Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65265

⸱

19 maja 2023

 ,  ,  , 
1Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 2Department of Diabetes and Metabolic Diseases, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3The University of Tokyo Excellent Young Researcher Program, The University of Tokyo

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Streszczenie

Badanie in vitro różnicowania białych, brązowych i beżowych adipocytów umożliwia badanie autonomicznych funkcji adipocytów i ich mechanizmów. Unieśmiertelnione białe linie komórkowe preadipocytów są publicznie dostępne i szeroko stosowane. Jednak pojawienie się beżowych adipocytów w białej tkance tłuszczowej w odpowiedzi na sygnały zewnętrzne jest trudne do pełnego podsumowania przy użyciu publicznie dostępnych linii komórkowych białych adipocytów. Izolacja zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej jest powszechnie wykonywana w celu uzyskania pierwotnych preadipocytów i przeprowadzenia różnicowania adipocytów. Jednak ręczne mielenie i trawienie kolagenazy tkanki tłuszczowej może powodować zmienność eksperymentalną i jest podatne na zanieczyszczenie. W tym miejscu przedstawiamy zmodyfikowany półautomatyczny protokół, który wykorzystuje dysocjator tkankowy do trawienia kolagenazy w celu uzyskania łatwiejszej izolacji SVF, w celu zmniejszenia zmienności eksperymentalnej, zmniejszenia zanieczyszczenia i zwiększenia odtwarzalności. Uzyskane preadipocyty i adipocyty zróżnicowane mogą być wykorzystane do analiz funkcjonalnych i mechanistycznych.

Wprowadzenie

Biologia tkanki tłuszczowej przyciąga coraz większą uwagę ze względu na rosnące rozpowszechnienie otyłości i cukrzycy typu 2 na całym świecie1. Adipocyty magazynują nadmiar energii w postaci kropelek lipidów, które są uwalniane po wygłodzeniu. Co więcej, tkanka tłuszczowa utrzymuje homeostazę energetyczną układu, służąc jako narząd endokrynny i komunikując się z innymi tkankami2,3. Co ciekawe, zarówno nadmiar tkanki tłuszczowej (otyłość), jak i utrata tkanki tłuszczowej (lipodystrofia) są związane z insulinoopornością i cukrzycą1. Adipocyty dzielą się na trzy typy: białe, brązowe i beżowe1. Białe adipocyty magazynują głównie nadmiar energii w postaci lipidów, podczas gdy brązowe i beżowe adipocyty rozpraszają energię w postaci ciepła za pośrednictwem mitochondrialnego białka rozprzęgającego białko-1 (Ucp1)1,4. Warto zauważyć, że beżowe adipocyty (zwane również "indukowalnymi" brązowymi adipocytami) pojawiają się w białej tkance tłuszczowej w odpowiedzi na zimną lub współczulną stymulację i wykazują wzorce ekspresji genów, które pokrywają się, ale różnią się od tych z "klasycznych" brązowych adipocytów5. Ostatnio przewidywano, że brązowe i beżowe adipocyty będą potencjalnymi celami leczenia przeciw otyłości i cukrzycy, którego celem jest "zwiększenie rozpraszania energii", a nie "tłumienie poboru energii"4. Pomocniczo, allel ryzyka wariantu otyłości FTO rs1421085 u ludzi, który wykazuje najsilniejszy związek z wyższym wskaźnikiem masy ciała (BMI) wśród popularnych wariantów6,7 i wykazuje różne interakcje gen-środowisko8,9, ma negatywnie regulować różnicowanie i funkcję adipocytów beżowych10. Receptor aktywowany proliferatorem peroksysomów γ (PPARγ) jest znany jako główny regulator transkrypcji adipogenezy i jest niezbędny i wystarczający do różnicowania adipocytów11. Regulatory transkrypcji, takie jak domena homologiczna PRD1-BF1-RIZ1 zawierająca 16 (PRDM16), wczesny czynnik komórek B 2 (EBF2) i czynnik jądrowy I-A (NFIA), mają kluczowe znaczenie dla różnicowania i funkcji brązowo-beżowych adipocytów12,13,14,15,16,17,18. Z drugiej strony, programowanie genów białych adipocytów wymaga regulatorów transkrypcji, takich jak białko wzmacniające podobne do transducyny 3 (TLE3) i białko palca cynkowego 423 (ZFP423)19,20,21.

