Method Article

Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA

DOI:

10.3791/65264

⸱

August 4th, 2023

 ,  , 
1Department of Internal Medicine, University of California, Davis, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje procedurę edycji genomu w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy przy użyciu kompleksów rybonukleoprotein Cas9-sgRNA składanych in vitro i dostarczanych przez elektroporację.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofagi pochodzące od myszy pochodzące ze szpiku kostnego są kluczowym narzędziem do badania złożonej biologii makrofagów tkankowych. Jako komórki pierwotne modelują fizjologię makrofagów in vivo dokładniej niż unieśmiertelnione linie komórkowe makrofagów i mogą pochodzić od myszy już noszących określone zmiany genetyczne. Jednak zakłócenie funkcji genów w BMDM pozostaje wyzwaniem technicznym. W tym miejscu udostępniamy protokół do wydajnej edycji genomu CRISPR/Cas9 w BMDM, który pozwala na wprowadzenie małych insercji i delecji (indeli), które skutkują mutacjami przesunięcia ramki odczytu, które zakłócają funkcję genu. Protokół opisuje, w jaki sposób syntetyzować RNA z pojedynczym przewodnikiem (sgRNA-Cas9) i tworzyć oczyszczone kompleksy rybonukleoproteinowe sgRNA-Cas9 (RNP), które mogą być dostarczane przez elektroporację. Zapewnia również wydajną metodę monitorowania wydajności edycji przy użyciu rutynowego sekwencjonowania Sangera i bezpłatnego programu do analizy online. Protokół można wykonać w ciągu 1 tygodnia i nie wymaga budowy plazmidu; Zwykle skutkuje to wydajnością edycji od 85% do 95%.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofagi to wrodzone komórki odpornościowe, które odgrywają kluczową rolę w naprawie tkanek i odporności1,2. Unieśmiertelnione linie komórkowe makrofagów, takie jak mysie komórki RAW 264.7 lub ludzkie komórki THP-1, mają kilka korzystnych cech, w tym silny wzrost i łatwość rozrywania genów poprzez dostarczanie wektorów do interferencji RNA lub CRISPR/Cas93,4. Jednak transformacja onkogenna dramatycznie zmienia ich fizjologię, co skutkuje nieprawidłową aktywacją niektórych szlaków i wyciszonymi reakcjami innych5,6. Pierwotne makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) bardziej przypominają fizjologię makrofagów in vivo, ale pozostają trudne do genetycznego manipulowania ze względu na niską skuteczność zarówno transfekcji plazmidu, jak i transdukcji wirusa w tych pierwotnych komórkach odpornościowych7,8. W związku z tym potrzebne są bardziej efektywne metody zakłócania funkcji genów.

Edycja genomu CRISPR/Cas9 to potężne narzędzie do manipulacji genetycznej w wielu systemach biologicznych, w tym w komórkach ssaków9,10,11,12. Białko Streptococcus pyogenes Cas9 skutecznie i specyficznie rozszczepia dwuniciowe DNA, gdy jest skompleksowane ze specyficznym dla sekwencji przewodnikiem RNA. Naprawa DNA poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) rozszczepionego DNA powoduje małe insercje lub delecje (indele), które powodują mutacje przesunięcia ramki odczytu. We wczesnych badaniach Cas9 i sgRNA były dostarczane za pośrednictwem wektorów plazmidowych lub lentiwirusowych, które są skutecznymi metodami dostarczania dla wielu linii komórkowych9,10. Jednak komórki pierwotne, a w szczególności pierwotne komórki odpornościowe, są często oporne na te metody ze względu na niską skuteczność dostarczania wektora przez transfekcję lub transdukcję. Następnie opracowano metody generowania kompleksów sgRNA-Cas9 in vitro i dostarczania ich za pomocą elektroporacji, a metody te osiągnęły wysoką wydajność w różnych typach komórek13,14. Wyniki sugerują możliwość wykorzystania tego podejścia do przeprowadzenia edycji genomu w pierwotnych makrofagach.

