć, oceniając integralność ścisłych połączeń RPE i śmierć komórki. Wcześniej wykazano, że ocena integralności złączy ścisłych, poprzez pomiar transnabłonkowego oporu elektrycznego (TEER), jest czułym markerem ogólnego stanu zdrowia komórek33. Można również zastosować bardziej tradycyjne, nieinwazyjne markery śmierci komórki, takie jak uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH).
    1. Wykonaj test TEER
      UWAGA: TEER jest testowany za pomocą miernika oporności elektrycznej przeznabłonka (TEER) i elektrody TEER, zazwyczaj zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
      1. Aby wysterylizować elektrodę TEER, należy użyć wycieraczki roboczej nasączonej 70% etanolem do czyszczenia elektrody, a następnie zanurzyć końcówki sondy elektrody w 70% etanolu na 10 minut.
      2. Pozostaw elektrodę do całkowitego wyschnięcia, a następnie zanurz ją w sterylnym medium.
      3. Wyjmij sondę ze sterylnych pożywek i włóż dwie sondy elektrody TEER do komory wierzchołkowej i podstawno-bocznej hodowanego Transwella; dłuższa końcówka sondy pasuje do komory podstawno-bocznej.
        UWAGA: Łatwo jest zeskrobać dno komory wierzchołkowej za pomocą elektrody TEER bez wprawy, a takie skrobanie radykalnie zmieni odczyty TEER, ponieważ zlewająca się monowarstwa RPE zostanie zakłócona. Dlatego zaleca się, aby początkujący ćwiczyli na nieistotnych Transwellach przed testowaniem na eksperymentalnych kulturach RPE. Ponadto, po przetestowaniu każdej płytki kultur RPE, eksperymentator powinien sprawdzić, czy monowarstwa RPE nie została zeskrobana pod standardowym mikroskopem kultur tkankowych.
      4. Gdy sondy wierzchołkowe i podstawno-boczne znajdą się na swoim miejscu w Transwell, naciśnij przycisk odczytu lub naciśnij przełącznik nożny miernika, aby zarejestrować TEER. Pomiędzy płytkami lub grupami ogniw umyj sondę elektrody sterylnymi mediami. Jeśli infekcja stanowi duże zaniepokojenie, należy ponownie sterylizować między płytkami.
      5. Oblicz TEER, biorąc odczyt rezystancji z miernika, odejmując wartość ślepej próby Transwell z mediami, ale bez komórek (zwykle 100-110 Ω dla 24-dołkowego Transwella o powierzchni 0,33 cm2), a następnie mnożąc przez pole powierzchni Transwell.
        UWAGA: Wartości TEER muszą być podawane znormalizowane do powierzchni komórki. Typowe wartości dla zdrowych kultur hfRPE wahają się od 350-1100 Ωcm2. Wartości TEER rosną wraz ze spadkiem temperatury. W związku z tym, podczas wyjmowania kultur z inkubatora o temperaturze 37 °C do okapu o temperaturze pokojowej, wartości TEER będą miały tendencję do zwiększania się na całej płytce. Aby zabezpieczyć się przed tą zmiennością, pracuj szybko (jeśli masz doświadczenie) lub poczekaj 10-15 minut, aż temperatura płyty zrównoważy się z temperaturą pokojową.
    2. Wykonać test uwalniania LDH
      UWAGA: Uwalnianie LDH do supernatantu hodowli komórkowej następuje podczas śmierci komórki i musi być mierzone za pomocą standardowego zestawu (patrz Tabela materiałów).
      1. Zebrać supernatant znad komórek po 24-godzinnej inkubacji i rozcieńczyć do 1:100 przy użyciu standardowych pożywek.
      2. Indukować całkowite możliwe uwalnianie LDH, co jest ważne dla normalizacji wszystkich wartości z kroku 2.2.2.1, poprzez dodanie 2 μl 10% trytonu X-100 do 100 μl pożywki wierzchołkowej z komórek kontrolnych w 24-dołkowym Transwellu. Po inkubacji mieszaniny tryton/supernatant komórkowy przez 15 minut w temperaturze 37 °C, wymieszać pożywkę nad teraz zlizowanymi komórkami i zebrać w celu zmierzenia całkowitego możliwego uwolnienia LDH.
