Artykuł metodologiczny

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65285

⸱

5 maja 2023

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Streszczenie

Międzypokoleniowe dziedziczenie epigenetyczne (TEI) pozwala na przekazywanie informacji przez linię zarodkową bez zmiany sekwencji genomu, poprzez czynniki takie jak niekodujące RNA i modyfikacje chromatyny. Zjawisko dziedziczenia interferencji RNA (RNAi) u nicienia Caenorhabditis elegans jest skutecznym modelem do badania TEI, który wykorzystuje krótki cykl życiowy tego organizmu modelowego, jego samorozprzestrzenianie się i przezroczystość. W dziedziczeniu RNAi narażenie zwierząt na RNAi prowadzi do wyciszenia genów i zmienionych sygnatur chromatyny w locus docelowym, które utrzymują się przez wiele pokoleń przy braku początkowego wyzwalacza. Protokół ten opisuje analizę dziedziczenia RNAi u C. elegans przy użyciu reportera białka zielonej fluorescencji jądrowej (GFP) wyrażonego w linii zarodkowej. Wyciszanie reporterowe jest inicjowane przez karmienie zwierząt bakteriami wykazującymi ekspresję dwuniciowego RNA ukierunkowanego na GFP. W każdym pokoleniu zwierzęta są pasażowane w celu utrzymania zsynchronizowanego rozwoju, a wyciszanie genów reporterowych jest określane za pomocą mikroskopii. W wybranych pokoleniach populacje są zbierane i przetwarzane pod kątem immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) w celu zmierzenia wzbogacenia modyfikacji histonów w locus reporterowym GFP. Ten protokół badania dziedziczenia RNAi można łatwo modyfikować i łączyć z innymi analizami w celu dalszego badania czynników TEI w małych szlakach RNA i chromatyny.

Wprowadzenie

Dziedziczenie epigenetyczne pozwala na przekazywanie informacji regulacyjnych genów między pokoleniami, a zatem może pozwolić środowisku lub doświadczeniom rodziców wpływać na ich potomstwo. U C. elegans wyciszenie genu linii zarodkowej zainicjowane przez egzogenny dwuniciowy RNA (dsRNA) może być dziedziczone przez wiele pokoleń u potomstwa, które nie jest narażone na oryginalny wyzwalacz1,2,3,4. Proces ten, określany jako dziedziczenie interferencji RNA (RNAi), jest jednym z kilku powiązanych epigenetycznych zjawisk wyciszania u C. elegans, w tym wielopokoleniowego wyciszania inicjowanego przez piRNA2,5, paramutacja/RNAe (wyciszanie epigenetyczne indukowane RNA)6,7,8 oraz wyciszanie inicjowane przez tablicę multikopii9, które mają pokrywające się, ale odrębne wymagania dotyczące małych mechanizmów regulacji RNA i chromatyny. W egzogennym RNAi C. elegans, dsRNA jest przetwarzane na małe interferujące RNA (siRNA), które działają w kompleksie z pierwotnymi białkami Argonaute, aby rozpoznać ich docelowe mRNA. To celowanie prowadzi do amplifikacji wtórnych siRNA, które łączą się z wtórnymi Argonautami w celu wyciszenia docelowego mRNA zarówno przez cytoplazmatyczne, jak i jądrowe szlaki wyciszania. W przypadku celów RNAi wyrażanych w linii zarodkowej, jądrowy wtórny Argonaute HRDE-1 i dodatkowe jądrowe czynniki RNAi celują w powstające transkrypty, powodując represję transkrypcyjną i rekrutację metylotransferaz histonowych do deponowania represyjnych znaczników chromatyny, w tym H3K9me310. Histon H3K9me3 sprzyja dziedzicznemu wyciszaniu transgenów białka zielonej fluorescencji (GFP) wyrażanego przez linię zarodkową poprzez dziedziczenie RNAi11,12.

Celem tego protokołu jest użycie transgenu wyrażającego białko fuzyjne GFP-histon w linii zarodkowej jako reportera do dziedziczenia RNAi oraz zbadanie zmian w modyfikacjach histonów w locus transgenu reporterowego za pomocą immunoprecypitacji chromatyny i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (ChIP-qPCR). Protokół ten opisuje ustandaryzowane podejście do podawania RNAi na płytkach w celu zainicjowania wyciszania reporterowego. Przedstawiono w nim również szczegółowy harmonogram pasażowania zwierząt między pokoleniami poprzez izolowanie zarodków w macicy od ciężarnych dorosłych osobników za pomocą alkalicznego podchlorynu ("bielenie"). Opisano również metody i reprezentatywne dane do monitorowania częstości wyciszania GFP w podgrupie populacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz dla histonu H3K9me3 ChIP-qPCR. Testy dziedziczenia RNAi oparte na reporterach zapewniają wysoce elastyczny system do funkcjonalnej analizy ról czynników genetycznych i środowiskowych w regulacji epigenetycznej13,14, a badania genetyczne wykorzystujące takie reportery zidentyfikowały oba geny, które są wymagane dla2,3,15 oraz geny, które negatywnie regulują16,17 czas trwania międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego.

Protokół

UWAGA: Harmonogram analizy przedstawiono na Rysunku 1.

