Method Article

Kwantyfikacja selektywności cech wzrokowych odruchu optokinetycznego u myszy

DOI:

10.3791/65281

⸱

June 23rd, 2023

 , 
1Department of Biology, University of Toronto Mississauga, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy standardowy protokół do ilościowego określania odruchu optokinetycznego. Łączy w sobie wirtualną stymulację bębna i wideookulografię, a tym samym umożliwia precyzyjną ocenę selektywności cech zachowania i jego plastyczności adaptacyjnej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odruch optokinetyczny (OKR) jest niezbędnym wrodzonym ruchem gałek ocznych, który jest wywoływany przez globalny ruch środowiska wzrokowego i służy do stabilizacji obrazów siatkówki. Ze względu na swoje znaczenie i solidność, OKR został wykorzystany do badania uczenia się wzrokowo-motorycznego oraz do oceny funkcji wzrokowych myszy o różnym pochodzeniu genetycznym, wieku i leczeniu farmakologicznym. W tym miejscu przedstawiamy procedurę oceny reakcji OKR myszy z głową z dużą dokładnością. Fiksacja głowy może wykluczyć wpływ stymulacji przedsionkowej na ruchy gałek ocznych, umożliwiając pomiar ruchów gałek ocznych wywołanych tylko ruchem wzrokowym. OKR jest wywoływany przez wirtualny system bębnowy, w którym pionowa siatka prezentowana na trzech monitorach komputerowych dryfuje poziomo w sposób oscylacyjny lub jednokierunkowy ze stałą prędkością. Dzięki temu systemowi rzeczywistości wirtualnej możemy systematycznie zmieniać parametry wizualne, takie jak częstotliwość przestrzenna, częstotliwość czasowa/oscylacyjna, kontrast, luminancja i kierunek siatek, a także określać ilościowo krzywe strojenia selektywności cech wizualnych. Szybka wideookulografia w podczerwieni zapewnia dokładny pomiar trajektorii ruchów gałek ocznych. Oczy poszczególnych myszy są kalibrowane, aby zapewnić możliwość porównania OKR-ów między zwierzętami w różnym wieku, różnej płci i o różnym pochodzeniu genetycznym. Ilościowa moc tej techniki pozwala na wykrycie zmian w OKR, gdy zachowanie to plastycznie dostosowuje się do starzenia się, doświadczeń sensorycznych lub uczenia się motorycznego; Tym samym sprawia to, że technika ta jest cennym dodatkiem do repertuaru narzędzi używanych do badania plastyczności zachowań oczu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W odpowiedzi na bodźce wizualne w otoczeniu, nasze oczy poruszają się, aby zmienić nasze spojrzenie, ustabilizować obrazy siatkówki, śledzić poruszające się cele lub wyrównać dołki dwojga oczu z celami znajdującymi się w różnych odległościach od obserwatora, co jest niezbędne do prawidłowego widzenia1,2. Zachowania okoruchowe są szeroko stosowane jako atrakcyjne modele integracji sensomotorycznej w celu zrozumienia obwodów neuronalnych w zdrowiu i chorobie, przynajmniej częściowo ze względu na prostotę układu okoruchowego3. Kontrolowane przez trzy pary mięśni zewnątrzgałkowych, oko obraca się w zębodole głównie wokół trzech odpowiadających sobie osi: uniesienia i obniżenia wzdłuż osi poprzecznej, przywodzenia i odwodzenia wzdłuż osi pionowej oraz skręcania i wygięcia wzdłuż osi przednio-tylnej1,2. Tak prosty system pozwala naukowcom łatwo i dokładnie ocenić zachowania okoruchowe myszy w środowisku laboratoryjnym.

Jednym z głównych zachowań okulomotorycznych jest odruch optokinetyczny (OKR). Ten mimowolny ruch gałek ocznych jest wywoływany przez powolne dryfowanie lub prześlizgiwanie się obrazów na siatkówce i służy do stabilizacji obrazów siatkówki, gdy porusza się głowa zwierzęcia lub jego otoczenie2,4. OKR, jako paradygmat behawioralny, jest interesujący dla badaczy z kilku powodów. Po pierwsze, może być niezawodnie stymulowany i dokładnie określany ilościowo5,6. Po drugie, procedury kwantyfikacji tego zachowania są stosunkowo proste i ustandaryzowane i mogą być stosowane do oceny funkcji wizualnych dużej kohorty zwierząt7. Po trzecie, to wrodzone zachowanie jest bardzo plastyczne5,8,9. Jego amplituda może być wzmocniona, gdy powtarzające się poślizgi siatkówki występują przez długi czas5,8,9, lub gdy jego partner działający przedsionkowy odruch oczny (VOR), inny mechanizm stabilizacji obrazów siatkówki wyzwalany przez wejście przedsionkowe2, jest upośledzony5. Te eksperymentalne paradygmaty wzmacniania OKR umożliwiają naukowcom odkrycie podstaw obwodu leżącego u podstaw uczenia się okulomotorycznego.