Tutaj udostępniamy protokół do wykorzystania kompleksów rybonukleoproteinowych sgRNA-Cas9 (RNP) do przeprowadzenia edycji genomu w pierwotnych BMDM. Zawiera kroki mające na celu złagodzenie aktywacji czujników immunologicznych obecnych w pierwotnych komórkach odpornościowych i powoduje do 95% edycji w docelowych loci przy minimalnej toksyczności. Protokół ten obejmuje również przepływy pracy do oceny wydajności edycji przy użyciu rutynowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i sekwencjonowania Sangera, a następnie analizy in silico za pomocą Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, dobrze zweryfikowanego narzędzia programowego online.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. projekt sgRNA

UWAGA: Ten krok opisuje wybór sekwencji docelowych i konstrukcję sgRNA. Pomocne jest zaprojektowanie przewodników, które znajdują się w pierwszym dużym eksonie kodującym, tak aby każde przetłumaczone białko zostało zakłócone na wczesnym etapie otwartej ramki odczytu. Pomocne jest również wybranie sekwencji docelowych, które leżą w obrębie tego samego eksonu, ponieważ usprawni to analizę wydajności edycji (krok 6). W przykładach edycji genomu dostarczonych za pomocą tego protokołu wykorzystano sgRNA ukierunkowane na pierwszy ekson genu Src i gen Cblb, a także w niekodującym locus Rosa26 genomu myszy.

  1. Zidentyfikuj 20 sekwencji genomowych nukleotydów, które mają być docelowe, korzystając z jednego z kilku bezpłatnych narzędzi do projektowania online (Tabela 1). Wybierz od czterech do pięciu przewodników, które nie nakładają się na siebie w obrębie każdego genu, ponieważ aktywność Cas9 różni się w zależności od wybranego konkretnego przewodnika, a przewidywanie a priori wysoce aktywnego przewodnika nie jest możliwe.
    UWAGA: Bardzo ważne jest zapewnienie właściwej orientacji przewodnika względem sekwencji docelowego locus. Narzędzia projektowe zazwyczaj zapewniają sekwencję prowadzącą w orientacji od 5 do 3 stóp, niezależnie od tego, która nić chromosomowa jest docelowa. Aby zweryfikować orientację nici, należy sprawdzić, czy istnieje sekwencja motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) dla S. pyogenes Cas9 (nGG) bezpośrednio 3' docelowej sekwencji genomowej. Sekwencja sgRNA nie zawiera PAM.

2. synteza sgRNA

UWAGA: Ten krok opisuje, jak syntetyzować sgRNA za pomocą PCR w celu wygenerowania matrycy do transkrypcji in vitro (IVT), a następnie oczyszczać sgRNA za pomocą kolumn spinowych (Rysunek 1A). Niestandardowe syntetyczne sgRNA są dostępne na rynku u kilku dostawców jako alternatywa dla PCR/IVT.

