Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa technika wizualizacji ultrastrukturalnych zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65290

⸱

23 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak zrekonstruować grzebienie mitochondrialne, aby uzyskać obrazowanie 3D z wysoką dokładnością, wysoką rozdzielczością i wysoką przepustowością.

Streszczenie

Zrozumienie dynamicznych cech ultrastruktury organelli komórkowej, która jest nie tylko bogata w nieznane informacje, ale także wyrafinowana z perspektywy trójwymiarowej (3D), jest kluczowe dla badań mechanistycznych. Mikroskopia elektronowa (EM) zapewnia dobrą głębię obrazowania i pozwala na rekonstrukcję stosów obrazów o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania ultrastrukturalnej morfologii organelli komórkowych nawet w skali nanometrowej; dlatego rekonstrukcja 3D zyskuje na znaczeniu ze względu na swoje nieporównywalne zalety. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) zapewnia wysokowydajną technologię akwizycji obrazu, która pozwala na rekonstrukcję dużych struktur w 3D z tego samego obszaru zainteresowania w kolejnych warstwach. Dlatego zastosowanie SEM w rekonstrukcji 3D na dużą skalę w celu przywrócenia prawdziwej ultrastruktury 3D organelli staje się coraz bardziej powszechne. W tym protokole sugerujemy połączenie seryjnego ultracienkiego przekroju i technik rekonstrukcji 3D w celu zbadania grzebień mitochondrialnych w komórkach raka trzustki. Szczegółowe informacje na temat wykonywania tych technik są opisane w niniejszym protokole krok po kroku, w tym metoda osmu-tiokarbohydrazydu-osmu (OTO), seryjne obrazowanie ultracienkich przekrojów oraz wyświetlanie wizualizacji.

Wprowadzenie

Mitochondria są jednymi z najważniejszych organelli w komórce. Służą jako centralny ośrodek bioenergetyki komórkowej i metabolizmu1,2 i odgrywają kluczową rolę w raku3. Rak trzustki (PC) jest jednym z najtrudniejszych nowotworów do leczenia 4 ze względu na szybkie rozprzestrzenianie się i wysoką śmiertelność. Dysfunkcja mitochondriów, która jest głównie spowodowana zmianami w morfologii mitochondriów3,5,6,7, została powiązana z mechanizmami chorobowymi leżącymi u podstaw PC8. Mitochondria są również bardzo dynamiczne, co znajduje odzwierciedlenie w częstych i dynamicznych zmianach w ich łączności sieciowej i strukturze cristae9. Przekształcenie struktury cristae może mieć bezpośredni wpływ na funkcję mitochondriów i stan komórkowy10,11, które są znacząco zmienione podczas wzrostu komórek nowotworowych, przerzutów i zmian mikrośrodowiska guza12,13.

W ostatnich latach naukowcy badali te organelle za pomocą obserwacji EM14,15,16,17; na przykład, badacze przeanalizowali dynamikę mitochondriów za pomocą technik rekonstrukcji 3D6,7,18,19. Ogólna koncepcja i metoda rekonstrukcji 3D obrazów mikroskopii elektronowej została formalnie ustalona już w 196820 i obejmowała połączenie mikroskopii elektronowej, dyfrakcji elektronów i komputerowego przetwarzania obrazu w celu rekonstrukcji ogona faga T4. Do tej pory technologia obrazowania 3D w mikroskopii elektronowej poczyniła znaczne postępy w zakresie rozdzielczości obrazu21, stopnia automatyzacji22 i objętości przetwarzania23 i jest stosowana na coraz szerszą skalę w badaniach biologicznych, od poziomu tkanki do poziomu ultrastruktury organelli w skali nanometrowej24. W ostatnich latach obrazowanie 3D w mikroskopii elektronowej stało się również obiecującą technologią dla szerokiego zakresu zastosowań25,26,27.

