Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model zakażenia Candida albicans stawu okołoprotezowego u myszy

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65263

⸱

2 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

W tym artykule

Podsumowanie

Infekcja stawu okołoprotezowego (PJI) spowodowana przez niebezpieczne patogeny jest powszechna w ortopedii klinicznej. Istniejące modele zwierzęce nie są w stanie dokładnie symulować rzeczywistej sytuacji PJI. W tym miejscu stworzyliśmy mysi model PJI związany z biofilmem Candida albicans, aby badać i opracowywać nowe terapie PJI.

Streszczenie

Infekcja stawu okołoprotezowego (PJI) jest jedną z najczęstszych infekcji wywoływanych przez Candida albicans (C. albicans), która coraz częściej niepokoi chirurgów i naukowców. Ogólnie rzecz biorąc, w miejscu infekcji tworzą się biofilmy, które mogą chronić C. albicans przed antybiotykami i klirensem immunologicznym. Chirurgia polegająca na usunięciu zakażonego implantu, oczyszczeniu, leczeniu przeciwbakteryjnym i reimplantacji jest złotym standardem w leczeniu PJI. W związku z tym ustalenie zwierzęcych modeli PJI ma ogromne znaczenie dla badań i rozwoju nowych leków lub terapii dla PJI. W tym badaniu gładki drut ze stopu niklu i tytanu, szeroko stosowany implant w klinikach ortopedycznych, został wprowadzony do stawu udowego myszy C57BL/6 przed zaszczepieniem C. albicans w jamie stawowej wzdłuż drutu. Po 14 dniach pod skaningowym mikroskopem elektronicznym (SEM) zaobserwowano dojrzałe i grube biofilmy na powierzchni implantów. Znacznie zmniejszoną bełeczkę kostną stwierdzono w barwieniu H&E zakażonych próbek stawów. Podsumowując, stworzono mysi model PJI z zaletami łatwej obsługi, wysokiego wskaźnika sukcesu, wysokiej powtarzalności i wysokiej korelacji klinicznej. Oczekuje się, że będzie to ważny model dla badań klinicznych nad zapobieganiem PJI związanym z biofilmem C. albicans.

Wprowadzenie

Candida albicans (C. albicans) komensywnie rezydują w wielu częściach ludzkiego ciała1, który jest również najczęstszym oportunistycznym patogenem, powodującym zagrażające życiu inwazyjne infekcje grzybicze, szczególnie u pacjentów z obniżoną odpornością2,3. C. albicans może przekształcać się między stanami drożdży i grzybni jako grzyb polimorficzny. Stan grzybni wykazuje większą zjadliwość, silniejszą adhezję oraz inwazję komórek i tkanek4,5. Poza tym C. albicans może tworzyć biofilmy na powierzchniach materiałów biomedycznych, takich jak protezy, cewniki i stenty1,6,7. Gęsta, trójwymiarowa struktura biofilmów ogranicza infiltrację leków przeciwgrzybiczych, wyraża geny oporności na leki i obniża metabolizm komórek grzybów, aby oprzeć się klirensowi układu odpornościowego6,7. Dlatego infekcje związane z biofilmami są dość trudne w klinikach8.

Staphylococcus aureus, gronkowiec koagulazo-ujemny i enterobacter to główne patogeny powodujące PJI9. Chociaż częstość występowania grzybiczego PJI jest stosunkowo niska (około 1%)10, koszt leczenia grzyba PJI jest wyższy11, cykl leczenia jest dłuższy11, a wskaźnik sukcesu leczenia jest niższy10 niż bakteryjny PJI. W ostatnich latach częstość występowania grzybiczego PJI wzrasta z roku na rok10. Candida PJI stanowi 77%-84% grzybów PJI10,12, a C. albicans występuje najczęściej w Candida (54%). Dlatego należy zbadać grzybicze PJI.

