Method Article

Nowatorska metoda wstrzykiwania komórek z minimalną inwazją

DOI:

10.3791/65260

⸱

April 21st, 2023

1Innovative Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Kansai Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda eliminuje wszelkie większe zakłócenia podczas iniekcji komórkowych spowodowane przez roztwór zawiesiny komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezpośrednie wstrzykiwanie komórek do tkanek jest niezbędnym procesem w podawaniu komórek i/lub terapii zastępczej. Wstrzyknięcie komórki wymaga wystarczającej ilości roztworu zawiesiny, aby komórki mogły dostać się do tkanki. Objętość roztworu zawiesiny wpływa na tkankę, co może spowodować poważne obrażenia inwazyjne w wyniku wstrzyknięcia komórki. W tym artykule opisano nowatorską metodę wstrzykiwania komórek, zwaną powolną iniekcją, która ma na celu uniknięcie tego urazu. Jednak wypchnięcie komórek z końcówki igły wymaga wystarczająco dużej prędkości wstrzykiwania zgodnie z prawem siły ścinającej Newtona. Aby rozwiązać powyższą sprzeczność, płyn nienewtonowski, taki jak roztwór żelatyny, został użyty jako roztwór zawiesiny komórkowej w tej pracy. Roztwór żelatyny jest wrażliwy na temperaturę, ponieważ ich postać zmienia się z żelu w zol w temperaturze około 20 °C. Dlatego, aby utrzymać roztwór zawiesiny komórkowej w postaci żelu, strzykawka była utrzymywana w chłodzie w tym protokole; Jednak po wstrzyknięciu roztworu do organizmu, temperatura ciała przekształciła go w zol. Przepływ płynu tkankowego śródmiąższowego może wchłonąć nadmiar roztworu. W tej pracy technika powolnego wstrzykiwania pozwoliła kulkom kardiomiocytów dostać się do mięśnia sercowego gospodarza i wszczepić się bez otaczającego zwłóknienia. W badaniu tym zastosowano metodę powolnego wstrzykiwania w celu wstrzyknięcia oczyszczonych i kulistych kardiomiocytów noworodków szczurów do odległego obszaru zawału mięśnia sercowego w sercu dorosłego szczura. Po 2 miesiącach od wstrzyknięcia serca grup przeszczepionych wykazały znaczną poprawę funkcji skurczowej. Co więcej, analizy histologiczne serc, którym podawano powolne wstrzykiwania, ujawniły bezproblemowe połączenia między kardiomiocytami gospodarza a przeszczepem za pośrednictwem interkalowanych dysków zawierających połączenia szczelinowe. Metoda ta może przyczynić się do opracowania terapii komórkowych nowej generacji, w szczególności w medycynie regeneracyjnej serca.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podawanie i zastępowanie komórek to obiecujące nowe strategie terapeutyczne dla ciężko uszkodzonych narządów. Wśród tych nowatorskich strategii terapeutycznych dużym zainteresowaniem cieszy się medycyna regeneracyjna serca. Jednak stan zapalny spowodowany urazami pośredniczy w tworzeniu blizn w kilku narządach1,2,3,4. Ludzkie serce składa się z około10-10 kardiomiocytów; Dlatego teoretycznie5,6, musi być leczony więcej niż 109 kardiomiocytami. Podawanie dużej liczby kardiomiocytów tradycyjnymi metodami iniekcji może prowadzić do poważnych uszkodzeń tkanek7. Ta metoda zapewnia nowatorską metodę wstrzykiwania komórek przy minimalnej inwazji tkanek.

Podanie komórek do miąższu narządu wymaga wstrzyknięcia. Istnieje jednak rozbieżność polegająca na tym, że samo wstrzyknięcie może prowadzić do uszkodzenia tkanek. Uszkodzenie tkanek powoduje miejscowy stan zapalny i nieuleczalne blizny w narządach i tkankach, a także upośledzenie zdolności regeneracyjnych8,9,10. Serce ssaków ma niezwykle wysoką skłonność do powstawania blizn zamiast regeneracji, ponieważ wymaga natychmiastowej naprawy urazów, aby wytrzymać wysokie ciśnienie krwi spowodowane jego ciągłą funkcją pompowania11. Terapia ablacyjna wykorzystuje tę wysoką skłonność do tworzenia blizn i blokuje obwód, w którym prawdopodobnie powstaną blizny, za pomocą arytmii12. W poprzednim badaniu zaobserwowano, że tkanka bliznowata izolowała wstrzyknięte kardiomiocyty w mięśniu sercowym gospodarza. Jest to zatem kolejny problem docelowy, który należy przezwyciężyć, aby uzyskać lepszą skuteczność terapeutyczną w medycynie regeneracyjnej serca.

