Optymalizacja parametrów wydajnościowych testu długości telomerów TAGGG

Telomery to powtarzające się sekwencje DNA obecne na końcu chromosomów. Mają tandemowe powtórzenia TTAGGG i utrzymują integralność genomu, chroniąc chromosom zarówno przed strzępieniem, jak i problemem replikacji końcowej, co oznacza, że część nawisu 3' nie może być replikowana przez polimerazę DNA^1,2. Krótkie telomery prowadzą do nieprawidłowości chromosomalnych w komórkach, w wyniku których komórki zostają trwale zatrzymane w etapie zwanym starzeniem replikacyjnym³. Krótkie telomery powodują również wiele innych problemów, takich jak dysfunkcja mitochondriów^4,5 i dysfunkcja komórek.

Powtórzenia telomerowe DNA są tracone podczas podziału komórki, ze średnią utratą od 25 do 200 pz rocznie⁶, co powoduje starzenie się komórek po pewnej liczbie podziałów⁶. Starzenie się wiąże się z większą częstością występowania chorób współistniejących, co objawia się skróceniem długości telomerów⁷. Analiza fragmentów restrykcyjnych telomerów (TRF), opisana przez Mendera, jest bardzo kosztowną metodą⁸. Z tego powodu nie jest wdrażany podczas ilościowego określania długości telomerów w większości badań.

Obecnie, większość badań epidemiologicznych wykorzystuje ilościowe pomiary długości telomerów oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR). Jednak metoda oparta na qPCR jest względną metodą pomiaru, ponieważ mierzy stosunek między telomerami a produktami amplifikacji genów z pojedynczą kopią, a nie bezwzględną długość telomerów. Pomiar długości telomerów za pomocą protokołu TRF jest złotym standardem, ponieważ może mierzyć rozkład długości telomerów w próbce, a pomiary mogą być wyrażone w wartościach bezwzględnych w kilozasadach (kb). Jednak jego zastosowanie jest ograniczone, ponieważ jest uciążliwe, pracochłonne i kosztowne. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół pomiaru długości telomerów za pomocą TRF opartych na chemiluminescencji.

Analiza TRF obejmuje siedem głównych etapów: 1) hodowla komórek do ekstrakcji genomowego DNA, 2) ekstrakcja genomowego DNA przy użyciu metody fenolo-chloroform:izoamylalcohol (P:C:I), 3) trawienie restrykcyjne genomowego DNA, 4) elektroforeza w żelu agarozowym, 5) Southern blotting fragmentu DNA z trawienia restrykcyjnego, 6) hybrydyzacja i detekcja za pomocą chemiluminescencja - Unieruchomiona sonda telomerowa jest wizualizowana przez bardzo czuły substrat chemiluminescencyjny dla fosfatazy alkalicznej, disodowej 2-chloro-5-(4-metoksyspiro[1,2-dioksetano-3,2′-(5-chlorotricyklo[3.3.1.13.7]dekan])-4-ylo]-1-fenylu fosforanu (CDP-Star) - i 7) w celu uzyskania informacji o średniej długości i zasięgu telomerów z tych rozmazów telomerowych.

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich odczynników używanych w poniższym protokole. Tabela 1 zawiera listę odczynników wyprodukowanych w laboratorium wraz ze zoptymalizowanymi objętościami, a Tabela 2 przedstawia stężenia robocze odczynników dostępnych na rynku.

1. Hodowla komórkowa

1. Utrzymuj komórki, których długość telomerów ma być mierzona (użyto tutaj komórek A2780, która jest linią komórkową gruczolakoraka jajnika) w zmodyfikowanym kompletnym pożywce Dulbecco z orłem (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), streptomycyną, penicyliną i amfoterycyną B na 6-centymetrowej szalce Petriego. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym i kontrolowanym środowisku zawierającym 5% dwutlenku węgla, aż komórki zlewają się w 80%-100%.
2. Usuń pożywkę i przemyj 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
3. Poddać komórki działaniu 1 ml kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w celu odłączenia komórek przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
4. Dodaj 2 ml kompletnej pożywki DMEM, aby dezaktywować trypsynę i zebrać komórki w probówce wirówkowej.
5. Granulować komórki w ilości 2 348 × g przez 5 minut.
6. Przemyć osad 1x PBS i odwirować przy 2,348 × g przez 5 minut.
7. Przechowywać granulki w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
   UWAGA: Liczba komórek może się różnić w zależności od linii komórkowej. Uzyskano około 2,5 × 10⁶ komórek w przypadku linii komórkowej A2780, która znajduje zastosowanie w dalszych etapach.