Obecnie, PJI jest leczone za pomocą operacji rewizyjnej poprzez (1) usunięcie zainfekowanego implantu, (2) oczyszczenie organizmu, (3) leczenie przeciwbakteryjne i (4) reimplantację. Po dokładnym oczyszczeniu umieszcza się antybiotyk zawierający cement kostny, a pacjent jest leczony antybiotykami ogólnoustrojowo przez ponad 6 tygodni, aby skutecznie kontrolować infekcję przed wszczepieniem nowego implantu13. Jednak ta metoda nie może w pełni wyeliminować patogenów w tkankach, a nawracające infekcje leczone długotrwałą terapią przeciwbakteryjną z dużym prawdopodobieństwem rozwiną się w szczepach opornych na leki14,15,16.

Tworzenie zwierzęcych modeli PJI jest ważne dla badań i rozwoju nowych leków lub terapii dla PJI. W rozwoju PJI wokół protezy tworzą się duże martwe przestrzenie, co prowadzi do powstawania krwiaków, które dodatkowo blokują dopływ krwi do otaczających tkanek i osłabiają działanie antybiotyków11,15. Ze względu na trudności w naśladowaniu otaczającego środowiska protezy, tradycyjne modele zwierzęce nie mogą dokładnie symulować rzeczywistej sytuacji PJI17,18.

W tym artykule, model PJI związany z biofilmem C. albicans u myszy został skonstruowany przy użyciu powszechnie stosowanego drutu tytanowo-niklowego do symulacji implantów stawów19,20. Ten model PJI wykazuje zalety łatwej obsługi, wysokiej skuteczności działania, wysokiej powtarzalności i wysokiej korelacji klinicznej. Oczekuje się, że będzie to ważny model do badania profilaktyki i leczenia PJI związanego z biofilmem C. albicans.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zwierzęta zostały zakupione na Uniwersytecie Xi'an Jiaotong. Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Xi'an Jiaotong (numer zgody: SCXK [Shaanxi] 2021-103). Myszy trzymano przez tydzień po 5 myszy w klatce. Mieli oni swobodny dostęp do jedzenia i wody. Zwierzęta utrzymywano w temperaturze pokojowej (RT; 24 °C ± 1 °C) i cyklu jasne/ciemnym (12 godzin/12 godzin) przed przeprowadzeniem badania.

1. Przygotowanie bufora i sprzętu

  1. Hodowla komórkowa C. albicans
    1. Zaszczepić monoklonalną kolonię C. albicans (SC5314) z pożywki płytkowej z dekstrozą peptonową z ekstraktem drożdżowym (YPD) z pętlą zaszczepiającą do 5 ml płynnej pożywki YPD (YPD + 50 μg/ml karbenicyliny).
    2. Następnie przez noc wstrząsnąć komórkami C. albicans z prędkością 220 obr./min w temperaturze 30 °C.
    3. Odwirować zawiesinę przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki C. albicans w normalnej soli fizjologicznej i rozcieńczyć stężenie komórek do 1 x 106 komórek/ml poprzez wizualne dostosowanie zmętnienia do tego samego, jak w przypadku 0,5 McFarlanda.
  2. Przygotowanie soli fizjologicznej
    1. Odważyć 0,9 g chlorku sodu i rozpuścić w 100 ml wody dejonizowanej, aby przygotować 0,9% soli fizjologicznej.
  3. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych
    1. Autoklaw (121 °C, 30 min) narzędzi chirurgicznych (nożyczki, kleszcze, kleszcze hemostatyczne, uchwyty do igieł, igły do szycia) i drut ze stopu tytanu i niklu (o średnicy około 0,5 mm) przed użyciem.

