Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja selektywności cech wzrokowych odruchu optokinetycznego u myszy

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65281

⸱

23 czerwca 2023

 , 
1Department of Biology, University of Toronto Mississauga, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy standardowy protokół do ilościowego określania odruchu optokinetycznego. Łączy w sobie wirtualną stymulację bębna i wideookulografię, a tym samym umożliwia precyzyjną ocenę selektywności cech zachowania i jego plastyczności adaptacyjnej.

Streszczenie

Odruch optokinetyczny (OKR) jest niezbędnym wrodzonym ruchem gałek ocznych, który jest wywoływany przez globalny ruch środowiska wzrokowego i służy do stabilizacji obrazów siatkówki. Ze względu na swoje znaczenie i solidność, OKR został wykorzystany do badania uczenia się wzrokowo-motorycznego oraz do oceny funkcji wzrokowych myszy o różnym pochodzeniu genetycznym, wieku i leczeniu farmakologicznym. W tym miejscu przedstawiamy procedurę oceny reakcji OKR myszy z głową z dużą dokładnością. Fiksacja głowy może wykluczyć wpływ stymulacji przedsionkowej na ruchy gałek ocznych, umożliwiając pomiar ruchów gałek ocznych wywołanych tylko ruchem wzrokowym. OKR jest wywoływany przez wirtualny system bębnowy, w którym pionowa siatka prezentowana na trzech monitorach komputerowych dryfuje poziomo w sposób oscylacyjny lub jednokierunkowy ze stałą prędkością. Dzięki temu systemowi rzeczywistości wirtualnej możemy systematycznie zmieniać parametry wizualne, takie jak częstotliwość przestrzenna, częstotliwość czasowa/oscylacyjna, kontrast, luminancja i kierunek siatek, a także określać ilościowo krzywe strojenia selektywności cech wizualnych. Szybka wideookulografia w podczerwieni zapewnia dokładny pomiar trajektorii ruchów gałek ocznych. Oczy poszczególnych myszy są kalibrowane, aby zapewnić możliwość porównania OKR-ów między zwierzętami w różnym wieku, różnej płci i o różnym pochodzeniu genetycznym. Ilościowa moc tej techniki pozwala na wykrycie zmian w OKR, gdy zachowanie to plastycznie dostosowuje się do starzenia się, doświadczeń sensorycznych lub uczenia się motorycznego; Tym samym sprawia to, że technika ta jest cennym dodatkiem do repertuaru narzędzi używanych do badania plastyczności zachowań oczu.

Wprowadzenie

W odpowiedzi na bodźce wizualne w otoczeniu, nasze oczy poruszają się, aby zmienić nasze spojrzenie, ustabilizować obrazy siatkówki, śledzić poruszające się cele lub wyrównać dołki dwojga oczu z celami znajdującymi się w różnych odległościach od obserwatora, co jest niezbędne do prawidłowego widzenia1,2. Zachowania okoruchowe są szeroko stosowane jako atrakcyjne modele integracji sensomotorycznej w celu zrozumienia obwodów neuronalnych w zdrowiu i chorobie, przynajmniej częściowo ze względu na prostotę układu okoruchowego3. Kontrolowane przez trzy pary mięśni zewnątrzgałkowych, oko obraca się w zębodole głównie wokół trzech odpowiadających sobie osi: uniesienia i obniżenia wzdłuż osi poprzecznej, przywodzenia i odwodzenia wzdłuż osi pionowej oraz skręcania i wygięcia wzdłuż osi przednio-tylnej1,2. Tak prosty system pozwala naukowcom łatwo i dokładnie ocenić zachowania okoruchowe myszy w środowisku laboratoryjnym.

Jednym z głównych zachowań okulomotorycznych jest odruch optokinetyczny (OKR). Ten mimowolny ruch gałek ocznych jest wywoływany przez powolne dryfowanie lub prześlizgiwanie się obrazów na siatkówce i służy do stabilizacji obrazów siatkówki, gdy porusza się głowa zwierzęcia lub jego otoczenie2,4. OKR, jako paradygmat behawioralny, jest interesujący dla badaczy z kilku powodów. Po pierwsze, może być niezawodnie stymulowany i dokładnie określany ilościowo5,6. Po drugie, procedury kwantyfikacji tego zachowania są stosunkowo proste i ustandaryzowane i mogą być stosowane do oceny funkcji wizualnych dużej kohorty zwierząt7. Po trzecie, to wrodzone zachowanie jest bardzo plastyczne5,8,9. Jego amplituda może być wzmocniona, gdy powtarzające się poślizgi siatkówki występują przez długi czas5,8,9, lub gdy jego partner działający przedsionkowy odruch oczny (VOR), inny mechanizm stabilizacji obrazów siatkówki wyzwalany przez wejście przedsionkowe2, jest upośledzony5. Te eksperymentalne paradygmaty wzmacniania OKR umożliwiają naukowcom odkrycie podstaw obwodu leżącego u podstaw uczenia się okulomotorycznego.

