Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezpośrednia synteza widocznych dla EM-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65246

⸱

28 kwietnia 2023

1National Institute of Biological Sciences, Beijing, 2Tsinghua Institute of Multidisciplinary Biomedical Research, Tsinghua University

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje technologię znakowania za pomocą klonowalnego mikroskopu elektronowego do wykrywania białek znakowanych metalotioneiną w komórkach za pomocą nowatorskiej techniki syntezy nanocząstek złota opartej na mechanizmie tłumienia autonukleacji.

Streszczenie

Analiza precyzyjnej lokalizacji cząsteczek białek w komórkach o ultrastrukturalnej rozdzielczości ma ogromne znaczenie dla badania różnych procesów fizjologicznych lub patologicznych we wszystkich żywych organizmach. Dlatego opracowanie klonowalnych znaczników, które mogą być używane jako sondy mikroskopii elektronowej, ma ogromną wartość, podobnie jak białka fluorescencyjne odegrały kluczową rolę w dziedzinie obrazowania optycznego. Niedawno odkryto mechanizm supresji autonukleacji (ANSM), który pozwala na specyficzną syntezę nanocząstek złota (AuNPs) na znacznikach bogatych w cysteinę, takich jak metalotioneina (MT) i białko zapobiegające zamarzaniu (AFP).

Na podstawie ANSM opracowano technologię znakowania mikroskopią elektronową, która umożliwia specyficzne wykrywanie oznaczonych białek w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych z niespotykaną dotąd skutecznością znakowania. Badanie to ilustruje protokół wykrywania białek fuzyjnych MTn (zmodyfikowany wariant MT pozbawiony reszt reaktywnych aldehydowo) w komórkach ssaków o dobrze zachowanej ultrastrukturze. W tym protokole zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i utrwalanie przez wymrażanie i substytucję przez wymrażanie przeprowadzono przy użyciu utrwalaczy niealdehydowych (takich jak kwas garbnikowy, octan uranylu) w celu zachowania prawie natywnej ultrastruktury i uniknięcia uszkodzenia aktywności znacznika spowodowanego sieciowaniem aldehydowym.

Prosty, jednoetapowy system nawadniania został zastosowany przed syntezą AuNP opartą na ANSM. Wyniki pokazały, że znakowane białka celowały w różne organelle, w tym błony i światło retikulum endoplazmatycznego (ER), a matryce mitochondrialne wykryto z wysoką wydajnością i swoistością. Badania te zapewniają biologom solidny protokół do rozwiązywania ogromnego zakresu problemów biologicznych na poziomie pojedynczej cząsteczki w kontekstach ultrastrukturalnych komórek.

Wprowadzenie

W erze postgenomicznej, rozwój białka zielonej fluorescencji (GFP) jako pojedynczego reportera do mikroskopii świetlnej zrewolucjonizował dziedzinę nowoczesnych badań nad naukami przyrodniczymi1,2. Przez dziesięciolecia mikroskopia elektronowa (EM) była potężnym narzędziem do intuicyjnej obserwacji ultrastruktury komórkowej z rozdzielczością nanoskalową3; Jednak precyzyjna identyfikacja i lokalizacja cząsteczek białka pozostaje wyzwaniem.

Najczęściej używaną techniką znakowania EM jest technika znakowania za pomocą mikroskopii immunoelektronowej (IEM), która opiera się na reakcji antygen-przeciwciało. Jednakże, chociaż w dziedzinie znakowania IEM opracowano wiele technik, w tym wstępne zatapianie IEM i końcowe zatapianie IEM (na sekcjach żywicy lub uwodnionych kriosekcjach), nadal cierpi z powodu niskiej skuteczności znakowania (<10%)4,5, co jest związane z przygotowaniem próbki i jakością przeciwciał. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowanie znaczników kodowanych genetycznie ma ogromny potencjał zastosowań.