2. Ustanowienie modelu PJI myszy

  1. Losowo podziel 30 myszy C57BL/6 (samce, 15-20 g) na 3 grupy (10 myszy / grupę), a mianowicie grupę kontrolną, grupę z pustym implantem (implantacja drutem tytanowo-niklowym bez infekcji C. albicans) i grupę PJI (implantacja drutem tytanowo-niklowym z infekcją C. albicans).
  2. Znieczulenie myszy za pomocą 1-4% inhalacji izofluranu przed usunięciem włosów z lewej tylnej kończyny i zdezynfekowaniem ich jodem. Utrata odruchu prostowania i brak reakcji na stymulację palca u nogi potwierdza głębokość znieczulenia. Podczas znieczulania nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i uzupełnić ciepło podczas operacji i rekonwalescencji.
  3. W przypadku myszy z grupy kontrolnej nie należy stosować żadnego leczenia. Zapewnij im swobodny dostęp do wody i jedzenia.
  4. W przypadku myszy w grupie z ślepym implantem i grupie PJI wykonaj 5 mm podłużne nacięcie na kolanie każdej lewej kończyny tylnej za pomocą ostrza #10 lub sterylnej brzytwy, aby odsłonić stawy.
  5. Wykonać otwór o długości 5 mm w kanale śródszpikowym kości udowej, wprowadzając sterylną igłę strzykawki (26 G).
  6. Włóż gładki drut ze stopu niklu i tytanu (o średnicy 0,5 mm, długości 5 mm) do otworu przed przecięciem nożyczkami (Rysunek 1).
  7. W przypadku myszy w grupie z ślepym implantem dodawać 2 μl pożywki YPD wzdłuż drutu ze stopu niklu i tytanu kropla po kropli, a następnie zamykać ranę warstwa po warstwie za pomocą nylonowego szwu (średnica 0,15 mm).
  8. W przypadku myszy z grupy PJI zaszczepij 2 μl komórek C. albicans (1 × 106 komórek/ml) w przestrzeni stawowej myszy wzdłuż drutu ze stopu niklu i tytanu kropla po kropli, a następnie zamknij ranę warstwa po warstwie za pomocą nylonowego szwu.
  9. Trzymaj myszy w domu z bezpłatnym dostępem do wody i pożywienia przez 14 dni. Meloksykam należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym (4 mg/kg) co 24 godziny przez okres do 3 dni.
  10. Po 14 dniach znieczulij myszy 3% izofluranem przed eutanazją myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.

3. Ocena modelu PJI

  1. Ocena zakażeń w głównych narządach
    1. Zbierz nerki, wątrobę i śledzionę od myszy po eutanazji.
    2. Dodać 500 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej do każdego narządu i zmielić tkanki na homogenizatorze w temperaturze 4 °C.
    3. Dodać 100 μl homogenatu przygotowanego w kroku 3.1.2 do płytki YPD, a następnie równomiernie rozprowadzić ją za pomocą wygiętego pręta.
    4. Umieścić odwrócone płytki YPD w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 48 godzin.
    5. Obserwuj i policz wizualnie liczbę kolonii.
  2. Obserwacja C. albicans i biofilmów na implantach
    1. Ostrożnie przeciąć skórę nad stawem myszy nożyczkami przed pobraniem implantu za pomocą pęsety.
    2. Implanty należy przechowywać zanurzone w 2,5% roztworze aldehydu glutarowego w celu utrwalenia w temperaturze 4 °C przez 48 godzin.
    3. Przepłucz implanty sterylnym PBS trzy razy przed zanurzeniem ich w 1% roztworze kwasu osmowego na 3 godziny.
    4. Przepłucz implanty sterylnym PBS trzy razy przed zanurzeniem ich w roztworach 50%, 70%, 80%, 90% i 100% etanolu na 15 minut w celu odwodnienia.
    5. Trzymaj implanty zanurzone w tert-butanolu przez 30 minut trzy razy przed liofilizacją implantów.
    6. Przymocować próbki implantu do stolika na próbkę, napylić implant złotem (powłoka 10 nm) i obserwować pod elektronicznym mikroskopem skaningowym (SEM) w wysokiej próżni i pod napięciem 1,5 kV.
  3. Analiza patologiczna tkanek kości udowej
    1. Zbierz tkanki udowe nożyczkami po eutanazji myszy.
    2. Zanurzyć tkanki kości udowej w 4% roztworze paraformaldehydu w celu utrwalenia w temperaturze 4 °C przez 48 godzin.
    3. Umieść tkanki kości udowej w 10% formalinie na 1 tydzień.
    4. Odwodnić tkanki kości udowej, zanurzając je odpowiednio w 50%, 70%, 80%, 90% i 100% roztworach etanolu na 15 minut.
    5. Zanurz odwodnione tkanki kości udowej w parafinie przed pocięciem tkanek na próbki o wielkości 4 μm za pomocą mikrotomu.
    6. Wybarwić skrawki kości udowej hematoksyliną i eozyną, postępując zgodnie ze standardowym protokołem przed analizą patologiczną21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przenoszenie próbek na podłoże płytkowe i liczenie kolonii po inkubacji przez noc jest powszechnie stosowane do oceny lokalnego obciążenia patogenami w pobliżu zmiany chorobowej22,23. W naszym badaniu hodowla mikrobiologiczna próbek wątroby, nerek i śledziony była ujemna, co wskazuje, że zastosowany w tej pracy model doprowadził jedynie do zakażenia lokalnego, a nie systemowego u myszy23.

