Montaż i eksploatacja etapu chłodzącego w celu unieruchomienia C. elegans na ich płytkach hodowlanych

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokoły budowy i obsługi etapu chłodzenia w celu masowego unieruchomienia C. elegans na ich oryginalnych płytach uprawowych.

Streszczenie

Wysokorozdzielcze metody mikroskopii in vivo mogą ujawnić subtelne informacje i drobne szczegóły wewnątrz modelowego zwierzęcia Caenorhabditis elegans (C. elegans), ale wymagają silnego unieruchomienia zwierzęcia, aby zapobiec rozmyciu ruchu na obrazach. Niestety, większość obecnych technik unieruchamiania wymaga znacznego wysiłku ręcznego, co sprawia, że obrazowanie w wysokiej rozdzielczości jest mało przepustowe. Immobilizacja C. elegans jest znacznie uproszczona dzięki zastosowaniu metody chłodzenia, która może z łatwością unieruchomić całe populacje bezpośrednio na ich płytach uprawowych. Etap chłodzenia może wytworzyć i utrzymać szeroki zakres temperatur z równomiernym rozprowadzeniem na płycie uprawowej. W tym artykule udokumentowany jest cały proces budowy etapu chłodzenia. Celem jest, aby typowy badacz mógł bez trudu zbudować działający stopień chłodzenia w swoim laboratorium zgodnie z tym protokołem. Pokazano wykorzystanie etapu chłodzenia zgodnie z trzema protokołami, a każdy protokół ma zalety dla różnych eksperymentów. Pokazany jest również przykładowy profil chłodzenia stolika w miarę zbliżania się do temperatury końcowej oraz kilka pomocnych wskazówek dotyczących korzystania z unieruchomienia chłodzenia.

Wprowadzenie

Mikroskopia optyczna o wysokiej rozdzielczości stanowi niezbędne narzędzie do badania struktur biologicznych in vivo na poziomie subkomórkowym. Wiele badań biologicznych wymaga obrazowania w rozdzielczości submikronowej w celu wyjaśnienia subtelnych szczegółów anatomicznych, w tym morfologii neuronów^1,2, membrane structure^3,4 i lokalizacja białka^5,6. Obraz o wysokiej rozdzielczości wymaga czasu naświetlania od kilku milisekund do sekund, w zależności od metody obrazowania i sondy^7,8. Aby osiągnąć optymalne wyniki, konieczne jest staranne zaplanowanie i przeprowadzenie eksperymentów mikroskopowych. Kluczowe znaczenie dla tych wysiłków ma skuteczna metoda przygotowania zwierząt, która ułatwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości.

Nicień C. elegans jest powszechnie wykorzystywanym organizmem modelowym do badania wielu procesów biologicznych⁹. To małe zwierzę jest zwykle hodowane na płytkach agarowych z pożywką wzrostową nicieni (NGM) i szybko się rozmnaża przez samozapłodnienie, dzięki czemu dobrze nadaje się do badań na dużą skalę. Ich przezroczystość i szeroki wachlarz technik etykietowania pozwalają na prostą wizualizację ich wewnętrznej anatomii^10,11. Drobne struktury C. elegans są idealne do badania procesów biologicznych na poziomie subkomórkowym, takich jak regeneracja neuronów¹², degeneracja neuronów¹³ i podział komórek¹⁴. Takie badania wymagają obrazowania w rozdzielczości submikronowej i unieruchomienia zwierząt wystarczająco silnego, aby zapobiec rozmyciu obrazu. Silne unieruchomienie jest szczególnie ważne w przypadku technik obejmujących wiele obrazów w przestrzeni lub czasie, takich jak stosy obrazów 3D (tj. stosy obrazów) i obrazowanie poklatkowe. Każdy ruch zwierzęcia między ekspozycjami może zaciemnić wynik. W przypadku C. elegans silne unieruchomienie zazwyczaj polega na ręcznym manipulowaniu pojedynczymi zwierzętami i montowaniu ich na szkiełkach za pomocą środka znieczulającego^15,16. Te czasochłonne i pracochłonne procedury bardzo utrudniają eksperymenty na dużą skalę. Strategia unieruchomienia, w której zwierzęta są bezpośrednio i odwracalnie unieruchamiane na swoich pierwotnych płytach hodowlanych, może umożliwić obrazowanie o wysokiej przepustowości i wysokiej rozdzielczości.

Unieruchomienie C. elegans zostało wykazane w kilku badaniach, ale nie jest powszechnie stosowane. Zazwyczaj łączy się go z urządzeniem mikroprzepływowym, aby jeszcze bardziej unieruchomić zwierzęta^17,18,19. Jednak urządzenia mikroprzepływowe są złożone, wymagają znacznego szkolenia operacyjnego i nie można ich łatwo zintegrować z typowymi procesami uprawy ciał stałych w eksperymentach z C. elegans. W związku z tym mikrofluidyka nie jest szeroko stosowana do unieruchamiania C. elegans. Przedstawiona tutaj, w połączeniu z niedawną publikacją Laboratorium Chunga²⁰, przedstawia wprowadzenie nowego podejścia do unieruchamiania chłodzenia przy użyciu termoelektrycznego stopnia chłodzenia (Rysunek 1) w celu rozwiązania tych niedociągnięć. Na etapie chłodzenia typowa płyta uprawowa z polistyrenu o grubości 60 mm może być schłodzona do dowolnej temperatury docelowej (_ustawionej T) w zakresie -8 °C do temperatury pokojowej. To podejście do etapu chłodzenia może łatwo i odwracalnie unieruchomić całą populację zwierząt przy minimalnym wysiłku użytkownika, eliminując 98% czasu przetwarzania zwierząt²⁰.