Przepływ płynu śródmiąższowego w tkankach odgrywa istotną rolę w dostarczaniu tlenu i składników odżywczych do komórek oraz usuwaniu wydalanych odpadów z komórek. Fizjologiczna prędkość przepływu płynu śródmiąższowego w każdej tkance/narządzie jest inna (zakres wynosi 0,01-10 μm/s)13. Zgodnie z najlepszą wiedzą autora nie ma danych dotyczących zdolności poszczególnych tkanek/narządów do utrzymywania dodatkowych ilości płynu bez patologicznego obrzęku; Jednak w tym eksperymencie próbuje się użyć niskiej prędkości wstrzykiwania, aby ewentualnie zmniejszyć uszkodzenie tkanki, a wyniki można wykorzystać do określenia praktyczności tej koncepcji.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi Uniwersytetu Medycznego Kansai-Medical dla eksperymentów na zwierzętach i zostały zatwierdzone przez komisje etyczne (numer zatwierdzenia: 23-104). Wszystkie zwierzęta były hodowane w stałym cyklu światło-ciemność w specyficznym środowisku wolnym od patogenów. Wszystkie wysterylizowane narzędzia chirurgiczne, takie jak nożyczki, kleszcze i retraktory, zostały autoklawizowane i dokładnie wysuszone.

1. Przygotowanie kulek kardiomiocytów noworodków szczurów

  1. Kolekcja serca noworodka szczura
    1. W przypadku kolekcji serca postępuj zgodnie z procedurą podobną do opisanej w poprzednim raporcie7.
    2. Zanurz noworodki (0-2 dni po urodzeniu) szczurów Sprague-Dawley (SD) w sekwencyjnych roztworach jodu powidonu i 70% etanolu, a następnie przenieś je do hermetycznego etui wypełnionego odparowanym izofluranem (stężenie powinno wynosić ponad 10% v/v) w celu głębokiego znieczulenia.
    3. Po stwierdzeniu utraty przytomności przez utratę aktywności ruchowej należy odciąć głowę szczurowi, trzymając ciało od tyłu ręką, a następnie przeciąć 2-4 mm tkanki od czołowego środka klatki piersiowej do ogona, a następnie w kierunku rostralnym za pomocą ostrych nożyczek.
    4. Chwyć tylną skórę, aby rozciągnąć nacięcie i wypchnąć serce z klatki piersiowej. Przeciąć komory nożyczkami i zanurzyć je w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez wapnia lub magnezu (PBS(−)).
  2. Dyspersja kardiomiocytów nowonarodzonych szczurów
    1. Zebrane komory rozdrobnić rozproszone w minimalnej ilości buforu Ads (bufor Ads: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mM NaH2PO4, 5,6 mM glukozy, 5,4 mM KCl, 0,8 mMMgSO4, pH 7,35) w autoklawowanym wklęsłym szkle szklanym na małe kawałki (1 mm x 1 mm) za pomocą zakrzywionych nożyczek.
    2. Przenieść zmielone tkanki i mieszadło mikromagnetyczne do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i rozproszyć tkanki na pojedyncze komórki z 0,1% kolagenazą, 0,1% trypsyną, 20 μg/ml DNazy I i estrem metylowym tetrametylodaminy 50 nM w buforze Ads w temperaturze 37 °C, mieszając przez 30 minut.
    3. Oddzielić agregaty i rozproszone komórki przez naturalną sedymentację, zebrać tylko rozproszone komórki do probówki i ponownie strawić pozostałe agregaty komórkowe za pomocą tego samego podłoża trawiącego.
    4. Kontynuuj tę procedurę, aż wszystkie komórki zostaną całkowicie zdysocjowane. Aby potwierdzić całkowite rozproszenie komórek, obserwuj rurki pod mikroskopem (soczewka obiektywu 4x).
    5. Zebrać rozproszone komórki za pomocą wirowania przy 150 x g przez 5 minut i zdysocjować je w 1-2 ml buforu ADS.
  3. Aktywowane fluorescencją sortowanie komórek kardiomiocytów
    1. Analizuj komórki za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) przy użyciu filtrów pasmowoprzepustowych 556-601 nm w celu wykrycia sygnałów czerwonej fluorescencji.
    2. Ostrożnie wykonaj wstępne bramkowanie, aby wyeliminować frakcje dubletowe14. Ustawienia bramki do eliminacji dubletów powinny być zgodne z instrukcjami producenta.
    3. Ustaw rozproszenie do przodu na osi x i czerwony sygnał fluorescencji na osi y. Zaobserwowano trzy populacje: najniższą populację zawierającą erytrocyty i martwe komórki, środkową populację zawierającą niekardiomiocyty, w tym fibroblasty i komórki śródbłonka, oraz górną populację zawierającą czyste kardiomiocyty komorowe7.
  4. Przygotowanie kulek kardiomiocytów znakowanych czerwoną fluorescencją
    1. Selektywnie posortuj kardiomiocyty i odwiruj przez 5 minut przy 150 x g. Całkowicie rozpuść granulki komórkowe w 1 ml minimalnej pożywki egzogennej modyfikowanej alfa (alpha-MEM) zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    2. Zmierz stężenie komórek za pomocą hemocytometru i rozcieńcz roztwór zawiesiny komórek do 3,000 komórek/ml za pomocą alpha-MEM 10% FBS.
    3. Rozprowadzić je na 96-dołkowych płytkach bez przywierania komórek (100 μl na studzienkę), odwirować przez 5 minut przy 100 x g i hodować przez 2-3 dni w inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    4. Przed eksperymentami iniekcyjnymi należy pobrać kulkę kardiomiocytów z każdej studzienki poprzez aspirację za pomocą pożywki hodowlanej za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i zebrać je w probówce o pojemności 15 ml.
    5. Wybarwić PKH26 zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi śledzenia po wszczepieniu.

