Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Summary

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Abstract

Międzypokoleniowe dziedziczenie epigenetyczne (TEI) pozwala na przekazywanie informacji przez linię zarodkową bez zmiany sekwencji genomu, poprzez czynniki takie jak niekodujące RNA i modyfikacje chromatyny. Zjawisko dziedziczenia interferencji RNA (RNAi) u nicienia Caenorhabditis elegans jest skutecznym modelem do badania TEI, który wykorzystuje krótki cykl życiowy tego organizmu modelowego, jego samorozprzestrzenianie się i przezroczystość. W dziedziczeniu RNAi narażenie zwierząt na RNAi prowadzi do wyciszenia genów i zmienionych sygnatur chromatyny w locus docelowym, które utrzymują się przez wiele pokoleń przy braku początkowego wyzwalacza. Protokół ten opisuje analizę dziedziczenia RNAi u C. elegans przy użyciu reportera białka zielonej fluorescencji jądrowej (GFP) wyrażonego w linii zarodkowej. Wyciszanie reporterowe jest inicjowane przez karmienie zwierząt bakteriami wykazującymi ekspresję dwuniciowego RNA ukierunkowanego na GFP. W każdym pokoleniu zwierzęta są pasażowane w celu utrzymania zsynchronizowanego rozwoju, a wyciszanie genów reporterowych jest określane za pomocą mikroskopii. W wybranych pokoleniach populacje są zbierane i przetwarzane pod kątem immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) w celu zmierzenia wzbogacenia modyfikacji histonów w locus reporterowym GFP. Ten protokół badania dziedziczenia RNAi można łatwo modyfikować i łączyć z innymi analizami w celu dalszego badania czynników TEI w małych szlakach RNA i chromatyny.

Introduction

Dziedziczenie epigenetyczne pozwala na przekazywanie informacji regulacyjnych genów między pokoleniami, a zatem może pozwolić środowisku lub doświadczeniom rodziców wpływać na ich potomstwo. U C. elegans wyciszenie genu linii zarodkowej zainicjowane przez egzogenny dwuniciowy RNA (dsRNA) może być dziedziczone przez wiele pokoleń u potomstwa, które nie jest narażone na oryginalny wyzwalacz^1,2,3,4. Proces ten, określany jako dziedziczenie interferencji RNA (RNAi), jest jednym z kilku powiązanych epigenetycznych zjawisk wyciszania u C. elegans, w tym wielopokoleniowego wyciszania inicjowanego przez piRNA^2,5, paramutacja/RNAe (wyciszanie epigenetyczne indukowane RNA)^6,7,8 oraz wyciszanie inicjowane przez tablicę multikopii⁹, które mają pokrywające się, ale odrębne wymagania dotyczące małych mechanizmów regulacji RNA i chromatyny. W egzogennym RNAi C. elegans, dsRNA jest przetwarzane na małe interferujące RNA (siRNA), które działają w kompleksie z pierwotnymi białkami Argonaute, aby rozpoznać ich docelowe mRNA. To celowanie prowadzi do amplifikacji wtórnych siRNA, które łączą się z wtórnymi Argonautami w celu wyciszenia docelowego mRNA zarówno przez cytoplazmatyczne, jak i jądrowe szlaki wyciszania. W przypadku celów RNAi wyrażanych w linii zarodkowej, jądrowy wtórny Argonaute HRDE-1 i dodatkowe jądrowe czynniki RNAi celują w powstające transkrypty, powodując represję transkrypcyjną i rekrutację metylotransferaz histonowych do deponowania represyjnych znaczników chromatyny, w tym H3K9me3¹⁰. Histon H3K9me3 sprzyja dziedzicznemu wyciszaniu transgenów białka zielonej fluorescencji (GFP) wyrażanego przez linię zarodkową poprzez dziedziczenie RNAi^11,12.

Celem tego protokołu jest użycie transgenu wyrażającego białko fuzyjne GFP-histon w linii zarodkowej jako reportera do dziedziczenia RNAi oraz zbadanie zmian w modyfikacjach histonów w locus transgenu reporterowego za pomocą immunoprecypitacji chromatyny i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (ChIP-qPCR). Protokół ten opisuje ustandaryzowane podejście do podawania RNAi na płytkach w celu zainicjowania wyciszania reporterowego. Przedstawiono w nim również szczegółowy harmonogram pasażowania zwierząt między pokoleniami poprzez izolowanie zarodków w macicy od ciężarnych dorosłych osobników za pomocą alkalicznego podchlorynu ("bielenie"). Opisano również metody i reprezentatywne dane do monitorowania częstości wyciszania GFP w podgrupie populacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz dla histonu H3K9me3 ChIP-qPCR. Testy dziedziczenia RNAi oparte na reporterach zapewniają wysoce elastyczny system do funkcjonalnej analizy ról czynników genetycznych i środowiskowych w regulacji epigenetycznej^13,14, a badania genetyczne wykorzystujące takie reportery zidentyfikowały oba geny, które są wymagane dla^2,3,15 oraz geny, które negatywnie regulują^16,17 czas trwania międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego.

Protocol

UWAGA: Harmonogram testu znajduje się w Rysunek 1.