Dwa główne typy znaczników EM zostały dokładnie zbadane w ostatnich latach. Jednym z typów jest metoda barwienia DAB, która wykorzystuje znaczniki takie jak APEX2 do utleniania 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) do polimerów osmiofilowych w celu wizualizacji EM6,7,8,9,10,11,12. Umożliwia znakowanie białek o wysokiej obfitości w regionach subkomórkowych, ale nie nadaje się do zliczania pojedynczych cząsteczek. Drugi typ wykorzystuje białka wiążące metale, takie jak ferrytyna13 i metalotioneina (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, do generowania gęstych elektronowo osadów metali in situ do wizualizacji EM. Tylko ten ostatni ma realny potencjał do wizualizacji i liczenia pojedynczych cząsteczek. Rozmiar cząsteczkowy ferrytyny jest zbyt duży (~450 kD), aby można go było wykorzystać jako obiecujący znacznik, podczas gdy mały rozmiar (~5 kD) MT i jego zdolność do wiązania różnych jonów przez 20 cystein przyciągnęły dużą uwagę. Kilka laboratoriów próbowało oznaczyć oczyszczone białka fuzyjne MT lub komórki wykazujące ekspresję MT poprzez inkubację bezpośrednio z Au +. Próby te początkowo dowiodły, że znaczniki MT mogą wiązać jony złota, tworząc sygnały o wysokim kontraście, ale żadna z nich nie osiągnęła skutecznej identyfikacji pojedynczych białek w komórkach i nie mają one powszechnego zastosowania14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.

Technika syntezy AuNP oparta na ANSM, która polega na syntezie AuNP o rozmiarach 2-6 nm bezpośrednio na znacznikach bogatych w cysteinę (np. MT, warianty MT MTn i MTα, AFP) jako etykiety o dużej gęstości elektronów do wizualizacji EM, jest pierwszym niezawodnym i możliwym do zastosowania podejściem do znakowania białek i wykrywania pojedynczych cząsteczek w komórkach24,25,26. Pozwala to na specyficzną syntezę AuNP na izolowanych białkach fuzyjnych znaczników i osiągnęło bezprecedensową skuteczność znakowania w nieutrwalonych lub chemicznie utrwalonych komórkach prokariotycznych (E. coli) i eukariotycznych (S. pombe). Jednak wdrożenie tego samego protokołu w bardziej zaawansowanych systemach, takich jak komórki ssaków, a nawet tkanki, wiąże się z dodatkowymi wyzwaniami, takimi jak bardziej złożona wewnątrzkomórkowa homeostaza redoks i bardziej delikatna struktura komórkowa.

To badanie przedstawia technologię znakowania EM opartą na klonowaniu, która łączy nowatorską technikę syntezy AuNP opartą na ANSM do znakowania genetycznie kodowanych znaczników bogatych w cysteinę (MT) z metodą przygotowania próbki HPF/FSF-rehydration-HPF/FSF, umożliwia jednoznaczną identyfikację pojedynczych cząsteczek oznakowanych białek w błonie ER, świetle ER i macierzy mitochondrialnej w komórkach HeLa. Obecna metoda łączy w sobie cechy wysokiej wydajności znakowania, wysokiego stosunku sygnału do szumu, znakowania pojedynczych cząsteczek i silnej uniwersalności, a metoda ta ma szerokie perspektywy zastosowania w badaniach z zakresu nauk przyrodniczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie materiały użyte w tym eksperymencie są wymienione w Tabeli Materiałów. Przebieg pracy krok po kroku bieżącego protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

1. Hodowla komórkowa na szafirowych krążkach

  1. Przenieś krążki szafirowe o wymiarach 3 mm x 0,16 mm do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml etanolu i poddaj sonifikacji w myjce ultradźwiękowej przez 10 minut.
  2. Spal każdy dysk szafiru w płomieniu lampy alkoholowej, aż na powierzchni nie będzie widocznych osadów.
    UWAGA: Dzięki powyższej metodzie szafirowe krążki można wielokrotnie poddawać recyklingowi.
  3. Oznacz jedną stronę każdej szafirowej tarczy numerem za pomocą długopisu odpornego na rozpuszczalniki (Rysunek 1A).
    UWAGA: Używany marker musi zostać wcześniej przetestowany w celu ustalenia, czy jest odporny na rozpuszczalniki acetonowe i metanolowe, aby zapobiec utracie śladów.
  4. Umieść oznaczone krążki szafirowe na dnie naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm oznaczoną stroną do góry.
  5. Sterylizuj naczynie do hodowli komórkowych z szafirowymi krążkami w świetle UV przez 30 minut.
  6. Odwróć szafirowe krążki pęsetą (oznaczoną stroną skierowaną w dół) i sterylizuj w świetle UV przez dodatkowe 30 minut. Teraz szalka hodowlana zawierająca szafirowe krążki jest gotowa do hodowli komórkowej.
    UWAGA: Szafirowe krążki można również sterylizować w autoklawie.
  7. Zasiej komórki na przygotowanych powyżej szafirowych krążkach i osiągnij 80%-90% zbiegu w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5% CO2 (Rysunek 1B).
    UWAGA: Stabilne linie komórkowe HeLa wyrażające znaczniki MTn zostały wygenerowane zgodnie z opisem w Jiang et al.26.