Systemy modelowe in vitro umożliwiają przeprowadzanie badań molekularnych, które mają na celu lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw funkcji i dysfunkcji adipocytów. Chociaż istnieją publicznie dostępne i unieśmiertelnione linie komórkowe preadipocytów, takie jak 3T3-L1 i 3T3-F442A22,23,24, hodowla pierwotnych preadipocytów i różnicowanie w adipocyty byłyby bardziej odpowiednim modelem do badania adipogenezy in vivo. Izolacja zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej jest dobrze znaną metodą otrzymywania pierwotnych preadipocytów25,26. Jednak trawienie kolagenazy tkanki tłuszczowej, które jest powszechnie wykonywane przy użyciu wytrząsarki bakteryjnej z rurką, może powodować zmienność eksperymentalną i jest podatne na zanieczyszczenie27,28. W tym miejscu opisujemy alternatywny protokół, który wykorzystuje delikatny dysocjator tkanek do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) do trawienia kolagenazy w celu łatwiejszej izolacji SVF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Tokijskiego i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Tokijskiego.

1. Przygotowanie roztworu enzymu i pożywki

  1. Umieścić obie strony pachwinowej białej tkanki tłuszczowej (prawa i lewa strona, około 150 mg) od 7-8-tygodniowej myszy i 2,5 ml roztworu enzymu do probówki C dysocjatora.
  2. Enzym D należy rozpuścić w 3 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle Substrate (DMEM)/F12 bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS) lub antybiotyków, enzym R w 2,7 ml DMEM/F12 bez FBS lub antybiotyków, a enzym A w 1 ml buforu A.
  3. Przygotować 2,5 ml roztworu enzymu, dodając 100 μl enzymu D, 50 μl enzymu R, 12,5 μl enzymu A i 2,35 ml DMEM/F12 bez FBS lub antybiotyków do probówki C. Ustawić probówkę C z roztworem enzymu na lodzie.

2. Izolacja tkanki tłuszczowej

  1. Eutanazja 7-8-tygodniowego samca myszy C57BL/6J (około 20 g) przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Na czystej ławce, aby wyizolować pachwinową białą tkankę tłuszczową, przetnij skórę/ostrymi nożyczkami na brzuchu i w kierunku kończyn dolnych. Odizoluj tkankę tłuszczową od wewnętrznej strony ud za pomocą ostrych/ostrych nożyczek. Jedna strona pachwinowej tkanki tłuszczowej waży ~75 mg.
  3. Umieść izolowaną tkankę tłuszczową w probówce C z roztworem enzymu na lodzie i trzymaj rurkę w czystej ławce, aby zachować sterylność.

3. Rozdrabnianie i trawienie tkanki tłuszczowej

  1. Na czystej ławie dodaj 2,5 ml roztworu enzymu do probówki C.
  2. Tkankę tłuszczową zmielić na małe kawałki, tnąc ostrymi/ostrymi nożyczkami 50 razy. Pokrój tkankę tłuszczową na ~2 mm2 kawałki.
  3. Szczelnie zamknij nakrętkę rurki C, odwróć rurkę do góry nogami i przymocuj ją do tulei dysocjatora tkanek z założoną nasadką. Następnie trawić próbkę przez ~40 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W tym badaniu użyto dysocjatora gentleMACS Octo z grzejnikami (Miltenyi Biotec 130-096-427) i zastosowano preinstalowany program "37C_mr_ATDK_1".

4. Filtracja zawiesiny komórkowej

  1. Wstępnie podgrzany DMEM/F12 zawierający 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny do 37 °C.
  2. Odłączyć probówkę C od dysocjatora tkanek i zatrzymać trawienie, dodając 5 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i delikatnie pipetując cztery razy.
  3. Wirować przy 700 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C.
  4. Ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.
  5. Zawiesić osad, dodając 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i delikatnie pipetując pięć razy.
  6. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 μm umieszczone na nowej probówce o pojemności 50 ml.
  7. Wirować przy 250 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).