2. Izolacja genomowego DNA

1. Dodać 500 μl buforu do lizy (10 mM tris-Cl, pH 8,0; 25 mM EDTA, pH 8,0; 100 mM NaCl; 0,5% w/v dodecylosarczanu sodu) do osadu komórkowego i delikatnie wymieszać za pomocą odciętej końcówki (o średnicy otworu co najmniej 2 mm). Dodać 20 μg/ml świeżo przygotowanej RNazy A i delikatnie wymieszać przez odwrócenie.
2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut i od czasu do czasu odwracać probówkę podczas inkubacji.
3. Dodać proteinazę K do końcowego stężenia 100 μg/ml i delikatnie wymieszać przez inwersję 10 razy. Inkubować w temperaturze 55 °C przez 2 godziny. Odwracać probówkę w regularnych odstępach czasu (co 10 minut) podczas inkubacji.
4. Dodać 500 μl odczynnika fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1) i delikatnie wymieszać przez inwersję 20 razy. Wirować przy 9 391 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej (około 25 °C).
   UWAGA: Rysunek 1A pokazuje trzy warstwy otrzymane po odwirowaniu.
5. Usuń lepką górną warstwę wodną z trzech widocznych warstw, umieść w świeżej tubce za pomocą odciętej końcówki i dodaj równą ilość chloroformu. Wymieszaj przez delikatną inwersję 20 razy.
6. Odwirować probówki o stężeniu 9,391 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
7. Zebrać warstwę wodną i dodać odpowiednią ilość 5 M NaCl, tak aby końcowe stężenie NaCl wynosiło 0,2 M.
8. Dodaj dwie objętości 100% etanolu. Wymieszaj przez delikatną inwersję 20-25 razy. Wirować przy 15 871 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
9. Usuń supernatant i dodaj 500 μl 70% etanolu, aby umyć osad. Wirować przy 15 871 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
10. Usunąć sklarat nad osadem, wysuszyć osad na powietrzu przez kilka minut i dodać 50 μl sterylnej wody wolnej od nukleaz. Pozwól DNA na nawodnienie przez 1-2 dni w temperaturze pokojowej. Mieszać pipetując za pomocą odciętej końcówki.
11. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometrii ultrafioletowej (UV). W razie potrzeby ponownie rozcieńczyć próbki, używając sterylnej wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać minimalne stężenie 300-500 ng/μl.
12. Sprawdź integralność DNA, uruchamiając je na 1% żelu agarozowym (Ryc. 1B).
13. Rozcieńczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

3. Trawienie genomowego DNA

1. Przygotować mieszaninę enzymów Rsa1 (20 U) i Hinf1 (20 U) i dodać 2 μl buforu do trawienia restrykcyjnego na reakcję.
2. Pobrać odpowiednią objętość genomowego DNA tak, aby całkowita ilość DNA wynosiła 1,5 μg. Uzupełnić objętość sterylną wodą wolną od nukleaz, tak aby całkowita objętość po dodaniu enzymu wynosiła 20 μl.
3. Dobrze wymieszaj, stukając, a następnie wiruj pulsacyjnie.
4. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.

4. Elektroforeza w żelu agarozowym

1. Przygotuj żel agarozowy o długości 10 cm × 15 cm 0,8% w 1x buforze tris acetate EDTA (TAE) przy użyciu wysokiej jakości agarozy.
2. Dodać 5 μl barwnika ładującego do każdej strawionej próbki genomowego DNA, uzyskując w ten sposób końcową objętość 25 μl, i załadować próbki do żelu.
3. Przygotuj mieszankę markerów molekularnych, używając 1 μl markera molekularnego (drabiny), 3 μl sterylnej wody wolnej od nukleaz i 1 μl 5x barwnika ładującego.
4. Załadować 5 μl mieszaniny markerów molekularnych po obu stronach próbek trawionych przez genomowe DNA, jeśli jest większa liczba próbek (~10), lub tylko po jednej stronie, jeśli jest mniej niż lub równe pięciu próbek.
5. Uruchom żel pod napięciem 5 V/cm przez 6 godzin. Po zakończeniu biegu wykonaj nacięcie w jednym rogu żelu, aby zaznaczyć kolejność ładowania.
6. Zanurz żel w 0,25 M HCl na 10 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
7. Spłucz żel dwukrotnie wodą destylowaną.
8. Denaturacja DNA poprzez zanurzenie żelu w roztworze 0,5 M NaOH i 1,5 M NaCl dwa razy na 15 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
9. Spłucz żel dwukrotnie wodą destylowaną.
10. Zneutralizować DNA, zanurzając żel w roztworze 0,5 M tris-HCl i 3 M NaCl (pH 7,5) dwa razy na 15 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.