2. Zamrażanie wysokociśnieniowe (HPF)

UWAGA: W tym eksperymencie używany jest ciekły azot. Podczas pracy z ciekłym azotem należy stosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa i środki ochrony osobistej, aby zapobiec odmrożeniom i uduszeniu.

  1. Maszynę do zamrażania wysokociśnieniowego należy przygotować co najmniej 2 godziny przed eksperymentem zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Przenieś aluminiowe nośniki HPF typu A (wgłębienie: 0,025/0,275 mm) do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml etanolu i poddaj sonikacji w myjce ultradźwiękowej przez 10 min.
  3. Wysuszyć nośniki na szalce Petriego pokrytej jakościową bibułą filtracyjną (średnia prędkość).
  4. Namocz wstępnie oczyszczone nośniki w 1-heksadecenie.
    UWAGA: BSA nie jest zalecany jako krioprotektant w obecnym eksperymencie, ponieważ będzie to zakłócać późniejszą syntezę nanocząstek złota.
  5. Użyj cienkiej pęsety, aby podnieść szafirowy krążek z komórkami z naczynia hodowlanego; dotknij oznaczonej powierzchni jakościową bibułą filtracyjną (średnia prędkość), aby usunąć nadmiar pożywki.
    UWAGA: Przewodność cieplna wody jest bardzo niska, a zbyt duża ilość wody resztkowej wpłynie na efekt zamarzania. Zatrzymaj minimalną ilość wody, aby zapobiec wysychaniu komórek.
  6. Zamontuj szafirowy krążek w uchwycie na próbki HPF i szybko przykryj dysk aluminiowym nośnikiem o głębokości 0,025 mm zawierającym 1-heksadecen (Rysunek 1C).
  7. Odessać nadmiar roztworu za pomocą jakościowej bibuły filtracyjnej (średnia prędkość).
  8. Załaduj uchwyt próbki do zamrażania pod wysokim ciśnieniem ( Rysunek 1D).
    UWAGA: Proces ładowania próbki musi być tak szybki, jak to możliwe (w ciągu 1 minuty), aby zminimalizować zmiany fizjologiczne spowodowane zmianami temperatury, wilgotności, pH i zawartości tlenu.
  9. Rozładuj zespół nośnika dysku szafirowego pod ciekłym azotem w krioboxie piankowym i przechowuj zespół w kriowiale w ciekłym azocie przed użyciem.
    UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Próbki w kriowialach mogą być przechowywane w ciekłym azocie Dewara przez lata.

3. Utrwalanie przez zamrożenie (FSF) i ponowne nawodnienie (Rysunek 1E)

  1. Napełnij automatyczną maszynę do zamrażania i substytucji (AFS) ciekłym azotem i schłodzić komorę do temperatury −90 °C.
    UWAGA: W tym eksperymencie używany jest ciekły azot. Podczas pracy z ciekłym azotem należy stosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa i środki ochrony osobistej, aby zapobiec odmrożeniom i uduszeniu.
  2. Przygotuj 2 ml 0,01% kwasu garbnikowego (w/v) w acetonie (roztwór FSF 1) w okrągłym pojemniku polipropylenowym o średnicy 20 mm (Rysunek 1E) w dygestoriach i zamroź je w ciekłym azocie.
  3. Załaduj próbki (szafirowe zespoły nośnika dysku) do pojemnika z zamrożonym roztworem FSF 1 pod LN2 za pomocą pary wstępnie schłodzonych pęset.
  4. Przenieść pojemnik do wstępnie schłodzonej komory AFS w celu przetwarzania FSF w temperaturze -90 °C.
  5. Próbki należy przechowywać w temperaturze -90 °C przez 1 godzinę, a następnie oddzielić krążki szafiru od nośników za pomocą wstępnie schłodzonej pęsety i upewnić się, że zaznaczone boki krążków szafirowych są skierowane w dół.
    UWAGA: Pęseta musi być odpowiednio wstępnie schłodzona, aby zapobiec zmianom temperatury. Szafirowe krążki powinny być łatwe do oddzielenia.
  6. Przechowywać w temperaturze -90 °C przez kolejne 8-10 godzin, a następnie ogrzać do -60 °C w ciągu 3 godzin.
  7. Zastąp roztwór FSF 1 w pojemniku wstępnie schłodzonym acetonem i inkubuj przez 1 godzinę. Powtórz to płukanie acetonem 2x.
  8. Ogrzać do -30 °C w ciągu 3 godzin. W tym okresie należy przygotować i schłodzić 2 ml 0,01% octanu uranylu w acetonie (roztwór FSF 2, rozcieńczony z 10% octanu uranylu w metanolu) w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml.
    UWAGA: Octan uranylu, użyty w obecnym eksperymencie, jest radioaktywny i wysoce toksyczny; Należy obchodzić się z nim zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa i utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
  9. Zastąpić aceton roztworem FSF 2 i inkubować w temperaturze -30 °C przez 3 godziny.
  10. Zastąpić roztwór FSF 2 w pojemniku wstępnie schłodzonym acetonem i inkubować przez 30 minut w temperaturze -30 °C. Powtórzyć to płukanie acetonem 2x.
  11. Ciepło od -30 °C do 4 °C w ciągu 2 godzin.
  12. Zastąp aceton 2 ml 0,2 M buforu HEPES zawierającego 1 mM CaCl2 i 1 mM MgCl2 przy pH 5,5.
  13. Zmienić bufor jeden raz i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany w tym miejscu na jedną noc lub kontynuowany przez co najmniej 6 godzin, aż próbki zostaną ponownie zamrożone w kroku 5.