Dwie nieinwazyjne metody były głównie używane do oceny OKR w poprzednich badaniach: (1) wideo-okulografia połączona z fizycznym bębnem7,10,11,12,13 lub (2) arbitralne określenie skrętów głowy w połączeniu z wirtualnym bębnem6,14,15,16. Chociaż ich zastosowania przyniosły owocne odkrycia w zrozumieniu molekularnych i obwodowych mechanizmów plastyczności okulomotorycznej, każda z tych dwóch metod ma pewne wady, które ograniczają ich możliwości w ilościowym badaniu właściwości OKR. Po pierwsze, fizyczne bębny, z nadrukowanymi wzorami czarno-białych pasków lub kropek, nie pozwalają na łatwą i szybką zmianę wzorców wizualnych, co w dużej mierze ogranicza pomiar zależności OKR od niektórych cech wizualnych, takich jak częstotliwość przestrzenna, kierunek i kontrast ruchomych siatek8,17. Zamiast tego testy selektywności OKR w stosunku do tych cech wizualnych mogą skorzystać ze skomputeryzowanej stymulacji wizualnej, w której cechy wizualne mogą być wygodnie modyfikowane z próby na próbę. W ten sposób badacze mogą systematycznie badać zachowanie OKR-ów w wielowymiarowej przestrzeni parametrów wizualnych. Co więcej, druga metoda testu OKR podaje tylko progi parametrów wizualnych, które wyzwalają dostrzegalne OKR-y, ale nie amplitudy ruchów oczu lub głowy6, 14,15,16. Brak mocy ilościowej uniemożliwia więc analizę kształtu krzywych strojenia i preferowanych cech wizualnych, czy wykrycie subtelnych różnic między poszczególnymi myszami w warunkach normalnych i patologicznych. Aby przezwyciężyć powyższe ograniczenia, wideo-okulografia i skomputeryzowana wirtualna stymulacja wizualna zostały połączone w celu zbadania zachowania OKR w ostatnich badaniach5,17,18,19,20. Jednak te wcześniej opublikowane badania nie dostarczyły wystarczających szczegółów technicznych ani instrukcji krok po kroku, w związku z czym naukowcom nadal trudno jest ustalić taki test OKR dla własnych badań.

Tutaj prezentujemy protokół do precyzyjnego ilościowego określenia selektywności cech wizualnych zachowania OKR w warunkach fotopowych lub skotopowych za pomocą kombinacji wideo-okulusografii i skomputeryzowanej wirtualnej stymulacji wizualnej. Myszy są unieruchomione na głowie, aby uniknąć ruchu gałek ocznych wywołanego stymulacją przedsionkową. Szybka kamera służy do rejestrowania ruchów gałek ocznych myszy oglądających ruchome siatki o zmieniających się parametrach wizualnych. Fizyczny rozmiar gałek ocznych poszczególnych myszy jest kalibrowany w celu zapewnienia dokładności wyznaczania kąta ruchów gałek ocznych21. Ta metoda ilościowa pozwala na porównywanie zachowań OKR między zwierzętami w różnym wieku lub o różnym pochodzeniu genetycznym lub monitorowanie jego zmiany spowodowanej leczeniem farmakologicznym lub uczeniem wzrokowo-motorycznym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Lokalny Komitet Opieki nad Zwierzętami Nauk Biologicznych, zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Toronto i Kanadyjską Radę Opieki nad Zwierzętami.

1. Implantacja pręta na głowę na szczycie czaszki

UWAGA: Aby uniknąć wpływu zachowania VOR na ruchy gałek ocznych, głowa myszy jest unieruchomiona podczas testu OKR. Dlatego pręt na głowę jest chirurgicznie wszczepiany na szczycie czaszki.