Dwie nieinwazyjne metody były głównie używane do oceny OKR w poprzednich badaniach: (1) wideo-okulografia połączona z fizycznym bębnem7,10,11,12,13 lub (2) arbitralne określenie skrętów głowy w połączeniu z wirtualnym bębnem6,14,15,16. Chociaż ich zastosowania przyniosły owocne odkrycia w zrozumieniu molekularnych i obwodowych mechanizmów plastyczności okulomotorycznej, każda z tych dwóch metod ma pewne wady, które ograniczają ich możliwości w ilościowym badaniu właściwości OKR. Po pierwsze, fizyczne bębny, z nadrukowanymi wzorami czarno-białych pasków lub kropek, nie pozwalają na łatwą i szybką zmianę wzorców wizualnych, co w dużej mierze ogranicza pomiar zależności OKR od niektórych cech wizualnych, takich jak częstotliwość przestrzenna, kierunek i kontrast ruchomych siatek8,17. Zamiast tego testy selektywności OKR w stosunku do tych cech wizualnych mogą skorzystać ze skomputeryzowanej stymulacji wizualnej, w której cechy wizualne mogą być wygodnie modyfikowane z próby na próbę. W ten sposób badacze mogą systematycznie badać zachowanie OKR-ów w wielowymiarowej przestrzeni parametrów wizualnych. Co więcej, druga metoda testu OKR podaje tylko progi parametrów wizualnych, które wyzwalają dostrzegalne OKR-y, ale nie amplitudy ruchów oczu lub głowy6, 14,15,16. Brak mocy ilościowej uniemożliwia więc analizę kształtu krzywych strojenia i preferowanych cech wizualnych, czy wykrycie subtelnych różnic między poszczególnymi myszami w warunkach normalnych i patologicznych. Aby przezwyciężyć powyższe ograniczenia, wideo-okulografia i skomputeryzowana wirtualna stymulacja wizualna zostały połączone w celu zbadania zachowania OKR w ostatnich badaniach5,17,18,19,20. Jednak te wcześniej opublikowane badania nie dostarczyły wystarczających szczegółów technicznych ani instrukcji krok po kroku, w związku z czym naukowcom nadal trudno jest ustalić taki test OKR dla własnych badań.

Tutaj prezentujemy protokół do precyzyjnego ilościowego określenia selektywności cech wizualnych zachowania OKR w warunkach fotopowych lub skotopowych za pomocą kombinacji wideo-okulusografii i skomputeryzowanej wirtualnej stymulacji wizualnej. Myszy są unieruchomione na głowie, aby uniknąć ruchu gałek ocznych wywołanego stymulacją przedsionkową. Szybka kamera służy do rejestrowania ruchów gałek ocznych myszy oglądających ruchome siatki o zmieniających się parametrach wizualnych. Fizyczny rozmiar gałek ocznych poszczególnych myszy jest kalibrowany w celu zapewnienia dokładności wyznaczania kąta ruchów gałek ocznych21. Ta metoda ilościowa pozwala na porównywanie zachowań OKR między zwierzętami w różnym wieku lub o różnym pochodzeniu genetycznym lub monitorowanie jego zmiany spowodowanej leczeniem farmakologicznym lub uczeniem wzrokowo-motorycznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzone w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez Lokalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami w Naukach Biologicznych, zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Toronto oraz Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Implantacja uchwytu głowowego na czaszce

UWAGA: Aby uniknąć wpływu odruchu przedsionkowo-ocznego (VOR) na ruchy gałek ocznych, podczas testu OKR głowa myszy jest unieruchomiona. W związku z tym na górnej części czaszki chirurgicznie implantowany jest uchwyt głowy.