2. Przygotowania do metody powolnej iniekcji

  1. Przygotowanie roztworu podstawowego żelatyny
    1. Zważ żelatynę, rozpuść ją w buforze ADS, aby uzyskać 10% roztwór w/v i przelej ją w autoklawie.
  2. Produkcja urządzenia do wstrzykiwania komórek
    1. Ogólny projekt urządzenia: Przygotuj aparaturę pokazaną na Rysunek 1. System ten jest połączony z aparatem chłodzącym strzykawkę i głównym aparatem iniekcyjnym.
    2. Przygotować główny aparat iniekcyjny opisany poniżej:
      1. Do wstrzyknięcia kulki do kardiomiocytów noworodka należy użyć igły o długości 29 g i długości 50 mm wyposażonej w strzykawkę.
      2. Podłączyć strzykawkę do przenoszenia mocy (18 G, 1 ml) tyłem do siebie za pomocą strzykawki do wstrzykiwania komórek (Rysunek 1). Podłączyć igłę strzykawki do przenoszenia mocy do cienkiej rurki polipropylenowej o niskiej rozszerzalności prześwitu.
      3. Następnie podłącz drugą stronę rurki do przenoszenia mocy do igły tej samej strzykawki (18 G, 1 ml) i umieść ją w pompie strzykawkowej. Napełnij dwie strzykawki i rurki do przenoszenia mocy wodą bez pęcherzyków powietrza.
        UWAGA: Po wciśnięciu jednego tłoka strzykawki do przenoszenia mocy, ciśnienie jest bezpośrednio przenoszone na drugą strzykawkę, a tłok wystaje.
    3. Skonfigurować system chłodzenia strzykawki iniekcyjnej zgodnie z poniższym opisem.
      1. Nawiń miedzianą rurkę (średnica zewnętrzna = 1 mm; średnica wewnętrzna = 0,3 mm; grubość = 0,35 mm) ciasno wokół zawierającej komórkę części strzykawki do wstrzykiwania komórek, pozostawiając 10 mm nadmiaru rurki na obu końcach.
      2. Podłącz rurkę miedzianą do elastycznej rurki z tworzywa sztucznego. Następnie podłącz drugie końce plastikowej rurki do zewnętrznej pompy, napełnij przewód wodą chłodzącą i schłodzić wodę, zanurzając nadmiar miedzianej rurki w kruszonym lodzie (Rysunek 1).
        UWAGA: Ten układ chłodzenia utrzymuje roztwór zawiesiny ogniw w cylindrze w temperaturze około 2 °C.

