Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Niedrogi elektroencefalograficzny system zapisu w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do przezczaszkowej stymulacji mózgu myszy in vivo

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65302

⸱

26 maja 2023

 ,  ,  , 
1Bioengineering and Bioinformatics, Graduate School of Information Science and Technology, Hokkaido University, 2Bioengineering and Bioinformatics, Division of Information Science and Technology, Hokkaido University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Proponuje się tani system zapisu elektroencefalograficznego w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do napędzania przezczaszkowej stymulacji magnetycznej mózgu myszy in vivo. Korzystając z konwencjonalnych elektrod śrubowych z niestandardowym, elastycznym podłożem z matrycą wieloelektrodową, można przeprowadzić zapis w wielu miejscach z mózgu myszy w odpowiedzi na przezczaszkową stymulację magnetyczną.

Streszczenie

Tani system rejestracji elektroencefalograficznej (EEG) jest tutaj proponowany do sterowania przezczaszkową stymulacją magnetyczną (TMS) mózgu myszy in vivo, wykorzystując cewkę o rozmiarach milimetrowych. Korzystając z konwencjonalnych elektrod śrubowych w połączeniu z niestandardowym, elastycznym podłożem z matrycą wieloelektrodową, można przeprowadzić zapis w wielu miejscach z mózgu myszy. Ponadto wyjaśniamy, w jaki sposób cewka o rozmiarze milimetrowym jest wytwarzana przy użyciu taniego sprzętu, który zwykle znajduje się w laboratoriach. Przedstawiono również praktyczne procedury wytwarzania elastycznego podłoża z matrycy wieloelektrodowej oraz technikę chirurgicznej implantacji elektrod śrubowych, które są niezbędne do wytwarzania niskoszumowych sygnałów EEG. Chociaż metodologia ta jest przydatna do rejestrowania z mózgu każdego małego zwierzęcia, niniejszy raport koncentruje się na zastosowaniu elektrody w znieczulonej czaszce myszy. Co więcej, metodę tę można łatwo rozszerzyć na obudzone małe zwierzę, które jest połączone na uwięzi za pomocą wspólnego adaptera i przymocowane za pomocą urządzenia TMS do głowy podczas nagrywania. Opisano obecną wersję systemu EEG-TMS, która może składać się maksymalnie z 32 kanałów EEG (jako przykład przedstawiono urządzenie z 16 kanałami z mniejszą liczbą kanałów) oraz jedno urządzenie kanałowe TMS. Ponadto pokrótce przedstawiono typowe wyniki uzyskane przez zastosowanie systemu EEG-TMS u znieczulonych myszy.

Wprowadzenie

Przezczaszkowa stymulacja magnetyczna (TMS) jest obiecującym narzędziem do nauki o ludzkim mózgu, zastosowań klinicznych i badań na modelach zwierzęcych ze względu na jej nieinwazyjność. We wczesnej fazie zastosowań TMS pomiar efektu korowego w odpowiedzi na TMS z pojedynczym i sparowanym impulsem u ludzi i zwierząt był ograniczony do kory ruchowej; Łatwo mierzalna moc wyjściowa ograniczała się do potencjałów wywołanych motorycznych i indukowanych potencjałów mioelektrycznych obejmujących korę ruchową1,2. Aby rozszerzyć obszary mózgu, które można mierzyć za pomocą modulacji TMS, zapis elektroencefalograficzny (EEG) został zintegrowany z TMS z pojedynczym i sparowanym impulsem jako użyteczną metodą bezpośredniego badania pobudliwości, łączności i dynamiki czasoprzestrzennej obszarów w całym mózgu3,4,5. Tak więc, jednoczesne zastosowanie TMS i zapisu EKG (TMS-EEG) do mózgu zostało wykorzystane do zbadania różnych powierzchownych obszarów kory mózgowej ludzi i zwierząt w celu zbadania wewnątrzkorowych obwodów nerwowych (patrz Tremblay et al.6). Co więcej, systemy TMS-EEG mogą być wykorzystywane do badania dodatkowych cech czasoprzestrzennych kory mózgowej, w tym propagacji sygnałów do innych obszarów kory mózgowej i generowania aktywności oscylacyjnej7,8.

Jednak mechanizm działania TMS w mózgu pozostaje spekulatywny ze względu na nieinwazyjność TMS, co ogranicza naszą wiedzę o tym, jak mózg funkcjonuje podczas aplikacji TMS. Dlatego inwazyjne badania translacyjne na zwierzętach, od gryzoni po ludzi, mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmu wpływu TMS na obwody neuronalne i ich aktywność. W szczególności w przypadku połączonych eksperymentów TMS-EEG na zwierzętach nie opracowano intensywnie jednoczesnego systemu stymulacji i pomiaru dla małych zwierząt. Dlatego eksperymentatorzy są zobowiązani do skonstruowania takiego systemu metodą prób i błędów zgodnie z ich specyficznymi wymaganiami eksperymentalnymi. Ponadto modele mysie są przydatne wśród innych modeli gatunków zwierząt in vivo, ponieważ wiele transgenicznych i izolowanych szczepów myszy jest dostępnych jako zasoby biologiczne. W związku z tym wygodna metoda zbudowania połączonego systemu pomiarowego TMS i EEG dla myszy byłaby pożądana dla wielu badaczy neurobiologii.