  1. Zanurz mysz (samica lub samiec C57BL/6 w wieku 2-5 miesięcy) w komorze gazowej z mieszaniną 4% izofluranu (v/v) i O2 w celu znieczulenia. Przenieś mysz na dostosowaną platformę chirurgiczną i zmniejsz stężenie izofluranu do 1,5%-2%. Przez cały czas trwania operacji monitoruj głębokość znieczulenia, sprawdzając odruch na uszczypnięcie palca stopy oraz częstość oddechów.
  2. Umieść matę grzewczą pod ciałem zwierzęcia, aby utrzymać jego temperaturę ciała. Na oba oczy nałóż warstwę smarującej maści ocznej, aby zapobiec ich wysychaniu. Przykryj oczy folią aluminiową, aby chronić je przed światłem.
  3. Wstrzyknij podskórnie karprofen w dawce 20 mg/kg w celu uśmierzenia bólu. Po zwilżeniu futra środkiem do oczyszczania skóry z glukonianem chlorheksydyny, wygol futro na szczycie czaszki. Zdezynfekuj odsłoniętą skórę głowy dwukrotnie 70% alkoholem izopropylowym i alkoholem z chlorheksydyną.
  4. Wstrzyknij bupiwakainę (8 mg/kg) podskórnie w miejscu nacięcia, a następnie usuń nożyczkami fragment skóry głowy (~1 cm2), aby odsłonić grzbietową powierzchnię czaszki, w tym tylną część kości czołowej, kość ciemieniową oraz kość międzyciemieniową.
  5. Na odsłoniętą czaszkę nanieś kilka kropli 1% lidokainy i epinefryny w stosunku 1:100 000, aby zmniejszyć ból miejscowy i krwawienie. Zeskrob powięź z czaszki kuretą Meyhoefera i oczyść ją solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS).
    UWAGA: Mięsień skroniowy jest oddzielany od czaszki, aby zwiększyć powierzchnię mocowania uchwytu głowy.
  6. Osusz czaszkę, delikatnie kierując strumień sprężonego powietrza na jej powierzchnię, aż zniknie wilgoć, a kość stanie się białawą. Na odsłoniętą powierzchnię czaszki, w tym na krawędź naciętej skóry, nanieś cienką warstwę superglue, a następnie warstwę żywicy akrylowej.
    UWAGA: Przed nałożeniem superglue powierzchnia czaszki musi być wolna od krwi i wody.
  7. Umieść stalowy uchwyt głowy (patrz Rysunek 1A) wzdłuż linii środkowej na szczycie czaszki. Nakładaj kolejno żywicę akrylową, zaczynając od krawędzi uchwytu, aż jego podstawa zostanie całkowicie zatopiona w żywicy. Powtórz nakładanie żywicy akrylowej dwa lub trzy razy, aby zwiększyć grubość warstwy.
  8. Odczekaj około 15 min, aż żywica akrylowa stwardnieje. Wstrzyknij podskórnie 1 mL roztworu Ringera z mleczanem. Następnie przenieś mysz do klatki umieszczonej na macie grzewczej, aż zwierzę odzyska pełną sprawność ruchową.
  9. Pozostaw mysz w klatce domowej na co najmniej 5 dni po operacji w celu rekonwalescencji. Gdy zwierzę będzie w dobrej kondycji, unieruchom jego głowę za pomocą uchwytu w układzie OKR na 15-30 min, aby oswoić je z fiksacją głowy i środowiskiem eksperymentalnym. Powtarzaj procedurę oswajania raz dziennie przez co najmniej 3 dni.

