Niedrogi elektroencefalograficzny system zapisu w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do przezczaszkowej stymulacji mózgu myszy in vivo

Przezczaszkowa stymulacja magnetyczna (TMS) jest obiecującym narzędziem do nauki o ludzkim mózgu, zastosowań klinicznych i badań na modelach zwierzęcych ze względu na jej nieinwazyjność. We wczesnej fazie zastosowań TMS pomiar efektu korowego w odpowiedzi na TMS z pojedynczym i sparowanym impulsem u ludzi i zwierząt był ograniczony do kory ruchowej; Łatwo mierzalna moc wyjściowa ograniczała się do potencjałów wywołanych motorycznych i indukowanych potencjałów mioelektrycznych obejmujących korę ruchową^1,2. Aby rozszerzyć obszary mózgu, które można mierzyć za pomocą modulacji TMS, zapis elektroencefalograficzny (EEG) został zintegrowany z TMS z pojedynczym i sparowanym impulsem jako użyteczną metodą bezpośredniego badania pobudliwości, łączności i dynamiki czasoprzestrzennej obszarów w całym mózgu^3,4,5. Tak więc, jednoczesne zastosowanie TMS i zapisu EKG (TMS-EEG) do mózgu zostało wykorzystane do zbadania różnych powierzchownych obszarów kory mózgowej ludzi i zwierząt w celu zbadania wewnątrzkorowych obwodów nerwowych (patrz Tremblay et al.⁶). Co więcej, systemy TMS-EEG mogą być wykorzystywane do badania dodatkowych cech czasoprzestrzennych kory mózgowej, w tym propagacji sygnałów do innych obszarów kory mózgowej i generowania aktywności oscylacyjnej^7,8.

Jednak mechanizm działania TMS w mózgu pozostaje spekulatywny ze względu na nieinwazyjność TMS, co ogranicza naszą wiedzę o tym, jak mózg funkcjonuje podczas aplikacji TMS. Dlatego inwazyjne badania translacyjne na zwierzętach, od gryzoni po ludzi, mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmu wpływu TMS na obwody neuronalne i ich aktywność. W szczególności w przypadku połączonych eksperymentów TMS-EEG na zwierzętach nie opracowano intensywnie jednoczesnego systemu stymulacji i pomiaru dla małych zwierząt. Dlatego eksperymentatorzy są zobowiązani do skonstruowania takiego systemu metodą prób i błędów zgodnie z ich specyficznymi wymaganiami eksperymentalnymi. Ponadto modele mysie są przydatne wśród innych modeli gatunków zwierząt in vivo, ponieważ wiele transgenicznych i izolowanych szczepów myszy jest dostępnych jako zasoby biologiczne. W związku z tym wygodna metoda zbudowania połączonego systemu pomiarowego TMS i EEG dla myszy byłaby pożądana dla wielu badaczy neurobiologii.

To badanie proponuje metodę łączoną TMS-EEG, która może być stosowana do jednoczesnej stymulacji i rejestracji mózgu myszy, który jest głównym typem transgenicznego zwierzęcia wykorzystywanego w badaniach, i który może być łatwo skonstruowany w typowych laboratoriach neurologicznych. Po pierwsze, opisano tani system rejestracji EEG wykorzystujący konwencjonalne elektrody śrubowe i elastyczne podłoże do powtarzalnego przypisywania pozycji matrycy elektrod w każdym eksperymencie. Po drugie, system stymulacji magnetycznej jest zbudowany przy użyciu cewki o rozmiarach milimetrowych, którą można łatwo wykonać na zamówienie w typowych laboratoriach. Po trzecie, system połączony z TMS-EEG rejestruje aktywność neuronalną w odpowiedzi na stymulację dźwiękową i magnetyczną. Metoda przedstawiona w tym badaniu może ujawnić mechanizmy, które generują określone zaburzenia u małych zwierząt, a wyniki uzyskane w modelach zwierzęcych można przełożyć na zrozumienie odpowiadających im zaburzeń u ludzi.

W obecnym badaniu, wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Hokkaido. Do niniejszego badania wykorzystano myszy C57BL/6J, dwa samce i trzy samice, w wieku od 8 do 10 tygodni. Jest to procedura terminalna. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).