      3. Po zebraniu supernatantów należy przeprowadzić test zgodnie ze standardowymi instrukcjami producenta, mierząc luminescencję po 30 minutach inkubacji przy użyciu roztworu buforowego zestawu.
        UWAGA: Wszystkie wartości LDH są znormalizowane do całkowitej możliwej ilości uwalnianego LDH.
  3. Charakterystyka spektrum i składu granulek podobnych do lipofuscyny
    1. Pozyskiwanie kwantyfikacji i widm autofluorescencji
      1. Utrwal kultury obciążone UAM 4% PFA w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie przemyj PBS 5x.
      2. Trzymaj niewielką ilość PBS w komorze wierzchołkowej, a następnie odwróć Transwell do góry nogami. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i żyletki odetnij półporowatą membranę od Transwell, przykładając siłę cięcia na styku membrany i Transwell.
        UWAGA: Zachowaj konsekwencję co do tego, jak blisko krawędzi Transwell wykonane jest cięcie, ponieważ membrana Transwell ma tendencję do wypaczania się i marszczenia, gdy cięcia nie są spójne.
      3. Po przecięciu membrany Transwell należy ją natychmiast umieścić na szkiełku mikroskopowym za pomocą kleszczy, uważając, aby nie dotykać komórek częściami membrany Transwell. Usuń nadmiar PBS za pomocą wycierania zadaniowego, unikając dotykania komórek. Dodaj nośnik montażowy i szkiełko nakrywkowe. Upewnij się, że śledzisz, która strona Transwell jest "prawą stroną do góry" podczas nakrywania Transwell.
      4. Uzyskaj intensywność i widma autofluorescencyjne, korzystając z tych samych ustawień i procedur, co w kroku 1.3.1.4 i kroku 1.3.1.5.
        UWAGA: Podczas obrazowania UAM ważnym czynnikiem zakłócającym jest to, że OxOS są autofluorescencyjne i często przyklejają się do powierzchni wierzchołkowej RPE przez kilka dni, a czasem nawet tygodni po zakończeniu karmienia OxOS. W rezultacie, przy ilościowym określaniu UAM, należy zastosować metodę, aby upewnić się, że zmierzona autofluorescencja pochodzi z UAM, a nie z OxOS. Najłatwiejszą metodą jest współbarwienie kultur lipofuscyny przeciwciałem rodopsyny. Na przykład przeciwciało anty-rodopsyny 4D2 może być stosowane w rozcieńczeniu 1:1000 i ze standardowym protokołem immunocytochemicznym wiązania PFA34. Przeciwciałem drugorzędowym przeciwko rodopsyny powinno być przeciwciało sprzężone z barwnikiem dalekiej czerwieni (np. o maksimum wzbudzenia bliskim 647 nm), ponieważ autofluorescencja UAM i OxOS jest zwykle najsłabsza na tej długości fali. Obrazy konfokalne mogą być następnie pozyskiwane sekwencyjnie w dwóch kanałach, wzbudzając autofluorescencję UAM i OxOS za pomocą lasera 405 nm i emisję od 415 nm do 550 nm, podczas gdy rodopsyna resztkowa, wskazująca na niestrawiony OxOS, może być wzbudzana standardowymi parametrami obrazowania barwnika dalekiej czerwieni w osobnym kanale. Po akwizycji kanał rodopsyny może być używany jako maska subtraktywna w programie takim jak ImageJ do usuwania autofluorescencji pochodzącej z lepkiego pozostałego OxOS, pozostawiając tylko autofluorescencję UAM do ilościowego określenia.
        UWAGA: Nawet system operacyjny, który nie jest utleniony fotooksydowany, wykazuje pewną autofluorescencję, a nawet przy rygorystycznym praniu, niektóre systemy operacyjne i OxOS przyklejają się do powierzchni RPE. Tak więc, bez wygenerowania maski subtraktywnej przy użyciu barwienia immunologicznego rodopsyny, jak zasugerowano w powyższej UWAGA, dokładne określenie ilościowe poziomów autofluorescencji UAM w kulturach karmionych OxOs lub standardowym OS nie jest możliwe.