Rosnące zainteresowanie grzbiecikami mitochondrialnymi szczególnie ilustruje podstawowe wymagania dotyczące ultrastrukturalnego obrazowania objętościowego. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) została wykorzystana do wizualizacji próbek zebranych na miedzianej siatce (400 mesh)28, z wiązką elektronów przechodzącą przez przekrój. Jednak ze względu na ograniczony zasięg siatki miedzianej niemożliwe jest pełne zobrazowanie ciągłych warstw tej samej próbki29. Komplikuje to badanie struktur docelowych podczas obrazowania TEM. Ponadto TEM opiera się na czasochłonnych i podatnych na błędy zadaniach ręcznych, w tym wycinaniu i zbieraniu wielu warstw oraz ich sekwencyjnym obrazowaniu21, więc nie jest przystosowany do ultrastrukturalnych rekonstrukcji próbek o dużej objętości23. Obecnie rekonstrukcja obrazowania próbek wielkoobjętościowych w wysokiej rozdzielczości odbywa się dzięki zastosowaniu specjalistycznego sprzętu, takiego jak macierz kamer TEM (TEMCA)30 lub dwa systemy TEMCA drugiej generacji (TEMCA2)31, które umożliwiają zautomatyzowane obrazowanie o wysokiej przepustowości w krótkim czasie. Jednak ten rodzaj obrazowania nie ma tej zalety, że jest łatwy do uzyskania i uniwersalny ze względu na wymóg stosowania niestandardowego sprzętu.

W porównaniu z TEM, metoda automatycznego generowania tysięcy seryjnych obrazów wolumetrycznych dla dużych obszarów na podstawie SEM32,33 zwiększa wydajność i niezawodność obrazowania szeregowego oraz zapewnia wyższe rozdzielczości z34. Na przykład seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa z blokową powierzchnią czołową (SBF-SEM) i skaningowa mikroskopia elektronowa ze skupioną wiązką jonów (FIB-SEM) umożliwiły osiągnięcie rekonstrukcji 3D ultrastruktury z dużą prędkością, wydajnością i rozdzielczością35,36. Nieuniknione jest jednak, że powierzchnia bloku zostanie mechanicznie ogolona nożem diamentowym SBF-SEM lub przez frezowanie skupioną wiązką jonów FIB-SEM33,37. Ze względu na destrukcyjność tych dwóch metod dla próbek, nie jest możliwe ponowne zrekonstruowanie tej samej struktury docelowej do dalszej analizy38,39,40. Ponadto w niewielu badaniach podjęto próbę rekonstrukcji ultrastruktury 3D organelli komórek rakowych za pomocą EM do obserwacji zmian patologicznych12. Z tych powodów, w celu dalszego wyjaśnienia patologicznych mechanizmów komórek nowotworowych, takich jak komórki raka trzustki, proponujemy nowatorską technologię rekonstrukcji 3D obrazów przekrojów seryjnych za pomocą ultramikrotomu i skaningowego mikroskopu elektronowego z emisją pola (FE-SEM) w celu analizy ultrastruktury mitochondriów na poziomie grzebienia; Dzięki tej technologii dane o wysokiej rozdzielczości mogą być pozyskiwane przy użyciu wydajnej i dostępnej metody. Seryjne ultracienkie skrawki wykonane za pomocą ultramikrotomu mogą być półtrwale przechowywane w siatkowej walizce i wielokrotnie odtwarzane, nawet po kilku latach41. FE-SEM jest wysoko ceniony jako narzędzie w różnych dziedzinach badawczych ze względu na jego zdolność do dostarczania obrazowania w wysokiej rozdzielczości, dużego powiększenia i wszechstronności42. Próbując ukazać delikatną strukturę organelli w 3D, technika wytwarzania szeregowych stosów obrazów 2D z użyteczną rozdzielczością przy użyciu elektronów rozpraszanych wstecznie wytwarzanych przez FE-SEM43,44 może być również wykorzystana do uzyskania wysokiej przepustowości i wieloskalowego obrazowania obszarów docelowych lub powiązanych z nimi struktur bez specjalnego sprzętu45. Generowanie artefaktów ładunku ma bezpośredni wpływ na jakość pozyskiwanych obrazów, dlatego szczególnie ważne jest, aby czas przebywania był krótki.

