Zarodki osy Nasonia zostały wypreparowane z poczwarek Lucillia sericata po pasożytowaniu przez 12-24 godziny i przemyte alkoholem i 10% roztworem podchlorynu sodu w celu uzyskania wolnych od zarazków zarodków. Po wyhodowaniu zarodków wolnych od zarazków i dostarczeniu im podłoża hodowlanego Nasonia do wzrostu i rozwoju in vitro, uzyskano dorosłe osobniki Nasonia wolne od zarazków.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Optymalizacja procedury chowu os wolnych od zarazków
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Technologia aseptycznego chowu to metoda hodowli owadów w sterylnych lub prawie sterylnych warunkach, która może skutecznie wyeliminować wpływ zewnętrznych mikroorganizmów na mikrobiotę owadów i w ten sposób promować szybki rozwój badań nad mikrobiotą owadów. Nasonia (rodzaj osy) to pasożytniczy owad osy, który ma wiele zalet, takich jak krótka żywotność, wysoka zmienność genetyczna, łatwa obsługa itp., i jest szeroko stosowany jako system modelowania owadów. W przeciwieństwie do antybiotykoterapii, która może jedynie zmniejszyć liczbę mikroorganizmów u zwierząt, techniki aseptycznego chowu mogą kontrolować zarówno skład, jak i ilość mikroorganizmów u zwierząt, co dodatkowo ułatwia badanie interakcji gospodarz-mikroorganizm. Jednak poprzednie wersje pożywki hodowlanej Nasonia (NRM) mają pewne wady i problemy, takie jak złożony i czasochłonny proces przygotowania, łatwe zanieczyszczenie bakteriami lub grzybami oraz krótki czas przechowywania. Dlatego niniejsze badanie rozwiązuje te problemy poprzez optymalizację narzędzi stosowanych w procesie przygotowania NRM, warunków przechowywania i proporcji składników. Zoptymalizowana pożywka może pozwolić na przechowywanie w temperaturze -20 °C przez co najmniej 3 miesiące i wyeliminować możliwość zanieczyszczenia NRM podczas karmienia sterylnych os. To dodatkowo poprawia przeżywalność i poziom zdrowia aseptycznej Nasonii, co jest ważne dla wykorzystania Nasonii jako modelu do badań mikrobiologicznych.
Wprowadzenie
Zwierzęta wolne od zarazków to zwierzęta, które nie mają wykrywalnych żywych mikroorganizmów i pasożytów1. Zarodki wolne od zarazków można uzyskać poprzez preparację matki w warunkach aseptycznych, a następnie hodować w systemach barierowych2. Takie zwierzęta mogą być wykorzystywane do badania wpływu mikroorganizmów na zwierzęta, takich jak mikrobiota jelitowa, układ odpornościowy i metabolizm1. Za pomocą pewnych środków technicznych wiele owadów, a nawet ssaków można uczynić sterylnymi3,4. Zwierzęta wolne od zarazków odgrywają wyjątkową rolę i są szeroko stosowane w różnych aspektach badań mikrobiologicznych5. Na przykład użycie wolnych od zarazków os Nasonia ujawniło, że mikroorganizmy mogą pomóc gospodarzom przystosować się do nowego środowiska w warunkach długotrwałego egzogennego stresu środowiskowego6,7.
Parazytoidy z Nasonia to małe pasożytnicze osy, które wstrzykują swoje jaja do poczwarek much4. Znane są cztery gatunki Nasonia, w tym Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti i Nasonia oneida8. N. vitripennis można znaleźć na całym świecie, podczas gdy pozostałe trzy gatunki mają ograniczony zasięg w Ameryce Północnej4. Osy pasożytnicze Nasonia są uważane za idealne owady modelowe ze względu na ich cechy, takie jak łatwa uprawa, krótki cykl reprodukcyjny, sekwencjonowany genom i długotrwała diapauza 8,9. Mogą być używane do badania różnych aspektów ewolucji owadów, genetyki, rozwoju, zachowania i symbiozy10. Co więcej, osy pasożytnicze Nasonia mogą również pomóc w zwalczaniu szkodliwych much w rolnictwie i chorobach11. Pomyślne wprowadzenie systemu sterylnych owadów obejmuje dwa główne etapy: (1) sterylizację zarodków i (2) dostarczenie larwom sterylnego pokarmu in vitro. Aby uzyskać sterylną żywność, Brucker i Bordenstein12 opracowali w 2012 roku Pożywkę hodowlaną Nasonia (NRMv1), używając substancji chemicznych, takich jak antybiotyki, wybielacze i płodowa surowica bydlęca do zabijania bakterii12. Jednak metoda sterylizacji chemicznej skutkowała niskimi wskaźnikami przeżywalności i eklozji N. vitripennis13. Następnie, w 2016 roku, Shropshire i in. opracowali NRMv2, stosując metodę sterylizacji filtracyjnej zamiast metody sterylizacji chemicznej, aby wyeliminować zagrożenia związane z antybiotykami i innymi substancjami, a także zoptymalizować proces hodowli13. Niestety, ta metoda nadal ma pewne wady, takie jak wyzwania związane z przygotowaniem i używaniem pożywki, a także ryzyko utonięcia, niedożywienia lub odwodnienia dla zarodków, larw i zamkniętych poczwar14. Wang i Brucker14 niedawno ulepszyli protokoły Nasonia dla chowu w wersji 3 (NRMv3) i dla hodowców wolnych od zarazków w wersji 2 (GFRv2). Te ulepszenia zmniejszyły koszty i zużycie mediów. Jednak NRMv3 ma bardzo krótki czas przechowywania i jest bardzo podatny na zanieczyszczenia.