    2. Wykonaj jednoczesne wykrywanie granulek podobnych do lipofuscyny i innych markerów immunofluorescencyjnych
      UWAGA: Jak opisano w kroku 2.3.1, szerokie spektrum autofluorescencji lipofuscyny ogranicza możliwości współbarwienia fluorescencyjnego. Można rozważyć następujące metody, aby ułatwić współbarwienie.
      1. Użyj dalekiego czerwonego fluoroforu. Autofluorescencja lipofuscyny jest słaba w bliskiej podczerwieni. Tak więc, użycie dalekiej czerwieni barwnika do fluorescencyjnego wykrywania antygenu będącego przedmiotem zainteresowania, w połączeniu z ostrożnymi regulacjami ustawień kanałów w mikroskopie konfokalnym, może zwykle odróżnić autofluorescencję od fluorescencji współbarwienia.
      2. Skorzystaj z długiego ogona emisji fluorescencji lipofuscyny.
        UWAGA: Ponieważ lipofuscyna ma bardzo szerokie spektrum emisji fluorescencji, często może być wzbudzana przy niskiej długości fali nm (np. laser 405 nm) i mieć emisję nadal wykrywaną w pomarańczowo-czerwonej części widma (np. 585-635 nm). Ta unikalna kombinacja długości fal wzbudzenia i emisji może być często dostosowana do innego współbarwiącego fluoroforu.
        1. Wykryj interesujący nas antygen za pomocą fluoroforu, który ma szczytowe wzbudzenie około 488 nm, z detekcją emisji przy 500-530 nm. Ustaw oddzielny kanał do wykrywania autofluorescencji o wzbudzeniu 405 nm i emisji 585-635 nm. Ten drugi kanał wykryje tylko UAM, podczas gdy pierwszy kanał wykryje interesujący nas antygen oraz lipofuscynę.
        2. Korzystając z darmowego programu, takiego jak ImageJ, wykorzystaj ten drugi kanał tylko UAM jako maskę subtraktywną, aby usunąć sygnał UAM z pierwszego kanału (który zawiera zarówno sygnał antygenowy, jak i sygnał UAM).
      3. Wykorzystaj mieszanie spektralne. Większość nowoczesnych mikroskopów konfokalnych zawiera opcję rozmieszania spektralnego. Pozwala to na uzyskanie widma próbki za pomocą samego UAM i innej próbki z samym fluoroforem współbarwiącym, który jest przedmiotem zainteresowania. Próbka eksperymentalna, która zawiera zarówno UAM, jak i fluorofor współbarwiący, może być następnie pozyskana i poddana metodom liniowego rozmieszania w celu obliczenia, jaki procent sygnału pochodził z autofluorescencji, a jaki z barwienia współbarwionego.
        UWAGA: Kompleksowe przewodniki dotyczące rozmieszania spektralnego są dostępne z większością nowoczesnych mikroskopów konfokalnych.
      4. Wykorzystaj obrazowanie czasu życia fluorescencji. Chociaż widmo emisyjne między UAM a fluoroforem współbarwiącym może być podobne, jest prawdopodobne, że ich czas życia fluorescencji znacznie się różni. Ogólnie rzecz biorąc, UAM wykazuje krótszy czas życia fluorescencji niż większość specyficznych fluoroforów. Dzięki dostępowi do mikroskopu konfokalnego, który pozwala na obrazowanie przez cały okres życia, można bramkować sygnały fluorescencyjne, aby wykryć te, które są dłuższe niż typowy czas życia lipofuscyny.
        UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, bramkowanie żywotności fluorescencji do sygnałów dłuższych niż 2 ns znacznie zmniejsza zanieczyszczenie UAM, chociaż nie eliminuje całkowicie sygnału.
      5. Wykorzystanie tłumika autofluorescencji. Tradycyjnie, Sudan Black był używany do wygaszania autofluorescencji przed specyficznym barwieniem immunofluorescencyjnym35. Kilka dostępnych na rynku produktów do gaszenia autofluorescencji zgłasza poprawę wyników Sudan Black, a produkty te są szczegółowo opisane w Tabeli materiałów. Wygaszanie autofluorescencji oczywiście zniszczy zdolność wykrywania lipofuscyny.