Tak więc, niniejsze badanie omawia procedury eksperymentalne stosowane w tej technice SEM do rekonstrukcji struktury 3D mitochondriów cristae46. W szczególności pokazujemy proces opracowany w celu osiągnięcia półautomatycznej segmentacji regionów mitochondrialnych i digitalizacji rekonstrukcji 3D za pomocą oprogramowania Amira, który obejmuje również tworzenie próbek warstwowych przy użyciu konwencjonalnej metody przygotowania próbek OTO44,47, uzupełnianie kolekcji sekcji za pomocą krojenia ultramikrotomowego i pozyskiwanie sekwencyjnych danych 2D przez FE-SEM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie materiału

  1. Hodować 2 x 106 komórek Panc02 w 12 ml pożywki DMEM (10% płodowej surowicy bydlęcej i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny) i utrzymywać w temperaturze 37 °C i wilgotności 95% w atmosferze 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza przez 48 godzin.
  2. Zebrać komórki Panc02, odwirować przy 28 x g przez 2 minuty, a następnie wyrzucić supernatant. Upewnij się, że próbka ma odpowiednią wielkość (1 x 107 komórek), ponieważ w przeciwnym razie następujące etapy utrwalania i odwadniania nie będą działać dobrze.
  3. Dodać 1 ml 2,5% aldehydu glutarowego jako utrwalacz, aby utrwalić świeże komórki Panc02 w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Próbki należy odwirowywać przy 1,006 x g przez 5 minut w każdym z następujących etapów (kroki 1.3-1.11).
  4. Odessać utrwalacz i przepłukać próbki dwukrotnie 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie dwukrotnie przepłukać wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) o temperaturze pokojowej przez 10 minut każda.
  5. Dodać 50 μl roztworu zawierającego 1% tetratlenku osmu (OsO4) i 1,5% żelazocyjanku potasu w stosunku 1:1 w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Następnie płukać dwukrotnie 0,1 M PBS przez 10 minut za każdym razem i płukać ddH2O przez kolejne 10 minut.
  6. Dodać 1 ml 1% tiokarbohydrazydu (TCH), inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut do 1 godziny, a następnie płukać ddH2O cztery razy przez 10 minut za każdym razem.
  7. Dodać 50 μl 1% OsO4, utrwalić w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie spłukać ddH2O cztery razy przez 10 minut za każdym razem.
  8. Dodać 1 ml 2% octanu uranylu w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie płukać ddH2O cztery razy przez 10 minut za każdym razem.
  9. Dodać 1 ml roztworu Waltona (0,066 g azotanu ołowiu rozpuszczonego w 10 ml roztworu podstawowego kwasu asparaginowego o stężeniu 0,03 mol/l) w temperaturze 60 °C przez dodatkowy 1 godzinę inkubacji.
  10. Płukać ddH2O cztery razy przez 10 minut za każdym razem, a następnie odwadniać w serii stopniowanych alkoholi przez 10 minut za każdym razem: 50% alkoholu, 70% alkoholu, 80% alkoholu i 90% alkoholu 1x i 100% alkoholu 2x. Następnie odwodnić w 100% acetonie dwa razy przez 10 minut za każdym razem. Użyj 1 ml każdego roztworu do odwodnienia.
  11. Wymieszać 200 μl acetonu z żywicą epoksydową Pon 812 w proporcjach 3:1, 1:1 i 1:3. Namocz próbkę w żywicy w temperaturze pokojowej odpowiednio przez 2 godziny, 4 godziny i 4 godziny, a następnie weź 100% żywicę epoksydową Pon 812 do impregnacji przez noc.
    UWAGA: Podczas wykonywania etapów barwienia i zatapiania żywicy ważne jest, aby pracować w dygestorium, ponieważ są to substancje toksyczne. Dodatkowo podczas eksperymentu należy nosić fartuchy laboratoryjne i rękawice odporne na rozpuszczalniki.
  12. Próbki należy umieścić w formie do zatapiania, a następnie umieścić w piecu w temperaturze 60 °C na 48 godzin w celu polimeryzacji. Użyj flat embedding29, aby zmniejszyć widoczność żywicy wokół próbki. Upraszcza to instalację próbki i zmniejsza wpływ artefaktów ładowania na późniejszą segmentację obrazu.
    UWAGA: Aby następnie wygenerować poziomą powierzchnię cięcia, można dodać niewielką ilość żywicy do otworu formy, uważając, aby go nie przepełnić.
  13. Przygotować płytki krzemowe, najpierw je myjąc, a następnie hydrofilując stężonym roztworemH2SO4/H2O2przez 30 min. Na hydrofilizowanych płytkach krzemowych należy kolejnie kroić paski o grubości 70 nm za pomocą ultramikrotomu i suszyć je w piecu o temperaturze 60 °C przez 10 min.
    UWAGA: Powoli chwyć plasterek, gdy plasterek unosi się na powierzchni wafli, aby zapobiec utracie lub deformacji plasterka.

