Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Biologia tkanki tłuszczowej przyciąga coraz większą uwagę ze względu na rosnące rozpowszechnienie otyłości i cukrzycy typu 2 na całym świecie¹. Adipocyty magazynują nadmiar energii w postaci kropelek lipidów, które są uwalniane po wygłodzeniu. Co więcej, tkanka tłuszczowa utrzymuje homeostazę energetyczną układu, służąc jako narząd endokrynny i komunikując się z innymi tkankami^2,3. Co ciekawe, zarówno nadmiar tkanki tłuszczowej (otyłość), jak i utrata tkanki tłuszczowej (lipodystrofia) są związane z insulinoopornością i cukrzycą¹. Adipocyty dzielą się na trzy typy: białe, brązowe i beżowe¹. Białe adipocyty magazynują głównie nadmiar energii w postaci lipidów, podczas gdy brązowe i beżowe adipocyty rozpraszają energię w postaci ciepła za pośrednictwem mitochondrialnego białka rozprzęgającego białko-1 (Ucp1)^1,4. Warto zauważyć, że beżowe adipocyty (zwane również "indukowalnymi" brązowymi adipocytami) pojawiają się w białej tkance tłuszczowej w odpowiedzi na zimną lub współczulną stymulację i wykazują wzorce ekspresji genów, które pokrywają się, ale różnią się od tych z "klasycznych" brązowych adipocytów⁵. Ostatnio przewidywano, że brązowe i beżowe adipocyty będą potencjalnymi celami leczenia przeciw otyłości i cukrzycy, którego celem jest "zwiększenie rozpraszania energii", a nie "tłumienie poboru energii"⁴. Pomocniczo, allel ryzyka wariantu otyłości FTO rs1421085 u ludzi, który wykazuje najsilniejszy związek z wyższym wskaźnikiem masy ciała (BMI) wśród popularnych wariantów^6,7 i wykazuje różne interakcje gen-środowisko^8,9, ma negatywnie regulować różnicowanie i funkcję adipocytów beżowych¹⁰. Receptor aktywowany proliferatorem peroksysomów γ (PPARγ) jest znany jako główny regulator transkrypcji adipogenezy i jest niezbędny i wystarczający do różnicowania adipocytów¹¹. Regulatory transkrypcji, takie jak domena homologiczna PRD1-BF1-RIZ1 zawierająca 16 (PRDM16), wczesny czynnik komórek B 2 (EBF2) i czynnik jądrowy I-A (NFIA), mają kluczowe znaczenie dla różnicowania i funkcji brązowo-beżowych adipocytów^{12,13,14,15,16,17,18}. Z drugiej strony, programowanie genów białych adipocytów wymaga regulatorów transkrypcji, takich jak białko wzmacniające podobne do transducyny 3 (TLE3) i białko palca cynkowego 423 (ZFP423)^19,20,21.

Systemy modelowe in vitro umożliwiają przeprowadzanie badań molekularnych, które mają na celu lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw funkcji i dysfunkcji adipocytów. Chociaż istnieją publicznie dostępne i unieśmiertelnione linie komórkowe preadipocytów, takie jak 3T3-L1 i 3T3-F442A^22,23,24, hodowla pierwotnych preadipocytów i różnicowanie w adipocyty byłyby bardziej odpowiednim modelem do badania adipogenezy in vivo. Izolacja zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej jest dobrze znaną metodą otrzymywania pierwotnych preadipocytów^25,26. Jednak trawienie kolagenazy tkanki tłuszczowej, które jest powszechnie wykonywane przy użyciu wytrząsarki bakteryjnej z rurką, może powodować zmienność eksperymentalną i jest podatne na zanieczyszczenie^27,28. W tym miejscu opisujemy alternatywny protokół, który wykorzystuje delikatny dysocjator tkanek do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) do trawienia kolagenazy w celu łatwiejszej izolacji SVF.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Tokijskiego i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Tokijskiego.

1. Przygotowanie roztworu enzymu i pożywki

1. Umieścić obie strony pachwinowej białej tkanki tłuszczowej (prawa i lewa strona, około 150 mg) od 7-8-tygodniowej myszy i 2,5 ml roztworu enzymu do probówki C dysocjatora.
2. Enzym D należy rozpuścić w 3 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle Substrate (DMEM)/F12 bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS) lub antybiotyków, enzym R w 2,7 ml DMEM/F12 bez FBS lub antybiotyków, a enzym A w 1 ml buforu A.
3. Przygotować 2,5 ml roztworu enzymu, dodając 100 μl enzymu D, 50 μl enzymu R, 12,5 μl enzymu A i 2,35 ml DMEM/F12 bez FBS lub antybiotyków do probówki C. Ustawić probówkę C z roztworem enzymu na lodzie.