2. Konfiguracja wirtualnego bębna i wideookulografii

  1. Zamontuj trzy monitory ortogonalnie względem siebie, tworząc kwadratową obudowę, która pokrywa ok. 270° azymutu i 63° elewacji w przestrzeni wizualnej (Rycina 1B lewo).
  2. Za pomocą oddzielnej karty graficznej połącz trzy monitory w jeden prosty wyświetlacz, aby zapewnić synchronizację obrazu na wszystkich monitorach.
  3. Zkalibruj luminancję monitorów zgodnie z poniższym opisem.
    1. Włącz komputer, do którego podłączone są monitory, i odczekaj 15 min. Rozgrzewanie jest niezbędne dla uzyskania stabilnej luminancji.
    2. Systematycznie zmieniaj ustawienie jasności na monitorze od 0 do 100 w krokach co 25.
    3. Dla każdej wartości jasności zmierz luminancję monitorów przy różnych wartościach pikseli (0-255, w krokach co 15) za pomocą luminometru.
    4. Dopasuj zależność między luminancją a jasnością dla wartości piksela 255 za pomocą regresji liniowej i oszacuj wartość jasności, która daje 160 cd/m2.
    5. Dla każdej wartości piksela użytej w pomiarze luminancji (krok 2.3.3) oszacuj luminancję dla wartości jasności wyznaczonej w kroku 2.3.4 na podstawie regresji liniowej. Użyj funkcji potęgowej lum = A * pixelγ , aby dopasować zależność między nowym zestawem wartości luminancji (przy wartości jasności wyznaczonej w 2.3.4) a odpowiadającymi im wartościami pikseli, w celu wyznaczenia współczynnika gamma γ oraz współczynnika A. Będą one wykorzystywane do generowania siatek sinusoidalnych o pożądanych wartościach luminancji.
    6. Ustaw jasność wszystkich trzech monitorów na wartości wyznaczone w kroku 2.3.4, aby zapewnić taką samą luminancję dla tej samej wartości piksela.
  4. Wygeneruj wirtualny bęben służący do stymulacji zachowania OKR za pomocą zestawu do stymulacji wizualnej, zgodnie z poniższym opisem.
    1. Wyświetl na monitorach pionową siatkę sinusoidalną i dostosuj okres (odstępy między pasami) wzdłuż azymutu, aby zapewnić stałą częstotliwość przestrzenną projekcji siatki na oko (siatka bębnowa; Rycina 1B środek i prawo).
    2. Upewnij się, że głowa zwierzęcia jest unieruchomiona w centrum obudowy w taki sposób, aby siatka widziana przez zwierzę miała stałą częstotliwość przestrzenną na całej powierzchni wirtualnego bębna.
    3. Zmodyfikuj parametry ruchomej siatki, takie jak amplituda oscylacji, częstotliwość przestrzenna, częstotliwość czasowa/oscylacji, kierunek, kontrast itp., w kodach stymulacji wizualnej. Zastosuj dwa typy ruchu wizualnego: (1) siatka przesuwa się zgodnie lub przeciwnie z ruchem wskazówek zegara w sposób oscylacyjny zgodnie z funkcją sinusoidalną:
      Równanie fali, pozycja bębna = Amp × sin(2π × f × t), wzór do analizy ruchu harmonicznego.
      Gdzie Amp to amplituda trajektorii bębna, f to częstotliwość oscylacji, a t to czas (amplituda oscylacji: 5°; częstotliwość przestrzenna siatki: 0,04-0,45 cpd; częstotliwość oscylacji: 0,1-0,8 Hz, co odpowiada szczytowej prędkości bodźca 3,14-25,12 °/s [prędkość bębna = Amp x 2π x f x cos (2π x f x t); kontrast: 80%-100%; średnia luminancja: 35-45 cd/m2; (2) siatka przesuwa się jednokierunkowo ze stałą prędkością:
      Wzór na pozycję bębna: pozycja bębna = Prędkość × czas; równanie do analizy kinematycznej.
      ​(Częstotliwość przestrzenna: 0,04-0,64 cpd; częstotliwość czasowa: 0,25-1 Hz; prędkość bębna = częstotliwość czasowa/częstotliwość przestrzenna.)
  5. Skonfiguruj wideo-okulografię zgodnie z poniższym opisem.
    1. Aby uniknąć blokowania pola widzenia zwierzęcia, umieść lustro podczerwone (IR) pod kątem 60° od linii środkowej, aby uzyskać obraz prawego oka.
    2. Umieść kamerę IR po prawej stronie za myszą (Rycina 1C lewo), aby rejestrować obraz prawego oka.
    3. Zamontuj szybką kamerę IR na ramieniu kamery, które pozwala na obrót kamery o ± 10° wokół obrazu prawego oka (Rycina 1C prawo).
    4. Użyj fotodiody przymocowanej do jednego z monitorów, aby dostarczyć sygnał elektryczny do synchronizacji czasu wideo-okulografii i stymulacji wizualnej.
    5. Umieść wokół prawego oka cztery diody emitujące podczerwień (LED) na ramionach typu „gęsia szyja”, aby zapewnić oświetlenie IR oka.
    6. Umieść dwie diody IR LED na kamerze, aby zapewnić punkty odniesienia odbicia rogówkowego (CR): jedną zamocuj nad kamerą (X-CR), a drugą po lewej stronie kamery (Y-CR; Rycina 1D).
    7. Zmierz powiększenie optyczne systemu wideo-okulografii za pomocą płytki kalibracyjnej.
      UWAGA: Referencyjne punkty CR są używane do eliminacji translacyjnych ruchów oka podczas obliczania kąta oka na podstawie rotacyjnych ruchów oka.
  6. Unieruchom głowę zwierzęcia w centrum obudowy utworzonej przez monitory, zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przymocuj głowę zwierzęcia za pomocą płytki głowowej do centrum aparatury, tak aby zwierzę było skierowane do przodu. Dostosuj nachylenie głowy tak, aby lewe i prawe oko znajdowały się na jednym poziomie, a nosowe i skroniowe kąciki oczu były wyrównane poziomo (Rycina 1E).
    2. Przesuwaj głowę zwierzęcia poziomo za pomocą regulacji wstępnej aparatu do unieruchamiania głowy i regulacji precyzyjnej za pomocą 2D stołu translacyjnego, a pionowo za pomocą aparatu do unieruchamiania głowy oraz pary trzpień/uchwyt trzpienia, aż prawe oko zwierzęcia pojawi się w obrazie z kamery na żywo. Przed kalibracją i pomiarem ruchów oka nałóż obraz prawego oka zwierzęcia odbity w lustrze gorącym na punkt obrotu ramienia kamery (szczegóły w kroku 3.4 poniżej).
  7. Zbuduj dostosowaną obudowę wokół zestawu OKR, aby zablokować światło w pomieszczeniu (Rycina 1F).

3. Kalibracja ruchów gałek ocznych

UWAGA: Rotacyjne ruchy gałki ocznej są obliczane na podstawie ruchów źrenicy oraz promienia orbity ruchów źrenicznych (Rp, odległość od środka źrenicy do środka gałki ocznej). Dla każdej myszy promień ten jest mierzony eksperymentalnie21.