1. Przygotowanie płytek z podłożem wzrostowym dla nicieni do RNAi (RNAi-NGM)

  1. Wyjałowuj E. coli HT115(DE3) zawierające wektory GFP lub kontrolne RNAi z zapasów glicerynowych na płytki agarowe Luria-Bertani (LB) uzupełnione o 100 µg/mL ampicyliny. Inkubuj bakterie przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Następnego dnia przygotuj płytki RNAi-NGM (1,7% [w/v] agar, 0,3% [w/v] NaCl, 0,25% [w/v] pepton, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterolu, 25 mM buforu fosforanowego potasu [pH 6,0], 1 mM MgSO4, 25 µg/mL karbenicyliny i 5 mM izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu [IPTG]) zgodnie ze standardowym protokołem18.
    1. Dla każdego szczepu w analizie przygotuj co najmniej sześć płytek RNAi-NGM z wysianym GFP RNAi (dwie płytki dla każdego z trzech powtórzeń biologicznych) oraz dwie płytki RNAi-NGM z wysianym kontrolnym RNAi (jedno powtórzenie biologiczne).
    2. Przykryj płytki luźno folią, aby chronić je przed światłem i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej do wyschnięcia.
  3. W tym samym dniu, w którym przygotowano płytki RNAi-NGM, przygotuj 4 mL kultur ciekłych bakterii RNAi.
    1. W warunkach sterylnych odmierz 4 mL pożywki LB uzupełnionej o 10 µg/mL tetracykliny i 100 µg/mL ampicyliny do probówek z kulturą. Przenieś pojedyncze kolonie z płytek agarowych LB do każdej probówki i inkubuj przez noc przy wstrząsaniu przez około 16 h w temperaturze 37 °C.
  4. Wysiej bakterie RNAi na płytki RNAi-NGM.
    1. Po nocnym wzroście zmierz gęstość optyczną (OD600) kultur, stosując rozcieńczenie bakterii w pożywce LB w stosunku 1:5.
    2. Rozcieńcz bakterie RNAi do względnej wartości OD600 równej 2, używając pożywki LB uzupełnionej o 10 µg/mL tetracykliny i 100 µg/mL ampicyliny.
    3. W warunkach sterylnych nanieś 150 µL bakterii kontrolnych lub bakterii GFP RNAi na każdą płytkę RNAi-NGM.
    4. Przykryj płytki folią i pozwól bakteriom rosnąć przez co najmniej 24 h w temperaturze pokojowej przed użyciem.
      UWAGA: Niewykorzystane płytki RNAi-NGM można przechowywać w pozycji odwróconej do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C w szczelnym pojemniku w ciemności.

2. Rozpoczęcie testu dziedziczenia RNAi: wybielanie i wysiew zarodków dla pokolenia P0

UWAGA: Przed rozpoczęciem testu dziedziczenia RNAi, nicienie zawierające reporter GFP mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 powinny być utrzymywane bez głodzenia w temperaturze 21 °C przez co najmniej dwa pokolenia.

  1. Na 4 dni (96 h) przed rozpoczęciem testu dziedziczenia RNAi (Rysunek 1), przenieś trzy lub cztery zapłodnione dorosłe osobniki na każdą standardową płytkę NGM 35 mm wysianą bakteriami OP50-1.
    UWAGA: Trzy płytki NGM na szczep są wystarczające. W przypadku szczepów o obniżonej płodności może być wymagane przeniesienie więcej niż czterech zwierząt na płytkę.
  2. Po 4 dniach upewnij się, że populacja dorosłych osobników zaczęła składać embriony na płytce. Zmyj nicienie z płytek do probówek 1,5 mL, używając 800 µL buforu M9 uzupełnionego o Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1mM MgSO4, 0,01% (v/v) TX-100). Powtórz płukanie i połącz zawartość w tej samej probówce.
  3. Wyizoluj embriony z populacji poprzez wybielanie w następujący sposób:
    1. Przygotuj roztwór do wybielania, mieszając wybielacz (6% podchloran sodu) i 10 N NaOH w stosunku objętościowym 1,5:1. Przygotuj ilość wystarczającą do użycia 250 µL na każdą próbkę.
    2. Odwiruj probówki 1,5 mL z nicieniami przy 1 000 x g przez 1,5-2 min.
    3. Odsuń aspirat znad osadu, pozostawiając 100 µL, nie naruszając „pelletu” z nicieniami. Alternatywnie, probówki można pozostawić na około 2 min, aby nicienie osiadły przed aspiracją.
    4. Dodaj 650 µL ddH2O do każdej probówki, aby uzyskać końcową objętość 750 µL.
      UWAGA: Następne kroki są wrażliwe na czas.
    5. Dodaj 250 µL roztworu do wybielania do każdej probówki i uruchom stoper.
    6. Co 1-2 min dokładnie wymieszaj probówki na wortexie. Po 5 min sprawdź nicienie pod stereomikroskopem, aby monitorować degradację osobników dorosłych.
    7. Kontynuuj wortexowanie, aż nicienie zostaną całkowicie rozpuszczone i pozostaną tylko embriony. Natychmiast odwiruj probówki przy 1 000 x g przez 1,5 min.
      UWAGA: Wybielanie zazwyczaj kończy się w ciągu 6-7 min, ale należy je monitorować pod stereomikroskopem przy powiększeniu wystarczającym do obserwacji uwolnionych embrionów (40x). Nie pozostawiaj nicieni w wybielaczu przez zbyt długi czas, ponieważ może to uszkodzić embriony.
    8. Po odwirowaniu odessaj nadmiar cieczy, pozostawiając około 50-100 µL. Dodaj 1 mL buforu M9 z TX-100 w celu płukania i wymieszaj na wortexie. Odwiruj ponownie przy 1 000 x g przez 1,5-2 min i powtórz płukanie co najmniej dwa razy.
    9. Odsuń aspirat z ostatniego płukania, pozostawiając w probówce około 100 µL. Wymieszaj na wortexie. Nanieś pipetą 2 µL z każdej probówki dwukrotnie na opisaną szkiełko przedmiotowe. Policz embriony za pomocą licznika ręcznego, aby oszacować stężenie embrionów na mikrolitr.
      UWAGA: W tym celu można użyć szkiełek z wieloma matowymi wgłębieniami, aby policzyć powtórzenia dla wielu szczepów. Szkiełka do liczenia można myć i używać ponownie.
  4. Aby rozpocząć wzrost populacji półzsynchronizowanej, wymieszaj i nanieś pipetą objętość zawierającą 250 embrionów na każdą płytkę RNAi-NGM. Użyj dwóch płytek dla każdego powtórzenia. Pozwól cieczy wchłonąć.
  5. W przypadku pokolenia P0 poddanego działaniu RNAi, inkubuj w temperaturze 21 °C przez 4 dni (96 h) (od stadium embrionu do dorosłości). Czas inkubacji może się różnić w zależności od genotypu.