Poniżej opisane są procedury budowania etapu chłodzenia od podstaw. Z wyjątkiem obróbki części i druku 3D, cała procedura ma zająć 4 godziny bez konieczności stosowania specjalnych narzędzi lub specjalistycznej wiedzy. Następnie opisano trzy różne strategie chłodzenia z różnymi szybkościami chłodzenia i wysiłkami użytkownika w celu unieruchomienia C. elegans na typowym mikroskopie pionowym. Preferowana strategia może zależeć od aplikacji użytkownika. Szczegółowo opisano protokoły dla tych trzech strategii unieruchamiania chłodzenia.

Protokół

1. Produkcja i przygotowanie każdego składnika etapu chłodzenia

UWAGA: Etap chłodzenia składa się z kilku elementów (patrz Tabela Materiałów). Większość komponentów jest dostępna od ręki. Szafirowe okno wymaga niestandardowego zamówienia, podczas gdy miedziana płyta, wspornik mocujący i płyta izolacyjna mogą być produkowane na miejscu za pomocą komputerowego młyna sterowanego numerycznie lub drukarki 3D. Po wstępnej produkcji, późniejszy proces montażu trwa około 2-3 godzin.

1. Użyj komputerowej frezarki sterowanej numerycznie, aby obrobić blachę miedzianą z blachy miedzianej o wymiarach 170 mm x 120 mm x 3 mm, 99,9% czystej miedzi (Rysunek 2A). Rysunek 2D dla tej produkcji znajduje się w pliku uzupełniającym 1. Użyj drobnoziarnistego papieru ściernego, aby usunąć wszelkie ostre krawędzie i brudne pozostałości.
2. Do produkcji wspornika mocującego i płyty izolacyjnej należy użyć drukarki 3D i filamentu z kwasu polimlekowego (PLA) o średnicy 1,75 mm (Rysunek 2B, C). Aby uzyskać lepszą jakość, drukarka 3D powinna zapewniać wysokość warstwy drobniejszą niż 0,2 mm. 3D modele są dostępne w pliku uzupełniającym 2 i pliku uzupełniającym 3.

2. Konstruowanie zestawu wodno-chłodzącego

1. Przygotuj silikonową rurkę utwardzaną platyną, zbiornik pompy, miedziany blok chłodzący i chłodnicę (Rysunek 3A) do budowy zespołu chłodzenia wodnego. Przygotuj żyletkę, nożyczki i klucz imbusowy gotowe do użycia. Należy pamiętać o zagrożeniach elektrycznych spowodowanych użyciem wody podczas montażu.
2. Pokrój silikonową rurkę na trzy sekcje o sugerowanych długościach 40 cm, 50 cm i 80 cm. W razie potrzeby dostosuj długość.
3. Podłącz odcinki rurki silikonowej z kroku 2.2 do portów chłodnicy, zbiornika pompy i miedzianego bloku chłodzącego, jak pokazano na rysunku Rysunek 3B. Upewnij się, że wszystkie połączenia są wodoszczelne. Zespół chłodzenia wodnego jest już zbudowany.
4. Przygotuj zestaw chłodzenia wodą, zasilacz 12 V, trzy czerwone i trzy czarne przewody połączeniowe, płytkę stykową i 500 ml oczyszczonej wody.
5. Upewnij się, że stół warsztatowy jest wolny od płynów ze względów bezpieczeństwa elektrycznego.
6. Podłącz zbiorniki pompy i przewody chłodnicy do zasilania 12 V za pomocą płytki stykowej (Rysunek 3C). Płytka stykowa jest używana dla wygody.
   UWAGA: Aby uzyskać bardziej trwałe i bezpieczne połączenie, badacze mogą zastąpić płytkę stykową drutami lutowniczymi.
7. Otwórz korek zbiornika pompy za pomocą płaskiego śrubokręta. Użyj lejka, aby dolać wody, aż zbiornik pompy będzie wypełniony w około 80% (Rysunek 3D). Nie zakrywaj zbiornika pompy po tym napełnieniu.
8. Włącz zespół chłodzenia wodą, podłączając zasilacz 12 V lub włączając go (jeśli jest obecny). Po włączeniu zasilania woda spłynie do wnętrza zespołu i powinny przedmuchać wentylatory na chłodnicy.
9. Ze względu na przepływ wody ze zbiornika pompy, poziom cieczy w zbiorniku spadnie. Dodaj więcej wody do zbiornika pompy, aż ustabilizuje się na prawie 2/3 napełnienia (Rysunek 3E).
10. Potrząśnij chłodnicą, aby pozbyć się pęcherzyków powietrza, a następnie zakręć zbiornik chłodzący.
11. Wyłącz zasilanie przed przejściem do następnego kroku.

3. Testowanie zimnych i gorących powierzchni Peltiera

UWAGA: Peltier, kluczowy element etapu chłodzenia, to aktywna pompa ciepła na poziomie stałym, która przenosi ciepło z jednej strony na drugą²¹. Jedna powierzchnia Peltiera nagrzewa się, a druga staje się zimna podczas dostarczania energii elektrycznej. Domyślnie producenci Peltiera oznaczają zimną powierzchnię przed sprzedażą, ale nadal pomocne jest ręczne przetestowanie jej przed montażem.