  1. Ustabilizuj głowę zwierzęcia w centrum obramowania utworzonego przez trzy monitory, zgodnie z opisem w kroku 2.6.1.
  2. Włącz kamerę i wyreguluj cztery diody LED otaczające prawe oko, aby uzyskać równomierne oświetlenie w podczerwieni.
  3. Pod kontrolą wizualną należy skorygować położenie prawego oka, aż znajdzie się ono w centrum obrazu wideo, zgodnie z opisem w punkcie 2.6.2.
  4. Wyrównaj wirtualny obraz prawego oka z punktem obrotu ramienia kamery, zgodnie z poniższym opisem.
    1. Ręcznie obróć ramię kamery do skrajnej pozycji po lewej stronie (-10°). Ręcznie przesuń prawe oko zwierzęcia w płaszczyźnie poziomej prostopadłej do osi optycznej, korzystając z precyzyjnej regulacji 2D stołu translacyjnego (Rycina 1C, zielona strzałka), aż do momentu, gdy X-CR znajdzie się w poziomym centrum obrazu.
    2. Ręcznie obróć ramię kamery na drugi koniec (+10°). Jeśli X-CR przesuwa się poza centrum obrazu, należy przesuwać prawe oko wzdłuż osi optycznej za pomocą regulacji precyzyjnej, aż X-CR znajdzie się w centrum (Rycina 1C, niebieska strzałka).
    3. Powtórz kroki 3.4.1–3.4.2 kilka razy, aż X-CR pozostanie w centrum podczas ruchu ramienia kamery w lewo i w prawo. Jeśli prawe oko przesunie się w trakcie jednego z powtórzeń, rozpocznij proces regulacji od nowa.
  5. Zmierz odległość pionową między Y-CR a X-CR po zablokowaniu ramienia kamery w pozycji centralnej. Włącz diodę LED Y-CR i zarejestruj jej położenie na wideo, a następnie przełącz na diodę LED X-CR i zarejestruj jej położenie.
    UWAGA: Odległość pionowa między Y-CR a X-CR zostanie wykorzystana do wyznaczenia pozycji Y-CR podczas pomiaru ruchów gałek ocznych, w którym włączona jest wyłącznie dioda LED X-CR.
  6. Zmierz promień rotacji źrenicy Rpzgodnie z opisem poniżej.
    1. Obróć ramię kamery do lewego krańca (-10°) i zarejestrować położenie źrenicy (Pp1) oraz X-CR (PCR1) na filmie.
    2. Następnie obróć ramię kamery do prawej krawędzi (+10°) i zarejestrować pozycje źrenicy (Pp2) i X-CR (PCR2) na filmie. Powtórz ten krok wielokrotnie.
      UWAGA: Prawe oko zwierzęcia musi pozostać nieruchome podczas każdego powtórzenia, aby liczba ruchów źrenicy na filmie dokładnie odzwierciedlała stopień wychylenia ramienia kamery.
    3. Na podstawie zapisanych powyżej wartości należy obliczyć promień rotacji źrenicy Rp (Rysunek 2A) z następującym wzorem:
      Równanie równowagi statycznej \( R_p \) dla analizy mechanicznej na schemacie; kąt \( \sin 10^\circ \).
      UWAGA: Odległość między odblaskiem rogówki a środkiem źrenicy w przestrzeni fizycznej jest obliczana na podstawie ich odległości w nagraniu wideo:
      PCR - Pp = liczba pikseli w filmie x rozmiar piksela matrycy kamery x powiększenie
  7. Opracuj zależność między Rp oraz średnica źrenicy, zgodnie z opisem poniżej. Rp zmienia się podczas rozszerzania lub zwężania źrenicy; w przybliżeniu jej wartość jest odwrotnie proporcjonalna do wielkości źrenicy (Rycina 2B góra).
    1. Systematycznie zmieniaj luminancję monitorów w zakresie od 0 do 160 cd/m²2 do regulacji wielkości źrenicy.
    2. Dla każdej wartości luminancji powtórzyć krok 3.6 od 8 do 10 razy i zapisać średnicę źrenicy.
    3. Zastosuj regresję liniową do zależności między Rp oraz średnicę źrenicy na podstawie powyższych pomiarów w celu wyznaczenia nachylenia i punktu przecięcia (Rysunek 2B dół).
      UWAGA: Wartości odstające spowodowane sporadycznymi ruchami gałki ocznej są usuwane przed dopasowaniem liniowym. W przypadku pomiarów powtarzanych w wielu sesjach kalibrację należy przeprowadzić tylko raz dla jednego zwierzęcia, chyba że jego gałka oczna powiększy się w trakcie eksperymentu.