3. Opracowanie modelu zawału mięśnia sercowego u szczura poprzez niejawne zamknięcie tętnicy wieńcowej

  1. Samce nagich szczurów z niedoborem odporności należy znieczulić powietrzem zawierającym 3% izofluranu. Włóż kaniulę do tchawicy i podłącz ją do respiratora.
  2. Podłącz kaniulę do parownika izofluranu za pomocą kontrolera, aby utrzymać 3% stężenie izofluranu, a tym samym utrzymać wystarczające znieczulenie. Potwierdź brak reakcji na bodźce bólowe. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
  3. Przymocuj kończyny za pomocą przeciętych taśm chirurgicznych na płytce chirurgicznej podgrzanej w temperaturze 40 °C. Przekręć ciało szczura w prawo od osi ciała i użyj lewej pachy jako pola operacyjnego.
  4. Usuń włosy w polu operacyjnym za pomocą kremu do depilacji i przetrzyj skórę jodowidonem. Za pomocą ostrych nożyczek wytnij 1,5 cm nacięcie w skórze i mięśniu piersiowym większym.
  5. Potwierdź trzecią przestrzeń międzyżebrową i rozerwij mięśnie międzyżebrowe i opłucną żebrową za pomocą mikrokleszczyków z końcówkami. Utrzymuj klatkę piersiową otwartą za pomocą retraktora. Delikatnie usuń cienkie osierdzie za pomocą kleszczy.
  6. Aby skonstruować model zawału bocznej ściany serca, znajdź pozycję 1 mm ogonową do końca lewego przedsionka, aby zidentyfikować rozwartą tętnicę wieńcową, przełóż jedwabny szew 7-0, zgarnij tkankę o szerokości 2,5 mm i głębokości 2,5 mm od grzbietu do brzusznej i mocno podwiąż tkankę.
  7. Potwierdź udane podwiązanie przez słaby skurcz dystalny od ligatury. Po delikatnym wyjęciu retraktora umieść jedwabny szew 5-0 między drugą a czwartą przestrzenią międzyżebrową i zamknij torakotomię.
  8. Zmniejszyć stężenie izofluranu do 1%. Delikatnie zszyj mięśnie i skórę jedwabiem 5-0. Zmniejszyć stężenie izofluranu do 0% i odczekać około 5 minut, aż rozpocznie się spontaniczne oddychanie.
  9. Stosować miejscowo 2 mg/ml lidokainy w soli fizjologicznej do nacięcia. Podawać 1 ml soli fizjologicznej we wstrzyknięciu podskórnym. Stosować miejscowo maść weterynaryjną, aby zapobiec infekcjom.
  10. Wyjmij szczura z rurki intubacyjnej i wróć do klatki dla zwierząt, a następnie hoduj szczury w oddzielnych klatkach przez 1 tydzień.
  11. Analizuj zmiany w funkcjonowaniu pompy skurczowej serca za pomocą echokardiografii.
    UWAGA: Czynność serca zostanie zmniejszona z powodu bocznego zawału mięśnia sercowego.

4. Przezskórne przeszczepienie komórek pod kontrolą echa metodą powolnej iniekcji

  1. Podgrzej 10% bulion żelatynowy w temperaturze 37 °C, aż stanie się płynny.
  2. Rozcieńczyć 10% bulionu żelatynowego z podgrzanym buforem ADS, aby uzyskać ostateczny 5% roztwór żelatyny do wstrzykiwań (wymagane jest 100 μl na zwierzę).
  3. Zawiesić 96 kulek kardiomiocytów (łącznie: 28 800 kardiomiocytów/zwierzę) w 100 μl wstępnie podgrzanego roztworu do wstrzykiwań.
  4. Zawiesinę przygotowaną w kroku 4.3 należy załadować do strzykawki do wstrzykiwania komórek, unikając zasysania nadmiaru powietrza.
  5. Aby usunąć pęcherzyki w strzykawce, należy trzymać ją pionowo z igłą skierowaną do góry, postukać w strzykawkę i zebrać pęcherzyki na górnym grzbiecie strzykawki.
    UWAGA: Podczas tego kroku obserwuj, jak kulki kardiomiocytów stopniowo osiadają na gumowej uszczelce tłoka.
  6. Utrzymać pionową pozycję strzykawki, powoli popychać tłok do góry i wyrzucić pęcherzyki oraz nadmiar roztworu zawiesiny komórkowej do momentu, gdy w strzykawce pozostanie 20 μl zawiesiny komórek. Ostrożnie naciskać tłok ze stałą prędkością, tak aby kulka kardiomiocytów pozostała spoczywająca na gumowej uszczelce tłoka.
  7. Zanurzyć strzykawkę z nakrętką bezpośrednio w łaźni lodowej na 5 minut.
  8. Umieścić schłodzoną strzykawkę w aparacie do wstrzykiwań. Mocno zamocuj strzykawkę do wstrzykiwań osadzoną na urządzeniu do precyzyjnych ruchów na etapie zwierzęcym za pomocą ręcznie wykonanego zacisku X-Y-Z z regulacją pozycji. Urządzenie do precyzyjnego ruchu może przesuwać pozycję igły za pomocą suwaka 20 mm w kierunku x, wychylania w kierunku y i ruchów kłaniania w kierunku z.
  9. Znieczulenie szczurów należy umieścić w szczelnie zamkniętym pudełku wypełnionym powietrzem zawierającym 3% izofluranu. Potwierdź znieczulenie brakiem reakcji na bodźce bólowe. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
  10. Przymocuj kończyny za pomocą przeciętych taśm chirurgicznych na podgrzanej płytce echa o temperaturze 40 °C. Aby utrzymać wystarczające znieczulenie, upewnij się, że wdychane powietrze zawiera około 3% stężenia izofluranu.
  11. Usuń włosy w polu iniekcji (2 cm średnicy) i na klatce piersiowej kremem do depilacji i przetrzyj skórę jodowidonem.
  12. Nałóż echo-żel na klatkę piersiową i sondę echo. Umieść echosondę blisko klatki piersiowej wzdłuż osi czaszki i ogona i zacznij wykonywać echokardiografię w trybie B zgodnie z instrukcją producenta.
  13. Wsuń końcówkę igły do wstrzykiwania do mięśnia sercowego w widoku z przodu (Rycina 2 i Dodatkowe wideo 1).
  14. Aby aktywować główną pompę strzykawkową, naciśnij przycisk Start i obróć pokrętło, aby ustawić się na wstępnie określoną liczbę dla prędkości wstrzykiwania około 0,02 μL/s. Nałożyć maść weterynaryjną miejscowo wokół miejsca igłowania, aby zapobiec infekcjom.
    UWAGA: Konieczne jest określenie odpowiedniego numeru wybierania dla zamierzonej szybkości wstrzykiwania za pomocą roztworu do wstrzykiwań. Po wykonaniu wstrzyknięcia należy wyjąć igłę iniekcji za pomocą przykładowego systemu ruchu.
  15. Zmniejszyć stężenie izofluranu do 0% i odczekać około 5 minut, aż zwierzę odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.