2. Izolacja tkanki tłuszczowej

1. Eutanazja 7-8-tygodniowego samca myszy C57BL/6J (około 20 g) przez zwichnięcie szyjki macicy.
2. Na czystej ławce, aby wyizolować pachwinową białą tkankę tłuszczową, przetnij skórę/ostrymi nożyczkami na brzuchu i w kierunku kończyn dolnych. Odizoluj tkankę tłuszczową od wewnętrznej strony ud za pomocą ostrych/ostrych nożyczek. Jedna strona pachwinowej tkanki tłuszczowej waży ~75 mg.
3. Umieść izolowaną tkankę tłuszczową w probówce C z roztworem enzymu na lodzie i trzymaj rurkę w czystej ławce, aby zachować sterylność.

3. Rozdrabnianie i trawienie tkanki tłuszczowej

1. Na czystej ławie dodaj 2,5 ml roztworu enzymu do probówki C.
2. Tkankę tłuszczową zmielić na małe kawałki, tnąc ostrymi/ostrymi nożyczkami 50 razy. Pokrój tkankę tłuszczową na ~2 mm² kawałki.
3. Szczelnie zamknij nakrętkę rurki C, odwróć rurkę do góry nogami i przymocuj ją do tulei dysocjatora tkanek z założoną nasadką. Następnie trawić próbkę przez ~40 minut w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: W tym badaniu użyto dysocjatora gentleMACS Octo z grzejnikami (Miltenyi Biotec 130-096-427) i zastosowano preinstalowany program "37C_mr_ATDK_1".

4. Filtracja zawiesiny komórkowej

1. Wstępnie podgrzany DMEM/F12 zawierający 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny do 37 °C.
2. Odłączyć probówkę C od dysocjatora tkanek i zatrzymać trawienie, dodając 5 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i delikatnie pipetując cztery razy.
3. Wirować przy 700 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C.
4. Ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.
5. Zawiesić osad, dodając 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i delikatnie pipetując pięć razy.
6. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 μm umieszczone na nowej probówce o pojemności 50 ml.
7. Wirować przy 250 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).

5. Poszycie komórek

1. Wirować przy 500 x g przez 5 min.
2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad, dodając 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i pipetując dziesięć razy.
3. Zawiesinę komórkową umieścić na 10 cm naczyniu pokrytym kolagenem i umieścić szalki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO_{2 )} na 1-2 godziny < /> UWAGA: Naczynia pokryte kolagenem nie są absolutnie wymagane. Jednak z doświadczenia wynika, że naczynia pokryte kolagenem pomagają w przyleganiu preadipocytów, a tym samym zwiększają przeżywalność komórek.
4. Odessać pożywkę i przemyć komórki dwukrotnie 3 ml PBS na pranie.
5. Dodać 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i umieścić szalki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂ ).

6. Pasażowanie preadipocytów

1. Następnego dnia odessać pożywkę (komórki będą przylegać, a zatem pożywkę można odessać), przemyć komórki dwukrotnie 3 ml PBS na przemycie i dodać 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.
2. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności (zwykle 4 dni po izolacji SVF), podziel komórki na cztery 10-centymetrowe naczynia pokryte kolagenem.
   1. W szczególności odessać pożywkę, umyć komórki PBS (temperatura pokojowa [RT]), dodać 1 ml wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny i inkubować przez 5 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych.
   2. Dodać 10 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny, aby stłumić aktywność trypsyny. Po pipetowaniu odwirować przy 440 x g przez 5 minut.
   3. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki, dodając 40 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny, a następnie umieścić komórki w czterech 10-centymetrowych naczyniach pokrytych kolagenem.
3. Ponownie przejdź przez komórki, gdy osiągną 80% konfluencji.

7. Przygotowanie antygenu T dużego antygenu T SV40 do retrowirusa do unieśmiertelnienia preadipocytów (opcjonalnie)

1. Co najmniej 3 dni przed uwiecznieniem, płytka Platinum-E (Plat-E) packaging cells²⁹ o gęstości 3,0 x 10⁵ komórek/ml w 2 ml DMEM z 10% FBS bez antybiotyków. Użyj hemekytometru, aby policzyć komórki.
2. Następnego dnia przetransfekuj 4 μg pBABE-neo largeTcDNA (dodaj plazmid genu #1780) za pomocą Lipofectamine 2000, zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Po 24 godzinach odessać pożywkę i dodać 2 ml DMEM z 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną.
4. Następnego dnia zbierz retrowirusowy supernatant. Retrowirus może być natychmiast użyty do unieśmiertelnienia lub przechowywany w temperaturze -80 °C.