4. Rejestracja ruchów gałek ocznych podczas OKR

  1. Utrwal głowę myszy w aparaturze zgodnie z krokami 3.1-3.4. Pomiń ten krok, jeśli rejestracja odbywa się bezpośrednio po zakończeniu kalibracji. Zablokuj ramię kamery w pozycji centralnej.
  2. Przygotuj monitory i zwierzę do skotopowego OKR zgodnie z poniższym opisem. Pomiń ten krok w przypadku fotopowego OKR.
    1. Przykryj ekran każdego monitora specjalnie dostosowanym filtrem, wykonanym z pięciu warstw folii o gęstości neutralnej (ND) 1.2. Upewnij się, że światło nie wydostaje się przez szczelinę między filtrem a monitorem.
    2. Wyłącz światło w pomieszczeniu. Kolejne kroki wykonuje się przy pomocy gogli IR.
    3. Zastosuj jedną kroplę roztworu pilokarpiny (2% w soli fizjologicznej) do prawego oka i odczekaj 15 min. Upewnij się, że kropla pozostała w oku i nie została starta przez mysz. Jeśli roztwór zostanie starty przez zwierzę, podaj kolejną kroplę roztworu pilokarpiny. Powoduje to zwężenie źrenicy do rozmiaru odpowiedniego dla śledzenia oka w warunkach skotopowych.
      UWAGA: W warunkach skotopowych źrenica rozszerza się znacząco, tak że jej krawędź jest częściowo ukryta za powieką. Wpływa to na precyzję szacowania środka źrenicy za pomocą wideookulografii. Farmakologiczne zwężenie źrenicy prawego oka zmniejsza dopływ bodźców wzrokowych, dzięki czemu bodźce wzrokowe są prezentowane lewemu oku.
    4. Przepłucz prawe oko solą fizjologiczną, aby dokładnie wypłukać roztwór pilokarpiny. Zasłoń kurtynę, aby całkowicie odizolować obudowę, co zapobiega zakłócaniu widzenia skotopowego przez światło rozproszone.
    5. Pozostaw zwierzę na 5 min, aby w pełni zaadaptowało się do środowiska skotopowego przed rozpoczęciem testu OKR.
  3. Uruchom oprogramowanie do stymulacji wzrokowej oraz oprogramowanie do śledzenia oka. Dla pomiaru fotopowego OKR upewnij się, że prążkowanie bębna oscyluje poziomo po trajektorii sinusoidalnej; dla pomiaru skotopowego OKR upewnij się, że prążkowanie bębna przesuwa się ze stałą prędkością od lewej do prawej, co odpowiada kierunkowi skroniowo-nosowemu w odniesieniu do lewego oka.
    UWAGA: Gdy w warunkach skotopowych źrenica prawego oka, ale nie lewego, jest zwężona pilokarpiną, OKR wywołany oscylacyjną stymulacją bębna jest silnie asymetryczny. Dlatego w przypadku pomiaru skotopowego OKR stymulowane jest lewe oko, podczas gdy monitorowany jest ruch prawego oka.
  4. Oprogramowanie do śledzenia oka automatycznie mierzy rozmiar źrenicy, pozycję CR oraz pozycję źrenicy dla każdej klatki i oblicza kąt położenia oka na podstawie następującego wzoru (Rysunek 2C):
    równanie arcsin dla kąta α, zawierające człony ciśnienia P_CR, P_p1 i promień R_P, przedstawienie wzoru
    Tutaj PCR to pozycja CR, Pp to pozycja źrenicy, a Rp to promień rotacji źrenicy. Odległość między odblaskiem rogówki a środkiem źrenicy w przestrzeni fizycznej jest obliczana na podstawie ich odległości w filmie:
    PCR - Pp = liczba pikseli w filmie x rozmiar piksela matrycy kamery x powiększenie
    Rp dla odpowiadającego rozmiaru źrenicy jest wyznaczany na podstawie modelu regresji liniowej w kroku 3.7.3 (Rysunek 2B dół).