1. Przygotuj przestrajalny zasilacz i ogniwo Peltiera, jak pokazano na rysunku Rysunek 4A.
2. Upewnij się, że przestrajalne zasilanie jest wyłączone, aby zapobiec możliwym zagrożeniom elektrycznym.
3. Podłącz czerwony przewód Peltiera do wyjścia dodatniego, a przewód do ujemnego wyjścia przestrajalnego zasilacza z zaciskami krokodylkowymi, które są dostarczane z zasilaczem (Rysunek 4B).
4. Włącz przestrajalny zasilacz i ustaw go na około 2 V, modulując zarówno pokrętła napięcia, jak i prądu w górnym rzędzie zasilacza. Natychmiast użyj gołego palca, aby wyczuć dwie powierzchnie Peltiera. Jedna powierzchnia staje się zimna w ciągu kilku sekund.
5. Po ustaleniu, która powierzchnia jest zimna, natychmiast wyłącz zasilanie i odłącz ogniwo Peltiera.
6. Użyj markera, aby wskazać zimną powierzchnię do przyszłego montażu.

4. Konstruowanie zespołu do chłodzenia Peltiera za pomocą zespołu chłodzącego wodą

1. Jak pokazano na Rysunek 4A, przygotuj wyłączony zespół chłodzenia wodnego, Peltiera (oznaczona zimną powierzchnią) i pastę termiczną (dla lepszego przewodzenia ciepła).
2. Oczyść wszystkie powierzchnie miedzianego bloku chłodzącego 70% etanolem (lub innym czystszym roztworem) w zespole chłodzącym wodę.
3. Nałóż około 0,4 g pasty termicznej na jedną powierzchnię miedzianego bloku chłodzącego wodę i upewnij się, że taka orientacja powierzchni zapobiegnie krzyżowaniu się lub zginaniu rurek skierowanych w dół. Użyj rękawicy, aby chronić skórę i spróbuj rozprowadzić pastę termiczną cienko i równomiernie (Rysunek 4C).
4. Podobnie, oczyść gorącą powierzchnię Peltiera, a następnie nałóż pastę termiczną na powierzchnię (Rysunek 4D).
5. Połącz gorącą powierzchnię Peltiera z miedzianą powierzchnią bloku chłodzącego za pomocą pasty termicznej. Zastosuj nacisk, aby upewnić się, że jest bezpieczny. Postępuj zgodnie z orientacją przewodów na ogniwie Peltiera i rurkach miedzianego bloku chłodzącego, jak pokazano na rysunku Rysunek 4E. Wyczyść nadmiar pasty termicznej.
6. Wyłącz zarówno zasilanie 12 V, jak i zasilacz przestrajalny. Podłącz ogniwo Peltiera do przestrajalnego zasilacza, jak w rozdziale 3.
7. Ponownie sprawdź połączenia zespołu elektrycznego i chłodzenia wodą, a następnie kolejno włączaj zasilanie 12 V i zasilacz przestrajalny.
8. Stopniowo włączaj przestrajalny zasilacz na 12 V. Przy sugerowanym Peltierze prąd powinien wynosić około 7,3 A.
9. Odczekaj 2 minuty; temperatura zimnej powierzchni Peltiera powinna być niższa niż -35 °C. Zmierz tę temperaturę za pomocą termometru na podczerwień (Rysunek 4F). Nie dotykaj zimnej powierzchni, aby zapobiec obrażeniom rąk.
10. Sprawdź wszystkie połączenia i komponenty, jeśli temperatura nie może osiągnąć poniżej -30 °C. Pęcherzyki powietrza wewnątrz zespołu chłodzenia wodą są możliwą przyczyną nieoptymalnej wydajności chłodzenia.
11. Aby zapewnić bezpieczeństwo w późniejszych krokach, wyłącz przestrajalne zasilanie, odczekaj 1 minutę, a następnie wyłącz zasilanie 12 V.

5. Konstruowanie zespołu miedzianej płyty i szafirowego okna

1. Przygotuj miedzianą płytkę, szafirowe okienko o średnicy 80 mm, pastę termiczną, taśmę o szerokości 4 cali i ostre ostrze do cięcia (Rysunek 5A).
2. Ostrożnie wyczyść miedzianą płytkę i szafirowe okienko 70% etanolem i użyj drobnoziarnistego papieru ściernego, aby wygładzić szorstkie powierzchnie.
3. Nałóż pastę termiczną na trzy wewnętrzne powierzchnie, jak pokazano na Rysunek 5B. Upewnij się, że pasta termiczna pokrywa wszystkie trzy powierzchnie, ale nie jest zbyt gruba, około 0.5 mm.
4. Połóż miedzianą płytkę na blacie zabezpieczoną papierem do drukarki. Papier ułatwia późniejsze czyszczenie.
5. Włóż szafirowe okienko do otworu w miedzianej płycie (Rysunek 5C). Upewnij się, że szafir nie obraca się podczas wkładania, aby zapobiec przesuwaniu się pasty termicznej do innych obszarów. Usuń nadmiar pasty termicznej.
6. Przyklej taśmę o szerokości 4 cali do górnej powierzchni zespołu okna z płytą miedzianą i szafirem (powierzchnia, która ma kwadratowy obszar wgłębienia, jak pokazano na Rysunek 5D). Unikaj pęcherzyków powietrza między taśmą a powierzchniami miedzianymi podczas wklejania, powoli prowadząc przyczepność z jednej strony na drugą.
7. Wytnij określone niebieskie przerywane obszary taśmy za pomocą ostrego ostrza, postępując zgodnie z Rysunek 5E. Cięcie odsłania dwa otwory na gwint, kwadratowe wgłębienie i obszar o średnicy 70 mm szafirowego okienka.
8. Przyklej dolną powierzchnię zespołu okna z płytą miedzianą i szafirem, a następnie powtórz procedurę cięcia (tylko obszar szafiru) na tej powierzchni, jak pokazano na Rysunek 5F.
   UWAGA: Teraz szafirowe okno jest przymocowane do miedzianej płyty, a miedziane powierzchnie są chronione przed rdzą.