1. Elastyczne projektowanie i budowa dwuwymiarowej tablicy

1. Przygotuj wymaganą liczbę miniaturowych elektrod śrubowych (nierdzewnych, SUS XM7; patrz tabela materiałów) o następujących właściwościach strukturalnych do użycia jako elektrody rejestrujące EEG i elektrody odniesienia: średnica nominalna, długość szyjki i średnica głowicy odpowiednio 0,6 mm, 1,5 mm i 1,1 mm (Rysunek 1A).
   UWAGA: W niniejszym badaniu użyto 16 miniaturowych elektrod śrubowych.
2. Przygotuj plan schematu obwodu drukowanego na elastycznym podłożu, wykonując poniższe czynności.
   1. Utwórz dwuwymiarowy (2D) wzór elektrody na elastycznym podłożu (cały rozmiar, 41,2 mm × 19,9 mm; patrz Tabela materiałów) dla elektrod śrubowych, które mają być odczytane. Zaprojektuj układ elektrod 2D. Rysunek 1B pokazuje konkretne układy użyte w tym badaniu oraz względne współrzędne od punktu bazowego (krzyżyk zaznaczony na początku [0, 0]).
      UWAGA: W niniejszym badaniu, aby zarejestrować aktywność neuronalną w korze słuchowej w obrębie płatów skroniowych, umieszczenie elektrod w kierunku bocznym do przyśrodkowym (poziomym) było dłuższe niż w kierunku rostralnym do ogonowym (pionowym) (Rysunek 1B).
   2. Upewnij się, że w przypadku elektrod rejestrujących EEG każda miedziana podkładka (patrz Tabela materiałów) na elastycznym podłożu ma kształt pierścienia o średnicy zewnętrznej 1.3 mm i średnicy wewnętrznej 0.8 mm (Rysunek 1C, po lewej). Wykonaj mały otwór (o średnicy 0,8 mm) w środku, aby każda elektroda śrubowa przeszła przez podłoże. W przypadku elektrod odniesienia każda podkładka miedziana powinna mieć kształt kwadratu o długości boku 1,4 mm; podobnie wykonaj mały otwór (o średnicy 0,8 mm) w środku, aby każda śruba przeszła przez kwadratową podkładkę na podłożu (Rysunek 1C, po prawej).
   3. Następnie, aby złącze do montażu powierzchniowego (Rysunek 1D, po lewej), zaprojektuj pola odczytu (tablica 2D) prowadzące do złącza (Rysunek 1D, po prawej). Na przykład użyj złącza z 2 × 10 pinami i rastrem 1,27 mm między sąsiednimi pinami (Rysunek 1D, po prawej).
   4. Podłącz elektrody śrubowe i podkładki łączące, używając zarówno warstwy, jak i warstwy tylnej, z szerokością linii 0,03 mm i odstępem między liniami 0,03 mm (cienkie linie w Rysunek 1E).
   5. Ponadto, aby podłączyć kanały odniesienia i uziemienia do wzmacniacza, podłącz elektrody elektrody odniesienia i uziemiającej do izolowanej części na zewnątrz elastycznej matrycy 2D (dwa pionowe prostokąty oznaczone literami "G" i "HR" na dole Rysunek 1E). Po określeniu kanału odniesienia i uziemienia należy pamiętać o przylutowaniu elektrod do odpowiednich złączy (patrz krok 2.1).
   6. Odpowiednio zaprojektuj odsłonięty obszar, który nie jest pokryty warstwą ochronną (warstwą poliimidową). Odsłoń podkładki łączące w warstwie powierzchniowej, odsłaniając podkładki elektrod śrubowych zarówno w warstwie powierzchniowej, jak i tylnej. Cała konstrukcja elektrody, rozmiary i wyprodukowana elastyczna matryca 2D są zilustrowane na Rysunek 1E, a obraz sfabrykowanego podłoża jest pokazany w Rysunek 1F.
   7. W górnej części elektrody (części głowicy) elastycznej matrycy 2D upewnij się, że trójwarstwowa struktura od góry do dołu składa się z następujących elementów (całkowita grubość 49,0 μm): górna warstwa miedzi (grubość 12,0 μm), środkowa warstwa rdzenia poliimidowego (25,0 μm) i dolna warstwa miedzi (12,0 μm) (Rysunek 1G, do góry).
   8. Wytrawiaj warstwy miedzi na górnej i dolnej powierzchni podłoża, na przykład za pomocą trawienia na mokro i standardowej techniki wytwarzania⁹.
   9. W dolnej kwadratowej części podkładki (część łącząca) elastycznej matrycy 2D upewnij się, że sześciowarstwowa struktura składa się z trzech warstw, w tym górnej warstwy miedzi (grubość 12,0 μm), środkowej warstwy poliimidowej rdzenia (25,0 μm) i dolnej warstwy miedzi (12,0 μm), które są warstwami ochronnymi poliimidowymi, w tym górną i dolną (obie 12,5 μm). Przymocuj płytę poliimidową o grubości 2 mm od dołu jako materiał wzmacniający (Rysunek 1G, na dole).
      UWAGA: Aby zachować elastyczność, wzmacniająca płyta poliamidowa nie jest montowana do części szyjki elastycznego układu 2D między głowicą a częścią łącznika.
   10. Podobnie w części łącznika wytrawić warstwy miedzi i ochronnego poliimidu na górze, używając trawienia na mokro i standardowej techniki wytwarzania.
       UWAGA: Całkowita waga wyprodukowanego, elastycznego urządzenia z matrycą 2D, wraz ze złączem, wynosi 0,84 g. Po zaprojektowaniu układu dla elastycznej tablicy 2D, dla wygody czasami zaleca się podłoża od komercyjnego producenta (patrz Tabela materiałów).