To badanie proponuje metodę łączoną TMS-EEG, która może być stosowana do jednoczesnej stymulacji i rejestracji mózgu myszy, który jest głównym typem transgenicznego zwierzęcia wykorzystywanego w badaniach, i który może być łatwo skonstruowany w typowych laboratoriach neurologicznych. Po pierwsze, opisano tani system rejestracji EEG wykorzystujący konwencjonalne elektrody śrubowe i elastyczne podłoże do powtarzalnego przypisywania pozycji matrycy elektrod w każdym eksperymencie. Po drugie, system stymulacji magnetycznej jest zbudowany przy użyciu cewki o rozmiarach milimetrowych, którą można łatwo wykonać na zamówienie w typowych laboratoriach. Po trzecie, system połączony z TMS-EEG rejestruje aktywność neuronalną w odpowiedzi na stymulację dźwiękową i magnetyczną. Metoda przedstawiona w tym badaniu może ujawnić mechanizmy, które generują określone zaburzenia u małych zwierząt, a wyniki uzyskane w modelach zwierzęcych można przełożyć na zrozumienie odpowiadających im zaburzeń u ludzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W niniejszym badaniu wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals oraz za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Hokkaido. W badaniu wykorzystano myszy C57BL/6J, dwa samce i trzy samice, w wieku od 8 do 10 tygodni. Jest to procedura terminalna. Zwierzęta pozyskano z komercyjnego źródła (patrz Tabela materiałów).

1. Projektowanie i konstrukcja elastycznej macierzy dwuwymiarowej

  1. Przygotować wymaganą liczbę miniaturowych elektrod śrubowych (stal nierdzewna, SUS XM7; patrz Tabela Materiałów) o następujących właściwościach strukturalnych do wykorzystania jako elektrody rejestrujące EEG i elektrody referencyjne: średnica nominalna 0,6 mm, długość szyjki 1,5 mm oraz średnica główki 1,1 mm (Rysunek 1A).
    UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano 16 miniaturowych elektrod śrubowych.
  2. Przygotować projekt schematu obwodu drukowanego na podłożu elastycznym zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Utworzyć dwuwymiarowy (2D) wzór podkładek elektrod na podłożu elastycznym (całkowity rozmiar 41,2 mm × 19,9 mm; patrz Tabela Materiałów) dla elektrod śrubowych, z których będą odczytywane sygnały. Zaprojektować rozmieszczenie elektrod 2D. Rysunek 1B przedstawia konkretne układy zastosowane w tym badaniu oraz współrzędne względne względem punktu bazowego (krzyżyk zaznaczony w punkcie początku układu [0, 0]).
      UWAGA: W niniejszym badaniu, w celu rejestracji aktywności neuronalnej w korze słuchowej w obrębie płatów skroniowych, rozmieszczenie elektrod w kierunku boczno-przyśrodkowym (poziomym) było większe niż w kierunku rostralno-kaudalnym (pionowym) (Rysunek 1B).
    2. Upewnić się, że w przypadku elektrod rejestrujących EEG każda miedziana podkładka (patrz Tabela Materiałów) na podłożu elastycznym ma kształt pierścienia o średnicy zewnętrznej 1,3 mm i średnicy wewnętrznej 0,8 mm (Rysunek 1C, lewo). Wykonać mały otwór (średnica 0,8 mm) w centrum każdej podkładki, aby elektrody śrubowe mogły przejść przez podłoże. W przypadku elektrod referencyjnych każda miedziana podkładka powinna mieć kształt kwadratu o długości boku 1,4 mm; analogicznie wykonać mały otwór (średnica 0,8 mm) w centrum, aby każda śruba mogła przejść przez kwadratową podkładkę na podłożu (Rysunek 1C, prawo).
    3. Następnie, aby przylutować złącze montowane powierzchniowo (Rysunek 1D, lewo), zaprojektować podkładki odczytowe (macierz 2D) prowadzące do złącza (Rysunek 1D, prawo). Na przykład zastosować złącze z 2 × 10 pinami i rozstawem 1,27 mm między sąsiednimi pinami (Rysunek 1D, prawo).
    4. Połączyć podkładki elektrod śrubowych i podkładki złącza, wykorzystując zarówno warstwę powierzchniową, jak i spodnią, przy szerokości linii 0,03 mm i odstępie między liniami 0,03 mm (cienkie linie na Rysunku 1E).
    5. Ponadto, aby podłączyć kanały referencyjne i masowe do wzmacniacza, połączyć podkładki elektrod referencyjnych i masowych z odizolowaną częścią na zewnątrz elastycznej macierzy 2D (dwa pionowe prostokąty oznaczone jako „G” i „HR” na dole Rysunku 1E). Po wyznaczeniu kanałów referencyjnych i masowych należy przylutować podkładki elektrod do odpowiednich złączy (patrz krok 2.1).
    6. Odpowiednio zaprojektować obszar odsłonięty, który nie jest pokryty warstwą ochronną (warstwą poliimidową). Odsłonić podkładki złącza w warstwie powierzchniowej, jednocześnie odsłaniając podkładki elektrod śrubowych w warstwie powierzchniowej i spodniej. Cały projekt elektrod, rozmiary oraz wykonana elastyczna macierz 2D są zilustrowane na Rysunku 1E, a obraz wykonanego podłoża przedstawiono na Rysunku 1F.
    7. W górnej części elektrod (części główki) elastycznej macierzy 2D upewnić się, że trójwarstwowa struktura od góry do dołu składa się z następujących elementów (całkowita grubość 49,0 µm): górnej warstwy miedzi (grubość 12,0 µm), środkowej warstwy rdzenia poliimidowego (25,0 µm) i dolnej warstwy miedzi (12,0 µm) (Rysunek 1G, góra).
    8. Wytrawić warstwy miedzi na górnej i dolnej powierzchni podłoża, na przykład metodą trawienia mokrego i standardową techniką wykonania9.
    9. W dolnej części z podkładkami kwadratowymi (części złącza) elastycznej macierzy 2D upewnić się, że struktura sześciowarstwowa składa się z trzech warstw, w tym górnej warstwy miedzi (grubość 12,0 µm), środkowej warstwy rdzenia poliimidowego (25,0 µm) i dolnej warstwy miedzi (12,0 µm), które są zamknięte pomiędzy ochronnymi warstwami poliimidowymi, w tym warstwami górną i dolną (obie o grubości 12,5 µm). Przymocować od dołu płytkę poliimidową o grubości 2 mm jako materiał wzmacniający (Rysunek 1G, dół).
      UWAGA: Aby zachować elastyczność, wzmacniająca płytka poliimidowa nie jest montowana do części szyjki elastycznej macierzy 2D pomiędzy częścią główki a częścią złącza.
    10. Analogicznie, w części złącza wytrawić miedź i ochronne warstwy poliimidu na górze, stosując trawienie mokre i standardową technikę wykonania.
      UWAGA: Całkowita masa wykonanego urządzenia w postaci elastycznej macierzy 2D, wraz ze złączem, wynosi 0,84 g. Po zaprojektowaniu układu elastycznej macierzy 2D, dla wygody zaleca się czasem zamówienie podłoży u komercyjnego producenta (patrz Tabela Materiałów).