5. Ocena czynności serca

  1. Znieczulenie szczurów należy umieścić w szczelnie zamkniętym pudełku wypełnionym powietrzem zawierającym 3% izofluranu. Potwierdź znieczulenie brakiem reakcji na bodźce bólowe. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
  2. Nałóż krem elektryzujący do akwizycji EKG na końcówki kończyn. Przymocuj kończyny za pomocą przeciętych taśm chirurgicznych na podgrzanej płytce echa o temperaturze 40 °C. Użyj systemu monitorowania fizjologicznego, aby wykryć EKG i tętno w czasie rzeczywistym.
  3. Zgodnie z instrukcjami producenta, najpierw określ kąt długiej osi za pomocą obrazu echa w trybie B pokazującego wierzchołek lewej komory do drogi odpływu, a następnie obróć echosondę o 90°, aby przejść do widoku krótkiej osi.
  4. Używając tylko systemu precyzyjnych ruchów osi ogonowej do rostralnej stadium zwierzęcego, dostosuj widok krótkiej osi do poziomu mięśni brodawkowatych. Następnie zmień tryb obrazu na tryb M, naciskając przycisk M-mode i nagrywaj wideo przez 5 sekund, naciskając przycisk Cine-loop.
  5. Aby przeanalizować i obliczyć skrócenie frakcji za pomocą oprogramowania, naciśnij przycisk Zmierz i narzędzie do linii pionowej, aby zdefiniować końcowe skurczowe i końcoworozkurczowe wymiary wewnętrzne lewej komory. Oprogramowanie automatycznie oblicza procentowe skrócenie frakcji (FS).
  6. Zmniejszyć stężenie izofluranu do 0% i odczekać około 5 minut, aż zwierzę odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.

6. Immunohistochemia

  1. Umocuj ciało poddane eutanazji (wykonaj eutanazję jak w kroku 1.1.3) na stole za pomocą przeciętych taśm chirurgicznych, wytnij serca, umyj PBS i zanurz serce w 4% paraformaldehydzie/PBS.
  2. Rozbić serca na trzy części, zanurzyć je w 40% sacharozie w celu krioprotekcji, zatopić w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zamrozić w temperaturze -80 °C.
  3. Tkanki poddane kriosekcji (o grubości 8 μm) należy przymocować do szkiełek pokrytych aminozelanem. Po wystarczającym wysuszeniu przy użyciu nieogrzewanego wiatru generowanego przez ogólną suszarkę do włosów, zanurz szkiełka w soli fizjologicznej buforowanej trisem zawierającej 0,2% Tween-20 (TBS-T).
  4. Zanurzyć je w roztworze blokującym na 30 minut w temperaturze 25 °C. Wlać 100 μl pierwszorzędowego roztworu blokującego zawierającego przeciwciała na szkiełko i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z uszczelnieniem parafinowym, aby roztwór przeciwciała rozprowadził się na tkance.
    UWAGA: Stężenie przeciwciał jest pokazane w Tabeli Materiałów.
  5. Połóż szkiełka poziomo w ręcznie robionym pudełku o wysokiej wilgotności, wykorzystując naturalną parę z mokrego papieru, aby zapobiec parowaniu. Umyj szkiełka trzykrotnie za pomocą TBS-T.
  6. Stosować drugorzędowy środek blokujący zawierający przeciwciała przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C w taki sam sposób, jak przeciwciało pierwszorzędowe. Po trzech praniach obserwuj sygnały fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i konfokalnego mikroskopu laserowego.
    UWAGA: Stężenie przeciwciał jest pokazane w Tabeli Materiałów.
  7. Analiza statystyczna: W celu porównania objętości komórek, jak pokazano na rysunku Rysunek 3A, wykonaj niesparowany test t; aby ocenić regenerację czynnościową serca po podaniu kardiomiocytów metodą powolnego wstrzykiwania, jak pokazano na Rysunek 4A, użyj sparowanego testu t. W niniejszej pracy różnice uznano za statystycznie istotne przy P < 0,01. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wpływ powolnego wstrzykiwania na przeżywalność komórek i odkładanie kolagenu
Kulki kardiomiocytów nowonarodzonych szczurów oznaczone PKH26 wstrzyknięto do normalnego mięśnia sercowego nagiego szczura przy użyciu normalnej lub powolnej metody wstrzykiwania. Wyniki wykazały, że metoda powolnego wstrzykiwania znacznie zwiększyła objętość przeszczepionych komórek (Ryc. 3A) i znacznie zmniejszyła odkładanie się kolagenu typu I na miejscu (Rysunek 3B).