Rysunek 1: Części składowe elastycznej dwuwymiarowej (2D) matrycy do zapisu elektroencefalograficznego (EEG) oraz spreparowane urządzenie, w tym matryca. (A) Miniaturowa elektroda śrubowa, która jest osadzona w czaszce myszy. (B) Zaprojektowane elektrody do pomiaru aktywności mózgu (zielone kółka) oraz kanału referencyjnego (kwadrat na dole po prawej). Pokazane są względne współrzędne elektrod od punktu odniesienia (znak krzyżyka) w punkcie początkowym (0, 0); Rozmiar w milimetrach jest zilustrowany w nawiasach. Współrzędne środkowe elektrod są symetryczne w stosunku do osi pionowej przechodzącej przez znak krzyża. (C) Pokazano podkładki elektrod i wywiercone otwory na elektrodę rejestrującą (po lewej) i elektrodę odniesienia (po prawej). (D) Złącze do montażu powierzchniowego (2 × 10 pinów) używane do elastycznej matrycy 2D (po lewej) oraz wzór i rozmiar zaprojektowanych padów na podłożu (po prawej). (E) Zaprojektowany plan z rozmiarem każdej części w milimetrach. (F) Obraz wytworzonego podłoża wskazanego w planie w E. (G) Struktura warstwowa elastycznej matrycy 2D (części głowicy i łącznika). Pokazano widok z góry i z boku elektrod śrubowych (na górze) i na podkładkach odczytowych (na dole). Głowica i części łącznikowe składają się odpowiednio ze struktury trójwarstwowej (na górze) i sześciowarstwowej (na dole). Dodatkowo część szyjna składa się z pięciowarstwowej struktury; Ochronna warstwa poliimidowa jest zamontowana na górnej i tylnej powierzchni, a wzmacniająca płyta poliimidowa nie jest zamontowana na części szyjki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Budowa adaptera i mapowanie kanałów

1. Wykonaj konstrukcję adaptera, wykonując poniższe czynności.
   1. Rozprowadź topnik lutowniczy na 2 × 10 pinach, złączu do montażu powierzchniowego (Rysunek 1D, po lewej) i podkładkach złączy tablicy 2D (Rysunek 1D, po prawej) (patrz Tabela materiałów) na elastycznym podłożu.
   2. 2 × 10-pinowe złącze do montażu powierzchniowego do padów złączy. W szczególności należy potwierdzić połączenie między dwoma polami lutowniczymi w dolnej części tablicy 2D a dwoma pinami złącza używanymi jako kanały odniesienia i uziemienia (Rysunek 2A).
   3. Podłącz każdą z dwóch elektrod do poszczególnych przewodów doprowadzających, aby poprowadzić sygnały linii bazowej do punktu zewnętrznego (np. punktu uziemienia podłączonego do kanału uziemienia systemu pomiarowego; Rysunek 2A).
      UWAGA: Jednak w tym badaniu jedna z okrągłych elektrod z elektrodami śrubowymi została użyta jako elektroda referencyjna zamiast elektrody kwadratowej w części złącza.
   4. Po przykryj punkty lutownicze żywicą epoksydową (patrz Tabela materiałów), aby chronić odsłonięte punkty i zapobiec zwarciom.
2. Przypnij połączeniowy i głowicę amplifier, wykonując poniższe czynności.
   1. Przygotuj złącze izolacyjno-przemieszczeniowe (IDC) z 2 × 10 pinami i rastrem 1,27 mm (Rysunek 2B, górny róg po lewej) i płaski 20-pinowy taśmowy (patrz tabela materiałów) o rastrze 0,635 mm (Rysunek 2B, dolny róg). Przytnij płaski taśmowy na wymaganą długość (np. 40 cm).
   2. Zaciśnij IDC i jeden koniec płaskiego taśmowego za pomocą narzędzia do zaciskania IDC (Rysunek 2B, prawy górny róg) (patrz Tabela materiałów).
   3. Oddziel każdą linię drugiego końca do około 15 mm od końca końcówki za pomocą obcinaka. Zdejmij izolację 3 mm od końca końcówki.
   4. Podłącz zaciśnięty IDC do płaskiego taśmowego i złącza 2 × 10 pinów przylutowanego do elastycznego podłoża (Rysunek 2C).
   5. Potwierdź zgodność między elektrodą rejestrującą a oddzielną linią. Upewnij się, że każda używana linia nie powoduje błędu nieprawidłowego połączenia.
   6. odsłonięte przewody miedziane poszczególnych linii odpowiadających wyjściu każdej elektrody do 20-pinowego złącza (raster 1,25 mm) systemu pomiarowego, w tym głównego wzmacniacza (Rysunek 2B, na dole po prawej).
   7. Po przylutowaniu potwierdzić przewodzenie między elektrodami śrubowymi a stykami złącza za pomocą sprzętu testującego (np. miernika LCR; patrz Tabela materiałów).
   8. Zakryj punkty lutownicze żywicą epoksydową i taśmą ekranującą, aby chronić je przed uszkodzeniem i zapobiec kontaktowi z innymi liniami sygnałowymi.
   9. Za pomocą żywicy epoksydowej przyklej cienki pręt ze stali nierdzewnej (średnica: 1,1-1,2 mm; długość: 100 mm) do tylnej strony części łącznika matrycy 2D na elastycznym podłożu.
      UWAGA: Ten pręt ze stali nierdzewnej może być chwytany przez uchwyt mikromanipulatora podczas eksperymentów (Rysunek 2C).
   10. Na koniec potwierdź mapowanie między elektrodami śrubowymi a kanałami wyjściowymi sygnału ( Rysunek 2D).