Schemat wykonania elektrod; obejmuje pomiary śrub, układ elektrod i konfigurację pinów złącza.
Rycina 1: Elementy składowe elastycznej dwuwymiarowej (2D) macierzy do zapisu elektroencefalograficznego (EEG) oraz wykonane urządzenie zawierające macierz. (A) Miniaturowa elektroda śrubowa osadzona w czaszce myszy. (B) Zaprojektowane podkładki elektrod do pomiaru aktywności mózgu (zielone koła) i kanał referencyjny (kwadrat w prawym dolnym rogu). Przedstawiono względne współrzędne podkładek elektrod względem punktu odniesienia (krzyżyk) w początku układu współrzędnych (0, 0); rozmiary w mm podano w nawiasach. Współrzędne środków podkładek elektrod są symetryczne względem osi pionowej przechodzącej przez krzyżyk. (C) Przedstawiono podkładki elektrod i otwory wiertnicze dla elektrody zapisującej (lewa) oraz elektrody referencyjnej (prawa). (D) Złącze montowane powierzchniowo (2 × 10 pinów) użyte do elastycznej macierzy 2D (lewa) oraz wzór i rozmiar zaprojektowanych podkładek na podłożu (prawa). (E) Projekt techniczny z wymiarami każdej części w mm. (F) Obraz wykonanego podłoża zgodnie z projektem przedstawionym w punkcie E. (G) Struktura warstwowa elastycznej macierzy 2D (części głowicy i złącza). Przedstawiono widoki z góry i z boku podkładek elektrod śrubowych (góra) oraz podkładek odczytujących (dół). Głowica i części złącza składają się odpowiednio ze struktury trzywarstwowej (góra) i sześciowarstwowej (dół). Dodatkowo część szyjki składa się ze struktury pięciowarstwowej; na górnej i tylnej powierzchni zamontowano ochronną warstwę poliimidu, natomiast w części szyjki nie zamontowano wzmacniającej płytki poliimidowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Konstrukcja adaptorów i mapowanie kanałów