5. Analiza ruchów gałek ocznych w OKR za pomocą oprogramowania do analizy oczu

  1. Przetworzyć zapisy ruchów gałek ocznych za pomocą filtru medianowego (okno filtra = 0.05 s), aby usunąć szum wysokoczęstotliwościowy (Rysunek 3A środek).
  2. Usunąć sakady lub nystagmus zgodnie z poniższym opisem.
    1. Oszacować prędkość gałek ocznych poprzez obliczenie pierwszej pochodnej ruchów oczu (Rysunek 3A dół). Zidentyfikować sakady lub nystagmus, stosując próg prędkości 50 °/s (Rysunek 3A dół).
    2. Zastąpić sakady lub nystagmus poprzez ekstrapolację pozycji oka podczas tych szybkich ruchów na podstawie regresji liniowej z segmentu poprzedzającego sakady lub nystagmus (Rysunek 3B).
  3. Obliczyć amplitudę ruchów oczu OKR za pomocą szybkiej transformaty Fouriera (algorytm Goertzela), jeśli prążki bębna oscylują (Rysunek 3C), lub obliczyć średnią prędkość ruchów oczu podczas stymulacji wizualnej, jeśli prążki bębna poruszają się ze stałą prędkością w jednym kierunku (Rysunek 3B dół).
    UWAGA: Amplituda oscylacyjnych ruchów oczu wyznaczona z transformaty Fouriera jest zbliżona do amplitudy uzyskanej z dopasowania trajektorii oka do funkcji sinusoidalnej (Rysunek 3D).
  4. Obliczyć wzmocnienie OKR. Dla oscylacyjnego ruchu bębna wzmocnienie OKR definiuje się jako stosunek amplitudy ruchów oczu do amplitudy ruchów bębna (Rysunek 3C prawo). Dla jednokierunkowego ruchu bębna wzmocnienie OKR definiuje się jako stosunek prędkości oka do prędkości prążków bębna (Rysunek 3B dół).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisaną powyżej procedurę, oceniliśmy zależność OKR od kilku cech wizualnych. Przedstawione tutaj przykładowe przebiegi zostały uzyskane przy użyciu kodów analitycznych dostarczonych w Supplementary Coding File 1, a plik z surowymi danymi przykładów znajduje się w Supplementary Coding File 2. Gdy kratka na bębnie przemieszczała się po trajektorii sinusoidalnej (0,4 Hz), oko zwierzęcia automatycznie śledziło ruch kratki w podobny sposób oscylacyjny (Rycina 3B...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda testu behawioralnego OKR ma kilka zalet. Po pierwsze, stymulacja wizualna generowana komputerowo rozwiązuje wewnętrzne problemy związane z fizycznymi bębnami. Rozwiązując problem polegający na tym, że bębny fizyczne nie wspierają systematycznego badania częstotliwości przestrzennej, kierunku lub strojenia kontrastu8, wirtualny bęben umożliwia zmianę tych parametrów wizualnych na zasadzie próba po próbie, ułatwiając w ten sposób systematyczną i ilościową analizę selektywn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Yingtian He za udostępnienie danych dotyczących strojenia kierunku. Prace te były wspierane przez granty z Canadian Foundation of Innovation i Ontario Research Fund (projekt CFI/ORF nr 37597), NSERC (RGPIN-2019-06479), CIHR (Project Grant 437007) oraz Connaught New Researcher Awards.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Etap translacyjny 2DThorlabsXYT1
Żywica akrylowaLang DentalB1356Do mocowania płyty głowy na czaszce i ochrony czaszki
BupiwakainaSTERIMAXST-BX223Bupiwakaina do wstrzykiwań BP 0,5%. Znieczulenie miejscowe
KarprofenRIMADYL8507-14-1Analgezja
Sprężone powietrzeDust-Off
Maśćdo oczu AlconSystaneDo utrzymywania nawilżenia oczu
Karta graficznaNVIDIAGeforce GTX 1650 lub Quadro P620.Do generowania pojedynczego ekranu na trzech monitorach
Poduszka grzewczaKent ScientificHTP-1500Do utrzymywania temperatury ciała
Szybka kamera na podczerwień (IR)Teledyne DalsaG3-GM12-M0640Do nagrywania rotacji gałek ocznych
LEDDigikeyPDI-E803-NDDo odniesienia CR i oświetlenia oka
Lusterko IREdmund optyka64-471Do odbijania obrazu oka
IsofluranFRESENIUS KABICP0406V2
LabviewWersja instrumentów krajowych2014śledzenie ruchu gałek ocznych
Dzwonek z mleczanamiBAXTERJB2324Zaopatrzenie w wodę i energię
Mieszanka lidokainy i epinefrynyDentsply Sirona82215-1XYLOCAINE. Znieczulenie miejscowe
Miernik luminancjiKonica MinoltaLS-150do kalibracji monitorów
MatlabMathWorkswersja xxxanaliza ruchów gałek ocznych
Meyhoefer CuretteWorld Precision Instruments501773Do skrobania czaszki i usuwania powięzi
Szkiełko kalibracyjne mikroskopuAmscopeMR095do pomiaru powiększenia Monitory wideookulograficzne
Acer B247WStymulacja wizualna
Filtr o neutralnej gęstościFiltry Lee299do generowania skotopowej stymulacji wzrokowej
Gogle do widzenia bliskiegoAlpha optykaAO-3277do skotopowego OKR
FotodiodaDigikeyTSL254-R-LF-NDdo synchronizacji stymulacji wzrokowej i wideookulografii
Chlorowodorek pilokarpinySigma-AldrichP6503
PostThorlabsTR1.5
Uchwyt na słupekThorlabsPH1
PsychoPywersja oprogramowania open sourcexxxzestaw narzędzi do stymulacji wizualnej
NożyczkiRWDS12003-09Do usuwania skóry
SuperglueKrazy Typ kleju: uniwersalny. Do przylegania nakrycia głowy na czaszce
IR