Rysunek 2: Konstruowanie adaptera dla dwuwymiarowego (2D) układu elektrod na elastycznym podłożu i nagrywanie mapowania kanałów. (A) W części złącza kanały odniesienia i uziemienia są połączone z dolnymi elektrodami za pomocą przewodów ołowianych. Jeśli kanały odniesienia i uziemienia są określone z wyprzedzeniem, kanały te należy podłączyć do odpowiednich dolnych elektrod elektrodowych w fazie projektowania. W takich przypadkach przewodów ołowianych do kanałów i elektrod nie jest konieczne. (B) Złącza przemieszczenia izolacji (u góry po lewej) są zaciśnięte na jednym końcu płaskiego (na dole po lewej) w celu połączenia złącza wzmacniacza pomiarowego (u góry po prawej). Wszystkie linie, które odpowiadają kanałom, które mają być używane, są przylutowane do zielonych złączy (na dole po prawej). W tym przypadku, ponieważ każde zielone złącze podłączone do wzmacniacza głównego jest przypisane do pomiaru ośmiokanałowego, do rejestrowania 16-kanałowych sygnałów aktywności mózgu potrzebne są co najmniej dwa złącza. Punkty lutowane są pokryte żywicą epoksydową i taśmą ekranującą, aby zapobiec kontaktowi z innymi liniami sygnałowymi. (C) Złącze i wyprodukowany są umieszczone na powierzchni elastycznego podłoża matrycy 2D. Cienki pręt ze stali nierdzewnej jest przymocowany do tylnej strony elastycznego podłoża. (D) Pokazane są lokalizacje przestrzenne kanałów rejestrujących na powierzchni mózgu myszy oraz mapy kanałów dla każdego punktu systemu pomiarowego. W tym przypadku dostępnych jest 16 kanałów nagrywających z elektrodami śrubowymi (czerwone kółka), chociaż łączna liczba możliwych miejsc nagrywania wynosi 32. Pozostałe 16 kanałów nienagrywających jest również pokazanych jako zielone kółka na powierzchni mózgu. Na wykresie odwzorowania "G" i "R" wskazują kanały przeznaczone odpowiednio dla elektrod masowych i referencyjnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Chirurgia zwierząt

1. Przygotuj sterylne środowisko chirurgiczne.
   1. Nosić sprzęt ochronny, taki jak rękawice lateksowe, podczas całej procedury doświadczalnej z udziałem zwierząt.
   2. Wysterylizuj aparat stereotaktyczny i narzędzia chirurgiczne (patrz tabela materiałów).
   3. Po wysterylizowaniu narzędzi chirurgicznych umyj je sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
2. Znieczulij zwierzęta.
   1. Zmierz wagę myszy przed operacją. Siarczan atropiny (0,04 mg/kg; patrz tabela materiałów) należy podawać we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
   2. Znieczulić mysz poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny medetomidyny (0,3 mg/kg), midazolamu (4,0 mg/kg) i butorfanolu (5,0 mg/kg).
   3. Potwierdź głębokość znieczulenia na podstawie poziomu odpowiedzi poprzez uszczypnięcie palca.
      UWAGA: Znieczulenie mija po około 40 minutach. Jeśli mysz zareaguje na uszczypnięcie palca u nogi, należy podać tę samą dawkę mieszaniny znieczulenia we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
3. Przygotuj się do zabiegu wszczepienia elektrody.
   1. Wytnij wąsy myszy, aby zapobiec odczuciom dotykowym.
   2. Nasmaruj oba oczy maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu. Zamknij powieki, aby utrudnić zmysł wzroku i utrzymuj zamknięcie, przyklejając górną i dolną powiekę taśmą naprawczą.
   3. Ogol włosy na głowie myszy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia. Włóż termometr do odbytnicy i utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C za pomocą poduszki grzewczej.
   4. Chlorowodorek lidokainy należy podawać jako miejscowy środek znieczulający miejscowo do części skóry głowy myszy, która zostanie nacięta.
   5. Naciąć skórę głowy myszy za pomocą skalpela lub nożyczek chirurgicznych w kierunku rostralnym do ogonowym (rozmiar obszaru: 7 × 10 mm²).
   6. Uszczypnij skórę głowy w pobliżu naciętej części pęsetą i unieś. Usuń widoczną błonę na czaszce za pomocą skalpela lub nożyczek chirurgicznych. Nie należy przerywać naczyń krwionośnych wokół oczu podczas operacji.
   7. Chwyć kleszczami skórę w pobliżu obu środków linii nacięcia skóry głowy i poszerz naciętą część, aby szeroko odsłonić górną część czaszki.
   8. Potwierdź całkowite usunięcie wszystkich błon na powierzchni czaszki i tkanki wokół lambda nożyczkami chirurgicznymi.
   9. Zwilż powierzchnię czaszki solą fizjologiczną, aby poprawić widoczność powierzchni mózgu pod czaszką i zlokalizować zatokę poprzeczną.
      UWAGA: Podczas wszczepiania elektrod śrubowych do czaszki należy pamiętać, aby nie osadzać ich powyżej i w zatoce poprzecznej.