  1. Wykonaj PCR, aby wygenerować matrycę IVT dla polimerazy RNA T7. W reakcji PCR wykorzystuje się uniwersalne startery, które zawierają promotor polimerazy T7 RNA i transaktywującą sekwencję CRISPR RNA (tracrRNA) (Tabela 2), a także krótkie pojedyncze startery z sekwencją prowadzącą specyficzną dla genu.
    1. Jest to krok rozszerzenia nakładania się bez wzmacniania. Rozcieńczyć bufor PCR do 1x i dodać dodatkowy 1 mM MgCl2. Następnie dodaj 0,25 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności, 0,5 mM trifosforanu deoksynukleotydu (dNTP), 0,02 mM startera specyficznego dla przewodnika i 0,02 mM odwróconego długiego uniwersalnego startera T7 (Tabela 2) do całkowitej objętości 46 μL. Następnie umieść probówkę w termocyklerze i uruchom dwa cykle: 95 °C przez 15 s, 37 °C przez 15 s i 72 °C przez 15 s. Ostudzić reakcje na lodzie.
    2. To jest etap amplifikacji PCR. Do każdej reakcji dodaj 2 μl 25 mM startera do amplifikacji do przodu i 2 μL 25 mM startera do amplifikacji wstecznej. Końcowa objętość reakcji wynosi 50 μl. Denaturacja przez 30 s w temperaturze 95 °C. Następnie uruchom 35 cykli: 95 °C przez 15 s, 65 °C przez 20 s i 72 °C przez 15 s. Wykonać dodatkowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 2 min.
    3. Sprawdź produkt reakcji PCR na 2% żelu agarozowym. PCR z nakładaniem się na siebie daje cząsteczkę dsDNA o długości 127 pz z promotorem T7 przed specyficznym dla genu przewodnikiem 20 nukleotydów i tracrRNA bezpośrednio za nim (Figura 1B).
  2. Oczyszczanie szablonu IVT: Istnieje wiele protokołów i zestawów, które dobrze się do tego nadają. W protokole tym wykorzystuje się kulki odwracalnego unieruchomienia w fazie stałej (SPRI). Wymieszaj 50 μl produktu PCR z 90 μl kulek i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować DNA, dodając 40 μl buforu (5 mM Tris, 0,1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego [EDTA]) i ogrzewać w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
  3. Zmierzyć stężenie DNA w matrycy IVT za pomocą absorpcji na długości fali 260 nm. Do IVT potrzebne jest stężenie DNA wynoszące co najmniej 50 ng/μl. Szablon IVT można przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Reakcja na IVT
    1. Używaj komercyjnego zestawu przeznaczonego do uzyskiwania wysokich plonów IVT (patrz Tabela materiałów). Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta, aby przeprowadzić reakcję IVT. Używając 250 ng matrycy IVT w reakcji 20 μl, inkubować w temperaturze 37 °C przez 4-16 godzin.
    2. Sprawdź produkt sgRNA IVT, przeprowadzając 1 μl reakcji na 2% żelu agarozowym. Należy zaobserwować jasne pasmo RNA, biegnące podobnie do 70 pz dsDNA (Rysunek 1C). Chociaż nie jest to obowiązkowe, aby uzyskać ostre i bardziej rozdzielcze pasma, należy użyć buforu próbki RNA z mocznikiem i denaturować próbkę w temperaturze 65 °C przez 5 minut przed załadowaniem.
      UWAGA: W przypadku niektórych przewodnikowych RNA można zaobserwować słabe pasma o większej masie cząsteczkowej i niewielkie różnice w migracji ze względu na różnice w drugorzędowej strukturze RNA.
  5. Defosforylacja produktu sgRNA IVT, aby zminimalizować aktywację RIG-I (obcego czujnika RNA) i późniejszą śmierć komórki po elektroporacji. Na każde 20 μl reakcji IVT dodać 69 μl wody molekularnej i 15 U fosfatazy jelitowej cielęcia () w 1x bufor. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  6. Zdegraduj matrycę IVT, aby zminimalizować aktywację komórkowych czujników DNA, które wywołują śmierć komórki po elektroporacji. Do każdej reakcji IVT dodać 2 U DNazy wolnej od RNaz. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Produkt IVT może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez 1 dzień lub -80 °C przez kilka miesięcy.
  7. Oczyść produkt IVT za pomocą kolumn wirujących. Na tym etapie zestawy do oczyszczania kulek SPRI są gorsze.
    1. Zwiąż RNA z kolumną, dodając 220 μl buforu wiążącego do produktu IVT, a następnie 1 ml 100% etanolu klasy biologii molekularnej. Dobrze wymieszaj i załaduj kolumnę. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj końcowe płukanie w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia sgRNA.
    2. Przeprowadź elucję w okapie z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia. Eluować RNA za pomocą 30 μl sterylnego 10 mM buforu Tris (pH 8,0).
  8. Zmierzyć stężenie sgRNA, mierząc absorbancję przy długości fali 260 nm.
    UWAGA: Typowa wydajność sgRNA wynosi co najmniej 100 μg.
  9. Przechowywać sgRNA w temperaturze -80 °C. Przygotować porcje, aby uniknąć więcej niż trzech cykli zamrażania i rozmrażania.