Opierając się na NRMv3, w tym badaniu zoptymalizowano metodę przechowywania narzędzi do przygotowania NRM i proporcje składników odżywczych. To udoskonalenie metodologiczne ułatwia wykorzystanie N. vitripennis jako modelu do badań mikrobiomu. W porównaniu z NRMv3 opracowanym przez Wang et al.14, ulepszone narzędzie do wyciskania poczwarki Sarcophaga bullata, jednego z surowców NRM, znacznie zwiększa wydajność produkcji płynu tkankowego poczwarki S. bullata w porównaniu ze strzykawką o pojemności 60 ml z dolnym otworem używaną przez Wang i wsp.14. Dostosowaliśmy stosunek składników odżywczych NRM, co doprowadziło do pewnego wzrostu wskaźnika przeżywalności wolnych od zarazków os Nasonia bez wpływu na ich czas rozwoju. Ponadto NRM został zapakowany w probówki wirówkowe o małej pojemności (1,5 ml) i zamrożony w lodówce o temperaturze -20 °C, aby wydłużyć czas przechowywania. Warto zauważyć, że chociaż użyliśmy muchy domowej Lucilia sericata jako żywiciela i źródła do przygotowania NRM, protokół ten może być prawdopodobnie dostosowany do innych gospodarzy Nasonia, którzy są dostępni w laboratorium.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie wolnego od zarazków podłoża hodowlanego Nasonia
- Umieścić dostępne w handlu poczwarki L. sericata (patrz tabela materiałów) na powierzchni, która może pomieścić wszystkie poczwarki, takiej jak taca lub arkusz papieru. Wyrzuć wszelkie słabo rozwinięte larwy, ciemne stare poczwarki, puste skorupki poczwarek, trociny lub inne zanieczyszczenia. Trzymaj tylko młode poczwarki o brązowo-czerwonym kolorze i przenieś je do zlewki (około 3,000-4,000 poczwarek).
UWAGA: Po przeprowadzeniu wielu eksperymentów stwierdzono, że podłoże wykonane z ciemnych starych poczwarek łatwo ciemnieje i zatrzymuje rozwój os wolnych od zarazków. Zjawisko to nie wystąpiło przy użyciu młodych brązowo-czerwonych poczwarek do produkcji pożywki. Przyczyna tego jest nadal niejasna i wymaga dalszych badań w celu jej weryfikacji. - Dodaj tyle wody dejonizowanej do zlewki, aby pokryć całą powierzchnię poczwarek. Owiń ujście zlewki folią aluminiową lub gazą, potrząśnij zlewką, aby oczyścić ją z zanieczyszczeń na powierzchni poczwarek, a następnie wylej wodę. Powtórz od trzech do pięciu razy.
- Umieścić oczyszczone poczwarki L. sericata w zbiorniku filtrującym prasy do czosnku, mocno ścisnąć i zebrać płyn tkankowy poczwarki L. sericata w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie wylej resztki poczwarki i włóż nowe poczwarki do zbiornika filtrującego prasy do czosnku, aż wszystkie zostaną wyciśnięte.
UWAGA: W porównaniu z urządzeniem do wytłaczania igieł używanym przez Wang et al.14, prasa do czosnku jest wygodniejsza i może dokładniej oddzielić płyn śródmiąższowy. Postęp ten stanowi podstawę do produkcji na dużą skalę i długoterminowego przechowywania NRM. - Odwirować mieszaninę w temperaturze 4 °C (25 000 x g) przez 10 minut. Po odwirowaniu mieszanina zostanie podzielona na trzy warstwy od dołu do góry: warstwę osadu, warstwę białka i warstwę tłuszczu (Rysunek 1).
- Aby zapobiec zatykaniu się podczas filtracji, należy odessać warstwę białka za pomocą sterylnej igły o sile 18 G i przenieść ją do nowej stożkowej sterylnej probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml.