4. Implantacja elektrod

1. Przymocuj pręt ze stali nierdzewnej zamontowany do matrycy elektrod 2D z tyłu elastycznego podłoża do mikromanipulatora. Umieść elastyczne podłoże na czaszce.
2. Dostosuj położenie kanałów (Chs) 3 i 14 (Rysunek 2D) na tablicy, aby zmieściły się w dolnym wzgórku.
   UWAGA: Wzgórek dolny znajduje się wzdłuż zatoki poprzecznej. Zalecamy wcześniejsze potwierdzenie lokalizacji wzgórka dolnego za pomocą atlasu mózgu myszy.
3. Narysuj małe kółka w miejscach rozdz. 3, 8, 9 i 14 (Rysunek 2D) na czaszce za pomocą trwałego markera, który będzie używany jako punkty orientacyjne.
4. Osusz powierzchnię czaszki, aby zwiększyć przyczepność do cementu dentystycznego i elektrycznie odizolować matrycę elektrod 2D na elastycznym podłożu od czaszki myszy.
5. Nałożyć cement dentystyczny (o grubości około 1 mm; patrz Tabela materiałów) na powierzchnię czaszki. Po nałożeniu cementu dentystycznego odczekaj około 30 minut, aż się utwardzi.
6. Wyrównaj elastyczne podłoże zgodnie z małymi okrągłymi znakami na powierzchni czaszki.
7. Dopasuj końcówkę wiertła dentystycznego do każdego otworu elektrody w elastycznym podłożu. Ostrożnie wkręć się w czaszkę przez każdy z otworów na elektrodę.
8. Przekręć każdą z miniaturowych elektrod śrubowych przez wywiercone otwory w czaszce za pomocą dedykowanego śrubokręta do miniaturowych.
9. Mocno zaciśnij elektrody śrubowej i podkładkę elektrody. Na koniec zmierz przewodność między każdą elektrodą śrubową a złączem za pomocą sprzętu testującego (np. miernika LCR), aby potwierdzić przewodność elektryczną.