    3. Określ skład granulek podobnych do lipofuscyny
      1. Oceń neutralne lipidy
        1. Zamocuj RPE obciążone UAM i studzienki kontrolne (zasilane nieobrobionym OS) w 4% PFA w temperaturze pokojowej przez 15 minut i umyj PBS 5x.
        2. Zabarwić neutralne lipidy za pomocą 10 μg/ml czerwieni nilowej lub 3,33 μg/ml Bodipy 493/503 w 3% roztworze BSA PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie przemyć PBS przez 5 min 3x.
        3. Wytnij i zamontuj Transwell jak w krokach 2.3.1.2 i 2.3.1.3 i obrazie. Ogólnie rzecz biorąc, do obrazowania należy stosować następujące szerokości pasma wzbudzenia i emisji: Czerwień Nilowa - ex 543 nm, em 620-700 nm i Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. Ocena estryfikowanego i nieestryfikowanego cholesterolu
        1. Wykonaj krok 2.3.3.1.1
        2. Filipin to barwnik fluorescencyjny, który rozpoznaje cholesterol nieestryfikowany, ale nie cholesterol estryfikowany36. Tak więc, aby ocenić ilość cholesterolu całkowitego (nieestryfikowanego i estryfikowanego) w UAM, najpierw należy wstępnie potraktować próbkę esterazy cholesterolu, aby przekształcić estryfikowany cholesterol w nieestryfikowany cholesterol. Potraktować komórki 20 U/ml esterazy cholesterolu w 0,1 M buforze fosforanu potasu (pH 7,2) (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C przez 3,5 godziny, a następnie przemyć PBS przez 5 minut 3x.
        3. Zabarwić 50 μg/ml filipiny (patrz Tabela Materiałów) w PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i myć PBS przez 5 minut 3x. Próbki należy przechowywać pod przykryciem, z dala od światła, ponieważ filipina łatwo fotowybiela.
          UWAGA: Jeśli ma być oznaczony tylko cholesterol nieestryfikowany, esteraza cholesterolu w kroku 2.3.3.2.2 może zostać pominięta. Jeżeli ilość estryfikowanego cholesterolu ma być określona ilościowo, można ją wywnioskować na podstawie różnicy między cholesterolem całkowitym a cholesterolem nieestryfikowanym w próbce.
        4. Wytnij i zamontuj Transwell, jak w krokach 2.3.1.2 i 2.3.1.3 oraz image.
          UWAGA: Podczas obrazowania filipińskiego bardzo szybko się fotowybiela. Należy zminimalizować intensywność i czas trwania wzbudzenia i spodziewać się, że pewne fotowybielanie może wystąpić nawet przy oglądaniu próbki przez okulary. Dlatego podczas obrazowania należy: (1) poszukać odpowiedniego obszaru do obrazowania za pomocą kanału fluorescencyjnego innego niż kanał filipinowy, (2) obrazować filipinę pod mikroskopem szerokokątnym, a nie konfokalnym (aby ograniczyć intensywność ekspozycji na światło) oraz (3) unikać wielokrotnego obrazowania obszaru. Ogólnie rzecz biorąc, do obrazowania filipiny należy używać następujących szerokości pasm wzbudzenia i emisji - ex 380 nm, em 480 nm.

3. Ocena wpływu granulek podobnych do lipofuscyny na fagocytozę RPE: Całkowita pojemność konsumpcyjna

UWAGA: Uzasadnienie pomiaru fagocytozy OS za pomocą protokołu OS tylko impulsowego poniżej jest szczegółowo opisane w sekcji reprezentatywnych wyników. Metoda, która jest określana jako "całkowita pojemność konsumpcyjna", pozwala uniknąć niejasności dotyczących wydajności fagocytozy, które mogą pojawić się w tradycyjnych testach fagocytozy z impulsem OS. Testy przeprowadza się na 24-dołkowych płytkach Transwell przy użyciu 50 μl pożywki zawierającej 4 x 106 OS/ml.