Wpływ powolnego wstrzykiwania na skuteczność leczenia w modelu zawału szczura
Metodę powolnego wstrzykiwania pod kontrolą echokardiografu zastosowano do wstrzykiwania kulek kardiomiocytów noworodków szczurów lub PBS (−) do serc szczurów modelowych z zawałem. Sama grupa, której wstrzyknięto komórki, wykazała znaczną poprawę funkcji skurczu serca po 2 miesiącach (Ryc. 4A). Analizy immunohistochemiczne wykazały bezproblemowe połączenie między przeszczepionymi komórkami a miocytami gospodarza za pośrednictwem interkalowanych dysków zawierających połączenia szczelinowe (Figura 4B).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat całego systemu wtryskowego. (A) Główny aparat wtryskowy. (B) Układ chłodzenia strzykawki iniekcyjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Powolna iniekcja przezskórna pod kontrolą echokardiografii. (A) Ustawienie zwierzęcia, sondy echa i aparatu do wstrzykiwań. (B) Widok echokardiograficzny strzykawki do wstrzykiwania i serca. Zwróć uwagę, że lewe i prawe zdjęcie są takie same, ale dodano żółtą linię, aby wskazać pozycję igły. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wpływ metody powolnej iniekcji na objętość przeszczepionej komórki i odkładanie kolagenu. (A) Objętość przeszczepionych komórek (N = 3) została obliczona na podstawie odcinków szeregowych. Słupki błędów wskazują odchylenia standardowe. *P < 0,01 w niesparowanym teście t. (B) Barwienie immunohistochemiczne kolagenu typu I. Podziałka wskazuje 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Poprawa funkcji serca i integracja histologiczna z kulkami kardiomiocytów wszczepionymi metodą powolnego wstrzykiwania. (A) Reprezentatywne widoki trybu M echokardiografu. Wykres przedstawia przejście skrócenia frakcji w grupie kardiomiocytów, którym przeszczepiono kulkę (ciągła czerwona linia; N = 4) i grupy nośnika (roztwór zawiesiny komórek do metody powolnego wstrzykiwania) (niebieska linia przerywana; N = 3). Skróty: MI = zawał mięśnia sercowego; Cx43 = złącze 43; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; PKH26 = czerwona fluorescencyjna etykieta błony komórkowej. Słupki błędów wskazują odchylenia standardowe. *P < 0,01 w sparowanym teście t. (B) Analizy immunohistochemiczne związku między wszczepionymi kulkami kardiomiocytów a kardiomiocytami gospodarza. Konwencjonalne laserowe obserwacje mikroskopowe przy użyciu soczewki obiektywowej 2x są pokazane w lewej kolumnie. Poniżej przedstawiono wersje z powiększeniem (przy użyciu soczewki obiektywowej 20x) dwóch obszarów pokazanych w ramce, oznaczonych * i #. Paski skali: górny obraz = 300 μm; * oraz # = 30 μm. Konfokalne laserowe obrazy mikroskopowe przy użyciu soczewki obiektywowej 20x są pokazane wraz z komaparisonem. Pokazane są trzy pozycje. Na połączonych obrazach groty strzałek wskazują na istnienie połączeń szczelinowych (Cx43) bezpośrednio łączących kardiomiocyty przeszczepu i gospodarza. Podziałka wskazuje 30 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo 1: Metoda powolnego wstrzykiwania sterowana echem. Echokardiogram w trybie B w widoku czołowym pokazuje, że końcówka igły iniekcyjnej jest wsunięta do mięśnia sercowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z krytycznych punktów w pomyślnym wykonaniu metody powolnej iniekcji jest przygotowanie skutecznego systemu iniekcyjnego za pomocą wydajnej pompy strzykawkowej i silnej rurki przenoszącej ciśnienie. Do wypchnięcia żelu z końcówki cienkiej igły wymagany jest system wysokociśnieniowy. Drugim krytycznym punktem jest stabilizacja pracy serca. Bicie serca przez igłę do wstrzykiwań wstrzykniętych do mięśnia sercowego może uszkodzić tkankę. W tym badaniu przeprowadzono wstrzyknięcie pod kontrolą echa, aby uniknąć drugiego otwartego urazu klatki piersiowej u zwierząt i podać wstrzyknięcie komórki w ustabilizowane serce z napompowanymi płucami. Ponadto w niektórych zastosowaniach dla większych zwierząt lub ludzi niektóre urządzenia do wstrzykiwań umieszczane na sercu powinny być traktowane jako część strategicznego projektu aplikacji. W przypadku wstrzyknięć do serca małych zwierząt na otwartej klatce piersiowej zaleca się użycie długiej, elastycznej igły ze względu na ich wyższe tętno.