5. Południowa plama

1. Wytnij nylonową membranę o wielkości 10 cm × 12 cm i wykonaj nacięcie w tej samej pozycji co żel.
2. Aktywować membranę, zanurzając ją w wodzie destylowanej, a następnie 20x bufor cytrynianu soli fizjologicznej (SSC) (patrz Tabela 1).
3. Skonfiguruj transfer.
   1. Weź czystą szklaną tacę i umieść w niej kolejną tacę w odwróconej pozycji. Utwórz za pomocą zwykłej bibuły filtracyjnej tak, aby końce dotykały podstawy zewnętrznej tacy.
   2. Umieść żel na bibule filtracyjnej. Delikatnie umieść aktywowaną membranę nylonową na żelu, tak aby nacięcia zachodziły na siebie, i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, przetaczając się po szklanym pręcie.
   3. Ułóż 2 cm stos 9,5 cm × 11,5 cm celulozowej bibuły filtracyjnej, a następnie 6 cm stos zwykłej bibuły filtracyjnej o tych samych wymiarach. Umieść ciężar na tej konfiguracji tak, aby pod spodem był równomierny rozkład ciężaru. Napełnij zewnętrzną tacę 20x buforem SSC (patrz Rysunek 2).
   4. Pozostaw konfigurację na przelew z dnia na dzień.
4. Po transferze południowym utrwal przeniesione DNA na błonie poprzez sieciowanie UV na transiluminatorze UV lub linkatorze UV. Użyj lampy 302 nm 8 W przez 5 minut lub lampy 254 nm 8 W przez 2 minuty, co odpowiada około 120 mJ. Upewnij się, że strona błony, na którą przenoszone jest DNA, jest skierowana w stronę lampy.
5. Przemyć membranę dwukrotnie 25 ml buforu 2x SSC.
6. W razie potrzeby należy wstrzymać protokół, całkowicie susząc blot i przechowując go w temperaturze 2-8 °C po luźnym zawinięciu w folię, do czasu dalszej obróbki.

6. Hybrydyzacja i wykrywanie chemiluminescencji

1. Podgrzej bufor prehybrydyzacyjny do temperatury 42 °C.
   UWAGA: Poniższe kroki obejmują objętości roztworów/, które należy stosować na 100^cm2 blot.
2. Inkubować błonę w 10 ml buforu prehybrydyzacyjnego przez 1 godzinę w temperaturze 42 °C z delikatnym mieszaniem w celu prehybrydyzacji.
3. Dodać 0,5 μl sondy telomerowej na 5 ml wstępnie podgrzanego buforu prehybrydyzacyjnego, aby uzyskać roztwór hybrydyzacyjny.
4. Inkubować blot w 10 ml roztworu hybrydyzacyjnego w temperaturze 42 °C przez 3 godziny, delikatnie mieszając.
5. Przemyć blot rygorystycznym buforem 1 (Tabela 1) dwa razy przez 10 minut (po 25 ml każdy) w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
6. Wstępnie podgrzej rygorystyczny bufor 2 (tabela 1) przez 30 minut w temperaturze 50 °C.
7. Przemyć blot rygorystycznym buforem 2 dwa razy przez 15 minut (po 25 ml każdy) w temperaturze 50 °C, delikatnie mieszając.
8. Płukać 15 ml buforu do przemywania przez 5 minut, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej temperatury.
9. Inkubować błonę w 10 ml świeżo przygotowanego 1x roztworu blokującego przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
10. Inkubować błonę w 10 ml antydigioksygeniny sprzężonej z roztworem roboczym fosfatazy alkalicznej (patrz Tabela 2) przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
11. Przemyć blot dwukrotnie buforem do przemywania w temperaturze pokojowej przez 15 minut z delikatnym mieszaniem.
12. Inkubować w 10 ml buforu detekcyjnego przez 5 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
13. Usuń nadmiar buforu detekcji i utrzymuj membranę z DNA skierowanym do góry na torbie hybrydyzacyjnej lub arkuszu octanu. Dodać kroplami ~1-1,5 ml roztworu substratu na membranę, natychmiast umieścić na niej kolejny arkusz i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
14. Wyciśnij nadmiar roztworu substratu do obrazowania.
15. Obrazuj plamę przez około 20 minut w systemie obrazowania z dokumentacją żelu, zbierając wiele obrazów w różnych punktach czasowych. Wybierz nienasycone obrazy do dalszej analizy.
    UWAGA: W przypadku, gdy sygnał jest słaby, obrazowanie można przeprowadzać przez dłuższy czas.