1. Przygotowanie płytek z pożywką RNAi dla nicieni (RNAi-NGM)

1. Usunąć E. coli HT115(DE3) zawierający GFP lub kontrolne wektory RNAi z zapasów glicerolu na płytki agarowe Luria-Bertani (LB) uzupełnione 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować bakterie przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Następnego dnia przygotuj płytki RNAi-NGM (1,7% [w/v] agar, 0,3% [w/v] NaCl, 0,25% [w/v] pepton, 1 mM CaCl₂, 5 μg/ml cholesterolu, 25 mM buforu fosforanu potasu [pH 6,0], 1 mM MgSO₄, 25 μg/ml karbenicyliny i 5 mM izopropylu β-d-1-tiogalaktopiranozydu [IPTG]) zgodnie ze standardowym protokołem¹⁸.
   1. Dla każdego szczepu w teście należy przygotować co najmniej sześć płytek RNAi-NGM wysianych RNAi GFP (dwie płytki na każdą z trzech kontrprób biologicznych) i dwie płytki RNAi-NGM wysiane kontrolnym RNAi (jedna kontrpróba biologiczna).
   2. Luźno przykryj talerze folią, aby chronić je przed światłem i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej do wyschnięcia.
3. Tego samego dnia, w którym należy wlać płytkę RNAi-NGM, przygotować 4 ml płynnych kultur bakterii RNAi.
   1. W sterylnych warunkach do probówek hodowlanych wsypać 4 ml bulionu LB uzupełnionego 10 μg/ml tetracykliny i 100 μg/ml ampicyliny. Pobrać pojedyncze kolonie z płytek agarowych LB do każdej probówki i inkubować przez noc, wytrząsając przez około 16 godzin w temperaturze 37 °C.
4. Wysiewaj bakterie RNAi na płytki RNAi-NGM.
   1. Po nocnym wzroście zmierzyć gęstość optyczną (OD₆₀₀) kultur, używając rozcieńczenia bakterii w stosunku 1:5 bulionem LB.
   2. Rozcieńczyć bakterie RNAi do względnego OD₆₀₀ wynoszącego 2 za pomocą bulionu LB uzupełnionego 10 μg/ml tetracykliny i 100 μg/ml ampicyliny.
   3. W sterylnych warunkach dodać 150 μl bakterii kontrolnych lub GFP RNAi na każdą płytkę RNAi-NGM.
   Przed użyciem przykryj
   4. talerze folią i pozwól bakteriom rosnąć przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej przed użyciem.
      UWAGA: Niewykorzystane płytki RNAi-NGM można przechowywać odwrócone do góry dnem do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C w szczelnie zamkniętym pojemniku w ciemności.

2. Rozpoczęcie testu dziedziczenia RNAi: bielenie i sianie zarodków dla pokolenia P0

UWAGA: Przed rozpoczęciem testu dziedziczenia RNAi, robaki zawierające reportera GFP mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]⁷ powinny być utrzymywane w stanie nietkniętym w temperaturze 21 °C przez co najmniej dwa pokolenia.

1. Na 4 dni (96 godzin) przed rozpoczęciem testu dziedziczenia RNAi (Rysunek 1), wybierz trzy lub cztery grawitacyjne dorosłe osobniki na każdą 35-milimetrową standardową płytkę NGM wysianą bakteriami OP50-1.
   UWAGA: Wystarczą trzy płytki NGM na szczep. W przypadku szczepów o upośledzonej płodności może być wymagane więcej niż cztery zwierzęta na płytkę.
2. Po 4 dniach upewnij się, że dorosła populacja zaczęła składać zarodki na płytce. Zmyj robaki z płytek do probówek o pojemności 1,5 ml za pomocą 800 μl buforu M9 uzupełnionego Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH₂PO₄, 42 mM Na₂HPO₄, 86 mM NaCl, 1mM MgSO₄, 0,01% (v/v) TX-100). Powtórz mycie i basen w tej samej probówce.
3. Odizolować zarodki od populacji przez wybielanie w następujący sposób.
   1. Przygotować roztwór wybielający z wybielaczem (6% podchloryn sodu) i 10 N NaOH w stosunku objętościowym 1,5:1. Przygotować wystarczającą ilość, tak aby można było użyć 250 μl na każdą próbkę.
   2. Odwirować probówki o pojemności 1,5 ml z robakami o sile 1 000 x g przez 1,5-2 minuty.
   3. Odessać supernatant, pozostawiając 100 μl, nie naruszając "osadu" robaka. Alternatywnie rurki można pozostawić na około 2 minuty, aby robaki mogły się uspokoić przed zasysaniem.
   4. Dodać 650 μl ddH₂O do każdej probówki, aby uzyskać końcową objętość 750 μL.
      UWAGA: Poniższe kroki są zależne od czasu.
   5. Dodaj 250 μl roztworu wybielającego do każdej probówki i uruchom minutnik.
   6. Co 1-2 minuty dokładnie wymieszaj rurki. Po 5 minutach sprawdź robaki pod stereoskopem, aby monitorować degradację dorosłych.
   7. Kontynuuj wirowanie, aż robaki całkowicie się rozpuszczą i pozostaną tylko zarodki. Natychmiast odwirować probówki o sile 1 000 x g przez 1,5 min.
      UWAGA: Bielenie jest zazwyczaj zakończone w ciągu 6-7 minut, ale powinno być monitorowane pod stereoskopem w powiększeniu wystarczającym do obserwacji uwolnionych zarodków (40x). Nie pozostawiaj robaków w wybielaczu przez dłuższy czas, ponieważ zagrozi to zarodkom.
   8. Po odwirowaniu odessać supernatant i pozostawić około 50-100 μl. Dodać 1 ml buforu M9 z TX-100 do przemycia i wymieszania przez wirowanie. Odwirować ponownie przy 1 000 x g przez 1,5-2 minuty i umyć jeszcze co najmniej dwa razy.
   9. Odessać supernatant z końcowego płukania i pozostawić około 100 μl w probówce. Wymieszaj przez wirowanie. Odpipetować 2 μl z każdej probówki dwukrotnie na oznakowane szkiełko podstawowe. Policz zarodki za pomocą licznika zliczającego, aby oszacować stężenie zarodków na mikrolitr.
      UWAGA: Szkiełka z wieloma oszronionymi studzienkami mogą być tutaj używane do liczenia powtórzeń wielu szczepów. Szkiełka do liczenia można myć i używać ponownie.
4. Aby rozpocząć częściowo zsynchronizowany wzrost populacji, wymieszaj i pipetuj objętość zawierającą 250 zarodków na każdej płytce RNAi-NGM. Dla każdej repliki należy użyć dwóch płytek. Poczekaj, aż płyn się wchłonie.
5. W przypadku pokolenia P0 poddanego działaniu RNAi inkubować w temperaturze 21 °C przez 4 dni (96 godzin) (od zarodków do dorosłości). Czas może się różnić w zależności od genotypu.