6. Końcowy montaż etapu chłodzenia

1. Upewnij się, że wszystkie niezbędne podzespoły i komponenty są gotowe.
2. Nałóż około 0,4 g pasty termicznej na kwadratowe wgłębienie miedzianej płytki (Rysunek 6A).
3. Nałóż około 0,4 g pasty termicznej na zimną powierzchnię Peltiera. Zauważ, że ogniwo Peltiera jest już przymocowane do miedzianego bloku chłodzącego (Rysunek 6B).
4. Podłącz zimną powierzchnię Peltiera do wgłębienia w miedzianej płytce z naciskiem skierowanym w dół. Wyczyść nadmiar pasty termicznej (Rysunek 6C).
5. Zamontuj wspornik wydrukowany w 3D na górze miedzianego bloku chłodzącego, a następnie użyj klucza imbusowego, aby dokręcić dwie o długości 8-32, 0,5 cala, aby przymocować wspornik do miedzianej płytki (Rysunek 6D). Użyj dokręcania z niskim momentem obrotowym, aby wydrukowany wspornik nie pękł ani nie odkształcił się, aby zapewnić prawidłowe przewodzenie ciepła od Peltiera do miedzi.
6. Umieść miedzianą płytkę w wydrukowanej w 3D podstawie izolacyjnej w celu izolacji termicznej od blatu stołowego lub podstawy mikroskopu podczas pracy (Rysunek 6D).
7. Etap chłodzenia jest zmontowany i gotowy do użycia (Rysunek 6E).
8. W przypadku mikroskopii umieść ukończony etap chłodzenia na pionowej platformie mikroskopu (Rysunek 7A).
9. Montaż stopnia chłodzenia został zakończony. Więcej szczegółów można znaleźć w publikacji towarzyszącej Laboratorium Chung, która w pełni opisuje szczegółowe strategie i ruchy zwierząt²⁰.

UWAGA: W poniższych sekcjach omówiono protokoły powolnego, szybkiego i nagłego chłodzenia. Hermafrodyty N2 w wieku L4 lub młodej osoby dorosłej wykorzystano do uzyskania następujących danych. Strategia powolnego schładzania jest przydatna do unieruchamiania zwierząt hodowanych w temperaturze 20 °C w temperaturze 6 °C; Zwierzęta N2 hodowane w temperaturze 15 °C są najsilniej unieruchomione w temperaturze 1 °C²⁰. Krótkie porównanie tych trzech protokołów chłodzenia przedstawiono w tabeli 1.

7. Protokół unieruchomienia powolnego chłodzenia

1. Przenieś talerz uprawowy z pokrywką do lodówki o temperaturze 4 °C.
2. Po przeniesieniu płyty uprawowej do lodówki włącz zasilanie 12 V stopnia chłodzenia i ustaw napięcie przestrajalnego zasilacza na 5,5 V.
3. Po tym, jak płyta uprawowa z pokrywką pozostanie w lodówce o temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, natychmiast przenieś płytkę do etapu chłodzenia i zdejmij pokrywkę (Rysunek 7A). Takie talerze uprawowe mają zwykle temperaturę około 6 °C. Wstępnie schłodzony etap jest stabilny i wystarczająco zimny, aby utrzymać powierzchnię agaru w temperaturze 6 °C.
4. Jeśli temperatura powierzchni agaru zmieni się, mierzona lub odnotowywana przez zauważenie ruchu zwierzęcia, należy nieznacznie wyregulować napięcie, aż ustabilizuje się na poziomie 6 °C.
5. Zwierzęta są odpowiednio unieruchomione w momencie transferu.

8. Protokół unieruchomienia szybkiego chłodzenia

UWAGA: Strategia szybkiego chłodzenia jest najbardziej podstawową metodą unieruchamiania (zobacz Film 1); jednak płytki agarowe bezczynnie zajmują scenę przez dłuższy czas, osiągając_zestaw T. Ponadto, gdy potrzebne jest silne unieruchomienie, a_ustawienie T wynosi 6 °C, czas bezczynności wydłuża się do około 1 h²⁰.