3. Przygotowanie do elektroporacji

UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia. W protokole tym wykorzystuje się dostępny na rynku system elektroporacji (patrz tabela materiałów) z końcówkami o pojemności 10 μl.

  1. Rozmrozić BMDM 48-72 h przed użyciem i rozwinąć je na płytkach niepoddanych hodowli tkankowej (TC).
    UWAGA: Na reakcję potrzebne są 4 x 105 komórek.
  2. Wysterylizuj probówki PCR do montażu reakcji. Przygotować jedną probówkę do PCR na reakcję i podgrzewać je w termocyklerze przez 10 minut w temperaturze 98 °C. Przygotować probówki partiami i przechowywać je zamknięte. Umieść wysterylizowane probówki PCR na lodzie, gdy są gotowe do użycia.
  3. Wyczyść stację pipetową 70% etanolem i umieść ją w okapie z przepływem laminarnym. Ustaw parametry na 1,900 V, 20 ms i jeden impuls.
  4. Ostrożnie wyjmij probówkę do transfekcji z opakowania, aby zachować jej sterylność i napełnij ją 3 ml buforu "E". Upewnij się, że bufor E ma temperaturę pokojową przed elektroporacją. Włóż rurkę do stacji i popchnij ją w dół, aż usłyszysz kliknięcie.
  5. Dla każdej reakcji podwielokrotność 2,5 μl sgRNA w stężeniu 1,100 ng/μL. Rozcieńczyć sgRNA w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) 0,9 mM CaCl2 i 0,5 mM MgCl2 (PBS + Ca/Mg). Zostaw to na lodzie.
  6. Przygotować dwie płytki: 12-dołkową niepowlekaną płytkę na komórki i dodatkową 24-dołkową płytkę do przechowywania pożywki hodowlanej. Podaniec 1,5 ml pożywki wolnej od antybiotyków na reakcję do dołków płytki 24-dołkowej.
  7. Przygotuj białko Cas9. Istnieje kilku komercyjnych i akademickich dostawców sterylnie oczyszczonego białka Cas9. Rozcieńczyć Cas9 do końcowego stężenia 20 μM zimnym PBS + Ca/Mg. Dla każdej reakcji elektroporacji podamy 1 μL z 20 μM Cas9 do sterylnych probówek do PCR. Pozostaw na lodzie.
  8. Przygotuj ogniwa do elektroporacji.
    1. Usuń podłoże wzrostowe. Umyj komórki za pomocą PBS bez CaCl2 i MgCl2 (PBS-Ca/Mg) w celu usunięcia surowicy i kationów dwuwartościowych, które sprzyjają adhezji. Następnie dodaj PBS + 1 mM EDTA i inkubuj w temperaturze pokojowej przez około 5 minut, aż komórki zaczną się odłączać.
    2. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby odłączyć komórki. Przenieś komórki do probówki o niskim poziomie wiązania białek 15 ml. Granulować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 min.
      UWAGA: Makrofagi przylegają do wyrobów z tworzyw sztucznych. Zastosowanie probówek wirówkowych o niskim stopniu wiązania białek znacznie poprawia wydajność komórek.
    3. Pracuj szybko, aby uniknąć długotrwałej inkubacji komórek w PBS + EDTA. Usunąć większość supernatantu, pozostawiając około 1 ml supernatantu w probówce. Ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatancie, a następnie przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml do mikronatchnienia, o niskiej zdolności wiązania białek.
    4. Usuń małą porcję komórek do policzenia. Pozostałe komórki osadzać przez odwirowanie w temperaturze 500 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    5. Podczas wirowania policz komórki i ogrzej probówki Cas9 i sgRNA do temperatury pokojowej.
    6. Usunąć cały sklarat sklarowany z osadu komórkowego. Zawiesić komórki w PBS + Ca/Mg w stężeniu 4 x 107 komórek/ml (4 x 105 komórek na 10 μl reakcji).
      UWAGA: Każdy zestaw jest dostarczany z ograniczoną ilością bufora elektroporacyjnego (Bufor R, Bufor T). Okazuje się jednak, że wydajność elektroporacji przy użyciu PBS + Ca/Mg jest równoważna z zastrzeżonymi.
    7. Podczas elektroporacji sgRNA dla różnych genów, należy podzielić komórki na różne rurki o niskim poziomie wiązania białka dla każdego genu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między sgRNA. Utrzymuj ogniwa w temperaturze pokojowej, aż będą gotowe do elektroporacji.