  1. Obliczyć liczbę dołków potrzebnych do eksperymentu, a następnie rozmrozić odpowiednią ilość zwykłego OS, odwirować w temperaturze 2400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w standardowej pożywce do hodowli komórek RPE do 4 x 106 OS / ml. Dodaj ligandy mostkujące, aby ułatwić tempo fagocytozy.
    UWAGA: Końcowe stężenie ligandów mostkujących w pożywce, która ma być karmiona komórkami, wynosi 4 μg/ml dla białka S i 1,5 μg/ml dla MFG-E8. Jak stwierdzono w kroku 1.1.11, może być konieczna zmiana stężeń ligandów mostkowych dla innych typów RPE lub gęstości komórek.
  2. Usunąć pożywkę wierzchołkową i dodać 50 μl 4 x 106 OS/ml, najlepiej z odpowiednimi stężeniami ligandów mostkujących.
  3. W różnych momentach po dodaniu OS (np. - 0 h, 1 h, 4 h i 24 h) dodać 16,67 μl 4x bufor próbki Laemmli z inhibitorami proteazy w celu lizy obu komórek i leżącego nad nimi supernatantu zawierającego OS. Użyj pipety P-200, aby zarysować powierzchnię Transwell, uważając, aby nie przebić membrany Transwell ani nie odłączyć membrany od Transwell, a następnie zebrać razem połączony supernatant komórkowy i lizat komórkowy. Odwirować, odwirować i pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 minut w celu dokładnej denaturacji.
    UWAGA: Pomimo użycia bufora próbki do lizy systemu operacyjnego, nie należy następnie podgrzewać roztworu do lizy, ponieważ może to wywołać agregację rodopsyny. Należy również unikać chłodzenia lizowanego systemu operacyjnego do czasu, gdy będzie on gotowy do przechowywania, ponieważ spowoduje to wytrącenie białka. Niewykorzystane lizaty zamrozić w temperaturze -20 °C, upewniając się, że lizaty są całkowicie rozmrożone przed użyciem.
  4. Uruchom lizaty na SDS PAGE przy użyciu tych samych ustawień, co w kroku 1.3.3, ładując równe objętości lizatów na studzienkę. Do normalizacji liczby komórek należy użyć GAPDH, β-aktyny lub innego białka porządkowego, ponieważ wskaźniki fagocytozy zależą od liczby komórek.
  5. Sonduj Western blot z przeciwciałami przeciwko N- lub C- końca rodopsyny. Stosować standardowe warunki Western blot, a rozcieńczenia przeciwciał są wymienione w Tabeli Materiałów.
    UWAGA: Poniżej głównego pasma rodopsyny będzie wiele fragmentów rodopsyny. Fragmenty te reprezentują częściowo strawioną rodopsynę, proces, który rozpoczyna się przed fuzją fagosomu z lizosomem32,33. Wzrost liczby fragmentów rodopsyny w RPE obciążonym UAM w porównaniu z kontrolnym RPE może wskazywać na defekt zdolności fagolizosomu na poziomie fuzji fagosomu z lizosomem, zakwaszenia lizosomów i/lub funkcji enzymu degradacyjnego16,34,35.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konfiguracja fotooksydacji systemu operacyjnego jest pokazana w Rysunek 1Ai. Szkiełka pokryte politetrafluoroetylenem pozwalają na załadowanie dużej ilości OS w roztworze na otwarty prostokąt bez rozprowadzania po pozostałej części szkiełka. Szkiełko z OS jest umieszczone w sterylnej szalce Petriego ze zdjętą pokrywką, a nad szkiełkiem umieszcza się lampę UV, jak pokazano na Rysunek 1Aii. Alternatywnie, szkiełko można umieścić w urządzeniu UV Crosslinker, jak pokazano na ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż lipofuscyna RPE jest badana od dziesięcioleci, jej toksyczność jest przedmiotem dyskusji 2,9,16,42. Biorąc pod uwagę niejasności co do toksyczności lipofuscyny z modeli zwierzęcych11, modele in vitro z wykorzystaniem ludzkiego RPE są cenne. Opisano szereg modeli akumulacji lipofuscyny in vitro, ale w żadnym z nich nie wykorzystano zarówno karmie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest częściowo wspierana przez granty z Fundacji Chirurgii Witreo-Siatkówki (VRSF), Fight for Sight (FFS) i Międzynarodowej Fundacji Badań nad Siatkówką (IRRF). J.M.L.M. jest obecnie wspierany przez grant K08 z National Eye Institute (EY033420). Na badania nad HFT nie wykorzystano żadnych funduszy federalnych. Dalsze wsparcie pochodzi od James Grosfeld Initiative for Dry AMD oraz następujących prywatnych darczyńców: Barbara Dunn oraz Dee & Dickson Brown.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Naczynie do hodowli komórkowych 100 mmCorning#353003Inne działają również
24-dołkowe TranswellsCorning#3470
Technologia sygnalizacji komórkowejprzeciwciała anty-LC3#4801Srozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało antyrodopsynowe 1D4Abcam#54171:1000 rozcieńczenie. Epitop jest C-końcowy.