Schemat przepływu interferencji RNA; diagram; C. elegans; RNAi E. coli; analiza ekspresji GFP; mikroskopia.
Rysunek 1: Schemat badania dziedziczenia RNAi. Proponowany harmonogram przygotowania płytek RNAi-NGM i konfiguracji badania dziedziczenia RNAi. Ciąża dorosłe są przenoszone w Dniu -4 na płytki NGM zaszczepione szczepem OP50-1. Po 4 dniach potomstwo dorosłe poddawane jest procesowi wybielania, a embriony są wysiewane na płytki RNAi-NGM. Pokolenie P0 jest eksponowane na RNAi przez 4 dni w temperaturze 21 °C. Po osiągnięciu przez nicienie stadium dorosłego, replikaty są przenoszone poprzez wybielanie, a w każdym pokoleniu ocenia się ekspresję GFP w linii zarodkowej. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

3. Pasażowanie i ocena każdej generacji pod kątem ekspresji GFP w linii zarodkowej

UWAGA: Aby ułatwić punktację, należy użyć płyty winylowej do stworzenia podkładek agarozowych z liniowymi rowkami, które posłużą do ustawienia nicieni w linii. Metoda ta została zaadaptowana z pracy Rivera Gomez i Schvarzstein19.

  1. Przygotuj 1% (w/v) agarozę, rozpuszczając agarozę w ddH2O w małej kolbie poprzez ogrzewanie w kuchence mikrofalowej. Dodaj mieszadło magnetyczne i przykryj folią. W przypadku konieczności ponownego stopienia, podgrzewaj agarozę na płycie grzejnej w temperaturze 200 °C podczas mieszania. Po stopieniu zmniejsz temperaturę do 80 °C.
  2. Zmyj nicienie z płytek NGM, używając 800 µL buforu M9 z TX-100, do probówki 1,5 mL. Przemyj płytki dwukrotnie, aby usunąć wszystkie ciążne osobniki dorosłe. Sprawdź płytki pod stereomikroskopem, aby potwierdzić efektywne zebranie zwierząt.
  3. Odwiruj probówki przy 1 000 x g przez 1,5-2 min lub odczekaj 2 min, aż nicienie opadną na dno. Odessaj nadsącz, pozostawiając 100 µL, nie naruszając „pelletu” z nicieniami.
  4. Przygotuj podkładki agarowe do montowania nicieni w następujący sposób:
    1. Nanieś kroplę roztopionej 1% (w/v) agarozy na płytę winylową (opisaną wcześniej19) za pomocą szklanej pipety Pasteura (z odłamanym wąskim końcem).
    2. Ustaw szkiełko przedmiotowe tak, aby linie na płycie były poziome lub pionowe, a następnie szybko połóż szkiełko na kropli agarozy. Odczekaj około 30 s przed zdjęciem szkiełka z płyty.
      UWAGA: Przy ocenie wielu genotypów pomocne może być przygotowanie większej podkładki agarowej na jednym szkiełku i przecięcie jej na pół za pomocą skalpela.
  5. Zamontuj nicienie na podkładkach agarowych:
    1. Pod stereomikroskopem dodaj około 5 µL 5 mM lewamisolu do podkładki agarowej. Roztwór lewamisolu powinien być przygotowywany na świeżo każdego tygodnia.
    2. Delikatnie potrząśnij probówkami z nicieniami, aby je wymieszać, a następnie przenieś 5-10 µL zawiesiny nicieni na podkładkę agarową. Oszacuj liczbę nicieni wzrokowo podczas dodawania, tak aby w każdej replikacji znajdowało się około 40 osobników.
    3. Ułóż nicienie w rzędach za pomocą igły (tzw. eyelash pick), aby ułatwić ich ocenę. Nałóż szklane szkiełko przykrywowe.
      UWAGA: Szkiełka z zwierzętami zamontowanymi w ten sposób mogą być stabilne przez kilka godzin przed wyschnięciem.
  6. Wyizoluj embriony z pozostałych zwierząt, stosując protokół wybielania (patrz krok 2.3) przed oceną szkiełek. Wysiej 250 embrionów na 35 mm płytki NGM zaszczepione szczepem OP50-120. Po wchłonięciu cieczy odwróć płytki i umieść je z powrotem w inkubatorze w temperaturze 21 °C.
  7. Użyj stereomikroskopu fluorescencyjnego z zestawem filtrów GFP. Policz i zapisz liczbę nicieni GFP-dodatnich i GFP-ujemnych na szkiełkach dla każdej replikacji, korzystając z licznika ręcznego.
    UWAGA: Nicienie GFP-dodatnie będą wykazywać jądrową ekspresję GFP w linii zarodkowej oraz w embrionach in utero. Linie zarodkowe nicieni GFP-ujemnych nie będą fluorescować; jednak w miarę jak GFP zacznie ponownie pojawiać się w późniejszych generacjach, fluorescencja może być słaba. W celu uwzględnienia ewentualnej autofluorescencji pomocne może być zamontowanie dodatkowych, nietransgenicznych szczepów nicieni.
  8. Przeprowadzaj pasażowanie populacji poprzez wybielanie, zgodnie z opisem powyżej, mniej więcej co 4 dni (96 h) w temperaturze 21 °C. Alternatywnie, dla wygody można stosować naprzemienny harmonogram 3-dniowy/4-dniowy. W przypadku stosowania pasażowania naprzemiennego wysiej dodatkowo około 50 embrionów dla krótszych generacji, ponieważ wydajność embrionów po 72 h może być niższa.
    ​UWAGA: Utrzymuj stały czas pasażowania generacji P0 wynoszący 4 dni po wysianiu embrionów.

4. Pobieranie zwierząt do ChIP

UWAGA: Liczba zwierząt i harmonogram zależą od szczepu, stopnia rozwoju, epitopu oraz liczby celów immunoprecypitacji (IP). W poniższym przykładzie pobrano zwierzęta do trzech procedur IP: H3K9me3, histony H3 oraz kontroli IgG. Protokół ChIP został zaadaptowany z pracy Askjaer i wsp.21.