  1. Znieczulić mysz (2-5-miesięczną samicę i samca C57BL/6) mieszaniną 4% izofluranu (v/v) iO2 w komorze gazowej. Przenieś mysz na dostosowaną platformę chirurgiczną i zmniejsz stężenie izofluranu do 1,5%-2%. Monitoruj głębokość znieczulenia, sprawdzając reakcję na ściśnięcie palca u nogi i częstość oddechów podczas operacji.
  2. Umieść poduszkę grzewczą pod ciałem zwierzęcia, aby utrzymać jego temperaturę ciała. Nałóż warstwę nawilżającej maści na oczy na oba oczy, aby chronić je przed wysuszeniem. Przykryj oczy folią aluminiową, aby chronić je przed światłem.
  3. Podskórnie wstrzyknąć karprofen w dawce 20 mg/kg mc. w celu zmniejszenia bólu. Po zwilżeniu sierści środkiem do czyszczenia skóry z glukonianem chlorheksydyny, ogol futro na czubku czaszki. Dwukrotnie zdezynfekuj odsłoniętą skórę głowy 70% alkoholem izopropylowym i alkoholem chlorheksydyny.
  4. Wstrzyknąć bupiwakainę (8 mg/kg) podskórnie w miejsce nacięcia, a następnie usunąć skórę głowy (~1 cm2) nożyczkami, aby odsłonić grzbietową powierzchnię czaszki, w tym tylną kość czołową, kość ciemieniową i kość międzyciemieniową.
  5. Nałóż kilka kropli 1% lidokainy i 1:100 000 epinefryny na odsłoniętą czaszkę, aby zmniejszyć miejscowy ból i krwawienie. Zeskrobać czaszkę łyżeczką Meyhoefera, aby usunąć powięź i oczyścić ją solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
    UWAGA: Mięsień skroniowy jest oddzielony od czaszki, aby zwiększyć powierzchnię do przyczepienia pręta na głowę.
  6. Osusz czaszkę, delikatnie wdmuchując sprężone powietrze w kierunku powierzchni czaszki, aż wilgoć zniknie, a kość zmieni kolor na białawy. Nałóż cienką warstwę superglue na odsłoniętą powierzchnię czaszki, w tym na krawędź odciętej skóry głowy, a następnie warstwę żywicy akrylowej.
    UWAGA: Powierzchnia czaszki musi być wolna od krwi lub wody przed nałożeniem superglue.
  7. Umieść pręt na głowę ze stali nierdzewnej (patrz Rysunek 1A) wzdłuż linii środkowej na szczycie czaszki. Nałóż więcej żywicy akrylowej, zaczynając od krawędzi głowicy, aż podstawa głowicy zostanie całkowicie osadzona w żywicy akrylowej. Nałóż żywicę akrylową dwa lub trzy razy, aby zwiększyć grubość.
  8. Odczekaj około 15 minut, aż żywica akrylowa stwardnieje. Wstrzyknąć podskórnie 1 ml roztworu Ringera z mleczanami. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce umieszczonej na poduszce grzewczej, aż zwierzę będzie w pełni mobilne.
  9. Pozwól myszy dojść do siebie w klatce domowej przez co najmniej 5 dni po zabiegu. Gdy zwierzę jest w dobrej formie, przymocuj jego głowę do paska na głowę w konfiguracji OKR na 15-30 minut, aby zapoznać je z mocowaniem głowy i środowiskiem eksperymentalnym. Powtarzaj zaznajamianie raz dziennie przez co najmniej 3 dni.