  1. Przeprowadź konstrukcję adaptera zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Nanieś topnik lutowniczy na złącze montażowe powierzchniowe 2 × 10 pinów (Rycina 1D, lewa strona) oraz na pady złącza macierzy 2D (Rycina 1D, prawa strona) (patrz Tabela materiałów) na elastycznym podłożu.
    2. Przylutuj złącze montażowe powierzchniowe 2 × 10 pinów do padów złącza. W szczególności potwierdź połączenie między dwoma padami w dolnej części macierzy 2D a dwoma pinami złącza pełniącymi funkcję kanałów referencyjnego i masy (Rycina 2A).
    3. Połącz każdy z dwóch padów z oddzielnymi przewodami doprowadzającymi sygnały bazowe do punktu zewnętrznego (np. do punktu masy połączonego z kanałem masy systemu pomiarowego; Rycina 2A).
      UWAGA: W niniejszym badaniu jeden z okrągłych padów elektrod z elektrodami śrubowymi został jednak użyty jako elektroda referencyjna zamiast elektrody kwadratowej w części złącza.
    4. Po lutowaniu pokryj punkty lutownicze żywicą epoksydową (patrz Tabela materiałów), aby zabezpieczyć odsłonięte miejsca i zapobiec zwarciom.
  2. Przygotuj okablowanie złącza i wzmacniacza głowicowego zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Przygotuj złącze IDC (insulation-displacement connector) z 2 × 10 pinami i skokiem 1,27 mm (Rycina 2B, góra po lewej) oraz płaską taśmową przewodów 20-żyłową (patrz Tabela materiałów) o skoku 0,635 mm (Rycina 2B, dół po lewej). Przytnij płaską taśmę do wymaganej długości (np. 40 cm).
    2. Zaciśnij złącze IDC i jeden koniec płaskiej taśmy za pomocą zaciskarki do złączy IDC (Rycina 2B, góra po prawej) (patrz Tabela materiałów).
    3. Rozdziel każdą żyłę na drugim końcu kabla na odcinku około 15 mm od końcówki za pomocą noża. Zdejmij izolację z 3 mm końcówki każdej żyły.
    4. Połącz zacisnięte złącze IDC z płaską taśmą oraz z złączem 2 × 10 pinów przylutowanym do elastycznego podłoża (Rycina 2C).
    5. Potwierdź zgodność między elektrodą rejestrującą a rozdzieloną żyłą kabla. Upewnij się, że żadna z użytych żył nie generuje błędu nieprawidłowego połączenia.
    6. Przylutuj odsłonięte miedziane druty poszczególnych żył odpowiadających wyjściu każdej elektrody do 20-pinowego złącza (skok 1,25 mm) systemu pomiarowego, w tym wzmacniacza głównego (Rycina 2B, dół po prawej).
    7. Po lutowaniu potwierdź przewodność między padami elektrod śrubowych a pinami złącza za pomocą sprzętu testowego (np. mostka LCR; patrz Tabela materiałów).
    8. Pokryj punkty lutownicze żywicą epoksydową i taśmą ekranującą, aby chronić je przed uszkodzeniem i zapobiec kontaktowi z innymi liniami sygnałowymi.
    9. Używając żywicy epoksydowej, przyklej cienki pręt ze stali nierdzewnej (średnica: 1,1-1,2 mm; długość: 100 mm) do tylnej strony części złącza macierzy 2D na elastycznym podłożu.
      UWAGA: Pręt ten może być chwytany przez uchwyt mikromanipulatora podczas eksperymentów (Rycina 2C).
    10. Na koniec potwierdź mapowanie między elektrodami śrubowymi a kanałami wyjściowymi sygnału (Rycina 2D).

Schemat układu elektrod w mózgu myszy przedstawiający części złącza, płaską taśmę kablową i pady elektrod.
Rycina 2: Konstrukcja adaptera dla dwuwymiarowej (2D) macierzy elektrod na elastycznym podłożu oraz mapowanie kanałów rejestracyjnych. (A) W części złącza kanały referencyjny i masy są połączone z dolnymi padami elektrod za pomocą przewodów doprowadzających. Jeśli kanały referencyjny i masy są określone z góry, kanały te powinny zostać połączone z odpowiednimi dolnymi padami elektrod na etapie projektowania. W takich przypadkach lutowanie przewodów do kanałów i padów elektrod nie jest konieczne. (B) Złącza izolacyjne (lewy górny róg) są zaciskanie na jednym końcu płaskiego kabla (lewy dolny róg), aby połączyć go ze złączem wzmacniacza pomiarowego (prawy górny róg). Wszystkie linie odpowiadające kanałom przeznaczonym do użytku są przylutowane do zielonych złączy (prawy dolny róg). W tym przypadku, ponieważ każde zielone złącze podłączone do wzmacniacza głowicowego jest przypisane do pomiaru ośmiokanałowego, do rejestracji sygnałów aktywności mózgu z 16 kanałów potrzebne są co najmniej dwa złącza. Punkty lutownicze są pokryte żywicą epoksydową i taśmą ekranującą, aby zapobiec kontaktowi z innymi liniami sygnałowymi. (C) Złącze i wykonany kabel są umieszczane na powierzchni elastycznego podłoża macierzy 2D. Cienki pręt ze stali nierdzewnej jest przymocowany do tylnej strony elastycznego podłoża. (D) Przedstawiono lokalizacje przestrzenne kanałów rejestracyjnych na powierzchni mózgu myszy oraz mapy kanałów dla każdego punktu w systemie pomiarowym. W tym przypadku znajduje się 16 kanałów rejestracyjnych z elektrodami śrubowymi (czerwone okręgi), mimo że całkowita liczba możliwych miejsc rejestracji wynosi 32. Pozostałe 16 kanałów nierejestracyjnych jest również zaznaczonych jako zielone okręgi na powierzchni mózgu. Na wykresie mapowania litery „G” i „R” oznaczają odpowiednio kanały przeznaczone dla elektrod masy (ground) i referencyjnych (reference). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Operacja chirurgiczna zwierząt