5. Poszycie komórek

  1. Wirować przy 500 x g przez 5 min.
  2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad, dodając 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i pipetując dziesięć razy.
  3. Zawiesinę komórkową umieścić na 10 cm naczyniu pokrytym kolagenem i umieścić szalki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ) na 1-2 godziny < /> UWAGA: Naczynia pokryte kolagenem nie są absolutnie wymagane. Jednak z doświadczenia wynika, że naczynia pokryte kolagenem pomagają w przyleganiu preadipocytów, a tym samym zwiększają przeżywalność komórek.
  4. Odessać pożywkę i przemyć komórki dwukrotnie 3 ml PBS na pranie.
  5. Dodać 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i umieścić szalki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ).

6. Pasażowanie preadipocytów

  1. Następnego dnia odessać pożywkę (komórki będą przylegać, a zatem pożywkę można odessać), przemyć komórki dwukrotnie 3 ml PBS na przemycie i dodać 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.
  2. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności (zwykle 4 dni po izolacji SVF), podziel komórki na cztery 10-centymetrowe naczynia pokryte kolagenem.
    1. W szczególności odessać pożywkę, umyć komórki PBS (temperatura pokojowa [RT]), dodać 1 ml wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny i inkubować przez 5 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    2. Dodać 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny, aby stłumić aktywność trypsyny. Po pipetowaniu odwirować przy 440 x g przez 5 minut.
    3. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki, dodając 40 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny, a następnie umieścić komórki w czterech 10-centymetrowych naczyniach pokrytych kolagenem.
  3. Ponownie przejdź przez komórki, gdy osiągną 80% konfluencji.

7. Przygotowanie antygenu T dużego antygenu T SV40 do retrowirusa do unieśmiertelnienia preadipocytów (opcjonalnie)

  1. Co najmniej 3 dni przed uwiecznieniem, płytka Platinum-E (Plat-E) packaging cells29 o gęstości 3,0 x 105 komórek/ml w 2 ml DMEM z 10% FBS bez antybiotyków. Użyj hemekytometru, aby policzyć komórki.
  2. Następnego dnia przetransfekuj 4 μg pBABE-neo largeTcDNA (dodaj plazmid genu #1780) za pomocą Lipofectamine 2000, zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Po 24 godzinach odessać pożywkę i dodać 2 ml DMEM z 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną.
  4. Następnego dnia zbierz retrowirusowy supernatant. Retrowirus może być natychmiast użyty do unieśmiertelnienia lub przechowywany w temperaturze -80 °C.

8. Unieśmiertelnienie preadipocytów za pomocą dużego antygenu T SV40 (opcjonalnie)

  1. Przejście i ekspansja preadipocytów dwukrotnie po izolacji SVF.
  2. Umieść komórki na płytkach 6-dołkowych o gęstości 0,5-1,0 x 10,4 komórki/ml w 2 ml DMEM/F12 z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Użyj hemekytometru, aby policzyć komórki.
  3. Następnego dnia przygotować 250 μl świeżego lub rozmrożonego retrowirusa wykazującego ekspresję dużego antygenu T SV40 na zagłębienie z płytek 6-dołkowych. Wirować przy 440 x g przez 5 minut i umieścić supernatant w nowej probówce.
  4. Dodać 750 μl DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny oraz 1 μl polibrenu na 250 μl retrowirusowego supernatantu, aby otrzymać działającego wirusa.
  5. Odessać pożywkę i dodać 1,000 μl działającego retrowirusa do każdej studzienki zawierającej preadipocyty.
  6. Dodaj 1 ml DMEM/F12 z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny 4 godziny później.
  7. Następnego dnia oddziel zakażone preadipocyty do 10-centymetrowego naczynia i wybierz zakażone komórki za pomocą DMEM/F12 zawierającego 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny i 500 μg/ml neomycyny. Aby monitorować dobór antybiotyków, przygotuj naczynie z niezakażonych komórek z neomycyną.
  8. Kontynuuj przechodzenie zainfekowanych komórek za pomocą neomycyny, aż wszystkie niezainfekowane komórki w naczyniu monitora umrą.