  1. Przed pobraniem próbek do ChIP-seq, zwiększ liczbę płytek z poprzedniej generacji testu dziedziczenia RNAi o dodatkowe trzy płytki NGM (do co najmniej czterech płytek na powtórzenie). Hoduj przez 4 dni w temperaturze 21 °C.
  2. Poddaj brzuchate dorosłe osobniki działaniu podchlorynu sodu, aby wyizolować embriony (patrz krok 2.3).
  3. Dla każdego szczepu przenieś około 3 500 embrionów na 14 płytek (250 na płytkę) i hoduj przez 3 dni w temperaturze 21 °C do stadium młodych osobników dorosłych.
  4. Przenieś zwierzęta do probówek 1,5 mL, płucząc je solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS) z dodatkiem 0,01% (v/v) TX-100 (PBS/TX). Wirować przy 1 000 x g przez 2 min. Odessaj nadsącz i połącz zwierzęta z jednego szczepu w jednej probówce, a następnie przemyj je jeszcze trzy razy, używając co najmniej 1 mL PBS/TX.
  5. Odbierz 1 000 µL zawiesiny, odwróć probówkę w celu wymieszania i trzykrotnie policz liczbę zwierząt w 3 µL (patrz krok 2.3.9).
  6. Oblicz stężenie zwierząt i przenieś objętość odpowiadającą 3 000 osobników do nowej probówki w celu sieciowania formaldehydem.
  7. Upewnij się, że całkowita objętość jest co najmniej 10-krotnie większa od objętości osadu z nicieni.

5. Sieciowanie formaldehydem

UWAGA: Praca z formaldehydem powinna odbywać się w dygestorium, aby zapobiec ekspozycji na jego opary.

  1. Dodaj formaldehyd (stężenie końcowe 1,8%) do probówki zawierającej nicienie. Inkubuj w rotatorze w temperaturze pokojowej przez 6 min.
  2. Natychmiast zamroź próbki w ciekłym azocie. Na tym etapie eksperyment można przerwać, a próbki przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Rozmroź usieciowaną próbkę w kąpieli wodnej w temperaturze pokojowej przez 3 min, a następnie inkubuj w rotatorze przez 16 min w temperaturze pokojowej.
  4. Dodaj glicynę 1,25 M do stężenia końcowego 125 mM i inkubuj w rotatorze przez 5 min.
    UWAGA: Do momentu elucji z kulek magnetycznych przechowuj próbki na lodzie lub w temperaturze 4 °C i używaj schłodzonych buforów.
  5. Odwiruj próbkę przy 1 000 x g przez 3 min. Przemyj trzy razy, używając za każdym razem 1 mL PBS/TX. Przemyj dwukrotnie 1 mL buforu do resuspensji (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego [EDTA], 0,01% TX-100, inhibitor proteaz [jedna tabletka na 5 mL]).
  6. Po ostatnim przemyciu pozostaw odpowiednią ilość buforu, aby upewnić się, że objętość całkowita jest co najmniej trzykrotnie większa od objętości osadu i wynosi minimum ~100 µL.

6. Sonikacja

UWAGA: Parametry sonikacji zależą od typu i modelu sonikatora oraz stadium rozwoju zwierzęcia. Parametry takie jak objętość i stężenie próbki, odstępy czasu włączania/wyłączania, liczba cykli oraz ustawienie mocy muszą zostać zoptymalizowane empirycznie. Na przykład w trakcie procesu sonikacji należy monitorować lizę nicieni za pomocą analizy białek i określić moment, w którym stężenie osiągnie plateau. Ponadto należy monitorować, kiedy średnia wielkość fragmentów ścinanego genomowego DNA wynosi około 200-1,000 bp, przeprowadzając elektroforezę DNA (oczyszczonego po odwróceniu sieciowania) na żelu 1,5% agarozy/tris-octanu-EDTA (TAE).

  1. Zmierzyć objętość próbek z poprzedniego kroku. Wymieszać i przenieść alikwoty o objętości 90-120 µL do polistyrenowej probówki do sonikacji.
  2. Dodać równą objętość buforu do resuspensji zawierającego 2x detergenty (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM EDTA, 0,2% deoksycholan sodu, 0,7% sarkosylu).
  3. Sonicować w sonikatorze kąpielowym przy 50% mocy przez 7 min (20 s włącz./40 s wyłącz.) w temperaturze 4 °C. Delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie. Powtórzyć sonikację przez kolejne 7 min.
  4. Przenieść zsonikowany lizat do probówki o pojemności 1,5 mL. Dodać 0,5 objętości buforu do resuspensji bez detergentów (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM EDTA) (np. dodać 100 µL buforu do 200 µL próbki).
  5. Wirować przy 13 000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant lizatu i przenieść do nowej probówki.
  6. Opcjonalnie przeprowadzić analizę białek w celu oznaczenia stężenia w każdym lizacie. Krok ten może być przydatny przy dużych ilościach próbek lub w porównaniach między analizami. Jednak standaryzacja liczby zwierząt opisana powyżej sprawdza się dobrze dla ilości próbek opisanych w niniejszym protokole, ponieważ wykazuje lepszą korelację z wydajnością chromatyny/DNA oznaczoną za pomocą qPCR.

7. Immunoprecypitacja

UWAGA: Dostosuj ilość przeciwciał i kulek magnetycznych do objętości i stężenia lizatu.

  1. Podziel supernatant lizatu na cztery porcje: trzy równe objętości dla każdej IP oraz 10% objętości jednej IP jako Input (np. 100 µL dla IP nr 1, 100 µL dla IP nr 2, 100 µL dla IP nr 3, 10 µL dla Input). Przenieś lizat IP do probówki PCR 200 µL, a lizat Input przechowuj w temperaturze -20 °C w probówce 1,5 mL.
  2. Do odpowiednich próbek IP dodaj 0,5 µg przeciwciała anty-H3K9me3, przeciwciała anty-histon H3 lub IgG. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C przy stałym obracaniu.
  3. Następnego dnia do jednej probówki 1,5 mL odlicz 9 µL magnetycznych kulek pokrytych białkiem G na każdą IP. Przemyj kulki dwukrotnie 1 mL buforu FA-150 (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM EDTA, 1% TX-100, 0,1% deoksycholan sodu).
  4. Resuspenduj kulki magnetyczne w buforze FA-150 do objętości pierwotnie pobranej z roztworu w kroku 7.3 powyżej. Dodaj 7,5 µL do każdej IP. Inkubuj przez 2 h w temperaturze 4 °C przy stałym obracaniu.

8. Przemywanie i elucja

UWAGA: Aby zapobiec wyschnięciu kulek magnetycznych, należy szybko dodawać każdy bufor płuczący lub eluujący bezpośrednio po odessaniu poprzedniego roztworu płuczącego.