5. Projektowanie i budowa małych cewek

1. Zaprojektuj dysk w kształcie pączka (patrz Dodatkowy plik kodowania 1) z otworem w środku (średnica wewnętrzna: 2 mm; średnica zewnętrzna: 7 mm; grubość: 1 mm) za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) (patrz Tabela materiałów).
2. Korzystając z drukarki 3D, wydrukuj dwa dyski (Rysunek 3A, po lewej) wykonane z materiału nieodpornego na ciepło (np. filamentu z polikwasu mlekowego); materiał nieodporny na ciepło nie zawsze jest konieczny (patrz poniżej).
3. Przyciąć pręt permalloy-45 (średnica: 2 mm; patrz tabela materiałów), aby utworzyć krótki wałek (długość: 60 mm).
4. Włóż wałek do każdego otworu dwóch dysków wydrukowanych w 3D ( Rysunek 3A, po prawej). Umieść jedną tarczę na końcu wału, a drugą 11 mm od końca, co daje odległość 10 mm między dwiema tarczami. Przyklej krążki klejem błyskawicznym (patrz Tabela materiałów).
5. Przymocuj koniec wału bez tarczy do wkrętarki udarowej (Rysunek 3B). Przymocuj mały magnes do wału permalloy-45. Umieść czujnik Halla w pobliżu magnesu w odległości 5 mm od wału. Podłączyć czujnik Halla do systemu akwizycji danych (DAQ; patrz tabela materiałów).
6. Aby policzyć liczbę zwojów, należy przygotować program komputerowy (patrz Tabela Materiałów), który analizuje sygnały wyjściowe z czujnika Halla poprzez system DAQ.
7. Podłącz cienki drut miedziany (średnica: 0,16 mm) do wału i przyklej do górnego końca drutu za pomocą kleju błyskawicznego.
8. Za pomocą wkrętarki udarowej nawiń drut miedziany na 1,000 zwojów między dwoma dyskami. Chociaż prędkość obrotowa jest dowolna, zwykle stosuje się około 5 obrotów na sekundę. Następnie przyklej do nawiniętego drutu za pomocą kleju błyskawicznego.
9. Odłącz dwie tarcze od wału. Jeśli krążki są mocno przylegające do wału, rozpuść je za pomocą opalarki.
10. Przykryj cewkę żywicą epoksydową, aby zaizolować i zabezpieczyć powierzchnię. Następnie odetnij odwinięta część wału jako nadmiar.
11. Upewnij się, że uzyskany zwój ma wysokość 10 mm i średnicę 6 mm (Rysunek 3B, po lewej). Aby manipulować cewką, zbuduj uchwyt cewki (Rysunek 3C, po prawej) lub przyklej pręt ze stali nierdzewnej do cewki (nie pokazany tutaj).
12. Zmierz rezystancję i indukcyjność cewki za pomocą miernika LCR (patrz Tabela materiałów). Na przykład zastosowana tutaj cewka miała rezystancję prądu stałego (DC) 18,3 Ω i indukcyjność 7,9 mH przy wejściu prądu przemiennego (AC) 1 kHz. Właściwości prądu przemiennego (rezystancja i indukcyjność) są pokazane w Rysunek 3D.
13. Użyj generatora funkcyjnego, aby zastosować bipolarną falę prostokątną do cewki. Typowa amplituda napięcia wejściowego wynosi 20 V przez zasilacz bipolarny o wzmocnieniu 10x, po wyjściu generatora 2 V. Wynikowy przebieg to bipolarna fala prostokątna o przybliżonej amplitudzie 20 V (tj. napięcie międzyszczytowe 40 V) (Rysunek 3E).
14. Pomiar gęstości strumienia magnetycznego za pomocą czujnika halla i systemu DAQ. W tym przypadku, na przykład, indukcja magnetyczna (B) cewki wynosiła 113,6 ±2,5 mT (średnia ± SEM), gdy dno cewki stykało się z czujnikiem Halla (Rysunek 3F).

Rysunek 3: Mała cewka do stymulacji magnetycznej. (A) Trójwymiarowy (3D) drukowany dysk (po lewej). Dwa identyczne dyski są przyklejone do wału permalloy-45; Jeden znajduje się na końcu wału, a drugi w odległości 10 mm (po prawej). (B) Konfiguracja do nawijania cewki. Wałek o średnicy 60 mm z dwiema tarczami jest przymocowany do wkrętarki udarowej. Czujnik Halla jest umieszczony w pobliżu małego magnesu przymocowanego do wału. Drut miedziany jest nawinięty między dwoma dyskami. (C) Skonstruowana cewka. Cewka ma 10 mm wysokości, 6 mm średnicy i 1,000 zwojów drutu miedzianego. Prawa strona rysunku przedstawia cewkę manipulowaną przez uchwyt cewki wydrukowany w 3D. (D) Właściwości AC cewki rejestrowane przez miernik LCR: (górna) rezystancja w funkcji częstotliwości wejścia sinusoidalnego; (na dole) indukcyjność w funkcji częstotliwości wejściowej. Typowa cewka ma rezystancję i indukcyjność odpowiednio 21,6 i 7,9 mH przy 1 kHz wejścia AC. (E) Dwufazowy przebieg prostokątny używany jako wejście cewki rejestrowane przez oscyloskop. (F) Zależność pomiędzy indukcją magnetyczną a odległością pomiędzy skonstruowaną cewką a czujnikiem Halla. Gęstość strumienia magnetycznego rejestrowano za pomocą pięciu różnych czujników halla, po jednym dla każdego czujnika. Wykreślana jest średnia z pięciu pomiarów, a słupki błędów reprezentują błędy standardowe średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. System i procedura rejestracji sygnału