9. Różnicowanie adipocytów

  1. Ułóż komórki na płytce. W przypadku płytek 12-dołkowych należy poszczepić komórki o gęstości 4,0 x 104 komórek/ml w 1 ml DMEM/F12 zawierającym 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.
  2. Gdy preadipocyty ulegną zlewaniu (48-72 godziny po posiewie, należy odessać pożywkę i zastąpić ją pożywką różnicującą (patrz tabela 1 dla składu).
  3. W 2. dniu różnicowania (tj. 48 godzin po wywołaniu różnicowania) należy zastąpić pożywkę pożywką podtrzymującą (patrz Tabela 1 dla składu). Następnie zmieniaj podłoże konserwacyjne co 2 dni. Różnicowanie końcowe osiąga się w 7 dniu różnicowania.
  4. Czerwony olej o barwienie
    1. W przypadku barwienia na czerwono olejem, odessać pożywkę i przepłukać komórki 1 ml PBS na studzienkę. Utrwal komórki, dodając 1 ml 4% formaldehydu na studzienkę i inkubuj komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Podczas inkubacji rozcieńczyć 0,5% roztwór podstawowy czerwieni olejowej (w alkoholu izopropylowym) do 0,3% przy użyciu ddH2O i przefiltrować roztwór roboczy za pomocą bibuły filtracyjnej.
    3. Po 15 minutach inkubacji usunąć formaldehyd, przepłukać komórki 60% alkoholem izopropylowym, dodać 1 ml przefiltrowanego oleju czerwonego o roztworu roboczego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Po inkubacji umyj komórki bieżącą wodą. Następnie obserwuj adipocyty obciążone lipidami pod odwróconym mikroskopem (powiększenie: obiektyw 20x i okular 10x).
  5. Analiza ekspresji mRNA
    UWAGA: Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z listą starterów użytych w tym badaniu.
    1. Odessać pożywkę i dodać 1 ml / studzienkę trizolu do studzienki.
    2. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, odłączyć komórki przez pipetowanie i zebrać próbki do probówek o pojemności 1,5 ml. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.
    3. Rozmrozić zamrożoną próbkę do temperatury regulowanej, dodać do niej 200 μl chloroformu i energicznie wstrząsać przez 15 s.
    4. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie wirować w temperaturze 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Ostrożnie usuń fazę wodną (górną, bezbarwną) i przenieś do nowych probówek. Nigdy nie przenoś fazy białkowej (środkowej, białej) lub fazy fenolowo-chloroformowej (dolnej, różowej).
    6. Powoli dodawaj równą objętość 70% EtOH i delikatnie wymieszaj. Nie wirować.
    7. Załadować próbkę (do 700 μl) do kolumny wirowej RNA umieszczonej w probówce zbiorczej. Pamiętaj, aby uwzględnić wszelkie osady, które mogły się uformować.
    8. Wirować z prędkością 9 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, a następnie wyrzucić przepływ.
    9. Dodać 700 μl buforu RW1, wirować z prędkością 9 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić przepływ.
    10. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej i dodać 500 μl buforu RPE.
    11. Wirować z prędkością 9 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić przepływ.
    12. Dodać 500 μl buforu RPE, wirować w temperaturze 9 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić przepływ.
    13. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej i wirować (kolumny bez buforu) w temperaturze 9 000 x g przez 1-2 minuty w temperaturze 4 °C.
    14. Przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml i dodaj 30 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na membranę kolumny.
    15. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty. Następnie wirować w temperaturze 9 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, aby wymyć RNA.
    16. Sprawdź stężenie RNA za pomocą fluorospektrometru.
      UWAGA: Zaleca się wyrównanie stężenia w tym miejscu.
    17. Wykonaj odwrotną transkrypcję przy użyciu ~200 ng matrycy RNA. Użyj komercyjnego ilościowego zestawu do reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR-RT) i postępuj zgodnie z protokołem producenta. Po reakcji rozcieńczyć cDNA 20 razy do 200 μl.
    18. Dodaj 2,0 μl cDNA, 3,0 μl Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μl 100 μM startera do przodu qPCR, 0,018 μl 100 μM startera odwrotnego qPCR i 0,96 μl ddH2O do każdego dołka na płytce 384-dołkowej.
    19. Przeprowadzić qPCR (etap wstrzymania: 50°C przez 2 minuty i 95°C przez 2 minuty; Etap PCR: 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 min; etap krzywej topnienia: 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min i 95 °C przez 15 s). Do oceny ilościowej należy użyć metody krzywej standardowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół pozwala na uzyskanie w pełni zróżnicowanych adipocytów z akumulacją lipidów 7 dni po indukcji różnicowania adipocytów. Stopień różnicowania adipocytów można ocenić za pomocą barwienia Oil Red O tryglicerydów i lipidów (Rysunek 1A) lub poprzez analizę ekspresji mRNA genów adipocytów za pomocą qPCR-RT, takich jak główny regulator adipogenezy Pparg oraz jego gen docelowy Fabp4 (Rysunek 1B). Aby zindukować różnicowanie adipocytów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy protokół izolacji SVF z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i przeprowadzenia różnicowania adipocytów in vitro. Zastosowanie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejszyło zmienność eksperymentalną, zmniejszyło ryzyko zanieczyszczenia i zwiększyło odtwarzalność. Chociaż procedura ta jest krytycznym krokiem w ramach przedstawionego protokołu, proces jest wysoce zautomatyzowany i nie jest potrzebna optymalizacja. Jednak w zależności od wieku myszy i składu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma konkurencyjnego interesu finansowego związanego z tą pracą.