Rysunek 1: Schemat testu dziedziczenia RNAi. Proponowany harmonogram przygotowania płytki RNAi-NGM i konfiguracji testu dziedziczenia RNAi. Gravid dorosłe osobniki są zbierane w dniu -4 na talerze NGM wysiane OP50-1. Po 4 dniach dorosłe potomstwo jest bielone, a zarodki są siane na płytkach RNAi-NGM. Wytwarzanie P0 poddaje się działaniu RNAi przez 4 dni w temperaturze 21 °C. Gdy robaki osiągną dorosłość, repliki są pasażowane przez bielenie i oceniane pod kątem ekspresji GFP linii zarodkowej w każdym pokoleniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przekazywanie i ocenianie każdego pokolenia pod kątem ekspresji GFP linii zarodkowej

UWAGA: Aby ułatwić punktację, użyj płyty winylowej, aby stworzyć podkładki agarozowe z liniowymi grzbietami, aby wyrównać robaki. Ta metoda została zaadaptowana z Rivera Gomez i Schvarzstein¹⁹.

1. Przygotować 1% (w/v) agarozy, rozpuszczając agarozę w ddH₂O w małej kolbie, ogrzewając w kuchence mikrofalowej. Dodaj mieszadło i przykryj folią. W przypadku ponownego topienia podgrzej agarozę na płycie grzejnej w temperaturze 200 °C, mieszając. Po stopieniu zmniejszyć ogień do 80 °C.
2. Zmyj robaki z płytek NGM za pomocą 800 μl buforu M9 z TX-100 do probówki o pojemności 1,5 ml. Umyj talerze dwukrotnie, aby usunąć wszystkie ciężarne dorosłe osobniki. Sprawdź tabliczki pod stereoskopem, aby upewnić się, że zwierzęta zostały skutecznie zebrane.
3. Odwirować probówki o stężeniu 1 000 x g przez 1,5-2 minuty lub pozostawić robaki na 2 minuty, aby się uspokoiły. Odessać supernatant i pozostawić 100 μl, nie naruszając "osadu" robaka.
4. Przygotuj podkładki agarozowe do montażu robaków w następujący sposób.
   1. Umieść kroplę stopionej 1% (w/v) agarozy na płycie winylowej (opisanej wcześniej¹⁹) za pomocą szklanej pipety Pasteura (z odłamanym wąskim końcem).
   2. Ustaw szkiełko w taki sposób, aby linie na płycie były poziome lub pionowe i szybko umieść szkiełko na kropli agarozy. Odczekaj około 30 s przed wyjęciem szklanego szkiełka z płyty.
      UWAGA: W przypadku oceniania wielu genotypów przydatne może być wykonanie większej podkładki agarozowej na jednym szkiełku i przecięcie jej na pół za pomocą ostrza.
5. Zamontuj robaki na podkładkach agarozowych.
   1. Pod stereoskopem dodać około 5 μl 5 mM lewamizolu do podkładki agarozowej. Rozcieńczenie lewamizolu powinno być świeże co tydzień.
   2. Delikatnie strzepnij rurki z robakami, aby wymieszać i przenieść 5-10 μl robaków na podkładkę agarozową. Oszacuj liczbę robaków na oko podczas ich dodawania, tak aby na replikę przypadało około 40 robaków.
   3. Ułóż robaki w rzędach za pomocą szpikulca do rzęs, aby ułatwić punktację. Dodaj szklane szkiełko nakrywkowe.
      UWAGA: Zjeżdżalnie ze zwierzętami zamontowanymi w ten sposób mogą wytrzymać kilka godzin, zanim wyschną.
6. Odizolować zarodki od pozostałych zwierząt przy użyciu protokołu wybielania (patrz krok 2.3) przed nacięciem szkiełek. Umieść 250 zarodków na 35 mm płytkach NGM wysianych OP50-1²⁰. Po wchłonięciu płynu odwrócić płytki i umieścić je z powrotem w inkubatorze o temperaturze 21 °C.
7. Użyj stereoskopu fluorescencji z zestawem filtrów GFP. Policz i zapisz liczbę robaków GFP dodatnich i ujemnych GFP na szkiełkach dla każdej repliki za pomocą licznika zliczania.
   UWAGA: Robaki GFP dodatnie będą miały ekspresję jądrową GFP w linii zarodkowej i zarodkach w macicy. Linie zarodkowe robaków GFP ujemnych nie będą fluoryzować, jednak gdy GFP zacznie się ponownie włączać w późniejszych pokoleniach, fluorescencja może być słaba. Pomocne może być zamontowanie dodatkowych nietransgenicznych szczepów robaków, aby uwzględnić zaobserwowaną autofluorescencję.
8. Przejście populacji przez bielenie, jak opisano powyżej, mniej więcej co 4 dni (96 godzin) w temperaturze 21 °C. Alternatywnie, pasażowanie można wykonać według naprzemiennego harmonogramu 3-dniowego/4-dniowego dla wygody. Umieść dodatkowe ~ 50 zarodków dla krótszych pokoleń pasażujących, jeśli są naprzemiennie, ponieważ może wystąpić niższa wydajność zarodków po 72 godzinach
   UWAGA: Utrzymuj stały czas pasażowania pokolenia P0 na poziomie 4 dni po posiewie zarodków.