2. Konfiguracja wirtualnego bębna i wideo-okulografii

  1. Zamontuj trzy monitory prostopadle do siebie, aby utworzyć kwadratową obudowę, która obejmuje ~270° azymutu i 63° wysokości w przestrzeni wizualnej (Rysunek 1B po lewej).
  2. Za pomocą oddzielnej karty graficznej połącz trzy monitory w prosty wyświetlacz, aby zapewnić synchronizację między wszystkimi monitorami.
  3. Skalibruj luminancję monitorów zgodnie z poniższym opisem.
    1. Włącz komputer, do którego podłączone są monitory i odczekaj 15 minut. Rozgrzewka jest niezbędna, aby uzyskać stabilną luminancję.
    2. Systematycznie zmieniaj ustawienie jasności na monitorze od 0 do 100 w krokach co 25.
    3. Dla każdej wartości jasności zmierz luminancję monitorów przy różnych wartościach pikseli (0-255, co 15) za pomocą miernika luminancji.
    4. Dopasuj zależność między luminancją a jasnością dla wartości piksela 255 za pomocą regresji liniowej i oszacuj wartość jasności, która daje 160 cd/m2.
    5. Dla każdej wartości piksela wykorzystanej w pomiarze luminancji (etap 2.3.3) należy oszacować luminancję dla wartości jasności wyznaczonej w kroku 2.3.4 w oparciu o regresję liniową. Użyj funkcji potęgowej lum = A * piksel γ, aby dopasować relację między nowym zestawem wartości luminancji (poniżej wartości jasności wyznaczonej w 2.3.4) a odpowiadającymi im wartościami pikseli, aby wyprowadzić współczynnik gamma γ i współczynnik A. Zostaną one wykorzystane do wygenerowania siatek sinusoidalnych o pożądanych wartościach luminancji.
    6. Ustaw jasność wszystkich trzech monitorów na wartości wyznaczone w kroku 2.3.4, aby upewnić się, że ich wartości luminancji są takie same dla tej samej wartości piksela.
  4. Wygeneruj wirtualny bęben, który służy do stymulowania zachowań OKR, za pomocą zestawu narzędzi do stymulacji wizualnej, jak opisano poniżej.
    1. Przedstawić pionową siatkę sinusoidalną na monitorach i wyregulować okres (odstępy między paskami) wzdłuż azymutu, aby zapewnić, że rzut siatki na oko ma stałą częstotliwość przestrzenną (krata bębnowa; Rysunek 1B w środku i po prawej).
    2. Upewnij się, że głowa zwierzęcia jest zamocowana na środku pomieszczenia w taki sposób, aby widziało, że krata ma stałą częstotliwość przestrzenną na powierzchni wirtualnego bębna.
    3. Zmodyfikuj parametry ruchomej siatki, takie jak amplituda oscylacji, częstotliwość przestrzenna, częstotliwość czasowa/oscylacyjna, kierunek, kontrast itp., w kodach stymulacji wizualnej. Użyj dwóch rodzajów ruchu wizualnego: (1) siatka dryfuje zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara w sposób oscylacyjny zgodnie z funkcją sinusoidalną:
      figure-protocol-1
      Tutaj Amp to amplituda trajektorii bębna, f to częstotliwość oscylacji, a t to czas (amplituda oscylacji: 5°; częstotliwość przestrzenna siatki: 0,04-0,45 cpd; częstotliwość oscylacji: 0,1-0,8 Hz, co odpowiada szczytowej prędkości bodźca 3,14-25,12 °/s [prędkość bębna = Amp x 2π x f x cos (2π x f x t); kontrast: 80%-100%; średnia luminancja: 35-45 cd/m2; (2) Siatka dryfuje jednokierunkowo ze stałą prędkością:
      figure-protocol-2
      (Częstotliwość przestrzenna: 0,04-0,64 cpd; częstotliwość czasowa: 0,25-1 Hz; prędkość bębna = częstotliwość czasowa/częstotliwość przestrzenna.)
  5. Skonfiguruj wideookulografię zgodnie z poniższym opisem.
    1. Aby uniknąć zablokowania pola widzenia zwierzęcia, umieść lustro w podczerwieni (IR) pod kątem 60° od linii środkowej, aby utworzyć obraz prawego oka.
    2. Umieść kamerę na podczerwień po prawej stronie za myszą ( Rysunek 1C po lewej), aby uchwycić obraz prawego oka.
    3. Zamontuj szybką kamerę na podczerwień na ramieniu kamery, które umożliwia obrót kamery o ± 10° wokół obrazu prawego oka (Rysunek 1C po prawej).
    4. Użyj fotodiody podłączonej do jednego z monitorów, aby dostarczyć sygnał elektryczny w celu zsynchronizowania czasu wideookulografii i stymulacji wizualnej.
    5. Umieść cztery diody elektroluminescencyjne (LED) podczerwone wsparte na ramionach na gęsiej szyi wokół prawego oka, aby zapewnić oświetlenie oka w podczerwieni.
    6. Umieść dwie diody podczerwieni na kamerze, aby zapewnić odniesienia odbicia rogówki (CR): jedna jest zamocowana nad kamerą (X-CR), a druga po lewej stronie kamery (Y-CR; Rysunek 1D).
    7. Zmierz powiększenie optyczne systemu wideookulograficznego za pomocą szkiełka kalibracyjnego.
      UWAGA: Referencyjne CR są używane do znoszenia translacyjnych ruchów gałek ocznych, gdy kąt oka jest obliczany na podstawie obrotowych ruchów gałek ocznych.
  6. Zamocuj głowę zwierzęcia na środku pomieszczenia utworzonego przez monitory, jak opisano poniżej.
    1. Przymocuj głowę zwierzęcia z płytą głowy do środka zestawu i ustaw ją skierowaną do przodu. Dostosuj nachylenie głowy tak, aby lewe i prawe oko były wyrównane, a kąciki nosowe i skroniowe oczu były wyrównane poziomo (Rysunek 1E).
    2. Przesuwaj głowę zwierzęcia w poziomie za pomocą zgrubnej regulacji zapewnianej przez aparat do fiksacji głowy i precyzyjnej regulacji zapewnianej przez stolik translacyjny 2D, a w pionie przez aparat do mocowania głowy i parę słupek/słupek, aż prawe oko zwierzęcia pojawi się w obrazie wideo na żywo z kamery. Przed kalibracją i pomiarem ruchów gałek ocznych należy nałożyć obraz prawego oka zwierzęcia odbity przez gorące lustro z punktem obrotu ramienia kamery (patrz szczegóły w kroku 3.4 poniżej).
  7. Zbuduj niestandardową obudowę wokół platformy OKR, aby blokować światło w pomieszczeniu (Rysunek 1F).

3. Kalibracja ruchów gałek ocznych

UWAGA: Obrotowe ruchy gałek ocznych są obliczane na podstawie ruchów źrenicy i promienia orbity ruchów źrenicy (Rp, odległość od środka źrenicy do środka gałki ocznej). Dla każdej myszy promień ten jest mierzony eksperymentalnie21.