- Dodać dostępną w handlu płynną pożywkę Drosophila (patrz tabela materiałów) do ekstraktu białkowego w stosunku 1:1.
UWAGA: Wygodniejszy skomercjalizowany L. sericata został użyty jako gospodarz i surowiec NRM, w porównaniu z NRMv3. W związku z tym stosunek składników odżywczych został dostosowany z 1:2 do 1:1 w oparciu o NRMv3, który był bardziej odpowiedni dla wzrostu i rozwoju bezpłodnej Nasonia (Rysunek 2). - Przefiltrować zmieszane podłoże (pożywka Drosophila i ekstrakt białkowy z poczwarki L. sericata) za pomocą systemu filtracji próżniowej o różnych rozmiarach porów (8, 1,2, 0,8 i 0,45 μm; patrz tabela materiałów) w celu usunięcia cząstek o różnych rozmiarach. Aby zapobiec zatykaniu, wymień bibułę filtracyjną, gdy przepływ zwalnia.
UWAGA: Do każdej filtracji wymagane jest użycie nowej sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. - Ponownie odwirować ciecz w temperaturze 4 °C (15 000 x g) przez 10 minut i wysterylizować pożywkę sklarowaną nad osadem przez filtr strzykawkowy 0,22 μm. Powtórz powyższe kroki raz.
- Przechowywać pożywkę hodowlaną w temperaturze -20 °C po porcjowaniu (Rysunek 3A) do długotrwałego przechowywania.
UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu oraz wielokrotnemu zamrażaniu i rozmrażaniu, zaleca się otwieranie każdej probówki NRM tylko raz w przypadku korzystania z pożywki hodowlanej po zapakowaniu (Rysunek 3A).
2. Zbieranie jaj wolnych od zarazków
- Aby zapewnić stabilny stosunek samców do samic u potomstwa, umieść poczwarki w fiolce Drosophila w fazie poczwarki w stosunku 50 samic do 15 samców ze względu na ich haploidalne cechy genetyczne (samce rozwijają się z komórek haploidalnych, podczas gdy samice rozwijają się z komórek diploidalnych, które powstają z zapłodnionych jaj)4,15.
- Po pojawieniu się dorosłych osobników pozwól samcom i samicom łączyć się w pary przez 1,5 dnia, a następnie umieść około 40 poczwarek L. sericata w fiolce. W ciągu 12-24 godzin po pasożytowaniu użyj sterylnej igły preparucyjnej, aby ostrożnie otworzyć jeden koniec skorupy poczwarki pod mikroskopem stereoskopowym (Ryc. 4).
- Przytrzymaj drugi koniec ręką i znajdź zarodki osy. Użyj igły preparucyjnej, aby przenieść zarodki z powierzchni tkanki poczwarki L. sericata do sterylnego sitka komórkowego z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS)14.
UWAGA: Starsze poczwarki L. sericata powinny być używane do pasożytnictwa, ponieważ sucha tkanka poczwarki L. sericata jest łatwiejsza do przenoszenia zarodków. Aby zapewnić płynne przenoszenie jaj z powierzchni tkanki poczwarki L. sericata, należy uważać, aby nie przebić tkanki, gdy igła preparcyjna otwiera obudowę poczwarki, aby płyn śródmiąższowy nie wypłynął .
- Umieść 20-30 zarodków na sitku do komórek i umyj je równomiernie 1 000 μl 10% dostępnego w handlu roztworu podchlorynu sodu (patrz Tabela materiałów), a następnie ponownie przemyj 1 000 μl 1x sterylnego PBS. Następnie przemyj raz 1 000 μl 70% roztworu etanolu i przemyj trzy razy 1 000 μl 1x sterylnego PBS.
- Najpierw umieść arkusz siatki polipropylenowej o średnicy 5 mm (patrz Tabela materiałów), który został wstępnie zwilżony 1x PBS, w 24-dołkowej płytce. Następnie za pomocą wysterylizowanej małej szczoteczki delikatnie zetrzyj zarodki osy na sitku komórkowym na arkuszu siatki polipropylenowej. Można to zrobić dla wszystkich czterech dołków w pionowej kolumnie płytki 24-dołkowej.
3. Hodowla os wolna od zarazków
- Dodaj 50 μl NRM do każdej studzienki w okapie z przepływem laminarnym. Aby utrzymać wilgotne środowisko do wzrostu, dodaj 1 ml sterylnej wody między każdą studzienkę w 24-dołkowej płytce. Małą zlewkę zawierającą 30 ml sterylnej wody można również umieścić w sterylnym plastikowym pudełku o pojemności 5 litrów z płytką 24-dołkową.