7. Analiza

1. Po uzyskaniu plików graficznych wyeksportuj je do publikacji w .tif formacie w najwyższej możliwej rozdzielczości (w tym przypadku 600 dpi).
2. Zainstaluj oprogramowanie Telotool. Wymaga to do działania określonej wersji (R2012a) programu MATLAB (dostępnej bezpłatnie).
3. Otwórz oprogramowanie i kliknij przycisk Załaduj plik obrazu w prawym górnym rogu.
4. Po załadowaniu obrazu kliknij przycisk Odwróć obraz, tak aby tło obrazu było czarne, a smugi/paski białe.
5. Przytnij obraz z górnymi rogami, zaczynając od studni. Po dokonaniu wyboru kadrowania kliknij w nim prawym przyciskiem myszy i wybierz Przytnij obraz.
6. Po przykadrowaniu obrazu kliknij Oblicz pasy ruchu i zezwól na automatyczne wykrywanie pasa ruchu.
7. Jeśli pasy ruchu nie zostały prawidłowo wykryte, na przykładample, jeśli niektóre pasy ruchu nie zostały w ogóle wykryte lub jeśli wykryto dodatkowe lub częściowe pasy ruchu, należy przeprowadzić korektę pasa ruchu w sposób opisany poniżej.
   1. Kliknij Dostosuj pasy ruchu i w wyskakującym okienku, które się otworzy, dodaj i/lub dostosuj pasy zgodnie z potrzebami, a następnie kliknij Zastosuj i zamknij.
8. Po dostosowaniu pasów upewnij się, że na każdym z torów widoczna jest czerwona kropka i dostosuj drabiny za pomocą przycisku Ladder Fit, upewniając się, że liczba szczytów na obu torach drabiny znajduje się w tym samym miejscu. Usuń wszelkie obce szczyty za pomocą przycisku Usuń ekstremum.
9. Po dostosowaniu drabin wybierz Profile pasa ruchu, kliknij Dopasowanie drabiny i wybierz Dopasowanie wielomianowe.
10. Kliknij Linia trendu, zgodnie z zaleceniami oprogramowania, a następnie wybierz Poprawione w następnej opcji.
11. Kliknij Pobierz wyniki, aby wyświetlić wyniki w postaci tabeli, w której wiersz Średnia TRF jest pomiarem długości telomerów odpowiednich próbek pasów.
12. Kliknij Zapisz wszystko, aby zapisać wyniki w formie arkusza kalkulacyjnego.

Wyekstrahowane genomowe DNA (gDNA), które zostało przeprowadzone na 1% żelu agarozowym, wykazało dobrą integralność, jak pokazano w Rysunek 1B, wskazując, że próbka może być wykorzystana do dalszego przetwarzania TRF. Test TRF został następnie przeprowadzony poprzez modyfikację objętości roztworów wymaganych na każdym etapie (patrz Tabela 1 i Tabela 2). Sygnał TRF był wyraźnie widoczny (Rysunek 3). W ten sposób, modyfikując objętości i stężenia roztworu, można było przetworzyć więcej próbek bez negatywnego wpływu na wyniki, a długość telomerów można było z powodzeniem określić za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania, takiego jak Telotool10.

Rysunek 1: Izolacja i kontrola jakości genomowego DNA. (A) Trzy odrębne fazy separacji uzyskane po odwirowaniu po dodaniu fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego. Górna warstwa wodna zawiera gDNA, interfaza zawiera białka, a dolna, organiczna faza zawiera zdegradowane RNA, szczątki komórkowe i lipidy. (B) Obraz 1% żelu agarozowego pokazujący nienaruszone, niestrawione gDNA. Tor 1 pokazuje drabinę 1 kb, a tor 2 pokazuje niestrawione gDNA linii komórek rakowych A2780. Skrót: gDNA = genomowe DNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ilustracja konfiguracji transferu Southern Blotting. Reprezentatywny schemat przedstawiający zespół systemu do przenoszenia powtarzających się rozmazów telomerów z żelu do membrany nylonowej poprzez działanie kapilarne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Chemiluminescencyjna detekcja TRF po Southern blotting i hybrydyzacji. Blot pokazujący zakres powtórzeń telomerowych jako rozmaz w pasie 2. Tor 1 pokazuje marker molekularny, z masami cząsteczkowymi (kb) prążków wskazanymi po lewej stronie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Lista odczynników używanych w tym protokole. Tabela zawiera odczynniki przygotowane w laboratorium wraz ze szczegółami ich przechowywania, zalecanym użyciem odczynników do oznaczania długości telomerów TAGGG oraz ich zmodyfikowanymi objętościami użycia, zgodnie z optymalizacją w tym protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Lista dostępnych na rynku odczynników ze zmodyfikowanymi instrukcjami użycia. Tabela zawiera dostępne na rynku odczynniki wraz z różnymi rozcieńczeniami, szczegółami ich przechowywania oraz ich zalecanym użyciem przez zestaw do oznaczania długości telomerów TAGGG i zmodyfikowanymi objętościami użycia, zgodnie z optymalizacją w tym protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.