  1. Zamocować głowę zwierzęcia w środku pomieszczenia utworzonego przez trzy monitory, zgodnie z opisem w kroku 2.6.1.
  2. Włącz kamerę i wyreguluj cztery diody LED otaczające prawe oko, aby uzyskać równomierne oświetlenie w podczerwieni.
  3. Pod nadzorem wizualnym dostosuj położenie prawego oka, aż pojawi się na środku filmu, zgodnie z opisem w kroku 2.6.2.
  4. Wyrównaj wirtualny obraz prawego oka z punktem obrotu ramienia kamery, jak opisano poniżej.
    1. Ręcznie obróć ramię kamery do lewego skrajnego końca (-10°). Ręcznie przesuń pozycję prawego oka zwierzęcia na płaszczyźnie poziomej prostopadłej do osi optycznej z precyzyjną regulacją etapu translacyjnego 2D (Rysunek 1C, zielona strzałka), aż X-CR znajdzie się w poziomym środku obrazu.
    2. Ręcznie obróć ramię kamery na drugi koniec (+10°). Jeśli X-CR ucieka od środka obrazu, przesuń prawe oko wzdłuż osi optycznej z precyzyjną regulacją, aż X-CR znajdzie się w środku (Rysunek 1C, niebieska strzałka).
    3. Powtórz kroki 3.4.1-3.4.2 kilka razy, aż X-CR pozostanie na środku, gdy ramię kamery wychyli się w lewo i w prawo. Jeśli prawe oko poruszy się w trakcie jednego powtórzenia, uruchom ponownie proces regulacji.
  5. Zmierz odległość w pionie między Y-CR i X-CR po zablokowaniu ramienia kamery w pozycji środkowej. Włącz diodę LED Y-CR i zapisz jej pozycję na wideo, a następnie przełącz się na X-CR LED i zapisz jej pozycję.
    UWAGA: Odległość pionowa między Y-CR a X-CR zostanie wykorzystana do wyznaczenia pozycji Y-CR podczas pomiaru ruchów gałek ocznych, w których włączona jest tylko dioda LED X-CR.
  6. Zmierz promień obrotu źrenicy Rp, jak opisano poniżej.
    1. Obróć ramię aparatu w lewo (-10°) i zapisz pozycje źrenicy (Pp1) i X-CR (P CR1) na wideo.
    2. Następnie obróć ramię kamery w prawy koniec (+10°) i nagraj pozycje źrenicy (Pp2) i X-CR (P CR2) na wideo. Powtórz ten krok wiele razy.
      UWAGA: Prawe oko zwierzęcia musi pozostać nieruchome podczas każdego powtórzenia, aby liczba ruchów źrenicy w filmie dokładnie odzwierciedlała stopień wychylenia ramienia kamery.
    3. Na podstawie wartości zapisanych powyżej oblicz promień obrotu źrenicy Rp (Rysunek 2A) według następującego wzoru:
      figure-protocol-3
      UWAGA: Odległość między odbiciem rogówki a środkiem źrenicy w przestrzeni fizycznej jest obliczana na podstawie ich odległości w filmie:
      PCR - Pp = liczba pikseli w filmie x rozmiar piksela chipa kamery x powiększenie
  7. Rozwiń zależność między Rp a średnicą źrenicy, jak opisano poniżej. Rp zmienia się, gdy źrenica rozszerza się lub zwęża; w przybliżeniu jego wartość jest odwrotnie proporcjonalna do wielkości źrenicy (Rysunek 2B u góry).
    1. Systematycznie zmieniaj luminancję monitorów od 0 do 160 cd/m2, aby regulować rozmiar źrenicy.
    2. Dla każdej wartości luminancji powtórz krok 3.6 8-10 razy i zapisz średnicę źrenicy.
    3. Zastosuj regresję liniową do zależności między Rp a średnicą źrenicy na podstawie wartości zmierzonych powyżej, aby wyprowadzić nachylenie i przecięcie (Rysunek 2B na dole).
      UWAGA: Wartości odstające spowodowane sporadycznymi ruchami gałek ocznych są usuwane przed dopasowaniem liniowym. W przypadku powtarzających się pomiarów w wielu sesjach, kalibrację należy wykonać tylko raz dla jednego zwierzęcia, chyba że jego oko powiększy się podczas eksperymentu.