1. Włącz chłodzenie stage zasilanie 12 V i ustaw napięcie przestrajalnego zasilacza na około 12 V. Odczekaj 10 minut.
2. Przenieś płytę uprawową z inkubatora bezpośrednio do etapu chłodzenia i zdejmij pokrywę.
3. Gdy temperatura powierzchni agaru spadnie do (_{T set} + ΔT) °C, ustaw przestrajalne zasilanie na_ustawienie V i poczekaj, aż agar osiągnie_ustawienie T._Zestaw V to odpowiednie napięcie do ustabilizowania agaru w_ustawieniu T. ΔT jest zmienną, która zapobiega przechłodzeniu. Patrz tabela 2, aby zapoznać się z kombinacją_zestawu T, ΔT_{i zestawu V}.
   UWAGA: Dane przedstawione w Tabeli 2 odnoszą się konkretnie do Laboratorium Chung, dlatego należy zauważyć, że parametry eksperymentalne mogą się różnić w zależności od unikalnych warunków środowiskowych i użytkowych każdego indywidualnego eksperymentu.
4. Zwierzęta są unieruchomione, gdy agar osiągnie_zestaw T. Unieruchomienie poprawia się z czasem, aż do ~50 min po rozpoczęciu chłodzenia.

9. Protokół nagłego unieruchomienia chłodzenia

UWAGA: Strategia nagłego schładzania pochłania najwięcej czasu użytkownika, ale najszybciej unieruchamia zwierzęta od temperatury ich uprawy.

1. Włącz chłodzenie stage zasilanie 12 V i zmniejsz napięcie przestrajalnego zasilacza do około 12 V. Trzymaj przez 10 minut.
2. Przynieś wolną płytkę agarową do etapu chłodzenia. Wykonaj krok 8.3 w protokole immobilizacji szybkiego chłodzenia, aby ustabilizować temperaturę powierzchni agaru przy_ustawieniu T.
3. Przenieś zwierzęta z ich pierwotnej płyty uprawowej na schłodzoną płytę znajdującą się na stoliku chłodzącym.
4. W zależności od wielkości małego zwierzęcia oczekuje się, że zwierzęta ostygną do_stanu T w ciągu kilku sekund i zostaną unieruchomione. Unieruchomienie poprawia się z czasem, aż do ~50 min po rozpoczęciu chłodzenia.

10. Ożywienie zwierząt po unieruchomieniu chłodzącym

1. Przenieść schłodzoną płytkę hodowlaną z powrotem do oryginalnego inkubatora lub do temperatury pokojowej.
2. Odczekaj od 20 minut do 1 godziny, aż wszystkie robaki na talerzu powrócą do normalnego pełzania i żerowania.

Wyniki

Pomiar temperatury chłodzenia
W przypadku wstępnych eksperymentów z unieruchomieniem poprzez chłodzenie ważne jest monitorowanie temperatury powierzchni agaru, aby upewnić się, że zwierzęta zostały prawidłowo unieruchomione. W przyszłych eksperymentach powielających ten protokół można stosować te same parametry, zazwyczaj bez konieczności częstego monitorowania temperatury. W celu pomiaru temperatury końcówkę termometru z termoparą sterylizuje się za pomocą 70% roztworu etanolu, odczekując do całkowitego odparowania etanolu przed użyciem. Następnie końcówkę termopary wprowadza się na 1 mm do agaru NGM, aby zapewnić dokładny odczyt temperatury. Końcówkę termometru utrzymuje się za pomocą uchwytu zaciskowego lub innych stabilizatorów (Rysunek 7B).

Pomiar temperatury za pomocą kamery podczerwieni
Stopień chłodzący został zaprojektowany tak, aby zapewnić jednorodność rozkładu temperatury w centralnym obszarze płytki o średnicy 40 mm. Do obrazowania rozkładu temperatury na powierzchni agaru wykorzystuje się kamerę podczerwieni FLIR. Maksymalna różnica temperatur wynosi około 1 °C przy T_set wynoszącej 1, 3 lub 6 °C (Rysunek 8A).

Ocena szybkości chłodzenia przy zastosowaniu strategii szybkiego chłodzenia
Strategia szybkiego chłodzenia jest wykorzystywana do charakterystyki szybkości chłodzenia platformy przy napięciu 12 V. Na platformie chłodzącej umieszcza się płytkę o temperaturze 20 °C, a do monitorowania temperatury powierzchni wykorzystuje się termometr z termoparą. Platforma chłodzi płytki z 20 °C do 6 °C w czasie 6 min, do 1 °C w 10 min, a ostatecznie stabilizuje temperaturę poniżej -7 °C w ciągu około 40 min (Rycina 8B).

Stosowanie stolika chłodzącego na platformie mikroskopu pionowego
Mikroskop pionowy składa się zazwyczaj z obiektywu do obrazowania, stolika do utrzymywania próbki oraz układu oświetlenia. Ten stolik chłodzący został zaprojektowany do użytku na typowym stoliku mikroskopu pionowego z możliwością łatwego wkładania i wyjmowania (Rysunek 8C). Gdy do obrazowania lub przesiewania wymagana jest immobilizacja poprzez chłodzenie, stolik chłodzący należy po prostu umieścić na stoliku mikroskopu, aby zakończyć instalację, i analogicznie w przypadku jego usuwania.

Unieruchomienie nicieni na płytce chłodzącej pokazano w Filmie 1.