4. Montaż RNP

  1. Utrzymuj sgRNA i Cas9 w temperaturze pokojowej, aby uniknąć wytrącania się. Dodaj 2,5 μl sgRNA do 1 μl rozcieńczonego Cas9 w wysterylizowanych probówkach PCR. Dozuj sgRNA powoli przez 15 s z mieszaniem, aby zapobiec wytrącaniu się.
  2. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksu RNP.

5. Dostarczanie RNP przez elektroporację

  1. Przygotuj końcówkę (kuwetę) do elektroporacji. Wciśnij tłok, aby wysunąć trzpień. Włóż trzpień do końcówki.
    UWAGA: Upewnij się, że końcówka jest zabezpieczona, a tłok przesuwa się płynnie i wysuwa poza osłonę końcówki. Jeśli końcówka nie jest prawidłowo umieszczona, pęcherzyki powietrza mogą zostać wprowadzone do końcówki, powodując awarię końcówki.
  2. Zawieś ogniwa, pipetując w górę iw dół, a następnie załaduj końcówkę elektroporacyjną ogniwami. Wycofaj pełną objętość końcówki wynoszącą 10 μl, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.
  3. Zaczynając od sgRNA kontroli ujemnej, przenieś 10 μl komórek w końcówce do elektroporacji do probówki zawierającej 3,5 μl RNP z kroku 4. Pipetuj trzy razy w górę i w dół, aby dobrze wymieszać. Narysuj 10 μl mieszaniny z powrotem do końcówki, upewniając się, że nie ma pęcherzyków.
  4. Umieść końcówkę w stacji elektroporacji, opuszczając ją do bufora. Unikaj kontaktu plastikowych powierzchni z końcówką, aby zachować sterylność. Naciśnij Start na ekranie dotykowym.
  5. Po zakończeniu wyświetlacz wskaże udany impuls. Wyjmij pipetę z urządzenia i umieść komórki w suchym dołku na oznakowanej, niepowlekanej płytce 12-dołkowej.
  6. Przepłukać końcówkę, pipetując dwukrotnie w górę i w dół w 15 ml PBS + Ca/Mg. Odłóż pipetę na bok z nadal założoną końcówką. Upewnij się, że końcówka niczego nie dotyka i pozostaje sterylna.
    UWAGA: W wielu eksperymentach możliwe jest ponowne użycie końcówki do wielu próbek, na przykład po nieaktywnej próbce sgRNA kontroli ujemnej lub podczas wstępnych ocen aktywności przewodnika, gdy testuje się od czterech do pięciu sgRNA na gen, a jedynym odczytem jest wydajność edycji. Jednak podczas analizy funkcjonalnej na edytowanych komórkach zaleca się nową końcówkę dla każdego genu, ponieważ niewielkie ilości sgRNA lub przeniesienie komórki mogą mieć wpływ na wyniki eksperymentalne.
  7. Natychmiast dodać 1 ml pożywki wolnej od antybiotyków (podanej w kroku 3.6) do komórek i delikatnie wstrząsnąć płytką, aby wymieszać.
  8. Powtórzyć kroki 5.2-5.6 dla pozostałych reakcji.
  9. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze.
  10. Sprawdź żywotność ogniw 1-2 godziny po elektroporacji. Komórki powinny przylegać w >90%. Opcjonalnie: Dodaj gentamycynę (5 μg/ml) do komórek 1-2 godziny po elektroporacji, aby zapobiec zanieczyszczeniu, jeśli nie zakłóci to dalszych eksperymentów.