Obrazy SEM implantów pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zakażenie spowodowane zanieczyszczeniem narzędzi chirurgicznych lub środowiska chirurgicznego podczas operacji jest główną przyczyną większości infekcji implantów 24,25,26,27. Dlatego w tym badaniu skonstruowano mysi model PJI związany z biofilmem C. albicans. W porównaniu z tradycyjnym modelem PJI, w którym jako implant użyto sterylnych cząstek stali nierdzewnej zawieszonych w soli fi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie finansowe od Fundacji Nauk Przyrodniczych prowincji Shaanxi (numer grantu 2021SF-118) oraz Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (numery grantów 81973409, 82204631).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0.5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
4 & stopni; C lodówkaElectrolux (China) Electric Co., LtdESE6539TA
AgarBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
Wagi analityczneShimadzuATX124
Autoklawy SterylizatorSANYOMLS-3750
CarbenicillinAmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon pionowy mikroskop optyczny NikonEclipse Ts2-FL
Glukoza Macklin 
Pierścień do zaszczepianiaThermo Scientific251586
IsofluraneRWD20210103
NaClXi'an Jingxi Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd20180108
ParaformaldehydBeyotime BiotechnologyP0099
PeptonBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-001
Wielokanałowy aparat do znieczulania małych zwierząt RWD R550 RWDR550
SEMHitachiTM-1000
Inkubator temperaturyShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
Generator wody ultraczystejHeal ForceNW20VF
UltrasonografDo-ChromDS10260D
Ekstrakt drożdżowyThermo Scientific  OxoidLP0021B
D823520