Rysunek 1: Model 3D aparatury stopnia chłodzącego. Dla przejrzystości nie przedstawiono połączeń elektronicznych. Zbiornik pompuje wodę przez blok chłodzący w celu odprowadzenia ciepła przekazanego przez element Peltiera wbudowany w stopień. Typowa 60 mm polistyrenowa płytka hodowlana może być umieszczona na przezroczystym szafirowym oknie i chłodzona przez stopień. Model wygenerowany w programie Solidworks. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Modele 3D komponentów do wykonania. (A) Płyta miedziana. (B) Wydrukowany w technologii 3D uchwyt mocujący. (C) Wydrukowana w technologii 3D płyta izolacyjna. Modele wygenerowane w programie Solidworks. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zestaw chłodzenia wodnego. (A) Poszczególne komponenty. Rurki przycięte do określonych długości. (B) Połączone komponenty chłodzenia wodnego. (C) Przewody łączące zbiornik pompy i chłodnicę z zasilaczem 12 V. Zazwyczaj czerwone przewody łączą się z biegunem dodatnim, a czarne z biegunem ujemnym. (D) Oczyszczona woda wlana do pompy. (E) Zbiornik wypełniony w ponad dwóch trzecich dla optymalnej wydajności pompy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Podłączenie elementu Peltiera i zestawu chłodzenia wodnego. (A) Komponenty do obsługi elementu Peltiera. (B) Wykorzystanie regulowanego zasilacza do określenia strony gorącej i zimnej elementu Peltiera. Ze względów bezpieczeństwa stosuje się napięcie nieprzekraczające 2 V. (C) Równomierne nałożenie pasty termoprzewodzącej na powierzchnię miedzianego bloku. (D) Równomierne nałożenie pasty termoprzewodzącej na gorącą powierzchnię elementu Peltiera. (E) Strona gorąca elementu Peltiera dociśnięta do miedzianego bloku z pastą termoprzewodzącą. (F) Termometr na podczerwień użyty do pomiaru temperatury zimnej powierzchni elementu Peltiera. W idealnych warunkach temperatura zimnej strony może osiągnąć wartość bliską -35 °C. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 5: Montaż płyty miedzianej i okna szafirowego. (A) Wymagane komponenty. (B) Pasta termiczna nałożona na trzy wewnętrzne powierzchnie płyty miedzianej, z którymi będzie stykać się okno szafirowe. Dwa widoki płyty miedzianej z góry, pokazujące położenie trzech powierzchni. (C) Okno szafirowe w otworze płyty miedzianej. (D) Taśma nałożona na górną powierzchnię zestawu. (E) Strona górna: Niebieskie przerywane linie wskazują miejsca wycięcia i usunięcia taśmy: kwadratowe wgłębienie, dwa otwory oraz obszar szafirowy o średnicy 70 mm. (F) Strona dolna: Taśma jest wycinana i usuwana zgodnie z rysunkiem. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 6: Końcowy montaż elementu chłodzącego. (A) Pasta termoprzewodząca nałożona na wgłębienie miedzianej płytki. (B) Pasta termoprzewodząca nałożona na zimną stronę ogniwa Peltiera. (C) Zimna powierzchnia ogniwa Peltiera połączona z wgłębieniem. (D) Miedziany blok chłodzący przymocowany do miedzianej płytki za pomocą śrub. Element chłodzący w podstawie izolacyjnej. (E) Gotowy element chłodzący. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 7: Stoły chłodzący na mikroskopie i pomiar termoparą. (A) Stół chłodzący umieszczony na podstawie mikroskopu do obrazowania. Szafirowe okno jest przezroczyste, co umożliwia prześwietlenie. (B) Termometr termoparowy używany do pomiaru temperatury powierzchni agaru NGM. Końcówka wprowadzona na około 1 mm w agar NGM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Charakterystyka i zastosowanie stolika chłodzącego. (A) Obrazy termiczne przedstawiające powierzchnię agaru schłodzoną do 1, 3 i 6 °C. Równomierny rozkład temperatury w centralnym obszarze o średnicy 40 mm (białe przerywane koło). (B) Temperatura powierzchni agaru NGM w czasie na stoliku chłodzącym przy 12 V. Powierzchnię agaru NGM można schłodzić poniżej -7 °C. Temperaturę zmierzono metodą przedstawioną na Rysunku 7B. (C) Stolik chłodzący w użyciu na typowym mikroskopie odwróconym. Stolik chłodzący można łatwo zainstalować lub zdemontować. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

	powolne chłodzenie	szybkie chłodzenie	gwałtowne chłodzenie
obłożenie etapu	minimum	długi	pożywka
czas do unieruchomienia zwierząt	długi	podłoże	bardzo krótki
wytrzymałość unieruchomienia	strong	pożywka	pożywka
wysiłek użytkownika	minimum	nieznacznie więcej niż minimum	maksymalny

Tabela 1: Porównanie strategii chłodzenia.

Tzestaw (°C)	ΔT (°C)	Vzestaw (V)
1	2	8
2	3	7.4
3	4.5	7
4	5.5	6.5
5	6	5.9
6	6	5.5

Tabela 2: Parametry służące do uzyskania pożądanej temperatury w strategii szybkiego chłodzenia.