W tej pracy metoda powolnej iniekcji znacznie zwiększyła objętość kardiomiocytów, które przeżyły, w porównaniu z normalną metodą iniekcji. Normalne wstrzyknięcie powoduje uszkodzenie komórki poprzez naprężenie ścinające15. W przeciwieństwie do tego, metoda powolnej iniekcji teoretycznie nie powoduje takiego stresu, ponieważ oprócz powolnego wstrzykiwania wykorzystuje rozwiązanie nienewtonowskie.

Jeśli chodzi o miejscowe zwłóknienie, przestrzeń śródmiąższowa wokół normalnie wstrzykiwanych kardiomiocytów, które przeżyły, wykazywała silne i rozległe odkładanie się kolagenu typu I. Natomiast sygnały kolagenu typu I wokół wszczepionych kardiomiocytów przeszczepionych metodą powolnej iniekcji były znacznie słabsze i bardziej ograniczone. Sugeruje to, że metoda powolnej iniekcji spowodowała znacznie mniej szkód. Powolne wstrzykiwanie kardiomiocytów noworodków do mięśnia sercowego dorosłego znacznie poprawiło funkcję skurczową serca po zawale. Analizy histologiczne sugerowały, że przeszczepienie kardiomiocytów metodą powolnej iniekcji skutkowało bezpośrednimi połączeniami i funkcjonalnym sprzężeniem z kardiomiocytami gospodarza. Zjawisko to wyjaśnia mechanizm funkcjonalnego odzyskiwania mięśnia sercowego gospodarza. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwsze doniesienie o wszczepionych kardiomiocytach noworodków z bezszwowymi połączeniami na dużą skalę z dorosłymi kardiomiocytami gospodarza. Funkcjonalne połączenia z mięśniem sercowym gospodarza poprzez sprzężenie elektryczne i mechaniczne mogą sprawić, że wszczepione kardiomiocyty dojrzeją i pozwolą im działać jako funkcjonalne miocyty, które przyczyniają się do funkcji serca gospodarza. Długotrwałe interakcje siły fizycznej między gospodarzem a kardiomiocytami przeszczepu mają kluczowe znaczenie dla pełnej dojrzałości. Dlatego może być wymagane 2 miesiące po wstrzyknięciu w celu funkcjonalnego powrotu do zdrowia serca po zawale. Zależne od czasu przywrócenie funkcji serca pacjenta może być oczekiwanym zjawiskiem w zastosowaniach terapeutycznych, co może być cechą charakterystyczną udanego ustanowienia funkcjonalnego sprzężenia de novo i integracji między gospodarzem a przeszczepionymi kardiomiocytami.