  1. Przy każdym myciu kulek należy użyć od 0,2-1 mL następujących roztworów buforowych. Kuleczki należy zebrać na statywie magnetycznym w celu odessania płuczki. Każde mycie należy inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 min z rotacją. Należy zachować poniższą kolejność.
    1. Przemyć dwukrotnie buforem FA-150.
    2. Przemyć raz buforem FA-1M (FA-150 z 1 M NaCl).
    3. Przemyć raz buforem FA-0.5M (FA-150 z 0,5 M NaCl). Przenieść do nowej probówki PCR.
    4. Przemyć raz buforem TE-LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1% IGEPAL CA-630, 1% deoxycholan sodu).
    5. Przemyć dwukrotnie buforem TE+ (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 0,005% IGEPAL CA-630).
      UWAGA: Dalsze przetwarzanie próbek należy prowadzić w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej.
  2. Odssać ostatnią porcję buforu do mycia. Resuspendować kulki magnetyczne w 50 µL buforu do elucji ChIP (200 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1% dodecylosiarczanu sodu [SDS]) i przenieść do probówki o pojemności 1,5 mL.
  3. Eluować w temperaturze 65 °C przez 15 min w thermomixerze, mieszając przy 1000 rpm przez 5 s w każdej minucie.
  4. Zebrać kulki na statywie magnetycznym i przenieść nadsącz do nowej probówki.
  5. Powtórzyć elucję z użyciem kolejnych 50 µL buforu do elucji ChIP. Połączyć nadsącze, aby uzyskać łącznie 100 µL. Przejść do odwrócenia sieciowania i elucji DNA, zgodnie z poniższymi szczegółami.

9. Odwracanie sieciowania i elucja DNA

  1. Odprzymrozić próbkę lizatu Input. Uzupełnić objętość do 100 µL za pomocą buforu elucyjnego ChIP.
  2. Do każdej próbki IP oraz Input dodać 16,5 µg RNazy A. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h.
  3. Dodać 40 µg Proteinazy K i inkubować w temperaturze 55 °C przez 2 h. Następnie inkubować w temperaturze 65 °C przez noc.
  4. Ostudzić próbki do temperatury pokojowej i oczyścić DNA za pomocą zestawu do oczyszczania na kolumnach wiriówek.

10. Przygotowanie i przeprowadzenie reakcji qPCR

UWAGA: Startery, konfiguracja reakcji oraz parametry termocyklera powinny zostać dostosowane do zaleceń producenta stosowanego zestawu mieszanin do reakcji qPCR.

  1. Przygotować zestawy starterów nakierowane na reporter RNAi GFP oraz regiony kontrolne z dodatnim i ujemnym wzbogaceniem H3K9me3. Temperatura topnienia starterów wynosi 60 °C. Sekwencje starterów znajdują się w Tabeli materiałów.
  2. Dla DNA wejściowego (Input DNA) przygotować czwórkowe rozcieńczenia seryjne (np. 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).
    UWAGA: DNA z immunoprecypitacji (IP DNA) można wykorzystać bezpośrednio lub rozcieńczyć (np. 1:2 lub 1:3), aby umożliwić przeprowadzenie większej liczby reakcji. Odpowiedniość rozcieńczenia należy określić empirycznie, ponieważ może ono wpłynąć na wydajność qPCR.
  3. Zorganizować wszystkie reakcje odpowiadające jednemu zestawowi starterów na jednej płytce PCR. Przygotować reakcje w dubletach technicznych dla każdego rozcieńczenia Input DNA i każdej próbki IP DNA. Każda reakcja o objętości 10 µL zawiera 1,5 µL Input lub IP DNA (lub bufor elucyjny jako kontrolę), qPCR master mix (stężenie końcowe 1x), startery forward i reverse (stężenie końcowe 400 nM dla każdego startera).
  4. W termocyklerze czasu rzeczywistego uruchomić następujący program: denaturacja początkowa: 95 °C przez 4 min; amplifikacja i detekcja fluorescencji: 40 cykli (95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s z odczytem z płytki); elongacja końcowa: 60 °C przez 5 min; krzywa topnienia: od 60 °C do 90 °C w przyrostach 0,5 °C, 5 s na krok.

11. Wyznaczanie wydajności amplifikacji i weryfikacja specyficzności produktu

  1. Dla każdego zestawu rozcieńczeń Input DNA nanieś cztery punkty danych, przyjmując [log10(1/rozcieńczenie)] na osi x oraz [Input Cq] na osi y. Wyznacz nachylenie linii trendu.
  2. Oblicz wydajność amplifikacji. Idealne zestawy starterów powinny wykazywać stałą wydajność na poziomie 95%-100%.
    Równanie wydajności amplifikacji; schemat wzoru do obliczania wydajności PCR na podstawie nachylenia linii.
  3. Sprawdź, czy wszystkie reakcje wykazują jeden ostry pik na krzywej topnienia oraz czy reakcje z tym samym zestawem starterów mają taką samą temperaturę topnienia. Występowanie wielu pików lub różnych temperatur topnienia może wskazywać na niespecyficzną amplifikację.
  4. Opcjonalnie przeprowadź elektroforezę produktów w standardowym 2% żelu agarozowym w buforze TAE w temperaturze pokojowej, aby zweryfikować wielkość prążka produktu.

12. Obliczanie procentowej zawartości wejścia (Input)

  1. Oblicz czynnik rozcieńczenia Input. Ponieważ 10% objętości lizatu IP zostało zachowane jako Input, czynnik rozcieńczenia dla rozcieńczenia DNA Input w stosunku 1:5 wynosi 50.
  2. Określ czynnik rozcieńczenia IP. Jeśli DNA IP nie jest rozcieńczane przed qPCR, czynnik rozcieńczenia wynosi 1.
  3. Oblicz różnicę Cq pomiędzy IP a Input, skorygowaną o czynniki rozcieńczenia.
    Schemat wzoru qPCR ΔCq dla analizy czynnika rozcieńczenia ChIP w badaniach ekspresji genów.
  4. Oblicz procent Input.
    Równanie wyników PCR w czasie rzeczywistym, Procent Input = (2^ΔCq)^-1 * 100, dla analizy ilościowej.