Bibliografia

  1. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  2. Fan, F., et al. Candida albicans biofilms: antifungal resistance, immune evasion, and emerging therapeutic strategies. International Journal of Antimicrobial Agents. 60 (5-6), 106673(2022).
  3. Tong, Y., Tang, J. Candida albicans infection and intestinal immunity. Microbiological Research. 198, 27-35 (2017).
  4. Kanaguchi, N., et al. Effects of salivary protein flow and indigenous microorganisms on initial colonization of Candida albicans in an in vivo model. Bmc Oral Health. 12, 36(2012).
  5. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  6. Douglas, L. J. Candida biofilms and their role in infection. Trends in Microbiology. 11 (1), 30-36 (2003).
  7. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69, 71-92 (2015).
  8. Mack, D., et al. Biofilm formation in medical device-related infection. The International Journal of Artificial Organs. 29 (4), 343-359 (2006).
  9. Miller, R., et al. Periprosthetic joint infection: A review of antibiotic treatment. JBJS Reviews. 8 (7), e1900224(2020).
  10. Brown, T. S., et al. Periprosthetic joint infection with fungal pathogens. The Journal of Arthroplasty. 33 (8), 2605-2612 (2018).
  11. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 255-267 (2004).
  12. Schoof, B., et al. Fungal periprosthetic joint infection of the hip: a systematic review. Orthopedic Reviews (Pavia). 7 (1), 5748(2015).
  13. Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. Periprosthetic joint infection: current concepts and outlook. EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).
  14. Tande, A. J., Patel, R. Prosthetic joint infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (2), 302-345 (2014).
  15. Stocks, G., Janssen, H. F. Infection in patients after implantation of an orthopedic device. ASAIO Journal. 46 (6), S41-S46 (2000).
  16. Shahi, A., Tan, T. L., Chen, A. F., Maltenfort, M. G., Parvizi, J. In-hospital mortality in patients with periprosthetic joint infection. The Journal of Arthroplasty. 32 (3), 948-952 (2017).
  17. Carli, A. V., Ross, F. P., Bhimani, S. J., Nodzo, S. R., Bostrom, M. P. Developing a clinically representative model of periprosthetic joint infection. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 98 (19), 1666-1676 (2016).
  18. Stavrakis, A. I., Niska, J. A., Loftin, A. H., Billi, F., Bernthal, N. M. Understanding infection: A primer on animal models of periprosthetic joint infection. The Scientific World Journal. 2013, 925906(2013).
  19. Qiao, B., Lv, T. Electrochemical investigation of interaction of candida albicans with titanium-nickel implant in human saliva. International Journal of Electrochemical Science. 17 (2), 22028(2022).
  20. Oh, Y. R., Ku, H. M., Kim, D., Shin, S. J., Jung, I. Y. Efficacy of a Nickel-titanium ultrasonic instrument for biofilm removal in a simulated complex root canal. Materials. 13 (21), 4914(2020).
  21. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue Processing and Hematoxylin and Eosin Staining. Histopathology: Methods and Protocols. Christina E, D. ay , Springer, New York. 31-43 (2014).
  22. Sinclair, K. D., et al. Model development for determining the efficacy of a combination coating for the prevention of perioperative device related infections: A pilot study. Journal of Biomedical Materials Research - Part B Applied Biomaterials. 101 (7), 1143-1153 (2013).
  23. Mo, F., et al. In vitro and in vivo effects of the combination of myricetin and miconazole nitrate incorporated to thermosensitive hydrogels, on C. albicans biofilms. Phytomedicine. 71, 153223(2020).
  24. Zahar, A., Sarungi, M. Diagnosis and management of the infected total knee replacement: a practical surgical guide. Journal of Experimental Orthopaedics. 8 (1), 14(2021).
  25. Parvizi, J., Jacovides, C., Zmistowski, B., Jung, K. A. Definition of periprosthetic joint infection: Is there a consensus. Clinical Orthopaedics and Related Research. 469 (11), 3022-3030 (2011).
  26. Karczewski, D., et al. Candida periprosthetic joint infections - risk factors and outcome between albicans and non-albicans strains. International Orthopaedics. 46 (3), 449-456 (2022).
  27. Cobo, F., Rodriguez-Granger, J., Sampedro, A., Aliaga-Martinez, L., Navarro-Mari, J. M. Candida prosthetic joint infection. A review of treatment methods. Journal of Bone and Joint Infection. 2 (2), 114-121 (2017).
  28. Cobrado, L., Silva-Dias, A., Azevedo, M. M., Pina-Vaz, C., Rodrigues, A. G. In vivo antibiofilm effect of cerium, chitosan and hamamelitannin against usual agents of catheter-related bloodstream infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 68 (1), 126-130 (2013).
  29. Vila, T., et al. Therapeutic implications of C. albicans-S. aureus mixed biofilm in a murine subcutaneous catheter model of polymicrobial infection. Virulence. 12 (1), 835-851 (2021).
  30. Nishitani, K., et al. Quantifying the natural history of biofilm formation in vivo during the establishment of chronic implant-associated Staphylococcus aureus osteomyelitis in mice to identify critical pathogen and host factors. Journal of Orthopaedic Research. 33 (9), 1311-1319 (2015).
  31. Ormsby, R. T., et al. Evidence for osteocyte-media ted bone-matrix degradation associated with periprosthetic joint infection (PJI). European Cells & Materials. 42, 264-280 (2021).
  32. Garlito-Díaz, H., et al. A new antifungal-loaded sol-gel can prevent candida albicans prosthetic joint infection. Antibiotics (Basel). 10 (6), 711(2021).
  33. Harro, J. M., et al. Development of a novel and rapid antibody-based diagnostic for chronic staphylococcus aureus infections based on biofilm antigens. Journal of Clinical Microbiology. 58 (5), e01414-e01419 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Zakażenie okołoprotetycznemysi model PJItworzenie biofilmuimplant niklowo-tytanowymodel zakażenia zwierzęcegozakażenie implantu stawowegoleczenie przeciwdrobnoustrojoweskaningowa mikroskopia elektronowautrata beleczek kostnych
Model zakażenia Candida albicans stawu okołoprotezowego u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.