  1. Przygotować sterylną przestrzeń zabiegową.
    1. Podczas całej procedury eksperymentalnej z udziałem zwierząt należy stosować środki ochrony osobistej, takie jak rękawiczki lateksowe.
    2. Sterylizować aparat stereotaksyczny i narzędzia chirurgiczne (patrz Tabela materiałów).
    3. Po wysterylizowaniu narzędzi chirurgicznych należy je przemyć sterylną solą fizjologiczną.
  2. Zanestezjuj zwierzęta.
    1. Zważ mysz przed operacją. Podaj siarczan atropiny (0,04 mg/kg; patrz Tabela materiałów) poprzez iniekcja dosytrojnościenna
    2. Zanieść mysz w stan anestezji poprzez dożylny zastrzyk mieszaniny medetomidyny (0,3 mg/kg), midazolamu (4,0 mg/kg) i butorfanolu (5,0 mg/kg).
    3. Potwierdź głębokość znieczulenia na podstawie poziomu reakcji poprzez uciśnięcie palca stopy.
      UWAGA: Działanie znieczulenia ustąpi po około 40 min. Jeśli mysz reaguje na uciśnięcie palca u stopy, należy podać tę samą dawkę mieszaniny anestetyku. poprzez iniekcja dootrzewnowa.
  3. Przeprowadź przygotowania wstępne do operacji implantacji elektrod.
    1. Przytnąć wibrysy myszy, aby wykluczyć odczuwanie haptyczne.
    2. Nawsmaruj oba oczy maścią oftalmiczną, aby zapobiec ich wysychaniu. Zamknij powieki w celu odcięcia zmysłu wzroku i utrzymaj je w zamknięciu, mocując górną i dolną powiekę za pomocą taśmy chirurgicznej.
    3. Wygolić sierść na głowie myszy za pomocą maszynki elektrycznej. Wprowadzić termometr do odbytu i utrzymywać temperaturę ciała na poziomie 37 °C z użyciem podkładki grzejnej.
    4. Podaj chlorowodorek lidokainy jako miejscowe znieczulenie powierzchniowe na fragment skóry głowy myszy, w którym wykonane zostanie nacięcie.
    5. Nacinamy skórę głowy myszy za pomocą skalpela lub nożyczek chirurgicznych w kierunku od rostralnego do kaudalnego (wielkość obszaru: 7 × 10 mm)2).
    6. Używając pęsety, uchwyć skórę głowy w pobliżu nacięcia i unieś ją. Usuń widoczną błonę z czaszki za pomocą skalpela lub nożyczek chirurgicznych. Podczas operacji należy uważać, aby nie przerwać naczyń krwionośnych w okolicy oczu.
    7. Za pomocą pincety uchwyć skórę w pobliżu obu środków linii nacięcia skóry głowy i rozszerz naciętą część, aby szeroko odsłonić sklepienie czaszki.
    8. Za pomocą nożyczek chirurgicznych należy potwierdzić całkowite usunięcie wszystkich błon z powierzchni czaszki oraz tkanki wokół lambda.
    9. Zwilż powierzchnię czaszki solą fizjologiczną, aby zwiększyć widoczność powierzchni mózgu pod czaszką, i zlokalizuj zatokę poprzeczną.
      UWAGA: Podczas implantacji elektrod śrubowych w czaszce należy pamiętać, aby nie umieszczać ich nad zatoką poprzeczną ani wewnątrz niej.

4. Implantacja elektrod

  1. Przymocuj pręt ze stali nierdzewnej, zamontowany do dwuwymiarowej macierzy elektrod na tylnej stronie elastycznego podłoża, do mikromanipulatora. Umieść elastyczne podłoże na czaszce.
  2. Dostosuj położenie kanałów (Chs) 3 i 14 (Rycina 2D) na matrycy, aby zmieściła się w obrębie wzgórza dolnego.
    UWAGA: Wzgórze dolne znajduje się wzdłuż zatoki poprzecznej. Zalecamy wcześniejsze potwierdzenie lokalizacji wzgórza dolnego przy użyciu atlasu mózgu myszy.
  3. Narysuj małe koła w miejscach występowania Chs 3, 8, 9 i 14 (Rycina 2D) na czaszce markerem permanentnym, aby służyły jako punkty orientacyjne do celowania.
  4. Osusz powierzchnię czaszki, aby zwiększyć przyczepność cementu dentystycznego oraz odizolować elektrycznie dwuwymiarową macierz elektrod na elastycznym podłożu od czaszki myszy.
  5. Nanieść cement stomatologiczny (grubość ok. 1 mm; patrz Tabela materiałów) do powierzchni czaszki. Po nałożeniu cementu dentystycznego odczekać około 30 min do jego utwardzenia.
  6. Dopasuj elastyczny podkład zgodnie z małymi okrągłymi znacznikami znajdującymi się na powierzchni czaszki.
  7. Ustaw końcówkę wiertła stomatologicznego nad każdym otworem na podkładkę elektrody na elastycznym podłożu. Ostrożnie wywierć otwory w czaszce przez każdy z otworów na podkładki elektrod.
  8. Wkręć każdą z miniaturowych elektrod śrubowych przez wywiercone otwory w czaszce, używając dedykowanego śrubokręta do miniaturowych śrub.
  9. Mocno zaciśnij łeb elektrody śrubowej oraz podkładkę elektrodową. Na koniec zmierz przewodność między każdą elektrodą śrubową a złączem za pomocą urządzenia pomiarowego (np. mostka LCR), aby potwierdzić przewodnictwo elektryczne.