1. Podłącz elastyczną matrycę 2D do systemu nagrywania (patrz Tabela materiałów) za pomocą płaskiego taśmowego.
2. Przymocuj pręt ze stali nierdzewnej zamontowany na cewce do mikromanipulatora (patrz Tabela materiałów).
3. Umieść cewkę nad bregmą i dostosuj pozycję w kierunku ogonowym, aby zlokalizować punkt ogniskowy powyżej dolnego wzgórka. Ogniskiem emitującego pole elektryczne jest linia środkowa obszaru nawiniętego na dolnej powierzchni cewki (tj. 1 mm od krawędzi do środka).
4. Przygotuj system stymulacji składający się z zasilacza bipolarnego i generatora funkcyjnego (patrz tabela materiałów) i podłącz cewkę do systemu.
5. Podłącz między zaciskiem wejściowym generatora funkcyjnego a zaciskiem wyjściowym systemu DAQ, aby podać sygnały wyzwalające do generatora funkcyjnego z systemu DAQ. Przygotuj odpowiedni program komputerowy dla sygnałów wyzwalających do inicjowania bodźców. Dodatkowo podłącz system DAQ do systemu nagrywania, aby zapisać czasy stymulacji jako znaczniki czasu.
6. Rozpocznij proces nabywania systemu nagrywania.
   UWAGA: Jeśli system nagrywania wychwytuje szumy, znajdź źródło szumu i zmniejsz je.
7. Przetestuj stymulację magnetyczną, uruchamiając system stymulacji.
   UWAGA: Jeśli hałas wytwarzany przez stymulację magnetyczną nasyca zakres pomiarowy, należy odpowiednio wyregulować zakres. Dodatkowo upewnij się, że system nagrywania prawidłowo zapisuje znaczniki czasu stymulacji.
8. Rozpocznij rejestrowanie danych odpowiedzi i rozpocznij sesje stymulacji. Zatrzymaj nagrywanie po zakończeniu każdej sesji stymulacji. Zapisz wszystkie zarejestrowane dane do późniejszej analizy.
   UWAGA: Aby przeprowadzić wszystkie warunki eksperymentalne z pięcioma różnymi intensywnościami magnetycznymi, na przykład, całkowity czas potrzebny na wszystkie sesje wynosił około 75 minut. Punkt końcowy był zwykle określany po zakończeniu wszystkich sesji nagraniowych. Jednakże, gdy zwierzęta wykazywały objawy kliniczne, w tym kaszel, ciężki oddech i sapanie, sesja eksperymentalna została natychmiast przerwana. W przypadku eutanazji dekapitację wykonywano ostrymi, czystymi nożyczkami, podczas gdy zwierzęta były pod narkozą.

7. Analiza danych

1. Przefiltruj sygnał szerokopasmowy (nieprzetworzony) za pomocą filtra dolnoprzepustowego o częstotliwości odcięcia 200 Hz.
2. Zbieraj przefiltrowane przebiegi w oknie czasowym wokół każdego znacznika czasu stymulacji. Uśrednij przebiegi, aby uzyskać przebiegi potencjału związanego ze zdarzeniami (ERP) (Rysunek 4 i Rysunek 5).

Przykładowe dane EEG zarejestrowane u znieczulonych myszy C57BL/6J z elastycznym podłożem w połączeniu z elektrodami śrubowymi są przedstawione poniżej.

Jako typowy przykład, średnie przebiegi EEG generowane w odpowiedzi na stymulację dźwiękiem (8 kHz tone-burst, 80 dB poziom ciśnienia akustycznego [SPL]) są pokazane dla 60 prób z identycznymi bodźcami (Rysunek 4A). Schemat mapowania kanałów nagrania jest również przedstawiony w środku Rysunek 4A. Odpowiedzi z rozdz. 5, 7, 10 i 12 są rejestrowane z obszarów w pobliżu kory słuchowej w obu płatach skroniowych. W poszczególnych przebiegach EEG kanałów zlokalizowanych wokół obszarów słuchowych (wzgórek dolny i kora słuchowa) odpowiedzi z wyłączeniem artefaktów stymulacji były najpierw ujemne natychmiast po rozpoczęciu stymulacji dźwiękiem (np. Rozdziały 3 i 10); amplitudy szczytowe wynosiły odpowiednio 45,6 ± 4,0 μV i 25,6 ± 1,5 μV. Odpowiedzi były następnie pozytywne, przechodząc do pewnego stopnia powyżej linii bazowej (Rysunek 4B,C) i oscylując podczas tłumienia. W przeciwieństwie do tego, odpowiedzi z innych kanałów były prawie niezależne od początku stymulacji, chociaż niektóre przebiegi kanałowe wykazywały podobne reakcje.