4. Rejestruj ruchy gałek ocznych OKR

  1. Napraw głowę myszy w zestawie, wykonując kroki 3.1-3.4. Pomiń ten krok, jeśli nagrywanie następuje zaraz po zakończeniu kalibracji. Zablokuj ramię kamery w środkowym położeniu.
  2. Skonfiguruj monitory i zwierzę dla skotopowego OKR zgodnie z poniższym opisem. Pomiń ten krok w przypadku OKR-ów fotograficznych.
    1. Zakryj ekran każdego monitora niestandardowym filtrem, który składa się z pięciu warstw folii o neutralnej gęstości (ND) 1,2. Upewnij się, że żadne światło nie wycieka przez szczelinę między filtrem a monitorem.
    2. Wyłącz światło w pomieszczeniu. Poniższe kroki wykonuje się za pomocą gogli IR.
    3. Nanieś jedną kroplę roztworu pilokarpiny (2% w soli fizjologicznej) na prawe oko i odczekaj 15 minut. Upewnij się, że kropla pozostaje na oku i nie została wytarta przez mysz. Jeśli roztwór zostanie zetarty przez zwierzę, nałóż kolejną kroplę roztworu pilokarpiny. Powoduje to zmniejszenie źrenicy do rozmiaru odpowiedniego do śledzenia ruchu gałek ocznych w warunkach skotopowych.
      UWAGA: W warunkach skotopowych źrenica znacznie się rozszerza, tak że jej krawędź jest częściowo ukryta za powieką. Wpływa to na precyzję oszacowania środka źrenicy za pomocą wideookulusografii. Farmakologicznie zmniejszenie źrenicy prawego oka zmniejsza jej wkład wzrokowy, a co za tym idzie, bodźce wzrokowe są prezentowane do lewego oka.
    4. Przepłukać prawe oko solą fizjologiczną, aby dokładnie zmyć roztwór pilokarpiny. Opuść kurtynę, aby całkowicie uszczelnić obudowę, co zapobiega zakłócaniu widzenia skotopowego przez światło rozproszone
      5. .
    5. Daj zwierzęciu 5 minut, aby w pełni przystosowało się do środowiska skotopowego przed rozpoczęciem testu OKR.
  3. Uruchom oprogramowanie do stymulacji wzrokowej i oprogramowanie do śledzenia ruchu gałek ocznych. W przypadku fotopowego pomiaru OKR upewnij się, że krata bębna oscyluje poziomo z trajektorią sinusoidalną; w przypadku skotopowego pomiaru OKR upewnij się, że krata bębna dryfuje ze stałą prędkością od lewej do prawej, co jest kierunkiem skroniowo-nosowym w odniesieniu do lewego oka.
    UWAGA: Gdy źrenica prawego oka, ale nie lewego, jest zmniejszona przez pilokarpinę w warunkach skotopowych, OKR wywołany oscylacyjną stymulacją bębna jest wysoce asymetryczny. Tak więc, w przypadku skotopowego pomiaru OKR, lewe oko jest stymulowane, podczas gdy ruch prawego oka jest monitorowany.
  4. Oprogramowanie do śledzenia ruchu gałek ocznych automatycznie mierzy rozmiar źrenicy, pozycję CR i pozycję źrenicy dla każdej klatki i oblicza kąt położenia oka na podstawie następującego wzoru (Rysunek 2C):
    figure-protocol-4
    Tutaj PCR jest pozycją CR, Pp jest pozycją źrenicy, a Rp jest promieniem obrotu źrenicy. Odległość między odbiciem rogówki a środkiem źrenicy w przestrzeni fizycznej jest obliczana na podstawie ich odległości w filmie:
    PCR - Pp = liczba pikseli w filmie x rozmiar piksela chipa kamery x powiększenie
    Rp odpowiadającego rozmiaru źrenicy jest wyprowadzane na podstawie modelu regresji liniowej w kroku 3.7.3 (Rysunek 2B na dole).

5. Analiza ruchów gałek ocznych OKR za pomocą oprogramowania do analizy oka

  1. Przetwarzaj ślady oczu za pomocą filtra mediany (okno filtra = 0,05 s), aby usunąć szumy o wysokiej częstotliwości (Rysunek 3A w środku).
  2. Usuń sakkady lub oczopląs zgodnie z opisem poniżej.
    1. Oszacuj prędkość gałki, obliczając pochodną ruchów gałek ocznych pierwszego rzędu (Rysunek 3A na dole). Zidentyfikuj sakkady lub oczopląs, stosując próg prędkości 50 °/s (Rysunek 3A na dole).
    2. Zastąp sakkady lub oczopląs, ekstrapolując pozycje oczu podczas tych szybkich ruchów gałek ocznych z segmentu przed sakkadami lub oczopląsem w oparciu o regresję liniową (Rysunek 3B).
  3. Oblicz amplitudę ruchów gałek ocznych OKR za pomocą szybkiej transformaty Fouriera (algorytm Goertzela), jeśli siatka bębna oscyluje (Rysunek 3C), lub oblicz średnią prędkość ruchów gałek ocznych podczas stymulacji wzrokowej, jeśli siatka bębna porusza się ze stałą prędkością w jednym kierunku (Rysunek 3B na dole).
    UWAGA: Amplituda oscylacyjnych ruchów gałek ocznych wyprowadzona z transformaty Fouriera jest podobna do amplitudy wynikającej z dopasowania trajektorii oka do funkcji sinusoidalnej (Rysunek 3D).
  4. Oblicz zysk OKR. W przypadku oscylacyjnego ruchu bębna wzmocnienie OKR definiuje się jako stosunek amplitudy ruchów gałek ocznych do amplitudy ruchów bębna (Rysunek 3C po prawej). W przypadku jednokierunkowego ruchu bębna, wzmocnienie OKR definiuje się jako stosunek prędkości oka do prędkości siatki bębna (Rysunek 3B na dole).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Za pomocą procedury opisanej powyżej, oceniliśmy zależność OKR od kilku cech wizualnych. Przykładowe ślady pokazane w tym miejscu zostały uzyskane przy użyciu kodów analizy podanych w Dodatkowym pliku kodowania 1, a przykładowy plik nieprzetworzony śladów można znaleźć w Uzupełniającym pliku kodowania 2. Gdy krata bębnowa dryfowała po trajektorii sinusoidalnej (0,4 Hz), oko zwierzęcia automatycznie podążało za ruchem siatki w podobny oscylacyjny sposób (Rysunek 3B