5. Projektowanie i konstrukcja małej cewki

  1. Zaprojektuj dysk w kształcie pierścienia (patrz: Supplementary Coding File 1) z otworem w centrum (średnica wewnętrzna: 2 mm; średnica zewnętrzna: 7 mm; grubość: 1 mm) przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) (patrz: Table of Materials).
  2. Za pomocą drukarki 3D wydrukuj dwa dyski (Figure 3A, lewa strona) wykonane z materiału nieodpornego na wysoką temperaturę (np. filamentu z kwasu polimlekowego); materiał nieodporny na wysoką temperaturę nie zawsze jest konieczny (patrz niżej).
  3. Przytnij pręt z permalloyu-45 (średnica: 2 mm; patrz: Table of Materials), aby utworzyć krótki wałek (długość: 60 mm).
  4. Wsuń wałek w otwory obu wydrukowanych w 3D dysków (Figure 3A, prawa strona). Umieść jeden dysk na końcu wałka, a drugi 11 mm od końca, co zapewni 10 mm odstępu między dyskami. Przyklej dyski za pomocą kleju błyskawicznego (patrz: Table of Materials).
  5. Przymocuj koniec wałka pozbawiony dysku do wkrętarki udarowej (Figure 3B). Przymocuj mały magnes do wałka z permalloyu-45. Umieść czujnik efektu Halla w pobliżu magnesu, w odległości 5 mm od wałka. Podłącz czujnik efektu Halla do systemu akwizycji danych (DAQ; patrz: Table of Materials).
  6. W celu zliczenia liczby zwojów przygotuj program komputerowy (patrz: Table of Materials), który analizuje sygnały wyjściowe z czujnika efektu Halla poprzez system DAQ.
  7. Podłącz cienki drut miedziany (średnica: 0,16 mm) do wałka i przyklej go na górnym końcu za pomocą kleju błyskawicznego.
  8. Używając wkrętarki udarowej, nawiń drut miedziany na 1000 zwojów pomiędzy dwoma dyskami. Chociaż prędkość obrotowa jest dowolna, zazwyczaj stosuje się około 5 obrotów na sekundę. Następnie przyklej nawinięty drut za pomocą kleju błyskawicznego.
  9. Zdejmij dwa dyski z wałka. Jeśli dyski są mocno przyklejone do wałka, stop je za pomocą opalarki.
  10. Pokryj cewkę żywicą epoksydową, aby zaizolować i zabezpieczyć powierzchnię. Następnie odetnij nadmiar nienawiniętej części wałka.
  11. Upewnij się, że otrzymana cewka ma wysokość 10 mm i średnicę 6 mm (Figure 3B, lewa strona). Do manipulowania cewką można zbudować uchwyt cewki (Figure 3C, prawa strona) lub przykleić do cewki pręt ze stali nierdzewnej (nie pokazano tutaj).
  12. Zmierz rezystancję i indukcyjność cewki za pomocą pomiaru LCR (patrz: Table of Materials). Na przykład cewka użyta w tym badaniu miała rezystancję prądu stałego (DC) 18,3 Ω i indukcyjność 7,9 mH przy wejściu prądu przemiennego (AC) o częstotliwości 1 kHz. Właściwości AC (rezystancję i indukcyjność) przedstawiono na Figure 3D.
  13. Użyj generatora funkcji, aby przyłożyć do cewki bipolarną falę prostokątną. Typowa amplituda napięcia wejściowego wynosi 20 V poprzez bipolarny zasilacz ze wzmocnieniem 10x, przy wyjściu generatora 2 V. Wynikiem jest bipolarna fala prostokątna o przybliżonej amplitudzie 20 V (tj. napięcie szczyt-szczyt 40 V) (Figure 3E).
  14. Zmierz gęstość strumienia magnetycznego za pomocą czujnika efektu Halla i systemu DAQ. W tym przypadku gęstość strumienia magnetycznego (B) cewki wynosiła 113,6 ±2,5 mT (średnia ± SEM), gdy spód cewki stykał się z czujnikiem efektu Halla (Figure 3F).

Układ indukcji elektromagnetycznej z czujnikiem efektu Halla, wykresami rezystancji AC i indukcyjności.
Rycina 3: Mała cewka do stymulacji magnetycznej. (A) Tarcza wydrukowana w technologii druku 3D (po lewej). Dwie identyczne tarcze są przyklejone do trzpienia z permalloy-45; jedna znajduje się na końcu trzpienia, a druga w odległości 10 mm (po prawej). (B) Układ do nawijania cewki. Trzpień o długości 60 mm z dwiema tarczami jest przymocowany do wkrętarki udarowej. Czujnik efektu Halla jest umieszczony w pobliżu małego magnesu przymocowanego do trzpienia. Drut miedziany jest nawijany pomiędzy dwiema tarczami. (C) Wykonana cewka. Cewka ma wysokość 10 mm, średnicę 6 mm i składa się z 1 000 zwojów drutu miedzianego. Prawa strona ryciny przedstawia cewkę manipulowaną za pomocą wydrukowanego w 3D uchwytu cewki. (D) Właściwości AC cewki zarejestrowane za pomocą pomiaru LCR: (góra) rezystancja w funkcji częstotliwości sygnału sinusoidalnego wejściowego; (dół) indukcyjność w funkcji częstotliwości wejściowej. Typowa cewka przy sygnale wejściowym AC o częstotliwości 1 kHz posiada rezystancję 21,6 Ω i indukcyjność 7,9 mH. (E) Bifazowy przebieg prostokątny użyty jako sygnał wejściowy cewki, zarejestrowany oscyloskopem. (F) Zależność między gęstością strumienia magnetycznego a odległością między wykonaną cewką a czujnikiem efektu Halla. Gęstość strumienia magnetycznego była rejestrowana przez pięć różnych czujników efektu Halla, raz dla każdego czujnika. Przedstawiono średnią z pięciu pomiarów, a słupki błędów reprezentują błędy standardowe średniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