4. Kolekcja zwierząt dla ChIP

UWAGA: Liczba zwierząt i czas zależy od szczepu, stadium rozwoju, epitopu i liczby celów immunoprecypitacji (IP). W poniższym przykładzie zbierz zwierzęta dla trzech adresów IP: H3K9me3, histon H3 i kontrola IgG. Protokół ChIP został zaadaptowany z Askjaer et al.²¹.

1. Przed pobraniem próbki ChIP należy rozszerzyć poprzednią generację testu dziedziczenia RNAi o dodatkowe trzy płytki NGM (do co najmniej czterech płytek na powtórzenie). Rośnie przez 4 dni w temperaturze 21 °C.
2. Wybielać graitujące dorosłe osobniki, aby wyizolować zarodki (patrz krok 2.3).
3. Dla każdego szczepu należy umieścić około 3 500 zarodków na 14 płytkach (250 na płytkę) i rosnąć przez 3 dni w temperaturze 21 °C do stadium młodego dorosłego osobnika.
4. Umyj zwierzęta w probówkach o pojemności 1,5 ml z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 0,01% (v/v) TX-100 (PBS/TX). Wirować przy 1.000 x g przez 2 min. Odessać i połączyć zwierzęta z jednego szczepu w jednej probówce i umyć jeszcze trzy razy co najmniej 1 ml PBS/TX.
5. Odessać do 1 000 μl, odwrócić w celu wymieszania i trzykrotnie policzyć liczbę zwierząt w 3 μl (patrz krok 2.3.9).
6. Oblicz stężenie zwierząt i przenieś objętość odpowiadającą 3,000 zwierząt do nowej probówki w celu sieciowania formaldehydu.
7. Upewnij się, że całkowita objętość jest co najmniej 10 razy większa niż objętość granulki robaka.

5. Sieciowanie formaldehydu

UWAGA: Pracuj z formaldehydem w dygestorium, aby zapobiec ekspozycji na opary.

1. Dodać formaldehyd (1,8% stężenia końcowego) do probówki zawierającej robaki. Obracać w temperaturze pokojowej przez 6 minut.
2. Natychmiast zamrozić w ciekłym azocie. Na tym etapie eksperyment można przerwać, a próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C.
3. Rozmrażać usieciowaną próbkę w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej przez 3 minuty i obracać przez 16 minut w temperaturze pokojowej.
4. Dodać 1,25 M glicyny do końcowego stężenia 125 mM i obracać przez 5 min.
   UWAGA: Do czasu elucji kulek magnetycznych należy przechowywać próbki na lodzie lub w temperaturze 4 °C i używać lodowatych.
5. Odwirować próbkę o masie 1 000 x g przez 3 minuty. Przemyć trzykrotnie 1 ml PBS/TX za każdym razem. Przemyć dwukrotnie 1 ml buforu do sporządzania zawiesiny (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego [EDTA], 0,01% TX-100, inhibitora proteazy [jedna tabletka na 5 ml]).
6. Po ostatnim praniu pozostaw wystarczającą ilość bufora, aby upewnić się, że całkowita objętość jest co najmniej trzykrotnie większa niż objętość granulki i minimum ~100 μL.

6. Sonikacja

UWAGA: Parametry sonikacji zależą od rodzaju i modelu sonikatora oraz stadium zwierzęcego. Parametry takie jak objętość i stężenie próbki, interwały włączania/wyłączania, liczba cykli i ustawienie mocy muszą być optymalizowane empirycznie. Na przykład, w trakcie trwania sonikacji, monitoruj lizę robaków za pomocą testu białkowego i określ, kiedy stężenie osiąga plateau. Ponadto monitoruj, kiedy średnia wielkość ścinania genomowego DNA wynosi około 200-1000 pz za pomocą elektroforezy DNA, oczyszczonego po odwróceniu sieciowania, na 1,5% żelu agaroza/tris-octan-EDTA (TAE).

1. Zmierz objętość próbek z poprzedniego etapu. Wymieszać i podsycić 90-120 μl do probówki do sonikacji polistyrenu.
2. Dodać równą objętość buforu do sporządzania zawiesiny zawierającego 2x detergenty (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,2% deoksycholanu sodu, 0,7% sarkozylu).
3. Sonikować w kąpieli wodnej z mocą 50% przez 7 minut (20 s wł./40 s wyłączenia) w temperaturze 4 °C. Delikatnie wymieszać pipetując. Powtarzaj sonikację przez dodatkowe 7 minut.
4. Przenieś sonikowany lizat do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 0,5 objętości buforu do sporządzania zawiesiny bez detergentów (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA) (np. dodać 100 μl buforu do 200 μl próbki).
5. Wirować przy 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zachować supernatant lizatu i przenieść do nowej probówki.
6. Opcjonalnie należy wykonać test białka, aby określić stężenia każdego lizatu. Ten krok może być przydatny w przypadku dużych ilości próbek lub porównań między testami. Jednak standaryzacja liczby zwierząt, jak opisano powyżej, działa dobrze w przypadku opisanych tutaj ilości próbek, ponieważ istnieje lepsza korelacja z wydajnością chromatyny/DNA określoną za pomocą qPCR.

7. Immunoprecypitacja

UWAGA: Skaluj ilość przeciwciał i kulek magnetycznych do objętości i stężenia lizatu.