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda testu behawioralnego OKR ma kilka zalet. Po pierwsze, stymulacja wizualna generowana komputerowo rozwiązuje wewnętrzne problemy związane z fizycznymi bębnami. Rozwiązując problem polegający na tym, że bębny fizyczne nie wspierają systematycznego badania częstotliwości przestrzennej, kierunku lub strojenia kontrastu8, wirtualny bęben umożliwia zmianę tych parametrów wizualnych na zasadzie próba po próbie, ułatwiając w ten sposób systematyczną i ilościową analizę selektywn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Yingtian He za udostępnienie danych dotyczących strojenia kierunku. Prace te były wspierane przez granty z Canadian Foundation of Innovation i Ontario Research Fund (projekt CFI/ORF nr 37597), NSERC (RGPIN-2019-06479), CIHR (Project Grant 437007) oraz Connaught New Researcher Awards.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Etap translacyjny 2DThorlabsXYT1
Żywica akrylowaLang DentalB1356Do mocowania płyty głowy na czaszce i ochrony czaszki
BupiwakainaSTERIMAXST-BX223Bupiwakaina do wstrzykiwań BP 0,5%. Znieczulenie miejscowe
KarprofenRIMADYL8507-14-1Analgezja
Sprężone powietrzeDust-Off
Maśćdo oczu AlconSystaneDo utrzymywania nawilżenia oczu
Karta graficznaNVIDIAGeforce GTX 1650 lub Quadro P620.Do generowania pojedynczego ekranu na trzech monitorach
Poduszka grzewczaKent ScientificHTP-1500Do utrzymywania temperatury ciała
Szybka kamera na podczerwień (IR)Teledyne DalsaG3-GM12-M0640Do nagrywania rotacji gałek ocznych
LEDDigikeyPDI-E803-NDDo odniesienia CR i oświetlenia oka
Lusterko IREdmund optyka64-471Do odbijania obrazu oka
IsofluranFRESENIUS KABICP0406V2
LabviewWersja instrumentów krajowych2014śledzenie ruchu gałek ocznych
Dzwonek z mleczanamiBAXTERJB2324Zaopatrzenie w wodę i energię
Mieszanka lidokainy i epinefrynyDentsply Sirona82215-1XYLOCAINE. Znieczulenie miejscowe
Miernik luminancjiKonica MinoltaLS-150do kalibracji monitorów
MatlabMathWorkswersja xxxanaliza ruchów gałek ocznych
Meyhoefer CuretteWorld Precision Instruments501773Do skrobania czaszki i usuwania powięzi
Szkiełko kalibracyjne mikroskopuAmscopeMR095do pomiaru powiększenia Monitory wideookulograficzne
Acer B247WStymulacja wizualna
Filtr o neutralnej gęstościFiltry Lee299do generowania skotopowej stymulacji wzrokowej
Gogle do widzenia bliskiegoAlpha optykaAO-3277do skotopowego OKR
FotodiodaDigikeyTSL254-R-LF-NDdo synchronizacji stymulacji wzrokowej i wideookulografii
Chlorowodorek pilokarpinySigma-AldrichP6503
PostThorlabsTR1.5
Uchwyt na słupekThorlabsPH1
PsychoPywersja oprogramowania open sourcexxxzestaw narzędzi do stymulacji wizualnej
NożyczkiRWDS12003-09Do usuwania skóry
SuperglueKrazy Typ kleju: uniwersalny. Do przylegania nakrycia głowy na czaszce
IR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerhard, D. Neuroscience. 5th Edition. Yale Journal of Biology and Medicine. , (2013).
  2. Distler, C., Hoffmann, K. P. The Oxford Handbook of Eye Movement. , Oxford University Press. 65-83 (2011).
  3. Sereno, A. B., Bolding, M. S. Executive Functions: Eye Movements and Human Neurological Disorders. , Elsevier. (2017).
  4. Giolli, R. A., Blanks, R. H. I., Lui, F. The accessory optic system: basic organization with an update on connectivity, neurochemistry, and function. Progress in Brain Research. 151, 407-440 (2006).
  5. Liu, B. H., Huberman, A. D., Scanziani, M. Cortico-fugal output from visual cortex promotes plasticity of innate motor behaviour. Nature. 538 (7625), 383-387 (2016).
  6. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  7. Stahl, J. S., van Alphen, A. M., De Zeeuw, C. I. A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. Journal of Neuroscience Methods. 99 (1-2), 101-110 (2000).
  8. Faulstich, B. M., Onori, K. A., du Lac, S. Comparison of plasticity and development of mouse optokinetic and vestibulo-ocular reflexes suggests differential gain control mechanisms. Vision Research. 44 (28), 3419-3427 (2004).
  9. Katoh, A., Kitazawa, H., Itohara, S., Nagao, S. Dynamic characteristics and adaptability of mouse vestibulo-ocular and optokinetic response eye movements and the role of the flocculo-olivary system revealed by chemical lesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (13), 7705-7710 (1998).