6. System i procedura rejestracji sygnału

  1. Podłącz elastyczny array 2D do systemu rejestracyjnego (patrz Tabela materiałów) za pomocą płaskiej taśmy przewodowej.
  2. Zamocuj pręt ze stali nierdzewnej zamontowany na cewce do mikromanipulatora (patrz Tabela materiałów).
  3. Umieść cewkę nad bregmą i dostosuj jej położenie w kierunku ogonowym, aby zlokalizować punkt ogniskowy nad wzgórkiem dolnym. Punktem ogniskowym emitowanego pola elektrycznego jest linia środkowa obszaru rany na dolnej powierzchni cewki (tj. 1 mm od krawędzi do środka).
  4. Przygotuj system stymulacji składający się z bipolarnego zasilacza i generatora funkcji (patrz Tabela materiałów), a następnie podłącz cewkę do systemu.
  5. Połącz kablem terminal wejściowy generatora funkcji z terminalem wyjściowym systemu DAQ, aby przesyłać sygnały wyzwalające z systemu DAQ do generatora funkcji. Przygotuj odpowiedni program komputerowy dla sygnałów wyzwalających w celu inicjacji bodźców. Dodatkowo podłącz system DAQ do systemu rejestracyjnego, aby zapisywać czasy stymulacji jako znaczniki czasu.
  6. Uruchom proces akwizycji w systemie rejestracyjnym.
    UWAGA: Jeśli system rejestracyjny wykazuje szumy, zlokalizuj ich źródło i zredukuj je.
  7. Przetestuj stymulację magnetyczną, wyzwalając system stymulacji.
    UWAGA: Jeśli szum generowany przez stymulację magnetyczną nasyca zakres pomiarowy, odpowiednio dostosuj ten zakres. Dodatkowo potwierdź, że system rejestracyjny prawidłowo zapisuje znaczniki czasu stymulacji.
  8. Rozpocznij rejestrację danych odpowiedzi i rozpocznij sesje stymulacji. Zakończ rejestrację po zakończeniu każdej sesji stymulacji. Zapisz wszystkie zarejestrowane dane do późniejszej analizy.
    ​UWAGA: Aby przeprowadzić wszystkie warunki eksperymentalne przy pięciu różnych natężeniach pola magnetycznego, całkowity czas wymagany dla wszystkich sesji wynosił około 75 min. Punkt końcowy był zazwyczaj ustalany po zakończeniu wszystkich sesji rejestracyjnych. Jednakże, gdy zwierzęta wykazywały objawy kliniczne, takie jak kaszel, utrudnione oddychanie i łapanie powietrza, sesja eksperymentalna była natychmiast przerywana. W celu eutanazji przeprowadzono dekapitację za pomocą ostrych, czystych nożyczek podczas gdy zwierzęta znajdowały się pod narkozą.

7. Analiza danych

  1. Przefiltruj szerokopasmowy (surowy) sygnał za pomocą filtra dolnoprzepustowego o częstotliwości odcięcia 200 Hz.
  2. Zbierz przefiltrowane przebiegi w oknie czasowym wokół każdego znacznika czasu stymulacji. Wyciągnij średnią z przebiegów, aby uzyskać przebiegi potencjałów wywołanych (ERP) (Rysunek 4 i Rysunek 5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Poniżej przedstawiono przykładowe dane EEG zarejestrowane u znieczulonych myszy C57BL/6J przy użyciu elastycznego podłoża w połączeniu z elektrodami śrubowymi.

Jako typowy przykład, średnie przebiegi EEG wygenerowane w odpowiedzi na stymulację dźwiękową (tonowy impuls 8 kHz, poziom ciśnienia akustycznego [SPL] 80 dB) przedstawiono dla 60 prób z identycznymi bodźcami (Rysunek 4A). Schemat mapowania kanałów rejestrujących zaprezentowano również w środkowej części