1. Podzielić supernatant lizatu na cztery porcje: trzy równe objętości dla każdego IP i 10% objętości jednego IP jako wejście (np. 100 μL IP #1, 100 μL IP #2, 100 μL IP #3, 10 μL Wejścia). Przenieś lizat IP do probówki PCR o pojemności 200 μl i przechowuj wejściowy lizat w temperaturze -20 °C w probówce o pojemności 1,5 ml.
2. Dodaj 0,5 μg przeciwciała anty-H3K9me3, przeciwciała antyhistonowego H3 lub IgG do odpowiedniej próbki IP. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc z rotacją.
3. Następnego dnia do pojedynczej probówki o pojemności 1,5 ml należy podać 9 μl kulek magnetycznych pokrytych białkiem G na IP. Umyj kulki dwukrotnie 1 ml FA-150 (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 1% TX-100, 0,1% deoksycholanu sodu).
4. Ponownie zawiesić kulki magnetyczne w buforze FA-150 do pierwotnej objętości pobranej z zapasu w kroku 7.3 powyżej. Dodaj 7,5 μl do każdego adresu IP. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny na zmianę.

8. Mycie i elucja

UWAGA: Aby upewnić się, że kulki magnetyczne nie wyschną, dodaj szybko każdy bufor do płukania lub elucji po zaessaniu poprzedniego płukania.

1. Za każdym razem używaj 0,2-1 ml następujących roztworów buforowych, aby umyć kulki. Zbierz koraliki na stojaku magnetycznym, aby zassać pranie. Inkubować każde płukanie w temperaturze 4 °C przez 5 minut z rotacją. Postępuj zgodnie z poniższą kolejnością.
   1. Umyj dwukrotnie za pomocą FA-150.
   2. Umyć raz za pomocą FA-1M (FA-150 z 1 M NaCl).
   3. Umyć raz za pomocą FA-0,5M (FA-150 z 0,5 M NaCl). Przenieś do nowej probówki PCR.
   4. Przemyć raz TE-LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1% IGEPAL CA-630, 1% deoksycholan sodu).
   5. Umyć dwukrotnie TE+ (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 0,005% IGEPAL CA-630).
      UWAGA: Kontynuuj przetwarzanie próbki w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej.
2. Zassać ostatni bufor do płukania. Zawiesić kulki magnetyczne za pomocą 50 μl buforu elucyjnego ChIP (200 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1% dodecylosiarczanu sodu [SDS]) i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
3. Elucja w temperaturze 65 °C przez 15 minut w termomikserze z mieszaniem z prędkością 1 000 obr./min przez 5 s co minutę.
4. Zbierz koraliki na stojaku magnetycznym i przenieś supernatant do nowej probówki.
5. Powtórzyć elucję z kolejnymi 50 μl buforu elucyjnego ChIP. Połącz supernatanty w sumie 100 μl. Przystąp do odwrotnego sieciowania i elucji DNA, jak opisano poniżej.

9. Odwrotne sieciowanie i elucja DNA

1. Rozmrozić wejściową próbkę lizatu. Uzupełnić do 100 μl buforem elucyjnym ChIP.
2. Dodaj 16,5 μg RNazy A do każdej próbki IP i wejściowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
3. Dodać 40 μg proteinazy K i inkubować w temperaturze 55 °C przez 2 godziny. Następnie inkubować w temperaturze 65 °C przez noc.
4. Schłodzić próbki do temperatury pokojowej i oczyścić DNA za pomocą zestawu do kolumn wirowych.

10. Konfiguracja i uruchomienie reakcji qPCR

UWAGA: Starter, ustawienie reakcji i parametry termocyklera powinny być zmodyfikowane tak, aby odpowiadały zaleceniom producenta dla używanej mieszanki reakcyjnej qPCR.

1. Przygotuj zestawy starterów ukierunkowane na reporter RNAi GFP oraz regiony kontrolne dodatniego i ujemnego wzbogacenia H3K9me3. Temperatura topnienia podkładu wynosi 60 °C. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z sekwencjami starterów.
2. Dla wejściowego DNA wykonaj cztery czterokrotne seryjne rozcieńczenia (np. 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).
   UWAGA: IP DNA może być używane bezpośrednio lub rozcieńczone (np. 1:2 lub 1:3), aby umożliwić więcej reakcji. Przydatność rozcieńczenia musi być określona empirycznie, ponieważ może to mieć wpływ na działanie qPCR.
3. Uporządkuj wszystkie reakcje odpowiadające jednemu zestawowi starterów na jednej płytce PCR. Skonfiguruj techniczne zduplikowane reakcje dla każdego rozcieńczenia wejściowego DNA i każdej próbki DNA IP. Każda 10 μl reakcji zawiera 1,5 μl wejściowego lub IP DNA (lub buforu elucyjnego jako kontrolę), główną mieszankę qPCR (1x stężenie końcowe), starter do przodu i starter do tyłu (stężenie końcowe 400 nM dla każdego startera).
4. Na termocyklerze działającym w czasie rzeczywistym uruchom następujący program: początkowa denaturacja: 95 °C przez 4 min; amplifikacja i detekcja fluorescencji: 40 cykli po 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s z odczytem płytki; końcowe wydłużenie: 60 °C przez 5 min; krzywa topnienia: od 60 °C do 90 °C w krokach co 0,5 °C, 5 s na krok.

11. Określanie skuteczności amplifikacji i weryfikacja specyfiki produktu

1. Dla każdego zestawu rozcieńczeń wejściowego DNA wykreślić cztery punkty danych z [log10(1/rozcieńczenie)] na osi x i [Input Cq] na osi y. Określ nachylenie linii najlepszego dopasowania.
2. Oblicz wydajność wzmocnienia. Idealne zestawy podkładów powinny konsekwentnie wykazywać skuteczność 95%-100%.
   
3. Sprawdź, czy wszystkie reakcje mają jeden ostry szczyt krzywej topnienia i czy reakcje z tym samym zestawem starterów mają tę samą temperaturę topnienia. Wielokrotne piki lub różne temperatury topnienia mogą wskazywać na niespecyficzne wzmocnienie.
4. Opcjonalnie przeprowadź reakcje na standardowym 2% żelu agarozowym/TAE w temperaturze pokojowej, aby zweryfikować rozmiar prążka produktu.