Plik uzupełniający 1: Płyta miedziana w systemie metrycznym. Rysunek 2D do obróbki płyty miedzianej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Uchwyt mocujący. Rysunek 3D uchwytu mocującego, który można otwierać lub modyfikować w programie Solidworks i eksportować do oprogramowania do druku 3D. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Płyta izolacyjna. Rysunek 3D płyty izolacyjnej, który można otwierać lub modyfikować w programie Solidworks i eksportować do oprogramowania do druku 3D. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Film 1: Film przedstawiający chłodzenie. Unieruchomienie nicieni na płytce agarowej NGM w 2 °CPłytkę schłodzono z temperatury pokojowej do 2 °Ci przebywał w 2 °C przez kilka minut. Następnie wyłączono etap chłodzenia, a płytki zaczęły naturalnie ogrzewać się do temperatury pokojowej. Nagranie wideo zostało przyspieszone dziesięciokrotnie, aby skompresować godzinowy materiał do 6 minut. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Tabela uzupełniająca 1: Szacunkowe koszty Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Etap chłodzenia, produkcja, montaż i użytkowanie są pokazane w tym manuskrypcie. Większość komponentów to produkty z półki, które można kupić online. Niektóre elementy, takie jak miedziana płyta i szafirowe okienko, wymagają niestandardowego zamówienia, a ich wyprodukowanie może zająć do 1 miesiąca. Inne komponenty, które można wydrukować w 3D, można łatwo wyprodukować w większości instytucji badawczych (tabela uzupełniająca 1). Proces montażu wymaga tylko kilku narzędzi i może być szybko wykonany przez laika w ciągu kilku godzin. Stąd wiekszosc laboratoriów biologicznych powinna byc w stanie z latwo zaimplementowac to urządzenie.

Faza chłodzenia i podejście do unieruchomienia chłodzenia mają kilka istotnych ulepszeń w stosunku do istniejących metod unieruchomienia, starannie szczegółowo opisanych w oryginalnej publikacji²⁰. Krótko mówiąc, etap chłodzenia umożliwia silne unieruchomienie dużych populacji C. elegans w każdym wieku, w tym zarodków i dauerów, na ich typowych płytkach hodowlanych w standardowych przepływach pracy mikroskopowej. Eliminuje to potrzebę stosowania skomplikowanych konfiguracji sprzętowych, takich jak mikrofluidyka, zapewniając jednocześnie silniejszy efekt unieruchomienia. Dodatkowo minimalizuje możliwe narażenie zwierząt i badaczy na toksyczne chemikalia, ponieważ nie stosuje się żadnych chemikaliów, zapewniając jednocześnie podobny efekt unieruchomienia. Te możliwości techniczne umożliwiają szerokie zastosowanie tego urządzenia i podejście do wielu eksperymentów, które wymagają mikroskopii in vivo o wysokiej rozdzielczości na dużej liczbie zwierząt.

Podczas budowy urządzenia należy wykonać kilka krytycznych kroków, w tym nałożenie pasty termicznej i szeroką taśmę do przymocowania szafirowego okienka do miedzianej płyty. Pasta termiczna zapewnia wysoką przewodność cieplną poprzez zastąpienie szczelin materiałem o niskim oporze cieplnym. Aby osiągnąć pożądaną wydajność chłodzenia, pasta musi być odpowiednio wprowadzona między wszystkie przylegające/stykające się powierzchnie, w tym zimną powierzchnię Peltiera do miedzianej płytki, gorącą powierzchnię Peltiera do miedzianego bloku chłodzącego i miedzianą płytkę do szafirowego okienka. Szeroka taśma nałożona na scenę izoluje miedzianą płytę, aby zapobiec nagrzewaniu się powietrza i kondensacji, co prowadzi do rdzy. Wzmacnia również połączenie między szafirowym oknem a miedzianą płytą. Dlatego zarówno nakładanie pasty termicznej, jak i szeroka taśma wymagają szczególnej ostrożności.

W rzeczywistym eksperymencie z unieruchomieniem chłodzenia parametry podane w tym manuskrypcie, takie jak napięcia i czasy, zależą od specyficznych właściwości płytek uprawowych i etapu, takich jak ilość agaru w płytkach, wydajność etapu oraz temperatura i wilgotność otoczenia. W przyszłych modyfikacjach można zainstalować regulator sprzężenia zwrotnego, taki jak pochodna proporcjonalno-całkująca (PID), aby aktywnie dostosować napięcie wejściowe do etapu chłodzenia w celu osiągnięcia żądanej temperatury i ustabilizowania jej.

Istnieje kilka ograniczeń tego unieruchomienia w fazie chłodzenia, dokładnie szczegółowo opisanych w oryginalnej publikacji²⁰. Krótko mówiąc, zwierzęta hodowane w różnych temperaturach są unieruchomione w różnym stopniu, co może wymagać dodatkowego dostrojenia. Ponadto ten obecny stopień chłodzenia nie jest przeznaczony dla mikroskopu odwróconego. Co więcej, obrazowanie lub przesiewanie bezpośrednio na płytce uprawowej może spowodować zanieczyszczenie płytki.

Projektujemy nowe wersje stopnia chłodzącego, odpowiednie dla różnych platform obrazowania, w tym złożonych mikroskopów pionowych i mikroskopów odwróconych. Te nowe konstrukcje umożliwią bezpośrednie unieruchomienie chłodzenia zwierząt na płytkach hodowlanych podczas obrazowania na tych platformach. Obrazowanie na tych stopniach chłodzenia będzie wykorzystywać obiektywy zanurzające w powietrzu na duże odległości robocze, podobnie jak w konfiguracji pionowej. Obecnie obiektywy zanurzeniowe mogą mieć aperturę numeryczną do 0,9, co zapewnia rozdzielczość około 300 nm do obrazowania białek zielonej fluorescencji. W ten sposób połączenie nowego stopnia chłodzenia z mikroskopem może umożliwić rutynowe obrazowanie fluorescencyjne w rozdzielczości submikronowej.