8. Unieśmiertelnienie preadipocytów za pomocą dużego antygenu T SV40 (opcjonalnie)

1. Przejście i ekspansja preadipocytów dwukrotnie po izolacji SVF.
2. Umieść komórki na płytkach 6-dołkowych o gęstości 0,5-1,0 x 10,⁴ komórki/ml w 2 ml DMEM/F12 z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Użyj hemekytometru, aby policzyć komórki.
3. Następnego dnia przygotować 250 μl świeżego lub rozmrożonego retrowirusa wykazującego ekspresję dużego antygenu T SV40 na zagłębienie z płytek 6-dołkowych. Wirować przy 440 x g przez 5 minut i umieścić supernatant w nowej probówce.
4. Dodać 750 μl DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny oraz 1 μl polibrenu na 250 μl retrowirusowego supernatantu, aby otrzymać działającego wirusa.
5. Odessać pożywkę i dodać 1,000 μl działającego retrowirusa do każdej studzienki zawierającej preadipocyty.
6. Dodaj 1 ml DMEM/F12 z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny 4 godziny później.
7. Następnego dnia oddziel zakażone preadipocyty do 10-centymetrowego naczynia i wybierz zakażone komórki za pomocą DMEM/F12 zawierającego 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny i 500 μg/ml neomycyny. Aby monitorować dobór antybiotyków, przygotuj naczynie z niezakażonych komórek z neomycyną.
8. Kontynuuj przechodzenie zainfekowanych komórek za pomocą neomycyny, aż wszystkie niezainfekowane komórki w naczyniu monitora umrą.

9. Różnicowanie adipocytów

1. Ułóż komórki na płytce. W przypadku płytek 12-dołkowych należy poszczepić komórki o gęstości 4,0 x 10⁴ komórek/ml w 1 ml DMEM/F12 zawierającym 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.
2. Gdy preadipocyty ulegną zlewaniu (48-72 godziny po posiewie, należy odessać pożywkę i zastąpić ją pożywką różnicującą (patrz tabela 1 dla składu).
3. W 2. dniu różnicowania (tj. 48 godzin po wywołaniu różnicowania) należy zastąpić pożywkę pożywką podtrzymującą (patrz Tabela 1 dla składu). Następnie zmieniaj podłoże konserwacyjne co 2 dni. Różnicowanie końcowe osiąga się w 7 dniu różnicowania.
4. Czerwony olej o barwienie
   1. W przypadku barwienia na czerwono olejem, odessać pożywkę i przepłukać komórki 1 ml PBS na studzienkę. Utrwal komórki, dodając 1 ml 4% formaldehydu na studzienkę i inkubuj komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Podczas inkubacji rozcieńczyć 0,5% roztwór podstawowy czerwieni olejowej (w alkoholu izopropylowym) do 0,3% przy użyciu ddH₂O i przefiltrować roztwór roboczy za pomocą bibuły filtracyjnej.
   3. Po 15 minutach inkubacji usunąć formaldehyd, przepłukać komórki 60% alkoholem izopropylowym, dodać 1 ml przefiltrowanego oleju czerwonego o roztworu roboczego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   4. Po inkubacji umyj komórki bieżącą wodą. Następnie obserwuj adipocyty obciążone lipidami pod odwróconym mikroskopem (powiększenie: obiektyw 20x i okular 10x).
5. Analiza ekspresji mRNA
   UWAGA: Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z listą starterów użytych w tym badaniu.
   1. Odessać pożywkę i dodać 1 ml / studzienkę trizolu do studzienki.
   2. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, odłączyć komórki przez pipetowanie i zebrać próbki do probówek o pojemności 1,5 ml. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.
   3. Rozmrozić zamrożoną próbkę do temperatury regulowanej, dodać do niej 200 μl chloroformu i energicznie wstrząsać przez 15 s.
   4. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie wirować w temperaturze 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Ostrożnie usuń fazę wodną (górną, bezbarwną) i przenieś do nowych probówek. Nigdy nie przenoś fazy białkowej (środkowej, białej) lub fazy fenolowo-chloroformowej (dolnej, różowej).
   6. Powoli dodawaj równą objętość 70% EtOH i delikatnie wymieszaj. Nie wirować.
   7. Załadować próbkę (do 700 μl) do kolumny wirowej RNA umieszczonej w probówce zbiorczej. Pamiętaj, aby uwzględnić wszelkie osady, które mogły się uformować.
   8. Wirować z prędkością 9 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, a następnie wyrzucić przepływ.
   9. Dodać 700 μl buforu RW1, wirować z prędkością 9 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić przepływ.
   10. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej i dodać 500 μl buforu RPE.
   11. Wirować z prędkością 9 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić przepływ.
   12. Dodać 500 μl buforu RPE, wirować w temperaturze 9 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić przepływ.
   13. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej i wirować (kolumny bez buforu) w temperaturze 9 000 x g przez 1-2 minuty w temperaturze 4 °C.
   14. Przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml i dodaj 30 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na membranę kolumny.
   15. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty. Następnie wirować w temperaturze 9 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, aby wymyć RNA.
   16. Sprawdź stężenie RNA za pomocą fluorospektrometru.
       UWAGA: Zaleca się wyrównanie stężenia w tym miejscu.
   17. Wykonaj odwrotną transkrypcję przy użyciu ~200 ng matrycy RNA. Użyj komercyjnego ilościowego zestawu do reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR-RT) i postępuj zgodnie z protokołem producenta. Po reakcji rozcieńczyć cDNA 20 razy do 200 μl.
   18. Dodaj 2,0 μl cDNA, 3,0 μl Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μl 100 μM startera do przodu qPCR, 0,018 μl 100 μM startera odwrotnego qPCR i 0,96 μl ddH2O do każdego dołka na płytce 384-dołkowej.
   19. Przeprowadzić qPCR (etap wstrzymania: 50°C przez 2 minuty i 95°C przez 2 minuty; Etap PCR: 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 min; etap krzywej topnienia: 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min i 95 °C przez 15 s). Do oceny ilościowej należy użyć metody krzywej standardowej.