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Takahito Wada i Saiko Yoshida (Uniwersytet Tokijski, Tokio, Japonia) za ich eksperymentalną pomoc. Praca ta została sfinansowana z następujących grantów dla Y.H.: grant badawczy z University of Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, numer grantu 19K17976; grant dla Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) od Japońskiej Fundacji Enzymologii Stosowanej, numer grantu 17F005; grant Fundacji Badań Farakologicznych; grant Fundacji Pamięci Mochidy na badania medyczne i farmaceutyczne; grant Fundacji MSD Life Science; stypendium Fundacji Zdrowia Daiwa Securities; grant Tokijskiej Fundacji Badań Biochemicznych; Grant na badania w dziedzinie nauk przyrodniczych przyznany przez Fundację Naukową Takeda; oraz grant Fundacji Badań Medycznych SENSHIN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie 100 mmCorning430167
płytka 12-dołkowaCorning3513
Naczynie 60 mmIWAKI3010-060
Zestaw do dysocjacji tkanki tłuszczowej, myszy i szczurówMiltenyi Biotec130-105-808zawartość: Enzym D, Enzym R, Enzym A i bufor A
Sitko komórkowe 70 &mikro; mBD falcon#352350
Naczynia pokryte kolagenem, 100 mmBD#356450
Naczynia pokryte kolagenem, 60 mmBD#354401
Kolagen I Płaszcz Microplate 6 dołkówIWAKI4810-010
DeksametazonWako041-18861
Kleszcze preparacyjneNiedotyczyautoklawu przed użyciem
Nożyczki preparacyjne,/ostreautoklaw N/AN/Aprzed użyciem
Nożyczki preparacyjne, ostre/ostreautoklaw N/AN/A przed użyciem
DMEM/F-12, suplement GlutaMAXGibco10565-042
Surowica bydlęca płodu (FBS)N/AN/
gentleMACS C TubesMilteny Biotec130-093-237
GentleMACSOcto Dysocjator z grzałkamiMiltenyi Biotec130-096-427
Humulin R Injection U-100Eli Lilly872492
IndomethacinSigmaI7378-5G
Izobutylometyloksantyna (IBMX)Sigma17018-1G
Lipofectamina 2000Life Technologies11668-019
Neomycyna SiarczanFujifilm146-08871 
Opti-MEMInvitrogen 31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)Dodaj gen#1780
Tabletki PBSTakaraT900
Platinum-E (Plat-E) Opakowanie retrowirusowe Komórka linii komórkowejbiolabRV-101
PolybreneNacalai Tesque12996-81
Power Sybr Green Master MixApplied Biosystems4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master MixTOYOBO#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)QIAGEN74106
RozyglitazonWako180-02653
T3SigmaT2877-100mg
Trypsyna-EDTA (0,05%)Gibco25200-056
A

Bibliografia

  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
  3. Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
  4. Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
  5. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  6. Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
  7. Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
  8. Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
  9. Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332(2010).
  10. Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
  11. Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
  12. Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
  13. Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
  14. Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
  15. Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
  16. Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
  17. Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044(2020).
  18. Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729(2022).
  19. Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
  20. Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
  21. Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
  22. Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
  23. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  24. Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
  25. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
  26. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).
  27. Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
  28. Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
  29. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
  30. Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
  31. Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093(2023).
  32. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Różnicowanie adipocytówtrawienie kolagenaząadipocyty brunatneadipocyty beżowehodowla komórkowabarwienie Oil Red Oanaliza ekspresji mRNA
Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.