12. Obliczanie procentu danych wejściowych

1. Obliczyć współczynnik rozcieńczenia wejściowego. Ponieważ 10% objętości lizatu IP zostało zapisane jako dane wejściowe, współczynnik rozcieńczenia dla rozcieńczenia 1:5 wejściowego DNA wynosi 50.
2. Określić współczynnik rozcieńczenia IP. Jeśli DNA IP nie zostanie rozcieńczone przed qPCR, wówczas współczynnik rozcieńczenia wynosi 1.
3. Obliczyć różnicę Cq między IP a danymi wejściowymi skorygowaną o współczynniki rozcieńczenia.
   
4. Obliczanie procentu Input.
   

Results

Zwierzęta będące nosicielami histonu H2B GFP wyrażonego w linii zarodkowej [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 reporter (Rysunek 2A) były narażone na GFP RNAi lub RNAi kontrolne poprzez karmienie i pasażowane zgodnie z opisem w protokole i Rysunek 1. Jądrowy sygnał GFP w linii zarodkowej oceniano ręcznie za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego dla próbki populacji w każdym pokoleniu. Wyciszenie transgenu było w pełni penetrujące u zwierząt z punktowanymi P0 i F1 leczonych GFP RNAi (Figura 2B). W pokoleniu F2 odsetek populacji wykazującej dziedziczne wyciszenie GFP wynosił około 50%. W pokoleniu F5 większość populacji nie wykazywała dziedziczenia wyciszenia, a w pokoleniu F10 nie wykryto dziedziczenia, ponieważ wszystkie zwierzęta wykazywały GFP.

Aby określić zmianę w wzbogaceniu histonu H3K9me3 odpowiadającą wyciszeniu wywołanemu przez RNAi, przeprowadzono ChIP-qPCR na zwierzętach z pokolenia F1 po leczeniu GFP RNAi lub kontrolnym RNAi. Zgodnie z oczekiwaniami, populacja traktowana RNAi GFP wykazywała wyższe poziomy histonu H3K9me3 w miejscu docelowym GFP i w regionie 1,3 kb w dół w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi traktowanymi RNAi (Figura 2C). Specyficzność histonu H3K9me3 ChIP jest wspierana przez wzbogacenie w locus kontroli pozytywnej (clec-18), o którym wiadomo, że jest wzbogacony w ten znak, ale nie w pobliskim locus kontroli ujemnej (hrp-2). Zgodnie z oczekiwaniami we wszystkich loci qPCR, wykryto również wzbogacenie histonu H3 i wzbogacenie w pobliżu tła w immunoprecypitacji kontrolnej IgG. Gdy wzbogacenie ChIP w reporterze jest znormalizowane do locus kontroli pozytywnej clec-18, pokazane jest wyższe wzbogacenie histonu H3K9me3 na GFP RNAi, podczas gdy wzbogacenie histonu H3 jest podobne między kontrolą a traktowaniem GFP RNAi (Figura 2D). Ponieważ nie oczekuje się, że GFP RNAi wpłynie na histon H3K9me3 lub całkowite zajętość histonu H3 w locus clec-18, normalizacja ta łagodzi różnice techniczne, takie jak różnice w wydajności ChIP między próbkami RNAi GFP a kontrolnymi próbkami RNAi. Krotna zmiana poziomów histonu H3K9me3 i histonu H3 między traktowaniami RNAi pokazuje specyficzne dla reportera GFP wzbogacenie histonu H3K9me3, niezależnie od zajętości histonów, po wyciszeniu indukowanym przez RNAi GFP (Figura 2E).

Rysunek 2: Wyciszenie wywołane przez GFP RNAi odpowiada podwyższonemu wzbogaceniu H3K9me3 w miejscu docelowym RNAi. (A) Diagram reportera RNAi GFP wyrażonego w linii zarodkowej mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] z oznaczonymi regionami amplikonu qPCR. (B) Ekspresja GFP oceniona przez pokolenia po podaniu działaniu RNAi w temperaturze 21 °C. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe od dwóch kontrprób biologicznych. (C) ChIP-qPCR kontroli H3K9me3, histonu H3 i IgG u młodych dorosłych F1 z dwóch kontrprób biologicznych. clec-18 i hrp-2 są odpowiednio dodatnimi i ujemnymi loci kontrolnymi dla wzbogacenia H3K9me3. (D) Wzbogacenie H3K9me3 i histonu H3 w reporterze GFP RNAi znormalizowane do locus kontroli pozytywnej clec-18. (E) Zmiana wzbogacenia H3K9me3 i histonu H3 między zwierzętami traktowanymi GFP RNAi i kontrolnymi RNAi, z normalizacją do clec-18. Linia przerywana reprezentuje zmianę zagięcia równą 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W tym protokole dsRNA jest wprowadzane przez karmienie, które stało się standardową metodą u C. elegans¹⁸. W przypadku testów dziedziczenia RNAi podejście żywieniowe zapewnia łatwą metodę uzyskania dużej populacji P0 2,11,12,22,23,24,25. Jednak czas i czas trwania ekspozycji na RNAi wpływa na skuteczność wyciszania transgenu²⁶, a stężenie bakterii RNAi wpływa na trwałość dziedzicznego wyciszania RNAi¹. Dlatego standaryzowane bakterie RNAi i wzrost robaków są ważne dla uzyskania stałego poziomu wyciszenia GFP i czasu trwania dziedziczenia. W tym przypadku zarodki są siane na płytkach RNAi, dzięki czemu zwierzęta P0 są narażone na działanie bakterii RNAi od wyklucia. Alternatywne podejścia polegały na umieszczeniu zsynchronizowanych zwierząt w stadium L1^24,27 lub L4²⁵ na płytkach RNAi-NGM. Ponadto, ponieważ głód i inne stresy wpływają na utrzymanie dziedziczenia RNAi¹³, talerze muszą być monitorowane, aby zapobiec przepełnieniu i wyczerpaniu zapasów żywności. Jako alternatywę dla inicjowania RNAi przez karmienie, niektóre z pionierskich badań dziedziczenia RNAi C. elegans indukowały RNAi poprzez wstrzyknięcie gonad, co zapewnia większą kontrolę stężenia dsRNA ^1,28.