Wyniki

Zwierzęta niosące reporter GFP-histony H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 wykazujący ekspresję w linii zarodkowej (Rysunek 2A) poddano działaniu GFP RNAi lub kontrolnego RNAi poprzez podawanie w pokarmie, a następnie przeprowadzono pasażowanie zgodnie z opisem w protokole i na Rysunku 1. Sygnał GFP w jądrach komórek linii zarodkowej oceniano manualnie za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu dissectingowego dla próbek populacji w każdym pokoleniu. Wyciszenie transgenu było w pełni penetrujące u ocenianych zwierząt P0 i F1 traktowanych GFP RNAi (Rysunek 2B). W pokoleniu F2 odsetek populacji wykazujący dziedziczenie wyciszenia GFP wynosił około 50%. Do pokolenia F5 większość populacji nie wykazywała dziedziczenia wyciszenia, a w pokoleniu F10 nie stwierdzono już żadnego dziedziczenia, ponieważ wszystkie zwierzęta wykazywały ekspresję GFP.

Aby określić zmianę wzbogacenia histony H3K9me3 odpowiadającą wyciszeniu indukowanemu przez RNAi, przeprowadzono analizę ChIP-qPCR u zwierząt pokolenia F1 po zastosowaniu RNAi przeciwko GFP lub kontrolnego RNAi. Zgodnie z oczekiwaniami, populacja traktowana RNAi GFP wykazała wyższy poziom histony H3K9me3 w obrębie celu GFP oraz w regionie 1,3 kb w dół rzeki w porównaniu do zwierząt traktowanych kontrolnym RNAi (Rycina 2C). Specyficzność ChIP dla histony H3K9me3 została potwierdzona poprzez wzbogacenie w locus kontroli pozytywnej (clec-18), w którym znane jest wzbogacenie tej modyfikacji, oraz brak wzbogacenia w pobliskim locus kontroli negatywnej (hrp-2). Zgodnie z oczekiwaniami, we wszystkich locus qPCR wykryto również wzbogacenie histony H3 oraz wzbogacenie na poziomie tła w immunoprecypitacjach kontrolnych z użyciem IgG. Po normalizacji wzbogacenia ChIP dla reportera do locus kontroli pozytywnej clec-18, wykazano wyższe wzbogacenie histony H3K9me3 po zastosowaniu RNAi GFP, podczas gdy wzbogacenie histony H3 było podobne dla obu grup traktowanych (Rycina 2D). Ponieważ nie oczekuje się, aby RNAi GFP wpływało na poziom H3K9me3 lub całkowite zajęcie histony H3 w locus clec-18, normalizacja ta niweluje zmienność techniczną, taką jak różnice w wydajności ChIP pomiędzy próbkami RNAi GFP a kontrolnymi. Krotność zmiany poziomu histony H3K9me3 i histony H3 pomiędzy grupami traktowanymi RNAi wykazuje specyficzne dla reportera GFP wzbogacenie histony H3K9me3, niezależne od zajęcia histonów, po wyciszeniu indukowanym przez RNAi GFP (Rycina 2E).

Wpływ RNAi na wyciszanie GFP i metylację histonów; diagramy i wykresy; badanie ekspresji genów.
Rycina 2: Wyciszanie GFP indukowane przez RNAi odpowiada zwiększonemu wzbogaceniu H3K9me3 w miejscu docelowym RNAi. (A) Schemat reportera RNAi GFP mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] wyrażanego w linii zarodkowej z zaznaczonymi regionami amplikonów qPCR. (B) Ekspresja GFP oceniana w kolejnych generacjach po zastosowaniu RNAi w temperaturze 21 °C. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe z dwóch powtórzeń biologicznych. (C) ChIP-qPCR dla H3K9me3, histonu H3 i kontroli IgG u młodych osobników F1 z dwóch powtórzeń biologicznych. clec-18 i hrp-2 są odpowiednio dodatnią i ujemną kontrolą loci dla wzbogacenia H3K9me3. (D) Wzbogacenie H3K9me3 i histonu H3 w reporterze RNAi GFP, znormalizowane do dodatniej kontroli locus clec-18. (E) Zmiana wzbogacenia H3K9me3 i histonu H3 pomiędzy zwierzętami traktowanymi RNAi przeciwko GFP a zwierzętami traktowanymi kontrolnym RNAi, z normalizacją do clec-18. Linia przerywana reprezentuje zmianę krotności (fold-change) równą 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tym protokole dsRNA jest wprowadzane przez karmienie, które stało się standardową metodą u C. elegans18. W przypadku testów dziedziczenia RNAi podejście żywieniowe zapewnia łatwą metodę uzyskania dużej populacji P0 2,11,12,22,23,24,25. Jednak czas i czas trwania ekspozycji na RNAi wpływa na skuteczność wyciszania transgenu26, a stężenie bakterii RNAi wpływa na trwałość dziedzicznego wyciszania RNAi1. Dlatego standaryzowane bakterie RNAi i wzrost robaków są ważne dla uzyskania stałego poziomu wyciszenia GFP i czasu trwania dziedziczenia. W tym przypadku zarodki są siane na płytkach RNAi, dzięki czemu zwierzęta P0 są narażone na działanie bakterii RNAi od wyklucia. Alternatywne podejścia polegały na umieszczeniu zsynchronizowanych zwierząt w stadium L124,27 lub L425 na płytkach RNAi-NGM. Ponadto, ponieważ głód i inne stresy wpływają na utrzymanie dziedziczenia RNAi13, talerze muszą być monitorowane, aby zapobiec przepełnieniu i wyczerpaniu zapasów żywności. Jako alternatywę dla inicjowania RNAi przez karmienie, niektóre z pionierskich badań dziedziczenia RNAi C. elegans indukowały RNAi poprzez wstrzyknięcie gonad, co zapewnia większą kontrolę stężenia dsRNA 1,28.

W tym protokole każde pokolenie jest pasażowane jako populacja z alkalicznym traktowaniem podchlorynem, jak opisano wcześniej 16,22,23,24. Leczenie podchlorynem zapewnia, że pokolenie F1 nie zostanie skażone bakteriami RNAi ze środowiska rodzicielskiego22 i zapobiega potencjalnemu niepożądanemu wąskiemu gardłu populacji. Jednak masowe pasażowanie może być również ograniczeniem, ponieważ poszczególne zwierzęta mogą mieć różne wzorce dziedziczenia 1,29. Alternatywną metodą ustalania każdego pokolenia jest selekcja pojedynczych zwierząt 1,2,9,11,25. Takie podejście pozwala na śledzenie fenotypów w obrębie linii genetycznych i włączanie krzyżówek genetycznych. Analiza pochodzenia może być również korzystna dla fenotypów o niskiej penetracji12.