Ten protokół daje w pełni zróżnicowane, nasycone lipidami adipocyty po 7 dniach od wywołania różnicowania adipocytów. Stopień zróżnicowania adipocytów można ocenić za pomocą barwienia trójglicerydów i lipidów czerwienią olejową (Figura 1A) lub analizy ekspresji mRNA przy użyciu qPCR-RT genów adipocytów, takich jak główny regulator adipogenezy Pparg i jego docelowy Fabp4 (Figura 1B). W celu wywołania różnicowania adipocytów w kolorze beżowym in vitro można zastosować agonistę PPARγ z grupy tiazolidynodionów, takiego jak rozyglitazon. Rzeczywiście, w eksperymentach z rozyglitazonem obserwujemy zależny od dawki wpływ stężeń do 1 μM na poziomy ekspresji genów specyficznych dla brunatnej tkanki tłuszczowej, takich jak Ucp1 i Ppargc1a. Z drugiej strony, wpływ rozyglitazonu na Fabp4 jest nasycony w stężeniu 0,1 μM (Rysunek 1C).

Zróżnicowane adipocyty uzyskane za pomocą tego protokołu mogą być używane do różnych analiz funkcjonalnych i mechanistycznych, takich jak analiza wskaźnika zużycia tlenu (OCR)16,30 (Rysunek 2A) i immunoprecypitacji chromatyny31 (ChIP; Rysunek 2B). Unieśmiertelnione preadipocyty mogą być przechowywane w systemie przechowywania komórek z ciekłym azotem bez utraty żywotności i mogą być rozmrożone w dowolnym momencie do wykorzystania w eksperymentach.

Rysunek 1: Różnicowanie preadipocytów na adipocyty obciążone lipidami. (A) SVF z pachwinowej białej tkanki tłuszczowej (iWAT) myszy typu dzikiego zostały wybarwione czerwonym olejem o w 0 lub 7 dniu różnicowania adipocytów. (B) poziomy ekspresji mRNA Pparg i Fabp4 w dniu 0 i 7 dnia różnicowania adipocytów (średnia ± błąd standardowy średniej [S.E.M.]; N = 3). (C) ekspresja mRNA ogólnego markera adipocytów Fabp4 i genów Ucp1 i Ppargc1a specyficznych dla brązowej tkanki tłuszczowej w adipocytach pochodzących z SVF traktowanych 0,1, 0,2, 0,5 i 1,0 μM rozyglitazonem, wraz z pożywką różnicującą i podtrzymującą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykłady analiz funkcjonalnych i mechanistycznych z wykorzystaniem zróżnicowanych adipocytów. (A) Analiza OCR adipocytów pochodzących z iWAT SVF (N = 10). (B) ChIP-qPCR dla H3K27Ac w adipocytach pochodzących z Nfiaflox/flox iWAT SVF w dniu 0 i 7 różnicowania. Witryna Ins-0,4 kb i Fabp4-13 kb jest pokazana jako witryny tła (średnia ± S.E.M.; N = 2). W obu eksperymentach dodano 1,0 μM rozyglitazon wraz z pożywką różnicującą i podtrzymującą, aby indukować różnicowanie adipocytów na kolor beżowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Skład podłoża różnicującego i podtrzymującego. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Lista starterów użytych w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Żaden z autorów nie ma konkurencyjnego interesu finansowego związanego z tą pracą.