Tutaj szczegółowo opisujemy protokół ilościowego oznaczania długości telomerów za pomocą nieradioaktywnej detekcji chemiluminescencyjnej, koncentrując się na optymalizacji różnych parametrów wydajności zestawu do oznaczania długości telomerów TAGGG, takich jak ilości i stężenia w próbce.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Optymalizacja parametrów wydajnościowych testu długości telomerów TAGGG
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Telomery to powtarzające się sekwencje, które są obecne na końcach chromosomów; ich skracanie jest cechą charakterystyczną ludzkich komórek somatycznych. Skrócenie następuje z powodu problemu z replikacją końcową i brakiem enzymu telomerazy, który jest odpowiedzialny za utrzymanie długości telomerów. Co ciekawe, telomery skracają się również w odpowiedzi na różne wewnętrzne procesy fizjologiczne, takie jak stres oksydacyjny i stany zapalne, na które mogą mieć wpływ czynniki zewnątrzkomórkowe, takie jak zanieczyszczenia, czynniki zakaźne, składniki odżywcze lub promieniowanie. Tak więc długość telomerów służy jako doskonały biomarker starzenia się i różnych fizjologicznych parametrów zdrowotnych. Zestaw do oznaczania długości telomerów TAGGG służy do ilościowego określania średnich długości telomerów za pomocą testu fragmentów restrykcyjnych telomerów (TRF) i jest wysoce powtarzalny. Jest to jednak droga metoda i z tego powodu nie jest rutynowo stosowana w przypadku dużych liczb prób. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół zoptymalizowanego i opłacalnego pomiaru długości telomerów za pomocą analizy Southern blot lub TRF i detekcji opartej na nieradioaktywnej chemiluminescencji.
Wprowadzenie
Telomery to powtarzające się sekwencje DNA obecne na końcu chromosomów. Mają tandemowe powtórzenia TTAGGG i utrzymują integralność genomu, chroniąc chromosom zarówno przed strzępieniem, jak i problemem replikacji końcowej, co oznacza, że część nawisu 3' nie może być replikowana przez polimerazę DNA1,2. Krótkie telomery prowadzą do nieprawidłowości chromosomalnych w komórkach, w wyniku których komórki zostają trwale zatrzymane w etapie zwanym starzeniem replikacyjnym3. Krótkie telomery powodują również wiele innych problemów, takich jak dysfunkcja mitochondriów4
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich odczynników używanych w poniższym protokole. Tabela 1 zawiera listę odczynników wyprodukowanych w laboratorium wraz ze zoptymalizowanymi objętościami, a Tabela 2 przedstawia stężenia robocze odczynników dostępnych na rynku.
1. Hodowla komórkowa
- Utrzymuj komórki, których długość telomerów ma być mierzona (użyto tutaj komórek A2780, która jest linią komórkową gruczolakoraka jajnika) w zmodyfikowanym kompletnym pożywce Dulbecco z orłem (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą by....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyekstrahowany genomowy DNA (gDNA), poddany elektroforezie na 1% żelu agarozowym, wykazał dobrą integralność, co przedstawiono w Rycina 1B, co wskazuje, że próbkę można wykorzystać do dalszych etapów przetwarzania TRF. Następnie przeprowadzono analizę TRF, modyfikując objętości roztworów wymaganych na każdym etapie (patrz Tabela 1 i Tabela 2). Sygnał TRF był wyraźnie widoczny (Rycina 3). Zatem poprzez modyfikację objętości i stę.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisujemy szczegółową procedurę nieradioaktywnej, opartej na chemiluminescencji metody pomiaru długości telomerów za pomocą Southern blot. Protokół został przetestowany, aby umożliwić rozsądne użycie kilku odczynników bez uszczerbku dla jakości wyników. Bufor prehybrydyzacji i hybrydyzacji może być ponownie użyty do pięciu razy. Stężenie enzymu może wahać się w granicach 10-20 U na 1,5-2 μg genomowego DNA bez wpływu na wyniki. Kilka innych elementów zestawu, takich jak marker masy cząsteczkowej znakowany DIG i sonda hybr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Pani Prachi Shah za pomoc w początkowej optymalizacji protokołu. Chcielibyśmy podziękować dr Manojowi Gargowi za dostarczenie linii komórkowej raka jajnika A2780. EK jest wspierany przez grant badawczy z Katedry Biotechnologii (nr BT/RLF/Re-entry/06/2015), Departament Nauki i Technologii (ECR/2018/002117) oraz NMIMS Seed Grant (IO 401405).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cell Line | |||
| A2780 (linia komórkowa gruczolakoraka jajnika) | Otrzymany w prezencie | ||
| Sprzęt | |||
| ChemiDoc XRS+ (do obrazowania i sieciowania UV) | Biorad | Kaptur uniwersalny II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoka 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Wersja 1.3 | ||
| Materiały | |||
| Kwas octowy | Molychem | 64-19-7 | |
| Agaroza | MP | 180720 | |
| Amfoterycyna B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | ||
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, Stany Zjednoczone | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Membrana | nylonowa Sigma | 11209299001 | |
| Penicylina | Gibco, ThermoFisher Scientific, Stany Zjednoczone | 15240062 | |
| Dodecylosiarczan sodu | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycyna | Gibco, ThermoFisher Scientific, Stany Zjednoczone | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Papier Whatmana | GE healthcare nauki przyrodnicze | 1001-917 | |
| Reodczynniki | |||
| 1 kb drabinka | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Zestaw do oznaczania długości telomerów | 12209136001 | |
| Roztwór blokujący 10x | zestaw do oznaczania długości telomerów Telo TAGGG | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Bufor detekcyjny 10x | Telo TAGGG Zestaw do oznaczania długości telomerów | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Zestaw do oznaczania długości telomerów | 12209136001 | |
| Bufor trawienny | Telo TAGGG Zestaw do oznaczania długości telomerów | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Zestaw do oznaczania długości telomerów | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternatywa dla zestawu) | NEB | R0155T | |
| Barwnik ładujący | BIOLABS | N3231S | |
| Bufor kwasu maleinowego 10x | Telo TAGGG Zestaw do oznaczania długości telomerów | 12209136001 | |
| Marker molekularny | Telo TAGGG Zestaw do oznaczania długości telomerów | 12209136001 | |
| sonda | Telo TAGGG Zestaw do oznaczania długości telomerów | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Zestaw do oznaczania długości telomerów | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternatywa dla zestawu) | NEB | R0167L | |
| Podłoże | Telo TAGGG Zestaw do oznaczania długości telomerów | 12209136001 | |
| Bufor do płukania | Telo TAGGG Zestaw do oznaczania długości telomerów | 12209136001 |
Bibliografia
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