Podajemy również kilka pomocnych wskazówek dotyczących korzystania ze stopnia chłodzenia zgodnie z naszym doświadczeniem. Na przykład osoby powinny sprawdzić, czy wewnątrz zespołu chłodzącego wodę nie ma pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza degradują chłodzenie do gorącej powierzchni Peltiera, a tym samym pogarszają skuteczność chłodzenia etapu chłodzenia. W przypadku obecności pęcherzyków powietrza należy włączyć zasilanie 12 V, aby woda mogła płynąć i wstrząsnąć wszystkimi elementami przepływu wody. Pęcherzyki powietrza mogą być wypłukiwane z uwięzionych obszarów i odprowadzane przez zbiornik pompy. Naukowcy powinni upewnić się, że rurka przepływu wody nie jest wygięta ani skrzyżowana podczas montażu zespołu chłodzenia wodą. Wygięcie lub skrzyżowanie rur może uniemożliwić odpowiedni przepływ wody i zmniejszyć skuteczność chłodzenia. Połączenia rurowe powinny być odpowiednio dopasowane i szczelne. W razie potrzeby można zamiast tego użyć miękkiej rurki o innej średnicy, aby zapewnić szczelność. Nie należy nakładać pasty, nawet jeśli połączenie nie jest wystarczająco szczelne, ponieważ pasta może spowodować zatkanie podczas przyszłego użytkowania. Wilgotność w pomieszczeniu wpływa na wydajność chłodzenia i wprowadza kondensację i lód na etapie chłodzenia. Przed umieszczeniem płyty uprawowej na etapie chłodzenia zaleca się użycie chusteczki papierowej do usunięcia kondensatu lub użycie radiatora do szybkiego usunięcia lodu, który utworzył się na szafirowym okienku. Zbiornik pompy i wentylatory chłodnicy mogą powodować niewielkie wibracje w mikroskopie, jeśli pracują na tym samym stole. Drgania mikroskopu rozmywają uzyskany obraz i dlatego należy ich unikać. Poduszka może służyć do mechanicznego ocieplenia zbiornika i chłodnicy lub można je położyć na osobnym pobliskim stole. Etap chłodzenia może stać się etapem ogrzewania poprzez odwrócenie połączenia elektrycznego z ogniwem Peltiera.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zasilanie 12-V	ANYTITI	ledpower00	wyjście DC 12V +/- 0,5V, 5A moc 60W
8-32 śruba	dowolna		do
wspornika	N/A	N/A	wydrukowana w 3D przy użyciu filamentu PLA 1,75 mm. Zobacz uzupełnienie dla modelu 3D.
płytka stykowa	DEYUE	7545924028	400-pinowy zestaw płytek bez do samodzielnego podłączania elektrycznego
miedziany blok chłodzący	Kalolary	Kalolary-Radiator001	40 * 40 mm < br / > wewnętrzna grubość żeber 0,5 mm
dowolna	płyta miedziana	nie dotyczy	Wykonane z blachy miedzianej 170x120x3 mm 99,9%.   Zobacz dodatkowe rysunki 2D do produkcji.
cyfrowy termometr termoparowy	Proster	4333090752	dwukanałowy termometr z dwiema sondami termopary typu K zakres pomiarowy -50-300° Dokładność C ± 1,5% rozdzielczość 0,1 i stopnie; C /° F < 1000&stopni;
podstawa izolacyjna	N/A	N/A	wydrukowana w 3D przy użyciu filamentu PLA 1,75 mm. Zobacz uzupełnienie dla modelu 3D.
przewody połączeniowe	dowolne		do podłączenia elektronicznego
wielostopniowe urządzenie chłodzące termoelektryczne peltiera	DigiKey	TEC1-12706	rozmiar 40*40*7,05 mm Umax 16,1 V  Imax 8.5 A & Delta; Tmax @ Th 85° C @ 27° C Qmax @ Th 51,6W @ 27° Odporność na C 1,65 Ω
Rurka silikonowa utwardzana platyną Nalgene 50	ThermoScientific	14-176-332E	ultramiękka rurka twardość twardości Shore A, średnica wewnętrzna 50 średnica zewnętrzna 1/4 cala średnica zewnętrzna 9,5 mm
taśma pakowa	o		szerokości 4 cali do zakrycia zbiornika pompy z blachą miedzianą
	Yosoo	SC-300T moc	wejściowa DC 12V natężenie przepływu 300L/h max
grzejnik	DIYhzWater	10463	12-rurowy aluminiowy wymiennik ciepła rząd odpływu wody chłodzącej z dwoma wentylatorami 120 mm
szafirowe okno	Altos Photonics, Inc.	Nie dotyczy	Altos kontaktowy na zamówienie rozmiar i Oslash; 80mm, grubość 3 mm jakość powierzchni 60-40s/d niepowlekana
pasta termiczna	Corsair	XTM50	zmniejsza impedancję termiczną między powierzchniami przewodność cieplna 5,0 W/mK
przestrajalny zasilacz	Kungber	DY-SPS3010B	zakres napięcia 0 – Zakres prądu 30V 0 – Zasilacz liniowy 10A z 4-cyfrowymi zgrubną i precyzyjną regulacją z przewodami krokodylkowymi

mocującego