4. Synteza AuNP oparta na ANSM dla komórek ssaków (Rysunek 1F)

  1. Myć buforem PBS-A 3x przez 5 min za każdym razem.
  2. Przenieść krążki szafirowe do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm zawierającego 1 ml buforu PBS-A w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Zawsze trzymaj zaznaczone boki szafirowych krążków skierowanymi w dół i unikaj zachodzenia na szafirowe krążki i ścierania komórek.
  3. Przygotować roztwór redukujący, dodając 4,28 μl 2-merkaptoetanolu do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml buforu PBS-A i dobrze mieszając w dygestorium.
    UWAGA: 2-merkaptoetanol jest toksyczny i ma ostry zapach; Należy obchodzić się z nim zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa.
  4. Zastąp bufor PBS-A w naczyniu hodowlanym 1 ml roztworu redukującego i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotuj prekursor złota przed użyciem.
    1. Dodać 80 μl 10 mM HAuCl4 w ddH2O do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml roztworu redukującego i natychmiast zawirować.
      UWAGA: Roztwór może stać się mętny.
    2. Dodać 80 μl 500 mM D-penicylaminy w ddH2O do powyższego roztworu i natychmiast wirować.
      UWAGA: Roztwór może stać się ponownie klarowny.
  6. Zastąpić roztwór w naczyniu hodowlanym 1 ml roztworu prekursora złota przygotowanego w kroku 4.5 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Jeden mililitr prekursora złota wystarcza do reakcji z około 1 × 106 komórkami (zlewającymi się na szalce o średnicy 35 mm). Większe ilości prekursora są potrzebne, gdy AuNP stają się znacznie mniejsze.
  7. Odważyć 0,0038 g NaBH4 do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, dodać 1 ml lodowatego ddH2O i przemieszać, aby uzyskać świeże 100 mM NaBH4 tuż przed użyciem.
  8. Dodać 20-100 μl 100 mM NaBH4 do roztworu z kroku 4.6, natychmiast wstrząsnąć do dobrego wymieszania i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Przygotuj 100 mM NaBH4 świeżo do natychmiastowego użycia. Po dodaniu NaBH4 kolor roztworu będzie stopniowo zmieniał kolor na czerwony, a następnie pogłębiał się. Jeśli nie zaobserwuje się żadnej zmiany koloru, w dużej mierze oznacza to, że eksperyment się nie powiódł.
  9. Zastąp roztwór 2 ml buforu PBS-A, aby zatrzymać reakcję.
    UWAGA: Zatrzymanie reakcji w ciągu 30 minut ma kluczowe znaczenie, ponieważ przedłużająca się reakcja stopniowo rozkłada AuNPs.

5. Zamrażanie wysokociśnieniowe i fiksacja przez zamrożenie (Rysunek 1C-F)

UWAGA: Próbki to ponownie HPF i FSF, a procedura jest prawie taka sama, jak poprzednio opisana w sekcji 2 i sekcji 3, z kilkoma modyfikacjami.