6. Ocena efektywności edycji

UWAGA: Większość edycji jest zakończona po 48 godzinach.

  1. Sprawdź monowarstwę ogniwa 48 godzin po elektroporacji. Jeśli komórki zlewają się w ponad 50%, przejdź dalej. Jeśli komórki są w <50% zlewne, odczekaj dodatkowe 1-2 dni. Analiza genomowego DNA w celu określenia wydajności edycji wymaga 1 x 105 komórek, oprócz komórek potrzebnych do dalszego eksperymentu.
  2. Przygotuj genomowe DNA (gDNA).
    1. Umyj komórki PBS (-Ca/Mg). Dodać 1 ml PBS + 1 mM EDTA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez około 5 minut, aż komórki zaczną odłączać się od płytki.
    2. Odłączyć komórki przez pipetowanie. Przenieść do probówki do mikrofuge o niskiej ilości wiązania białek.
    3. Policz komórki i usuń podwielokrotność 1 x 105 komórek. Pozostałe ogniwa można ponownie posiać w celu wykorzystania w dalszych eksperymentach. Ogólnie rzecz biorąc, eksperymenty przeprowadza się 5 dni po elektroporacji, aby umożliwić rozpad białka.
    4. Osadzaj komórki do analizy gDNA przez 15 s z maksymalną prędkością w probówce do mikrofuge.
    5. Zawiesić osad w 50 μl buforu do lizy. Wirować, aby odłączyć wszelkie komórki przyklejone do ścianek probówki, i podgrzewać w temperaturze 98 °C przez 10 minut, aby zlizować komórki i dezaktywować endogenną DNazę.
    6. Umieść probówki na lodzie.
    7. Dodać 1 μl proteinazy K (20 mg/ml). Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C; Dla wygody można go zostawić na noc.
    8. Podgrzewać do 98 °C przez 10 minut, aby dezaktywować proteinazę K.
    9. Wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut z maksymalną prędkością. Usunąć supernatant, który zawiera DNA. Ten surowy preparat bez dalszego oczyszczania sprawdza się dobrze w większości reakcji PCR.
  3. Oceń wydajność edycji za pomocą sekwencjonowania Sangera.
    1. Zaprojektuj startery PCR 200-300 pz przed najbardziej 5' miejscami przewodników i 200-300 pz za najbardziej 3' miejscami przewodnikowymi. Typowy rozmiar amplikonu to ~500 pz. Zaprojektuj zagnieżdżony starter sekwencjonowania w odległości co najmniej 125 pz od najbliższego miejsca prowadzenia (Rysunek 2A).
    2. Wykonaj PCR przy użyciu 2 μl gDNA.
  4. Przygotować produkt PCR do sekwencjonowania. W protokole tym stosuje się leczenie egzonukleazą I/fosfatazą alkaliczną krewetek (ExoI/SAP). Komercyjne zestawy do oczyszczania DNA również działają, ale wymagają więcej czasu praktycznego.
    1. Przygotować 15 μl produktu PCR. Dodaj 7,5 μl wody, 1 μl 10x buforu ExoI, 10 U ExoI i 1 U SAP, aby zdegradować dNTP i startery, które zakłócają sekwencjonowanie Sangera.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie w temperaturze 85 °C przez 20 minut w celu dezaktywacji enzymów.
  5. Przeprowadzić sekwencjonowanie Sangera na produkcie PCR poddanym działaniu Exo/SAP; użyć znanej ilości markera wielkości DNA, aby oszacować wielkość produktu PCR obecnego w próbce. Reakcje sekwencjonowania mogą wymagać optymalizacji, ponieważ oprogramowanie TIDE wymaga wysokiej jakości chromatogramów sekwencyjnych, aby dokładnie oszacować wydajność edycji. Chromatogram sekwencyjny dla nieedytowanego locus powinien zapewniać wyraźne piki z minimalnym tłem (Rysunek 2B, C).
  6. Aby oszacować wydajność edycji, użyj TIDE do analizy plików chromatogramu sekwencjonowania Sangera przy użyciu edytowanego gDNA i nieedytowanego gDNA kontrolnego. (Tabela 1, Rysunek 2). Prześlij pliki sekwencjonowania Sanger i uruchom oprogramowanie z ustawieniami domyślnymi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szablon IVT to produkt PCR o sile 127 pz (Rysunek 1B). Pełnowymiarowy produkt IVT to 98 nt RNA, który migruje podobnie do dwuniciowego fragmentu DNA o długości 70 pz (Figura 1C).