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie to dotyczy wieloośrodkowego systemu rejestracji EEG w połączeniu z systemem stymulacji magnetycznej przeznaczonym dla małych zwierząt, w tym myszy. Zbudowany system jest tani i łatwy do zbudowania w laboratoriach fizjologicznych, a także może rozszerzyć istniejące konfiguracje pomiarowe. Procedura chirurgiczna niezbędna do uzyskania danych z systemu rejestracji myszy jest niezwykle prosta, jeśli takie laboratoria mają wcześniejsze doświadczenie ze standardowymi eksperymentami elektrofizjologicznymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Murata Science Foundation, Suzuken Memorial Foundation, Nakatani Foundation for Advancement of Measuring Technologies in Biomedical Engineering, oraz Grant-in-Aid for Exploratory Research (numer grantu 21K19755, Japonia) i na badania naukowe (B) (numer grantu 23H03416, Japonia) dla T.T.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drukarka 3DZhejiang Flashforge 3D Technology Co., LtdFFD-101Drukarka używana do drukowania 3D krążków w kształcie pączków
SIARCZAN ATROPIN  0,5 mgNIPRO ES PHARMA CO., LTD.-Siarczan atropiny
Wzmacniacz bipolarnyNF Corp.KIT61380Do wzmacniania przebiegów dla wejścia cewki
ButorphanolMeiji Seika Pharma
Co., Ltd., Tokio,		Japonia-Do anatezy zwierząt
Komercyjny producent elastycznej matrycy 2Dp-ban.com Corp.-URL: https://www.p-ban.com/
Program komputerowy do analizy sygnałów wyjściowychNatinal InstrumentsNI-DAQ i  NI-DAQmx PythonDo analizy sygnałów wyjściowych z czujnika halla
ConnectorHarwin Inc.G125-FV12005L0PDo złącza do podłączenia do układu pomiarowego Podkładka
miedzianap-ban.com Corp.miedźPodkładka miedziana na każdym podłożu
Drut miedzianyKyowa Harmonet Ltd.P644432Uzwojenia cewki
DAQ BoardNational Instruments Corp.USB-6343Do pomiaru gęstości strumienia magnetycznego cewki
Cement dentystycznySHOFU INC.Samoutwardzalna elektroda ortodontyczna
ECoGNeuroNexus Inc.HC32Odniesienie do projektu elastycznej matrycy 2D
z żywicy epoksydowejKonishi Co., Ltd.#16123Do budowy cewek
Karbaminian etyluFUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.050-05821Do znieczulenia uretanowego
Płaski taśmowyOki Electric Cable Co., Ltd.FLEX-B2(20)-7/0.1 20028 5mDo do połączenia złącza natynkowego z elastycznym podłożem systemu pomiarowego
p-ban.com Corp.poliimidPłyta bazowa elastycznego podłoża
Generator funkcjiNF Corp.WF1947Do generowania przebiegów dla czujnika Halla na wejściu cewki
,Honeywell International Inc.SS94A2DDo pomiaru gęstości strumienia magnitycznego cewki
Zaciskarka IDCPro'sKit Industries Co.6PK-214Do zaciskania IDC i jednego końca płaskiego taśmowego; Narzędzie do zaciskania płaskich złączy kablowych
Klej błyskawicznyKonishi Co., Ltd.#04612Do budowy cewek
Łącznik izolacyjno-przemieszczeniowy (IDC )Uxcell JapanB07GDDG3XG2 i razy; 10 pinów o rastrze 1,27 mm 
Miernik LCRNF Corp.ZM2376Do pomiaru właściwości AC
manipulatoraNARISHIGE Group.SM-15LDo manipulowania cewką
MedetomidineKobayashi Kako, Fukui,Japonia-Doanatezy zwierząt
MidazolamAstellas Pharma, Tokio, Japonia-Doanatezy zwierząt
Miniaturowa śrubaKOFUSEIBYO Co., Ltd.S0,6 * 1,5Do wykrywania EEG i elektrody referencyjnej
MyszJapan SLC, Inc.C57BL/6J  (C57BL/6JJmsSlc)Zwierzę doświadczalne
Pręt Permalloy-45Nilaco Corp.780544Rdzeń cewki
System nagrywaniaPlexon Inc.OmniPlexDo akwizycji danych EEG
Drut ze stali nierdzewnejWakisangyo Co., Ltd.HW-136Do chwytania za pomocą manipulatora
Aparat stereotaktycznyNARISHIGE Group.SR-5M-HTDo mocowania głowicy myszy
Złącze do montażu powierzchniowegoUseconn Electronics Ltd.PH127-2x10MGDo złącza do montażu na elastycznej matrycy 2D
Sprzęt testujący (miernik LCR)NF Corp.ZM2372Kontrola styków i pomiary impedancji
Biały filament PLAZhejiang Flashforge 3D Technology Co., LtdPLA-F13Materiał używany do drukowania 3D krążków w kształcie pączka
Xylocaine Jelly 2%Sandoz Pharma Co., Ltd.-chlorowodorek lidokainy
Quick Resin cewki

Bibliografia

  1. Ilmoniemi, R. J., et al. Neuronal responses to magnetic stimulation reveal cortical reactivity and connectivity. Neuroreport. 8 (16), 3537-3540 (1997).
  2. Hallett, M. Transcranial magnetic stimulation: a primer. Neuron. 55 (2), 187-199 (2007).
  3. Thut, G., Pascual-Leone, A. Integrating TMS with EEG: How and what for. Brain Topography. 22 (4), 215-218 (2010).
  4. Ilmoniemi, R. J., Kicic, D. Methodology for combined TMS and EEG. Brain Topograpy. 22 (4), 233-248 (2010).
  5. Daskalakis, Z. J., Farzan, F., Radhu, N., Fitzgerald, P. B. Combined transcranial magnetic stimulation and electroencephalography: its past, present and future. Brain Research. 1463, 93-107 (2012).
  6. Tremblay, S., et al. Clinical utility and prospective of TMS-EEG. Clinical Neurophysiology. 130 (5), 802-844 (2019).
  7. Pellicciari, M. C., Veniero, D., Miniussi, C. Characterizing the cortical oscillatory response to TMS pulse. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 38(2017).
  8. Lin, Y. J., Shukla, L., Dugue, L., Valero-Cabre, A., Carrasco, M. Transcranial magnetic stimulation entrains alpha oscillatory activity in occipital cortex. Scientific Reports. 11 (1), 18562(2021).
  9. Takahashi, S., et al. Laminar responses in the auditory cortex using a multielectrode array substrate for simultaneous stimulation and recording. IEEJ Transactions Electrical and Electronic Engineering. 14 (2), 303-311 (2019).
  10. Yoshikawa, T., Higuchi, H., Furukawa, R., Tateno, T. Temporal and spatial profiles of evoked activity induced by magnetic stimulation using millimeter-sized coils in the mouse auditory cortex in vivo. Brain Research. 1796, 148092(2022).
  11. Tang, A. D., et al. Construction and evaluation of rodent-specific rTMS coils. Frontiers in Neural Circuits. 10, 47(2016).
  12. Li, L. Controlling annealing and magnetic treatment parameters to achieve high permeabilities in 55 Ni-Fe toroid cores. IEEE Transactions on Magnetics. 37 (4), 2315-2317 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przezczaszkowa stymulacja magnetycznastymulacja m zgu myszyelastyczna macierz elektrodelektrody ruboweEEG ma ych zwierz tsystem akwizycji danychodpowied kory s uchowejstymulacja magnetyczna
Niedrogi elektroencefalograficzny system zapisu w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do przezczaszkowej stymulacji mózgu myszy in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.