  1. Przygotować 1% tetratlenku osmu i 0,1% octanu uranylu w acetonie (roztwór FSF 3, rozcieńczony z 4% tetratlenku osmu w acetonie i 10% octanu uranylu w metanolu).
    UWAGA: Tetroksynek osmu i octan uranylu są wysoce toksycznymi chemikaliami; Należy z nimi obchodzić się zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa i utylizować je jako niebezpieczne odpady chemiczne.
  2. Załaduj próbki (szafirowe zespoły nośnika dysku) do pojemnika z zamrożonym roztworem FSF 3 pod LN2 za pomocą pary wstępnie schłodzonej pęsety.
  3. Przenieść pojemnik do wstępnie schłodzonej komory AFS w celu przetwarzania FSF w temperaturze -90 °C i uruchomić program FSF w następujący sposób: przechowywać w temperaturze -90 °C przez 8-10 godzin; następnie ogrzać do -60 °C w ciągu 3 godzin; utrzymywać w temperaturze -60 °C przez 3 godziny; następnie ogrzać do -30 °C w ciągu 3 godzin; utrzymywać w temperaturze -30 °C przez 3 godziny; następnie rozgrzać do 4 °C w ciągu 2 godzin.
  4. Gdy temperatura osiągnie 4 °C, przenieść próbki do dygestorium i utrzymywać w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  5. Myć acetonem 3x przez 15 min za każdym razem.
  6. Przechowywać w acetonie w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny.

6. Infiltracja, zatapianie i polimeryzacja żywicy

  1. Przed użyciem przygotować mieszaninę żywicy epoksydowej zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Żywica epoksydowa użyta w obecnym eksperymencie jest toksyczna przed polimeryzacją; Należy obchodzić się z nim zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa. Niespolimeryzowaną żywicę należy zutylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne lub spolimeryzować przed utylizacją.
  2. Przenieś krążki szafirowe do kapsułek z płaskim dnem i infiltruj żywicą przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Trzymaj zaznaczone boki szafirowych krążków skierowanymi w dół.
  3. Próbkę polimeryzować w temperaturze 60 °C w piecu przez co najmniej 18 h.
    UWAGA: Protokół można tutaj wstrzymać po polimeryzacji. Spolimeryzowane bloki próbek można przechowywać w suchym pojemniku przez lata.

7. Ultracienkie przekroje

  1. Ostrożnie przytnij spolimeryzowane bloki próbki za pomocą brzytwy, aby odsłonić krążki szafiru.
  2. Zanurz końcówki bloków z szafirowymi krążkami w ciekłym azocie na kilka sekund i rozmroź w temperaturze pokojowej. Powtórz czynność zamrażania i rozmrażania kilka razy, aby odłączyć krążki od bloków.
    UWAGA: Unikaj długotrwałego zamrażania, ponieważ może to spowodować pęknięcie bloków próbki. Delikatnie odczep szafirowe krążki za pomocą ostrza, unikając nadmiernej siły, która może uszkodzić próbki.
  3. Przytnij powierzchnię bloku do kształtu trapezu w celu ultracienkiego przekroju (Rysunek 1G).
  4. Uzyskaj ultracienkie przekroje 70-100 nm za pomocą ultramikrotomu (Rysunek 1H).
  5. Wybierz sekcje na sześciokątnych siatkach miedzianych o siatkach 200.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu wstrzymać po przeprowadzeniu sekcji. Sekcje na pasach mogą być przechowywane w suchym pojemniku przez lata. W razie potrzeby skrawki na siatkach można zabarwić 2% acetonem uranylowym, aby uzyskać lepszy kontrast membrany. Należy unikać barwienia ołowiem, ponieważ zamaskuje to sygnały cząstek nanozłota.