Ekspresja białek fluorescencyjnych jest potężnym i wygodnym odczytem wyciszania indukowanego przez RNAi 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Zgodnie z opisem w tym protokole, wyrażenie GFP może być ręcznie oceniane jako ON lub OFF 11,12,15,16,25. Ręczną punktację można dodatkowo udoskonalić, przypisując jakościowe poziomy intensywności 3,4,14. Alternatywnie, zautomatyzowana ocena intensywności obrazów mikroskopowych 11,12,14,25,27 lub pomiar fluorescencji żywych zwierząt za pomocą cytometrii przepływowej 2 mogą zapewnić ilościowy i wysokoprzepustowy odczyt. Ponieważ jednak ekspresja reporterowa jest ograniczona do linii zarodkowej, zastrzeżenie zautomatyzowanych podejść polega na tym, że muszą one również rozróżniać zwierzęta z wyciszoną ekspresją GFP i zwierzęta bez linii zarodkowej, zwłaszcza jeśli badanie obejmuje mutanty z nieprawidłowym rozwojem linii zarodkowej. Jako alternatywę dla fluorescencji GFP, odwrotna transkrypcja (RT)-qPCR może być stosowana do ilościowego określania docelowych poziomów RNAi pre-mRNAi mRNA 2,16,23,24. Takie podejście zapewnia bardziej bezpośredni odczyt wyciszania, które jest ukierunkowane na RNA i jest szczególnie przydatne w przypadku innych celów RNAi, w których wyciszanie nie wytwarza widocznego fenotypu. Ograniczeniem stosowania sztucznych reporterów GFP jest to, że sekwencje egzogenne i endogenne są różnie regulowane w międzypokoleniowym RNAi11. Badania z celami endogennymi, takimi jak wrażliwy na temperaturę embrionalny śmiertelny allel oma-1(zu405)1,11,16,25, powinny być zatem uważane za podejście uzupełniające do fluorescencyjnych reporterów transgenowych.

Analiza ChIP w kontekście testów dziedziczenia RNAi wymaga porównania między traktowanymi i powtórzonymi próbami. Po pierwsze, aby uwzględnić różnice w materiale wyjściowym między próbkami, sygnał ChIP jest normalizowany do sygnału wejściowego w tym samym miejscu, co "procent wejścia". Równoległe przetwarzanie histonu H3 ChIP pomoże określić, czy jakiekolwiek zmiany modyfikacji histonu odpowiadają zmianom gęstości nukleosomów. Ponadto, ponieważ ChIP jest procesem wieloetapowym, wydajność może się różnić w zależności od próbki. Wybór odpowiednich loci kontroli dodatniej i ujemnej jest przydatny do oceny i porównania stosunku sygnału do szumu między próbkami i eksperymentami. Ponadto, aby ułatwić porównania między próbkami, wartości progowe cyklu qPCR ChIP DNA w miejscu docelowym RNAi są często normalizowane do locus kontrolnego 3,11,15,23,30,31. Aby ocenić efekty leczenia RNAi, porównuje się również stosunek sygnału ChIP w warunkach RNAi poddanych działaniu RNAi w porównaniu z warunkami kontrolnymi lub brakiem RNAi. Ograniczeniem obecnego podejścia jest to, że ChIP przeprowadza się na całych zwierzętach, podczas gdy odpowiedź na leczenie RNAi może być unikalna dla linii zarodkowej. Podejściem do przezwyciężenia tego zastrzeżenia jest wykonanie ChIP przy użyciu izolowanych jąder linii zarodkowej. Dodatkowe zagadnienia techniczne dotyczące optymalizacji ChIP zostały również szeroko omówione w innym miejscu32,33.

Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół dziedziczenia RNAi i ChIP zapewnia szczegółową i łatwą do dostosowania podstawę, którą można zintegrować z innymi technikami w celu dalszego zbadania międzypokoleniowej regulacji epigenetycznej. Na przykład biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości można skonstruować z DNA ChIP (ChIP-seq), aby uzyskać bardziej szczegółowy obraz krajobrazu chromatyny zarówno proksymalnie do celu RNAi, jak i w skali całego genomu.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy potwierdzają, że nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

