Method Article

Trójwymiarowa technika wizualizacji ultrastrukturalnych zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki

DOI:

10.3791/65290

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak zrekonstruować grzebienie mitochondrialne, aby uzyskać obrazowanie 3D z wysoką dokładnością, wysoką rozdzielczością i wysoką przepustowością.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie dynamicznych cech ultrastruktury organelli komórkowej, która jest nie tylko bogata w nieznane informacje, ale także wyrafinowana z perspektywy trójwymiarowej (3D), jest kluczowe dla badań mechanistycznych. Mikroskopia elektronowa (EM) zapewnia dobrą głębię obrazowania i pozwala na rekonstrukcję stosów obrazów o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania ultrastrukturalnej morfologii organelli komórkowych nawet w skali nanometrowej; dlatego rekonstrukcja 3D zyskuje na znaczeniu ze względu na swoje nieporównywalne zalety. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) zapewnia wysokowydajną technologię akwizycji obrazu, która pozwala na rekonstrukcję dużych struktur w 3D z tego samego obszaru zainteresowania w kolejnych warstwach. Dlatego zastosowanie SEM w rekonstrukcji 3D na dużą skalę w celu przywrócenia prawdziwej ultrastruktury 3D organelli staje się coraz bardziej powszechne. W tym protokole sugerujemy połączenie seryjnego ultracienkiego przekroju i technik rekonstrukcji 3D w celu zbadania grzebień mitochondrialnych w komórkach raka trzustki. Szczegółowe informacje na temat wykonywania tych technik są opisane w niniejszym protokole krok po kroku, w tym metoda osmu-tiokarbohydrazydu-osmu (OTO), seryjne obrazowanie ultracienkich przekrojów oraz wyświetlanie wizualizacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są jednymi z najważniejszych organelli w komórce. Służą jako centralny ośrodek bioenergetyki komórkowej i metabolizmu1,2 i odgrywają kluczową rolę w raku3. Rak trzustki (PC) jest jednym z najtrudniejszych nowotworów do leczenia 4 ze względu na szybkie rozprzestrzenianie się i wysoką śmiertelność. Dysfunkcja mitochondriów, która jest głównie spowodowana zmianami w morfologii mitochondriów3,5,6,7, została powiązana z mechaniz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiału

  1. Hodować 2 x 106 komórek Panc02 w 12 ml pożywki DMEM (10% płodowej surowicy bydlęcej i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny) i utrzymywać w temperaturze 37 °C i wilgotności 95% w atmosferze 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza przez 48 godzin.
  2. Zebrać komórki Panc02, odwirować przy 28 x g przez 2 minuty, a następnie wyrzucić supernatant. Upewnij się, że próbka ma odpowiednią wielkość (1 x 107 komórek), ponieważ w przeciwnym razie następujące etapy utrwalania i odwadniania nie będą działać dobrze.
  3. Dodać 1 ml 2,5% aldehydu glutarowego jako utrwalacz, aby utrwalić świeże k....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas hodowli komórkowej (Rysunek 1A), najpierw podzieliliśmy komórki raka trzustki na grupę kontrolną hodowaną z kompletną pożywką hodowlaną, grupę (1S,3R)-RSL348 (RSL3, aktywator ferroptozy, 100 nM) i grupę RSL3 (100 nM) plus ferrostatyna-149 (Fer-1, inhibitor ferroptozy, 100 nM). Dzięki powyższym etapom eksperymentalnym skaningowy mikroskop elektronowy uzyskał 38 (rysunek uzupełniający 1), 43 (rysunek uzupełniający 2) i 44 (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda jest przydatnym przewodnikiem krok po kroku dotyczącym zastosowania techniki rekonstrukcji 3D, która polega na zastosowaniu mikroskopii elektronowej i technologii przetwarzania obrazu do układania i segmentacji obrazów tomograficznych 2D generowanych z szeregowych ultracienkich przekrojów. Protokół ten podkreśla ograniczenie obrazów 2D, które można rozwiązać za pomocą wizualizacji 3D ultrastruktury organelli, która ma zalety w postaci silnej odtwarzalności struktur na poziomie wysokiej rozdziel.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były wspierane przez granty Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82274364, 81673607 i 81774011); a także projekt badawczy dotyczący dobrobytu publicznego w ramach grantu Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). Doceniamy ogromną pomoc, wsparcie techniczne i eksperymentalne ze strony Publicznej Platformy Centrum Badań Medycznych, Akademii Chińskich Nauk Medycznych, Chińskiego Uniwersytetu Medycznego Zhejiang.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(1S,3R)-RSL3MCEHY-100218A
AcetonSIGMA179124
Amira Visage Imaging2020.2
Kwas asparaginowyMCEHY-42068
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle' s mediumGibco11995115
EtanolMerck100983
Ferrostatin-1MCEHY-100579
Płodowa surowica bydlęcaGibco10437010
Skaningowy mikroskop elektronowy z emisją w poluHITACHISU8010
Aldehyd glutarowyAlfa AesarA10500.22
Ołów azotanSANTA CRUZsc-211724
Tetratlenek osmuSANTA CRUZsc-206008B
Panc02Europejska Kolekcja Uwierzytelnionych Kultur Komórkowych 
Penicylina-streptomycynaBiosharpBL505A
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiBiosharpBL302A
Pon 812 Żywica epoksydowaSPI CHEMGS02660
Żelazocyjanek potasuMacklinP816416
TiokarbohydrazydMerck223220
UltramikrotomOctanEMUC7
RHAWNR032929
98102213 uranylu LEICA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial UltrastructurePancreatic Cancer CellsThree Dimensional ReconstructionScanning Electron MicroscopySerial Ultrathin SectionMitochondrial CristaeElectron MicroscopyOrganelle MorphologyOTO MethodMitochondrial Dysfunction

Related Articles