Po elektroporacji, ogniwa powinny być >90% żywotne, z całkowitą liczbą komórek wynoszącą >70% początkowej liczby komórek. Powstała w ten sposób pula zmutowanych komórek powinna mieć zróżnicowany zestaw indeli, zaczynający się w pobliżu miejsca rozszczepieni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Edycja genomu za pomocą elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA pozwala na skuteczne zakłócenie funkcji genów w BMDM. Wydajność edycji różni się w zależności od sekwencji docelowej i genu. Zazwyczaj od czterech do pięciu sgRNA jest zwykle poddawanych badaniom przesiewowym w celu zidentyfikowania jednego, który jest wysoce aktywny. Niektóre loci mają niższą wydajność edycji, najprawdopodobniej ze względu na strukturę chromatyny. W takich przypadkach można wprowadzić kilka modyfikacji, aby zwiększyć wydajność edycji. Jedno...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantu NIH 5R01AI144149. Schematyczne rysunki zostały stworzone za pomocą BioRender.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Linia komórkowa 3T3-MCSFPrezent od Russella Vance'anie dotyczy
Alt-R Cas9 Wzmacniacz elektroporacjiIDT1075915
Kulki odczynnikowe Ampure XPBeckman CoulterA63880
Fosfataza alkaliczna jelitowa cielęciaNEBM0525S
DNazaNEBM0303S
DPBS + Ca/Mg (0,9 mM CaCl2 i 0,5 mM MgCl2)Thermo Fisher14040-133
DPBS -Ca/MgThermo Fisher14190-144
ExoINEBM0293S
Surowica cielęca płodu (FCS)Corning35-015-CV
Polimeraza DNA i bufor HerculaseAgilent600677
HiScribe T7 Zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajnościNEBE2040S
Probówki stożkowe LoBind 15 mlEppendorf30122216
LoBind Probówki Eppendorf 2 mlEppendorf22431102
NEBuffer r2.1 NEBB6002S
System transfekcji neonowejThermo FisherMPK5000, MPP100, MPS100
System transfekcji neonowej 10 uL KońcówkiThermo FisherMPK1025 lub MPK1096
PBS + 1mM EDTALonzaBE02017F
Proteinaza KThermo FisherEO0491
rCutSmart Bufor do ExoINEBB6004S
RibolockThermo FisherEO0384
Barwnik ładujący RNANEBB0363S
RNeasy Mini KitQiagen74104
S. pyogenes Cas9-NLSUniwersytet Kalifornijski Macro Labnie dotyczyDostępne dla badaczy spoza UC przez  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, zmodyfikowanyIDT1081059
SAPNEBM0371S
3. generacji

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
  2. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  3. Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
  4. Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
  5. Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225(2017).
  6. Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957(2019).
  7. Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
  8. Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
  9. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  10. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  11. Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
  12. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471(2013).
  13. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  14. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766(2014).
  15. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).
  16. Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , Master's thesis (2022).
  17. Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143(2019).
  18. Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gene DisruptionBone Marrow MacrophagesCRISPR Cas9ElectroporationRibonucleoprotein ComplexSanger SequencingGenome EditingPrimary MacrophagessgRNA SynthesisPCR Analysis

Related Articles