Pragniemy podziękować laboratoriom w społeczności C. elegans, które opracowały i udostępniły narzędzia i których praca jest cytowana w tym manuskrypcie. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Praca ta była wspierana przez grant Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR) dla A.L.S. (PJT-175245). CL jest wspierany przez stypendium podyplomowe Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) (PGS-D).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgaroseBioshopAGA002
AmpicillinBioshopAMP201Przygotować roztwór o stężeniu 100 mg/ml w wodzie ultraczystej. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Przeciwciało poliklonalne anty-H3K9me3 królikaAbcamab8898Stężenie jest zależne od partii (0,9 - 1 mg / ml).
Przeciwciało poliklonalne przeciw histonowi H3 królikaAbcamab1791Stężenie zależy od partii (0,7 - 1 mg / ml).
Wybielacz (6% podchloryn sodu)Szczep Lavo02358107
C. elegans z GFP RNAi ReporterNA, SX1263Sapetschnig i in., 2015 (ref. 7). Prezent od laboratorium E. Miska, University of Cambridge.
CarbenicillinBioShopCAR544Przygotuj roztwór o stężeniu 25 mg/ml w ultraczystej wodzie. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Dynabeads Białko G Koraliki magnetyczneInvitrogen10003D
E. coli szczep HT115(DE3)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)HT115(DE3)
E. coli szczep OP50-1Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)OP50-1
EDTA (0,5 M, pH 8,0)Invitrogen15575020
fluorescencji StereoskopZeissAxio Zoom.V16
Formaldehyd (37%)SigmaF8775
GlicynaSigma50046Przygotować 1,25 M roztwór i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
HEPES-KOH (1 M, pH 7,5)TeknovaH1035
Hydrofobowe szkiełka z nadrukiem, 10 dołkówVWR100488-904
IGEPAL CA-630 (etoksylowany oktylofenol)BioShopNON999Przygotuj 10% (v/v) roztwór w ultraczystej wodzie i przechowuj w temperaturze pokojowej.
IPTG (Izopropylo-β-D-tiogalaktozyd)BioShopIPT001Przygotuj roztwór o stężeniu 0,2 g/ml w ultraczystej wodzie. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725122
LB Płytki agarowe uzupełnione o 100 &mikro; g/ml AmpicylinaNANAStandardowa receptura laboratoryjna.
Lewamizol (chlorowodorek tetramizolu)SigmaL9756Przygotować 200 mM roztwór w ultraczystej wodzie. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
LiCl (8 m)SigmaL7026
M9 BuforNANA 22mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.
Separator magnetyczny (probówki 1,5 ml)Applied BiosystemsA13346
Separator magnetyczny (probówki 0,2 ml)PermagenMSR812
Fisher Scientific12541B
Szkiełko mikroskopoweWybór technologaLAB-037
NaCl (5 M)PromegaV4221Do ChIP.
NaOH SigmaS5881Przygotuj 10 M roztwór i przechowuj w temperaturze pokojowej.
PłytkiNGM NANA1,7% (w/v) agar, 0,3% (w/v) NaCl, 0,25% (w/v) pepton, 1 mM CaCl2, 5 μ g/ml cholesterolu, 25 mM fosforanu potasu pH 6,0, 1 mM MgSO4, 50 i mikro; g/ml streptomycyny.
Normalna IgG królika (1 mg / ml)Technologia sygnalizacji komórkowej2729
Szalki Petriego (35 mm x 10 mm)Sarstedt82.1135.500
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10X)Odczynniki FisherBP3991
Plazmid - Kontrolny RNAi AddgeneL4440 (Plasmid #1654)
Plazmid - RNAi  namierzający GFP AddgeneL4417 (Plazmid #1649)Należy pamiętać, że można zastosować alternatywne plazmidy pochodzące z L4440 ukierunkowane na GFP.
Para starterów [-3.3 kb przed gfp]Zintegrowane technologie DNANAF: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG
Para starterów [+1.3 kb za gfp]Zintegrowane technologie DNAF: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT
Para starterów [CLEC-18]Zintegrowane technologie DNA F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGAGA
Para starterów [gfp exon 1]Zintegrowane technologieDNAF: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC
Para starterów [gfp exon 4]Zintegrowane technologie DNAF: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA
Para starterów [HRP-2]Zintegrowanetechnologie DNAF: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTCTCCA
Tabletka koktajlowa inhibitora proteazyRoche11836170001
Proteinaza K BiolineBIO-37084
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Qiagen28104
System wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-RadCFX96 
Płytki RNAi-ngmNANA1,7% (w/v) agar, 0,3% (w/v) NaCl, 0,25% (w/v) pepton, 1 mM CaCl2, 5 i mikro; g/ml cholesterolu, 25 mM bufor fosforanowy pH 6,0, 1 mM MgSO4, 25 i mikro; g/ml karbenicyliny i 5 mM IPTG.
RNaza ASigmaR4642
Sarkosyl (sól sodowa N-lauroilsarkozyny)SigmaL5777Przygotować 10% (w/v) roztwór i przechowywać w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem przez maksymalnie 1 miesiąc.
SDSSigma74255Przygotować 10% (w/v) roztwór i przechowywać w temperaturze pokojowej.
Deoksycholan soduSigma30970Przygotować 5% (w/v) roztwór i przechowywać w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem maksymalnie przez 1 miesiąc.
Rurka Sonication Evergreen214-3721-010
Nasadka rurki sonikacyjnejEvergreen300-2911-020
SonicatorQsonicaQ800R3-110
Siarczan streptomycynyBioshopSTP101Przygotuj roztwór 50 mg/ml w ultraczystej wodzie. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Bufor TAE (1X)NANA40 mM Tris, 20 mM acetat, 1 mM EDTA
Tally counter clickerUlineH-7350
TetracyklinaBioshopTET701Przygotować roztwór 5 mg/ml w etanolu i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
ThermomixerEppendorf05-400-205
Tris-HCl (1 M, pH 8,0)Invitrogen15568025
Triton X-100SigmaT8787Przygotować 10% (v/v) roztwór w ultraczystej wodzie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
, Szkło pokrywowe mikroskopu Szkiełko mikroskopowe

Bibliografia

  1. Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).
  2. Ashe, A., et al. piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans. Cell. 150 (1), 88-99 (2012).
  3. Buckley, B. A., et al. A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality. Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).
  4. Vastenhouw, N. L., et al. Long-term gene silencing by RNAi. Nature. 442 (7105), 882(2006).
  5. Lee, H. -C., et al. C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts. Cell. 150 (1), 78-87 (2012).
  6. Luteijn, M. J., et al. Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).
  7. Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans. PLoS Genetics. 11 (3), e1005078(2015).
  8. Shirayama, M., et al. piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline. Cell. 150 (1), 65-77 (2012).
  9. Minkina, O., Hunter, C. P. Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus. Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).
  10. Seroussi, U., et al. Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways. Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).
  11. Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes. eLife. 8, e40448(2019).
  12. Woodhouse, R. M., et al. Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance. Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).
  13. Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. Stress resets ancestral heritable small RNA responses. eLife. 10, e65797(2021).
  14. Houri-Ze'evi, L., et al. A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 165 (1), 88-99 (2016).
  15. Spracklin, G., et al. The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).
  16. Perales, R., et al. Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein. Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).
  17. Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing. Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).
  18. Ahringer, J. Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology. WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).
  19. Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record. microPublication Biology. 2018, (2018).
  20. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).
  21. Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).
  22. Gu, S. G., et al. Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint. Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).
  23. Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans. Epigenetics & Chromatin. 10, 6(2017).
  24. Kalinava, N., et al. elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing. Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).
  25. Lev, I., et al. MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance. Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).
  26. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  27. Xu, F., et al. A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi. Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).
  28. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).
  29. Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).
  30. Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).
  31. Mao, H., et al. The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).
  32. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  33. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dziedziczenie RNAimodyfikacja histonówwyciszanie w linii zarodkowejreporter GFPszlaki małych RNAwyciszanie genów
Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.