  10. Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: application to genetic and drug-induced variation. PLoS One. 3 (4), 2055(2008).
  11. Cameron, D. J., et al. The optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (80), 50832(2013).
  12. de Jeu, M., De Zeeuw, C. I. Video-oculography in mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3971(2012).
  13. Kodama, T., du Lac, S. Adaptive acceleration of visually evoked smooth eye movements in mice. The Journal of Neuroscience. 36 (25), 6836-6849 (2016).
  14. Doering, C. J., et al. Modified Ca(v)1.4 expression in the Cacna1f(nob2) mouse due to alternative splicing of an ETn inserted in exon 2. PLoS One. 3 (7), e2538(2008).
  15. Shi, C., et al. Optimization of optomotor response-based visual function assessment in mice. Scientific Reports. 8 (1), 9708(2018).
  16. Waldner, D. M., et al. Transgenic expression of Cacna1f rescues vision and retinal morphology in a mouse model of congenital stationary night blindness 2A (CSNB2A). Translational Vision Science & Technology. 9 (11), 19(2020).
  17. Tabata, H., Shimizu, N., Wada, Y., Miura, K., Kawano, K. Initiation of the optokinetic response (OKR) in mice. Journal of Vision. 10 (1), 1-17 (2010).
  18. Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Current Biology. 32 (19), 4286-4298 (2022).
  19. Harris, S. C., Dunn, F. A. Asymmetric retinal direction tuning predicts optokinetic eye movements across stimulus conditions. eLife. 12, e81780(2023).
  20. van Alphen, B., Winkelman, B. H., Frens, M. A. Three-dimensional optokinetic eye movements in the C57BL/6J mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 623-630 (2010).
  21. Stahl, J. S. Calcium channelopathy mutants and their role in ocular motor research. Annals of the New York Academy of Sciences. 956, 64-74 (2002).
  22. Endo, S., et al. Dual involvement of G-substrate in motor learning revealed by gene deletion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (9), 3525-3530 (2009).
  23. Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
  24. Burroughs, S. L., Kaja, S., Koulen, P. Quantification of deficits in spatial visual function of mouse models for glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3654-3659 (2011).
  25. Wakita, R., et al. Differential regulations of vestibulo-ocular reflex and optokinetic response by β- and α2-adrenergic receptors in the cerebellar flocculus. Scientific Reports. 7 (1), 3944(2017).
  26. Dehmelt, F. A., et al. Spherical arena reveals optokinetic response tuning to stimulus location, size, and frequency across entire visual field of larval zebrafish. eLife. 10, e63355(2021).
  27. Magnusson, M., Pyykko, I., Jantti, V. Effect of alertness and visual attention on optokinetic nystagmus in humans. American Journal of Otolaryngology. 6 (6), 419-425 (1985).
  28. Collins, W. E., Schroeder, D. J., Elam, G. W. Effects of D-amphetamine and of secobarbital on optokinetic and rotation-induced nystagmus. Aviation, Space, and Environmental Medicine. 46 (4), 357-364 (1975).
  29. Reimer, J., et al. Pupil fluctuations track fast switching of cortical states during quiet wakefulness. Neuron. 84 (2), 355-362 (2014).
  30. Sakatani, T., Isa, T. PC-based high-speed video-oculography for measuring rapid eye movements in mice. Neuroscience Research. 49 (1), 123-131 (2004).
  31. Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neuroscience Research. 58 (3), 324-331 (2007).
  32. Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
  33. Bradley, M. M., Miccoli, L., Escrig, M. A., Lang, P. J. The pupil as a measure of emotional arousal and autonomic activation. Psychophysiology. 45 (4), 602-607 (2008).
  34. Hess, E. H., Polt, J. M. Pupil size as related to interest value of visual stimuli. Science. 132 (3423), 349-350 (1960).
  35. Di Stasi, L. L., Catena, A., Canas, J. J., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S. Saccadic velocity as an arousal index in naturalistic tasks. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (5), 968-975 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optokinetic ReflexVisual Feature SelectivityVideo OculographyHead FixationVirtual Visual StimulationTuning CurvesEye Movement QuantificationSpatial FrequencyVisual Motor LearningOcular Plasticity

Related Articles