2. Akwizycja obrazu i rekonstrukcja trójwymiarowa

  1. Przed zamontowaniem wafla silikonowego na scenie należy trzykrotnie umyć sekcje wodą destylowaną i wysuszyć je na powietrzu. Wytnij przewodzącą taśmę węglową o wymiarach 1 cm x 0,5 cm i przyklej ją między płytką krzemową a stolikiem próbki SEM, aby zakończyć konfigurację próbki (Rysunek 2E).
  2. Ustawić parametr napięcia przyspieszającego FE-SEM na 2 kV z odległością roboczą 4 mm (Rysunek 3B i tabela 1).
    UWAGA: Aby poprawić stosunek sygnału do szumu i zredukować szumy na obrazie, obserwuj przy małych powiększeniach, gdy tylko jest to możliwe. Wraz ze wzrostem wielokrotności zmniejsza się zasięg skanowania SEM, co prowadzi do wzrostu akumulacji ładunku na obrazach.
  3. Kliknij ikonę H/L na górnym pasku menu. Najpierw, przy małym powiększeniu, zorientuj pierwszą sekcję docelowych pasków plasterka, a następnie ponownie kliknij opcję H/L (Rysunek 3A), aby przełączyć się na tryb dużego powiększenia; Zbierz obraz odpowiedni do interesującej Cię struktury, dostosowując jasność, kontrast i powiększenie obrazu.
  4. Wybierz opcję Project View > Open Data i zaimportuj pliki obrazów, które mają zostać przeanalizowane, do oprogramowania.
  5. Wyrównaj obrazy, klikając Wyrównaj plasterki > Edytuj (Rysunek 4B) i dostosuj wartość Zakres intensywności w lewym dolnym pasku menu, modyfikując przezroczystość obrazu. W tym przypadku użyj półautomatycznej strategii wyrównywania; W szczególności, poprzez automatyczne wyrównywanie, spraw, aby obrazy nakładały się na poprzedni obraz, a następnie wykonaj ręczne dostrajanie.
    UWAGA: W tej pracy, podczas procesu wyrównywania, poprzedni obraz został wykorzystany jako odniesienie, a operacje przesuwania i obracania zostały wykorzystane do maksymalnego nałożenia na siebie docelowej struktury obu obrazów. Kliknięcie opcji Wyrównaj bieżącą parę plasterków może pomóc w automatycznym wyrównaniu obrazów, ale może wystąpić niewłaściwe umieszczenie.
  6. Wybierz moduł Wyodrębnij podwolumin i przytnij wyrównane zestawy danych, aby dopasować je do rozmiaru nakładającej się części całego stosu.