Bibliografia

  1. Gerhard, D. Neuroscience. 5th Edition. Yale Journal of Biology and Medicine. , (2013).
  2. Distler, C., Hoffmann, K. P. The Oxford Handbook of Eye Movement. , Oxford University Press. 65-83 (2011).
  3. Sereno, A. B., Bolding, M. S. Executive Functions: Eye Movements and Human Neurological Disorders. , Elsevier. (2017).
  4. Giolli, R. A., Blanks, R. H. I., Lui, F. The accessory optic system: basic organization with an update on connectivity, neurochemistry, and function. Progress in Brain Research. 151, 407-440 (2006).
  5. Liu, B. H., Huberman, A. D., Scanziani, M. Cortico-fugal output from visual cortex promotes plasticity of innate motor behaviour. Nature. 538 (7625), 383-387 (2016).
  6. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  7. Stahl, J. S., van Alphen, A. M., De Zeeuw, C. I. A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. Journal of Neuroscience Methods. 99 (1-2), 101-110 (2000).
  8. Faulstich, B. M., Onori, K. A., du Lac, S. Comparison of plasticity and development of mouse optokinetic and vestibulo-ocular reflexes suggests differential gain control mechanisms. Vision Research. 44 (28), 3419-3427 (2004).
  9. Katoh, A., Kitazawa, H., Itohara, S., Nagao, S. Dynamic characteristics and adaptability of mouse vestibulo-ocular and optokinetic response eye movements and the role of the flocculo-olivary system revealed by chemical lesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (13), 7705-7710 (1998).
  10. Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: application to genetic and drug-induced variation. PLoS One. 3 (4), 2055(2008).
  11. Cameron, D. J., et al. The optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (80), 50832(2013).
  12. de Jeu, M., De Zeeuw, C. I. Video-oculography in mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3971(2012).
  13. Kodama, T., du Lac, S. Adaptive acceleration of visually evoked smooth eye movements in mice. The Journal of Neuroscience. 36 (25), 6836-6849 (2016).
  14. Doering, C. J., et al. Modified Ca(v)1.4 expression in the Cacna1f(nob2) mouse due to alternative splicing of an ETn inserted in exon 2. PLoS One. 3 (7), e2538(2008).
  15. Shi, C., et al. Optimization of optomotor response-based visual function assessment in mice. Scientific Reports. 8 (1), 9708(2018).
  16. Waldner, D. M., et al. Transgenic expression of Cacna1f rescues vision and retinal morphology in a mouse model of congenital stationary night blindness 2A (CSNB2A). Translational Vision Science & Technology. 9 (11), 19(2020).
  17. Tabata, H., Shimizu, N., Wada, Y., Miura, K., Kawano, K. Initiation of the optokinetic response (OKR) in mice. Journal of Vision. 10 (1), 1-17 (2010).
  18. Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Current Biology. 32 (19), 4286-4298 (2022).
  19. Harris, S. C., Dunn, F. A. Asymmetric retinal direction tuning predicts optokinetic eye movements across stimulus conditions. eLife. 12, e81780(2023).
  20. van Alphen, B., Winkelman, B. H., Frens, M. A. Three-dimensional optokinetic eye movements in the C57BL/6J mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 623-630 (2010).
  21. Stahl, J. S. Calcium channelopathy mutants and their role in ocular motor research. Annals of the New York Academy of Sciences. 956, 64-74 (2002).
  22. Endo, S., et al. Dual involvement of G-substrate in motor learning revealed by gene deletion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (9), 3525-3530 (2009).
  23. Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
  24. Burroughs, S. L., Kaja, S., Koulen, P. Quantification of deficits in spatial visual function of mouse models for glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3654-3659 (2011).
  25. Wakita, R., et al. Differential regulations of vestibulo-ocular reflex and optokinetic response by β- and α2-adrenergic receptors in the cerebellar flocculus. Scientific Reports. 7 (1), 3944(2017).
  26. Dehmelt, F. A., et al. Spherical arena reveals optokinetic response tuning to stimulus location, size, and frequency across entire visual field of larval zebrafish. eLife. 10, e63355(2021).
  27. Magnusson, M., Pyykko, I., Jantti, V. Effect of alertness and visual attention on optokinetic nystagmus in humans. American Journal of Otolaryngology. 6 (6), 419-425 (1985).
  28. Collins, W. E., Schroeder, D. J., Elam, G. W. Effects of D-amphetamine and of secobarbital on optokinetic and rotation-induced nystagmus. Aviation, Space, and Environmental Medicine. 46 (4), 357-364 (1975).
  29. Reimer, J., et al. Pupil fluctuations track fast switching of cortical states during quiet wakefulness. Neuron. 84 (2), 355-362 (2014).
  30. Sakatani, T., Isa, T. PC-based high-speed video-oculography for measuring rapid eye movements in mice. Neuroscience Research. 49 (1), 123-131 (2004).
  31. Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neuroscience Research. 58 (3), 324-331 (2007).
  32. Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
  33. Bradley, M. M., Miccoli, L., Escrig, M. A., Lang, P. J. The pupil as a measure of emotional arousal and autonomic activation. Psychophysiology. 45 (4), 602-607 (2008).
  34. Hess, E. H., Polt, J. M. Pupil size as related to interest value of visual stimuli. Science. 132 (3423), 349-350 (1960).
  35. Di Stasi, L. L., Catena, A., Canas, J. J., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S. Saccadic velocity as an arousal index in naturalistic tasks. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (5), 968-975 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wideookulografiaunieruchomienie głowywirtualna stymulacja wzrokowakrzywe dostrojeniakwantyfikacja ruchów gałek ocznychczęstotliwość przestrzennawzrokowo-motoryczna naukaplastyczność okularna
Kwantyfikacja selektywności cech wzrokowych odruchu optokinetycznego u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.