- Przez cały czas trwania eksperymentu należy przechowywać sterylne plastikowe pudełko i płytkę 24-dołkową w komorze klimatycznej w stałej temperaturze 25 ± 2 °C i w stałym świetle.
- Przed codziennym przenoszeniem i dodawaniem NRM należy rozmrozić zamrożony NRM na ławce laminarnej. W sterylnym środowisku użyj pęsety zdezynfekowanej alkoholem, aby przenieść siatkę polipropylenową z larwami z jednej studzienki do drugiej. Na koniec dodaj 50 μl NRM, który został zrównoważony do temperatury pokojowej (Rysunek 3B). Powtarzaj powyższe czynności codziennie, aż do zaobserwowania poczwarek.
UWAGA: Wraz z rozwojem os należy odpowiednio zwiększyć ilość NRM, aby zapewnić osom wolnym od zarazków wystarczające składniki odżywcze. Na przykład larwy w czwartym stadium rozwojowym były zaopatrywane w 60 do 70 μl NRM. Ponieważ różne etapy rozwoju mogą współistnieć w tej samej studzience, użyj wysterylizowanej szczotki, aby przenieść poczwarki. Dodaj niewielką ilość NRM do pozostałych larw. Stosuj techniki aseptyki, aby uniknąć inwazji drobnoustrojów i zanieczyszczenia. - Po karmieniu przez 9 do 11 dni ponad 80% larw przekształca się w białe lub żółte poczwarki. W tym czasie przenieś filtr do czystej płytki studzienkowej i przestań dodawać pożywkę hodowlaną, aby poczekać na ekleksję.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wydajność przygotowania NRM znacznie poprawiono dzięki udoskonaleniu narzędzi przygotowawczych. Dodatkowo, problem zanieczyszczenia NRM w procesie podawania wyeliminowano poprzez optymalizację strategii i metody przechowywania. Jednocześnie zmodyfikowane NRM posiadało bardziej odpowiedni stosunek składników odżywczych dla wzrostu i rozwoju wolnych od drobnoustrojów błonicznic z L. sericata jako gospodarzami. Przeżywalność wolnych od drobnoustrojów błonicznic na etapie od larwy do poczwarki uległa znaczącej popra...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dzięki zastosowaniu wysokoprzepustowych technologii wykrywania, takich jak genomika i metabolomika, naukowcy stopniowo zdali sobie sprawę, że mikrobiota jelitowa jest niezwykle różnorodna genetycznie i złożonametabolicznie16. Te symbiotyczne bakterie są ściśle związane z różnymi stanami fizjologicznymi lub patologicznymi, takimi jak metabolizm żywieniowy gospodarza, nowotwory, odporność i starzenie się poprzez złożone interakcje z gospodarzem17. Jednak badania związane z si...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Finansowanie: ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauki Chin (32270538), Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2022YFF0710603), Fundację Nauk Przyrodniczych w Pekinie (6222046), oraz strategiczne finansowanie CAS poprzez program finansowania CAS-CSIRO (152111KYSB20210011) przyznane G.H.W. Wkład autora: wszyscy autorzy opracowali zakres i cel recenzji oraz przyczynili się do napisania manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,22 Sterylny filtr próżniowy | NEST | 331011 | |
| 10% podchloryn sodu | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x roztwór PBS | Solarbio | P1020 | |
| siatka nylonowa o siatce 200 siatka | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24-dołkowa płytka | NEST | 702001 | |
| 8, 1,2, 0,8 i 0,45 µ m filtry | Shanghai Xingya Fabryka Materiałów Oczyszczających | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolutny alkohol etylowy | Macklin | E809057-500ml | |
| Sitko do komórek | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Igła preparcyjna | Bioroyee | 17-9140 | |
| Prasa | do czosnkuTaobao | Brak numerów katalogowych | Zakup na Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | Brak numerów katalogowych | Zakup na Taobao |
| Mały pędzel do pisania | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoskop | SOPTOP | RX50 | |
| Pęseta | SALMART | A109001-56 |
Bibliografia
- Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551(2021).
- Pang, X., et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs. The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).
- Uzbay, T. Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies. Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).
- Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -H. Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research. Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).
- Li, J., Wei, H. Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research. Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Dittmer, J., Brucker, R. M. When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis. Microbiome. 9 (1), 85(2021).
- Dittmer, J., et al. Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps. Frontiers in Microbiology. 7, 1478(2016).
- Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. PLoS Biology. 14 (11), e2000225(2016).
- Heavner, M. E., et al. Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera. Gene. 526 (2), 195-204 (2013).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia. PLoS One. 7 (12), e51269(2012).
- Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia. PeerJ. 4, e2316(2016).
- Wang, G. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219(2022).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia. Science. 341 (6146), 667-669 (2013).
- Fontaine, C. A., et al. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122 (1), 107-118 (2005).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