  7. W podsekcji Segmentacja (Rysunek 4C) wybierz opcję Resample > Segmentation > Save. Wybierz próg magicznej różdżki i rozmiar narzędzia Pędzel, aby wybrać odpowiedni zakres. Również w tym przypadku zastosuj półautomatyczną metodę segmentacji, najpierw używając Magicznej Różdżki, aby automatycznie wybrać odpowiedni duży obszar, a następnie użyj Pędzla, aby dokładnie opisać szczegóły.
    UWAGA: Magiczna różdżka może być stosowana do segmentowania obrazów w oparciu o oczywiste różnice w intensywności pikseli istniejące między strukturą będącą przedmiotem zainteresowania a otaczającymi strukturami, zmieniając wartość maskowania i używając linii limitu rysowania. Nie jest w stanie rozróżnić artefaktów ładowania generowanych podczas akwizycji obrazu. W związku z tym może to skutkować nieprawidłową segmentacją dla regionów docelowych. Za pomocą narzędzia Pędzel można ręcznie segmentować w celu dokładnej rekonstrukcji struktur biologicznych.
  8. W obszarze Segmentacja > wybór kliknij ikonę +, aby dodać wybrany obszar (Rysunek 4C).
  9. Powtórz powyższy krok (2.8), aby wybrać tę samą strukturę docelową na różnych obrazach, aż wybór zostanie zakończony w celu rekonstrukcji interesujących mikrostruktur.
    UWAGA: Podczas procesów przebudowy mitochondriów wybór obiektu docelowego musi być wykonany z obrazu znajdującego się w środku grupy obrazów sekwencyjnych. Jeśli żądany obszar zostanie wybrany z pierwszego lub ostatniego zdjęcia, wynik rekonstrukcji nie będzie w stanie przedstawić pełnej wizualizacji 3D.
  10. Po zakończeniu segmentacji regionalnej wygeneruj plik obrazu zgodnie z najlepszymi wynikami dla rozmiaru obiektu i rozdzielczości obrazu. Kliknij Edytor kadrowania, a następnie wprowadź liczbę 6 w polu Wirtualny suwak (Rysunek 4C).
  11. W menu rozwijanym po lewej stronie kliknij prawym przyciskiem myszy szary obszar w podsekcji Projekt i wybierz opcję Generuj powierzchnię > Utwórz > zastosuj. W wygenerowanym pliku użyj modułu Widok powierzchni, aby utworzyć strukturę powierzchni i reprezentację 3D.