Rysunek 4: Przebiegi potencjału związanego ze zdarzeniami dźwiękowymi (ERP) w 16 miejscach w mózgu myszy. (A) W odpowiedzi na stymulację dźwiękiem (8 kHz tone-burst, 80 dB SPL) zastosowaną do znieczulonej myszy, zilustrowano 16-kanałowe przebiegi ERP. Schemat mózgu myszy jest pokazany w środku, a 16 miejsc nagrywania (czerwone kółka) na powierzchni mózgu myszy jest oznaczonych numerami kanałów. W tym przypadku używanych jest 16 kanałów nagrywania; Pozostałe 16 kanałów nienagrywających jest oznaczonych zielonymi kółkami. (B) Rozszerzone widoki przebiegów ERP dla Ch 3. (C) Rozszerzone widoki przebiegów ERP dla Ch 10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podobnie, średnie przebiegi zapisów EEG w odpowiedzi na krótką stymulację magnetyczną (Vin = 60 Vpp) obszaru w pobliżu prawego wzgórka dolnego są pokazane dla 60 prób z identycznymi bodźcami w Rysunek 5A. Schemat mapowania kanałów nagrywania jest również przedstawiony w środku Rysunek 5A. Ponieważ cewka stymulująca znajdowała się w pobliżu obszaru Ch 14, artefakt stymulacji był największy w tym kanale. Jednak stosunkowo duże artefakty stymulacji zaobserwowano dla większości kanałów bezpośrednio po rozpoczęciu stymulacji, co wskazuje, że stymulacja magnetyczna wpłynęła na wszystkie miejsca nagrywania. Ponieważ odpowiedzi z rozdz. 5, 7, 10 i 12 zostały zarejestrowane z obszarów w pobliżu kory słuchowej w obu płatach skroniowych, poszczególne przebiegi EEG z wyłączeniem artefaktów stymulacji były najpierw negatywne, a następnie do pewnego stopnia dodatnie, w zależności od pozycji kanału (Rysunek 5A-C). W pobliżu obszarów słuchowych przebiegi czasu reakcji wywołane stymulacją magnetyczną różniły się od tych wywołanych stymulacją dźwiękową. Na przykład dla rozdz. 3 i 10 odpowiedzi były ujemne natychmiast po rozpoczęciu stymulacji dźwiękiem, chociaż amplitudy szczytowe wynosiły odpowiednio 58,8 ± 4,0 μV i 28,2 ± 2,0 μV. Ponadto, wraz ze wzrostem intensywności stymulacji magnetycznej, szczytowe amplitudy odpowiedzi sterowanych dla Ch 10 uległy zwiększeniu (Rysunek 5D), co sugeruje, że stymulacja magnetyczna wpłynęła na wywołane reakcje neuronalne.

Rysunek 5: Przebiegi potencjału związanego ze zdarzeniami (ERP) sterowane przezczaszkową stymulacją magnetyczną (TMS) w 16 miejscach w mózgu myszy. (A) Zilustrowano 16-kanałowe przebiegi ERP w odpowiedzi na TMS (Vin = 60 Vpp) zastosowane do znieczulonej myszy. Schemat mózgu myszy jest pokazany w środku, a 16 miejsc nagrywania (czerwone kółka) na powierzchni mózgu myszy jest oznaczonych numerami kanałów. (B) Rozszerzone widoki przebiegów ERP dla Ch 3. (C) Rozszerzone widoki przebiegów ERP dla Ch 10. (D) Podsumowanie amplitud ERP rozdz. 10 wywołanych różnymi natężeniami magnetycznymi (napięcie wejściowe). Do analizy statystycznej stosuje się analizę ANOVA dla wielokrotnych porównań, a następnie test Tukeya-Kramera post hoc. * i *** reprezentują odpowiednio p < 0,05 i p < 0,001. Numer badania dla sesji wynosi 60 razy dla każdego schorzenia poszczególnych zwierząt. Statystyki oblicza się dla próbek pobranych od dwóch zwierząt. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ta metoda może być również łatwo rozszerzona na obudzone małe zwierzę, które jest połączone na uwięzi za pomocą wspólnego adaptera i przymocowane za pomocą urządzenia TMS do głowy podczas nagrywania (Rysunek Uzupełniający 1 i Rysunek Uzupełniający 2).

Rysunek uzupełniający 1: Mocowanie cewki stymulacyjnej przymocowanej do czaszki myszy. (A) W przypadku obudzonej myszy pokazana jest cewka stymulująca przymocowana do uchwytu przymocowanego do czaszki myszy. (B) Potencjały związane ze zdarzeniami (ERP) obudzonej myszy zostały zarejestrowane w akrylowym pudełku, w którym mysz mogła poruszać się wewnątrz pudełka. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Kształty fal ERP sterowanych dźwiękiem i przezczaszkową stymulacją magnetyczną (TMS) w 16 miejscach z mózgu obudzonej myszy. (A) W odpowiedzi na stymulację dźwiękową (8 kHz tone-burst, 80 dB SPL) zastosowaną do obudzonej myszy w akrylowym etui (Dodatkowe Rysunek 1B), zilustrowano 16-kanałowe przebiegi ERP. Schemat mózgu myszy jest pokazany pośrodku, a 16 miejsc nagrywania (czerwone kółka) na powierzchni mózgu myszy jest oznaczonych numerami kanałów. W tym przypadku używanych jest 16 kanałów nagrywania; Pozostałe 16 kanałów nienagrywających jest oznaczonych zielonymi kółkami. (B) Podobnie, zilustrowano 16-kanałowe przebiegi ERP w odpowiedzi na TMS (Vin = 60 Vpp) zastosowane do tej samej wybudzonej myszy. Schemat mózgu myszy jest pokazany w środku, a 16 miejsc nagrywania (czerwone kółka) na powierzchni mózgu myszy jest oznaczonych numerami kanałów. Cewka stymulacyjna znajduje się w pobliżu obszaru Ch 14. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 1: plik danych CAD dla dysku w kształcie pączka wymagany do budowy cewki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.