8. Obrazowanie TEM (Rysunek 1I)

  1. Zbadaj ultracienkie przekroje na miedzianych siatkach za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Zazwyczaj zakres powiększenia od 11 kX do 30 kX jest odpowiedni do wizualizacji AuNP w komórkach i potrzebna jest odpowiednia wartość rozmycia, aby zapewnić widoczność AuNP 2-3 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Technika syntezy AuNP oparta na ANSM jest niezwykle użytecznym narzędziem do znakowania i wykrywania białek z etykietą MT za pomocą TEM26. Aby potwierdzić jej skuteczność w komórkach ssaków, wygenerowano trzy stabilne linie komórkowe Hela wykazujące ekspresję EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn lub Mito-acGFP-MTn. KDEL jest kanoniczną C-terminalną sekwencją retencji/odzyskiwania w siateczce śródplazmatycznej (ER), która utrzymuje białko fuzyjne EGFP-MTn-KDEL wewnątrz lumeny ER lub w przestrzeni perinukle...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W badaniu przedstawiono solidną technologię klonowalnego znakowania EM do wizualizacji pojedynczych cząsteczek białka w środowisku komórkowym z rozdzielczością ultrastrukturalną. AuNP bezpośrednio syntetyzowane na genetycznie kodowanych znacznikach bogatych w cysteinę zapewniają jednoznaczną i precyzyjną lokalizację docelowych białek. Technika zamrażania pod wysokim ciśnieniem i zamrażania przez substytucję doskonale zachowuje ultrastrukturę próbek biologicznych. Podsumowując, przedstawiona tutaj technologia znakowania k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor deklaruje brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Opisany tutaj protokół pochodzi z artykułu opublikowanego przez Jiang et al. (2020). Prace te były wspierane przez granty z MOST (973 programy nr 2011CB812502 i 2014CB849902) oraz przez wsparcie finansowe ze strony władz miejskich Pekinu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,025 mm/0,275 mm Aluminiowy nośnikBeijing Wulundes Biotech Ltd., lub Biuro Inżynieryjne M. Wohlwend
0,2 M buforRozpuść HEPES (0,2 M) w 980 ml ddH2O, a następnie dodaj 10 ml 100 mM MgCl2 i 10 ml 100 mM CaCl2 (stężenie końcowe 1 mM), odpowiednio dostosuj pH do 5,5
1,5 ml MaxyClear mikroprobówka zatrzaskowaAxygen Scientific MCT150C
2 ml mikroprobówki z polipropylenową nakrętkąBiologix81-0204
Sześciokątna siatka miedziana o oczkach 200Tedpella incG200HEX
2-merkaptoetanolAmresco0482-250ML
35 mm szalki do hodowli komórkowychCorning
Probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 50 mlCorning430928
AcetonBeiijng Tong Guang Fine Chemicals Company31025
Automatyczna maszyna do substytucji zamrażaniaLeicaAFS2
Dostosowane uchwyty na próbki 3,05 mm x 0,66 mm do HPFBeijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicylaminaTCIP0147
Dulbecco" s zmodyfikowany Eagle mediumGBICOC11965500BT
Płodowa surowica bydlęcaGBICO10099-141C
Kapsułka do zatapiania z płaskim dnemTedpella inc
Foam cryobox
Żywica Formvar 15/95Mikroskopia elektronowa Sciences15800
HAuCl4Sigma4022-1G
HEPESsigma Maszyna H3375-500G
HPFWohlwend HPF compact01
Methonal Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company12397
NaBH4Sigma480886-25G
OsO4Mikroskopia elektronowa Nauki19110
BuforRozpuszczanie NaH2PO4 (1,125 mM), Na2HPO4 (3,867 mM), NaCl (100 mM) w 1 l ddH2O, dostosować do pH 7,4
Jakościowa bibuła filtracyjna (średnia prędkość)Beyotime BiotechnologyFFT08
Dyski szafirowePekin Wulundes Biotech Ltd. lub Biuro Inżynieryjne M. Wohlwenda
Pióro odporne na rozpuszczalnikiMikroskopia elektronowa Nauki62053-B
Żywica SPI-Pon 812SPI Inc02659-AB
Elektron transmisyjny mikroskopiaFEITecnai G2 duch
Trypsyna-EDTAGBICOC25200-056
PęsetaDumont
UltramictotomeLeicaFC7
Octan uranyluMikroskopia elektronowa Nauki22400
HEPES 430165 PBS-A

Bibliografia

  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  2. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).
  3. Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
  4. Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
  5. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
  6. Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
  7. Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
  8. Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
  9. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041(2011).
  10. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
  11. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  12. Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
  13. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
  14. Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
  15. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
  16. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
  17. Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
  18. Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
  19. Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
  20. Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
  21. Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
  22. Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
  23. Ding, S. -W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087(2014).
  24. Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
  25. Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
  26. Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
  27. Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia elektronowazachowanie ultrastrukturyznaczniki bogate w cysteinmro enie pod wysokim ci nieniemsubstytucja mro eniakom rki ssak winterakcje organellidetekcja pojedynczych cz steczek
Bezpośrednia synteza widocznych dla EM-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.