3. Kwantyfikacja

  1. Kliknij Usuń małe plamki > Zastosuj (Rysunek 4D). W podsekcji Projekt kliknij prawym przyciskiem myszy szary obszar i wybierz Analiza etykiet > Zastosuj (Rysunek 4D).
  2. Dostosuj nazwę kolumny i wybierz grupę miar. Wybierz Volume3d i Length3d z pola Native Measurements (Pomiary natywne).
  3. Kliknij przycisk Zastosuj w lewym dolnym rogu ekranu. Skopiuj dane i wykres w oprogramowaniu statystycznym, takim jak GraphPad.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podczas hodowli komórkowej (Rycyna 1A) komórki raka trzustki podzielono najpierw na grupę kontrolną hodowaną w pełnej pożywce, grupę (1S,3R)-RSL348 (RSL3, aktywator ferroptozy, 100 nM) oraz grupę RSL3 (100 nM) z dodatkiem ferrostatyny-149 (Fer-1, inhibitor ferroptozy, 100 nM). W ramach powyższych kroków eksperymentalnych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego wykonano odpowiednio 38 (Rycina uzupełniająca 1), 43 (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda jest przydatnym przewodnikiem krok po kroku dotyczącym zastosowania techniki rekonstrukcji 3D, która polega na zastosowaniu mikroskopii elektronowej i technologii przetwarzania obrazu do układania i segmentacji obrazów tomograficznych 2D generowanych z szeregowych ultracienkich przekrojów. Protokół ten podkreśla ograniczenie obrazów 2D, które można rozwiązać za pomocą wizualizacji 3D ultrastruktury organelli, która ma zalety w postaci silnej odtwarzalności struktur na poziomie wysokiej rozdziel...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Te badania były wspierane przez granty Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82274364, 81673607 i 81774011); a także projekt badawczy dotyczący dobrobytu publicznego w ramach grantu Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). Doceniamy ogromną pomoc, wsparcie techniczne i eksperymentalne ze strony Publicznej Platformy Centrum Badań Medycznych, Akademii Chińskich Nauk Medycznych, Chińskiego Uniwersytetu Medycznego Zhejiang.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(1S,3R)-RSL3MCEHY-100218A
AcetonSIGMA179124
Amira Visage Imaging2020.2
Kwas asparaginowyMCEHY-42068
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle' s mediumGibco11995115
EtanolMerck100983
Ferrostatin-1MCEHY-100579
Płodowa surowica bydlęcaGibco10437010
Skaningowy mikroskop elektronowy z emisją w poluHITACHISU8010
Aldehyd glutarowyAlfa AesarA10500.22
Ołów azotanSANTA CRUZsc-211724
Tetratlenek osmuSANTA CRUZsc-206008B
Panc02Europejska Kolekcja Uwierzytelnionych Kultur Komórkowych 
Penicylina-streptomycynaBiosharpBL505A
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiBiosharpBL302A
Pon 812 Żywica epoksydowaSPI CHEMGS02660
Żelazocyjanek potasuMacklinP816416
TiokarbohydrazydMerck223220
UltramikrotomOctanEMUC7
RHAWNR032929
98102213 uranylu LEICA

Bibliografia

  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
  4. Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39(2017).
  5. Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644(2009).
  6. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610(2016).
  7. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037(2021).
  8. Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
  9. Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604(2009).
  10. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  11. Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673(2022).
  12. Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254(2019).
  13. Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L. Mitochondrial metabolism and cancer. Cell Research. 28 (3), 265-280 (2018).
  14. Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
  15. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
  16. Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux' Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
  17. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
  18. Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
  19. Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350(2018).
  20. Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
  21. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98(2018).
  23. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172(2012).
  24. Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
  25. Kittelmann, M. 3D electron microscopy of the ER. Methods in Molecular Biology. 1691, 15-21 (2018).
  26. Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited - New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383(2018).
  27. Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  28. Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
  29. Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
  30. Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
  31. Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
  32. Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118(2022).
  33. Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
  34. Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
  35. Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
  36. Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56(2021).
  37. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
  38. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  39. Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38(2016).
  40. Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804(2021).
  41. Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368(2021).
  42. Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
  43. Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
  46. Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373(2021).
  47. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390(2021).
  48. Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
  49. Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
  50. Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
  51. Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068(2016).
  52. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321(2019).
  53. Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414(2022).
  54. Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021(2021).
  55. Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371(2018).
  56. Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
  57. Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
  58. Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65(2021).
  59. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
  60. Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
  61. Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
  62. Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431(2020).
  63. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340(2016).
  64. Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740(2021).
  65. Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
  66. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916(2017).
  67. Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036(2021).
  68. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699(2020).
  69. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  70. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
  71. Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996(2014).
  72. Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
  73. Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer's disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
  74. Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ultrastruktura mitochondriówrekonstrukcja trójwymiarowaskaningowa mikroskopia elektronowaseryjne ultracienkie przekrojegrzebienie mitochondrialnemikroskopia elektronowamorfologia organellimetoda OTOdysfunkcja mitochondrialna
Trójwymiarowa technika wizualizacji ultrastrukturalnych zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.