Przeciwciało anty-rodopsynowe 4D2EnCor BiotechMCA-B6301:5000 rozcieńczenie do western blot, rozcieńczenie 1:1000 do barwienia immunologicznego. Epitop jest N-końcowy.
Wygaszacz autofluorescencjiBiotium#23007TrueBlack Lipofuscin Ugaszanie autofluorescencji
Wygaszanie autofluorescencjiVector LaboratoriesSP-8400Vector TrueVIEW Zestaw do gaszenia autofluorescencji
Bodipy 493/503Life TechnologiesD3922
Esteraza cholesterolu Life TechnologiesFrom A12216
Mikroskop konfokalnyLeicaLeica Stellaris SP8 z modułem
Siatkówki bydlęce przystosowane do ciemnościFirma W. L. Lawson Ciemnesiatkówki bydła (wstępnie wypreparowane)Informacje kontaktowe:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
Filipińskicytometr przepływowy Sigma-AldrichF4767
Thermo FisherAttune NxT
Oprogramowanie do analizy cytometru przepływowego BDFlowJo
Ręczna lampa UV Analytik Jena USUVGL-55
Ludzki MFG-E8Sino Biological10853-H08B
Ludzkie oczyszczone białko SEnzyme Research LaboratoriesHPS
LaemmliTest próbek Thermo FisherJ60015-AD
LDHPromegaJ2380LDH-Glo Test cytotoksyczności
Media montażoweInvitrogenP36930Odczynnik przeciwblaknięcie Prolong Gold
Czerwień nilowaSigma-Aldrich#72485
Szkiełka powlekane politetrafluoroetylenemTekdonDostosowaneDostosowane specyfikacje: Maska PTFE z następującymi "wycięciami" -  3 szklane prostokąty, każdy o wymiarach 17 mm x 9 mm, zorientowane tak, aby bok 17 mm znajdował się 4 mm od góry szkiełka i 4 mm od dołu szkiełka, przy założeniu standardowego szkiełka mikroskopowego o wymiarach 25 mm x 75 mm. Każdy prostokąt jest oddalony o co najmniej 6 mm od innych prostokątów i krawędzi zjeżdżalni. Wydrukuj maskę PTFE na szkiełku z matowym szkłem z jednej strony, aby umożliwić oznaczenie szkiełka.
Inhibitory proteazy Technologia sygnalizacji komórkowej#5872
Test białkaBio-Rad#5000122 Test
Elektroda TEERWorld Precision InstrumentsSTX3
Miernik transnabłonkowej rezystancji elektrycznej (TEER)World Precision InstrumentsEVOM3
Urządzenie do sieciowania ultrafioletowegoAnalytik Jena USUVP CL-1000
Zestaw FALCON Bufor próbki Testbiałka RC DC

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease--correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215(2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170(2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, Clifton, N.J. 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, Clifton, N.J. 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582(2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch's membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846(2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39(2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170(2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118(2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. 0, 51-60 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lipofuscin ModelsRetinal Pigment EpitheliumOuter Segment PhagocytosisHuman RPE CulturesLipofuscin AccumulationPhagocytosis AssayTotal Consumptive CapacityAutofluorescence ImagingConfocal MicroscopyRhodopsin Degradation

Related Articles