W tym protokole każde pokolenie jest pasażowane jako populacja z alkalicznym traktowaniem podchlorynem, jak opisano wcześniej 16,22,23,24. Leczenie podchlorynem zapewnia, że pokolenie F1 nie zostanie skażone bakteriami RNAi ze środowiska rodzicielskiego²² i zapobiega potencjalnemu niepożądanemu wąskiemu gardłu populacji. Jednak masowe pasażowanie może być również ograniczeniem, ponieważ poszczególne zwierzęta mogą mieć różne wzorce dziedziczenia ^1,29. Alternatywną metodą ustalania każdego pokolenia jest selekcja pojedynczych zwierząt 1,2,9,11,25. Takie podejście pozwala na śledzenie fenotypów w obrębie linii genetycznych i włączanie krzyżówek genetycznych. Analiza pochodzenia może być również korzystna dla fenotypów o niskiej penetracji¹².

Ekspresja białek fluorescencyjnych jest potężnym i wygodnym odczytem wyciszania indukowanego przez RNAi 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Zgodnie z opisem w tym protokole, wyrażenie GFP może być ręcznie oceniane jako ON lub OFF 11,12,15,16,25. Ręczną punktację można dodatkowo udoskonalić, przypisując jakościowe poziomy intensywności ^3,4,14. Alternatywnie, zautomatyzowana ocena intensywności obrazów mikroskopowych 11,12,14,25,27 lub pomiar fluorescencji żywych zwierząt za pomocą cytometrii przepływowej 2 mogą zapewnić ilościowy i wysokoprzepustowy odczyt. Ponieważ jednak ekspresja reporterowa jest ograniczona do linii zarodkowej, zastrzeżenie zautomatyzowanych podejść polega na tym, że muszą one również rozróżniać zwierzęta z wyciszoną ekspresją GFP i zwierzęta bez linii zarodkowej, zwłaszcza jeśli badanie obejmuje mutanty z nieprawidłowym rozwojem linii zarodkowej. Jako alternatywę dla fluorescencji GFP, odwrotna transkrypcja (RT)-qPCR może być stosowana do ilościowego określania docelowych poziomów RNAi pre-mRNAⁱ mRNA 2,16,23,24. Takie podejście zapewnia bardziej bezpośredni odczyt wyciszania, które jest ukierunkowane na RNA i jest szczególnie przydatne w przypadku innych celów RNAi, w których wyciszanie nie wytwarza widocznego fenotypu. Ograniczeniem stosowania sztucznych reporterów GFP jest to, że sekwencje egzogenne i endogenne są różnie regulowane w międzypokoleniowym RNAi¹¹. Badania z celami endogennymi, takimi jak wrażliwy na temperaturę embrionalny śmiertelny allel oma-1(zu405)1,11,16,25, powinny być zatem uważane za podejście uzupełniające do fluorescencyjnych reporterów transgenowych.

Analiza ChIP w kontekście testów dziedziczenia RNAi wymaga porównania między traktowanymi i powtórzonymi próbami. Po pierwsze, aby uwzględnić różnice w materiale wyjściowym między próbkami, sygnał ChIP jest normalizowany do sygnału wejściowego w tym samym miejscu, co "procent wejścia". Równoległe przetwarzanie histonu H3 ChIP pomoże określić, czy jakiekolwiek zmiany modyfikacji histonu odpowiadają zmianom gęstości nukleosomów. Ponadto, ponieważ ChIP jest procesem wieloetapowym, wydajność może się różnić w zależności od próbki. Wybór odpowiednich loci kontroli dodatniej i ujemnej jest przydatny do oceny i porównania stosunku sygnału do szumu między próbkami i eksperymentami. Ponadto, aby ułatwić porównania między próbkami, wartości progowe cyklu qPCR ChIP DNA w miejscu docelowym RNAi są często normalizowane do locus kontrolnego 3,11,15,23,30,31. Aby ocenić efekty leczenia RNAi, porównuje się również stosunek sygnału ChIP w warunkach RNAi poddanych działaniu RNAi w porównaniu z warunkami kontrolnymi lub brakiem RNAi. Ograniczeniem obecnego podejścia jest to, że ChIP przeprowadza się na całych zwierzętach, podczas gdy odpowiedź na leczenie RNAi może być unikalna dla linii zarodkowej. Podejściem do przezwyciężenia tego zastrzeżenia jest wykonanie ChIP przy użyciu izolowanych jąder linii zarodkowej. Dodatkowe zagadnienia techniczne dotyczące optymalizacji ChIP zostały również szeroko omówione w innym miejscu^32,33.

Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół dziedziczenia RNAi i ChIP zapewnia szczegółową i łatwą do dostosowania podstawę, którą można zintegrować z innymi technikami w celu dalszego zbadania międzypokoleniowej regulacji epigenetycznej. Na przykład biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości można skonstruować z DNA ChIP (ChIP-seq), aby uzyskać bardziej szczegółowy obraz krajobrazu chromatyny zarówno proksymalnie do celu RNAi, jak i w skali całego genomu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bioshop	AGA002
Ampicillin	Bioshop	AMP201	Przygotować roztwór o stężeniu 100 mg/ml w wodzie ultraczystej. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Przeciwciało poliklonalne anty-H3K9me3 królika	Abcam	ab8898	Stężenie jest zależne od partii (0,9 - 1 mg / ml).
Przeciwciało poliklonalne przeciw histonowi H3 królika	Abcam	ab1791	Stężenie zależy od partii (0,7 - 1 mg / ml).
Wybielacz (6% podchloryn sodu)	Szczep Lavo	02358107
C. elegans z GFP RNAi Reporter	NA	, SX1263	Sapetschnig i in., 2015 (ref. 7). Prezent od laboratorium E. Miska, University of Cambridge.
Carbenicillin	BioShop	CAR544	Przygotuj roztwór o stężeniu 25 mg/ml w ultraczystej wodzie. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Dynabeads Białko G Koraliki magnetyczne	Invitrogen	10003D
E. coli szczep HT115(DE3)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	HT115(DE3)
E. coli szczep OP50-1	Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)	OP50-1
EDTA (0,5 M, pH 8,0)	Invitrogen	15575020
fluorescencji Stereoskop	Zeiss	Axio Zoom.V16
Formaldehyd (37%)	Sigma	F8775
Glicyna	Sigma	50046	Przygotować 1,25 M roztwór i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
HEPES-KOH (1 M, pH 7,5)	Teknova	H1035
Hydrofobowe szkiełka z nadrukiem, 10 dołków	VWR	100488-904
IGEPAL CA-630 (etoksylowany oktylofenol)	BioShop	NON999	Przygotuj 10% (v/v) roztwór w ultraczystej wodzie i przechowuj w temperaturze pokojowej.
IPTG (Izopropylo-β-D-tiogalaktozyd)	BioShop	IPT001	Przygotuj roztwór o stężeniu 0,2 g/ml w ultraczystej wodzie. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725122
LB Płytki agarowe uzupełnione o 100 &mikro; g/ml Ampicylina	NA	NA	Standardowa receptura laboratoryjna.
Lewamizol (chlorowodorek tetramizolu)	Sigma	L9756	Przygotować 200 mM roztwór w ultraczystej wodzie. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
LiCl (8 m)	Sigma	L7026
M9 Bufor	NA	NA 22	mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.
Separator magnetyczny (probówki 1,5 ml)	Applied Biosystems	A13346
Separator magnetyczny (probówki 0,2 ml)	Permagen	MSR812
	Fisher Scientific	12541B
Szkiełko mikroskopowe	Wybór technologa	LAB-037
NaCl (5 M)	Promega	V4221	Do ChIP.
NaOH	Sigma	S5881	Przygotuj 10 M roztwór i przechowuj w temperaturze pokojowej.
Płytki	NGM NA	NA	1,7% (w/v) agar, 0,3% (w/v) NaCl, 0,25% (w/v) pepton, 1 mM CaCl2, 5 μ g/ml cholesterolu, 25 mM fosforanu potasu pH 6,0, 1 mM MgSO4, 50 i mikro; g/ml streptomycyny.
Normalna IgG królika (1 mg / ml)	Technologia sygnalizacji komórkowej	2729
Szalki Petriego (35 mm x 10 mm)	Sarstedt	82.1135.500
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10X)	Odczynniki Fisher	BP3991
Plazmid - Kontrolny RNAi	Addgene	L4440 (Plasmid #1654)
Plazmid - RNAi  namierzający GFP	Addgene	L4417 (Plazmid #1649)	Należy pamiętać, że można zastosować alternatywne plazmidy pochodzące z L4440 ukierunkowane na GFP.
Para starterów [-3.3 kb przed gfp]	Zintegrowane technologie DNA	NA	F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG
Para starterów [+1.3 kb za gfp]	Zintegrowane technologie DNA		F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT
Para starterów [CLEC-18]	Zintegrowane technologie DNA F		: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGAGA
Para starterów [gfp exon 1]	Zintegrowane technologie	DNA	F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC
Para starterów [gfp exon 4]	Zintegrowane technologie DNA		F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA
Para starterów [HRP-2]Zintegrowane	technologie DNA		F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTCTCCA
Tabletka koktajlowa inhibitora proteazy	Roche	11836170001
Proteinaza K	Bioline	BIO-37084
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	Qiagen	28104
System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym	Bio-Rad	CFX96
Płytki RNAi-ngm	NA	NA	1,7% (w/v) agar, 0,3% (w/v) NaCl, 0,25% (w/v) pepton, 1 mM CaCl2, 5 i mikro; g/ml cholesterolu, 25 mM bufor fosforanowy pH 6,0, 1 mM MgSO4, 25 i mikro; g/ml karbenicyliny i 5 mM IPTG.
RNaza A	Sigma	R4642
Sarkosyl (sól sodowa N-lauroilsarkozyny)	Sigma	L5777	Przygotować 10% (w/v) roztwór i przechowywać w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem przez maksymalnie 1 miesiąc.
SDS	Sigma	74255	Przygotować 10% (w/v) roztwór i przechowywać w temperaturze pokojowej.
Deoksycholan sodu	Sigma	30970	Przygotować 5% (w/v) roztwór i przechowywać w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem maksymalnie przez 1 miesiąc.
Rurka Sonication Evergreen		214-3721-010
Nasadka rurki sonikacyjnej	Evergreen	300-2911-020
Sonicator	Qsonica	Q800R3-110
Siarczan streptomycyny	Bioshop	STP101	Przygotuj roztwór 50 mg/ml w ultraczystej wodzie. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Bufor TAE (1X)	NA	NA	40 mM Tris, 20 mM acetat, 1 mM EDTA
Tally counter clicker	Uline	H-7350
Tetracyklina	Bioshop	TET701	Przygotować roztwór 5 mg/ml w etanolu i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Thermomixer	Eppendorf	05-400-205
Tris-HCl (1 M, pH 8,0)	Invitrogen	15568025
Triton X-100	Sigma	T8787	Przygotować 10% (v/v) roztwór w ultraczystej wodzie i przechowywać w temperaturze pokojowej.