Metoda powolnego wstrzykiwania może być wykonywana podczas operacji otwartej klatki piersiowej. Ponadto tę metodę można zastosować u myszy. W przypadku przyszłych zastosowań w terapii u ludzi musimy jeszcze rozwiązać kilka problemów. Szybkość wstrzykiwania powinna być zoptymalizowana, biorąc pod uwagę pojemność buforową przepływu płynu śródmiąższowego w każdym narządzie docelowym u człowieka. Należy stosować materiały wolne od kseno, takie jak żelatyna ludzka lub biodegradowalne materiały syntetyczne. Należy opracować kliniczne aparaty do powolnego wstrzykiwania klasy GMP, takie jak kompaktowe narzędzia jednorazowego użytku specyficzne dla narządów lub aparaty wielokrotnego użytku do stosowania w szerokim narządzie.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant od JSPS KAKENHI (Grant nr 23390072 i 19K07335) oraz AMED (Grant nr A-149).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Igła 18 G i tuberkulina, 1 mlTerumo NN1838R, SS-01T
igła o długości 50 mm w rozmiarze 29 mmIto Corporation, Tokio, Japonia14903 Typ-A 
Rura miedzianaGeneral Suppliersśrednica zewnętrzna, 1 mm; średnica wewnętrzna, 0,3 mm; grubość, 0,35 mm
Bufor reklamowyKażdy składnik został zakupiony od Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, JaponiaRęcznie robione, Skład: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mM NaH2PO4, 5,6 mM glukozy, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, pH 7,35
alpha-MEMFuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japonia051-07615
Przeciwciało poliklonalne królika antykolagenowego typu I (H + L)Proteintech14695-1-APprzy użyciu rozcieńczenia 1:100
Przeciwciało poliklonalne królika anty-Connexin-43 (H+L)Sigma AldrichC6219przy użyciu rozcieńczenia 1:100
Przeciwciało poliklonalne anty-królicze IgG (H+L) donley-AlexaFluo488 Thermo ScientificA21206w rozcieńczeniu 1:300
(Blocking One)Nacalai Tesque, Kioto, Japonia03953-95 
kolagenazaFuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japonia034-22363
konfokalny mikroskop laserowyCarl Zeiss Inc., Oberkochen, NiemcyLSM510 META
DNase ISigma-AldrichDN25
FACS Aria IIIBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA
płodowa surowica bydlęcaBioWest, FL, USAS1820-500
urządzenie do precyzyjnego ruchu (mikromanipulator)Narishige Co., Ltd., Tokio, JaponiaM-44
  Nikon Instruments, Tokio, JaponiaŻelatyna Eclipse Ti2
ze skóry bydlęcejSigma-AldrichG9382rozpuszcza się w PBS (-) do 10% i autoklawuje ją
Noworodki Sprague-Dawley (SD) szczuryJaponia SLC Inc., Shizuoka, Japonia0– 2 d po urodzeniu
nieprzywiejne płytki 96-dołkowe (płytka sferoidalna)Sumitomo Bakelite, Tokio, JaponiaMS-0096S
Optymalna temperatura cięcia (OCT) Związek Sakura Finetek USA, Inc., CA, USATissue-Tek OCT (
do układu chłodzenia)As One Co., Osaka, JaponiaSMP-23AS
PKH26Sigma-AldrichPKH26GL
Mieszadło Bar, Mikro, Magnetyczne, PTFE, Długość x Średnica w mm: 5 x 2Chemglass life sciences LLC, NJ, USACG-2003-120
 Ito Corporation, Tokio, JaponiaMS-N25
z pilotemzdalnego sterowania As One Co., Osaka, JaponiaMR-1, CT-10
ester metylowy tetrametylorodaminyThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAT668
trypsynaDIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA215240
Tween-20Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japonia167-11515
maść weterynaryjna  Fujita Pharmaceutical Co., Sp. z o.o.Maść Hibikusu  #WAK-95832
System obrazowania Vevo 2100Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, KanadaVevo 2100
Vevo 2100 Oprogramowanie systemu obrazowania w wersji 1.0.0Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, KanadaVevo 2100
Słabo zakrzywiona igła z gwintem okulistycznymNatsume Seisakusho Co., Ltd., Tokio, JaponiaC7-70
przy użyciu roztworu blokującego Mikroskop fluorescencyjny Pompa perystaltyczna Strzykawka Pompa strzykawkowa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chavkin, N. W., et al. The cell surface receptors Ror1/2 control cardiac myofibroblast differentiation. Journal of the American Heart Association. 10 (13), e019904(2021).
  2. Li, H., et al. The cell membrane repair protein MG53 modulates transcription factor NF-κB signaling to control kidney fibrosis. Kidney International. 101 (1), 119-130 (2022).
  3. Liu, X., Liu, Y., Khodeiry, M. M., Lee, R. K. The role of monocytes in optic nerve injury. Neural Regeneration Research. 18 (8), 1666-1671 (2023).
  4. Weber, F., Treeck, O., Mester, P., Buechler, C. Expression and function of BMP and activin membrane-bound inhibitor (BAMBI) in chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 3473(2023).
  5. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  6. Hattori, F., Fukuda, K. Strategies for replacing myocytes with induced pluripotent stem in clinical protocols. Transplantation Reviews. 26 (3), 223-232 (2012).
  7. Hattori, F., et al. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7 (1), 61-66 (2010).
  8. Fernandes, S., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes engraft but do not alter cardiac remodeling after chronic infarction in rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (6), 941-949 (2010).
  9. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
  10. Wendel, J. S., et al. Functional effects of a tissue-engineered cardiac patch from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in a rat infarct model. Stem Cells Translational Medicine. 4 (11), 1324-1332 (2015).
  11. Hattori, F. Technology Platforms for Heart Regenerative Therapy Using Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Cancer Stem Cells, Volume 7: Therapeutic Applications in Disease and Injury. , 33-45 (2012).
  12. Tao, S., et al. Ablation lesion characterization in scarred substrate assessed using cardiac magnetic resonance. JACC: Clinical Electrophysiology. 5 (1), 91-100 (2019).
  13. Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends in Cell Biology. 17 (1), 44-50 (2007).
  14. Hattori, F. How to purify cardiomyocytes for research and therapeutic purposes. Cardiac Regeneration using Stem Cells. Fukuda, K., Yuasa, S. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
  15. Li, M., Tian, X., Zhu, N., Schreyer, D. J., Chen, X. Modeling process-induced cell damage in the biodispensing process. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (3), 533-542 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell InjectionSlow InjectionRegenerative MedicineCardiac RegenerationMyocardial InfarctionCardiomyocyte TransplantationNon Newtonian FluidGelatin SolutionPluripotent Stem CellsHost Graft Interaction

Related Articles