Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

Mohammad Fazli; Chantell  S. Evans

doi:10.3791/65304

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

DOI:

10.3791/65304

⸱

12 maja 2023

Mohammad Fazli¹ , Chantell S. Evans¹

¹Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria to dynamiczne organelle kluczowe dla homeostazy metabolicznej poprzez kontrolowanie produkcji energii poprzez syntezę ATP. Aby wspierać metabolizm komórkowy, różne mechanizmy kontroli jakości mitochondriów współpracują ze sobą w celu utrzymania zdrowej sieci mitochondrialnej. Jednym z takich szlaków jest mitofagia, w której kinaza 1 indukowana przez PTEN (PINK1) i fosfo-ubikwitynacja uszkodzonych mitochondriów Parkiny ułatwiają sekwestrację autofagosomów, a następnie usuwanie z komórki poprzez fuzję lizosomów. Mitofagia jest ważna dla homeostazy komórkowej, a mutacje w parkinie są związane z chorobą Parkinsona (PD). Ze względu na te odkrycia położono znaczny nacisk na badanie uszkodzeń i obrotu mitochondriów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne i dynamikę kontroli jakości mitochondriów. W tym przypadku wykorzystano obrazowanie żywych komórek do wizualizacji sieci mitochondrialnej komórek HeLa, w celu ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych po leczeniu m-chlorofenylohydrazonem cyjanku karbonylu (CCCP), środkiem rozprzęgającym mitochondria. Ponadto mutacja Parkiny związana z PD (Parkin^T240R), która hamuje mitofagię zależną od Parkiny, została wyrażona w celu określenia, w jaki sposób zmutowana ekspresja wpływa na sieć mitochondrialną w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję Parkiny typu dzikiego. Przedstawiony tutaj protokół opisuje prosty przepływ pracy wykorzystujący podejścia oparte na fluorescencji w celu skutecznego ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sieć mitochondrialna to szereg połączonych ze sobą organelli, które odgrywają kluczową rolę w produkcji energii¹, odporność wrodzona²^,³, oraz sygnalizacja komórkowa⁴^,⁵. Rozregulowanie mitochondriów jest związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Parkinsona (PD)⁶^,⁷. PD to postępująca choroba neurodegeneracyjna atakująca neurony dopaminergiczne istoty czarnej, która dotyka prawie 10 milionów ludzi na całym świecie⁸. PD zo....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbek biologicznych

UWAGA: Wykonaj następujące kroki przy użyciu sterylnej techniki w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Spryskaj powierzchnię szafki i wszystkie materiały 70% etanolem.

Hodowla i transfekcja komórek HeLa
1. Hodowla 30 000 komórek HeLa w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle (DMEM) zawierającej 4,5 g / L glukozy uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% roztworem L-glutaminy (pożywka HeLa; patrz tabela materiałów). Umieścić komórki na 35-milimetrowych szalkach do obrazowania ze szklanym dnem (patrzT able of Materials) zawierając....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, kwantyfikacja oparta na fluorescencji została użyta do pomiaru potencjału błonowego i poziomów ponadtlenkowych sieci mitochondrialnej po leczeniu CCCP (Rysunek 1). W tym procesie pracy wykorzystano komórki HeLa, unieśmiertelnioną linię komórkową pochodzącą z raka szyjki macicy. Komórki HeLa są rutynowo wykorzystywane do badania biologii mitochondriów i są stosunkowo płaskie, co ułatwia wizualizację sieci mitochondrialnej za pomocą mikroskopii. Aby zbadać rolę Parkiny w utrzymaniu zdro.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj przepływ pracy można wykorzystać do ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w sposób solidny i powtarzalny przy użyciu obrazowania opartego na fluorescencji³⁰. Podczas projektowania tych eksperymentów należy wziąć pod uwagę ważne ograniczenia techniczne. Komórki HeLa transfekowano pustym wektorem YFP, YFP-Parkin^WT lub YFP-Parkin^T240R. Pusty wektor YFP został użyty jako kontrola w celu potwierdzenia, że wyniki eksperyme.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Evansa za ich wnikliwe opinie na temat tego manuskryptu. Praca ta jest wspierana przez Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars oraz Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Rysunek 1A został wykonany przy użyciu BioRender.com.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chemicals, peptides and Recombinant Proteins
CCCP (m-chlorofenylohydrazon cyjanku karbonylu)	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x) z 4,5 g/L glukozy	Gibco	11-965-084
DMSO, Bezwodny	ThermoFisher Scientific	D12345
Hyklon płodu bydlęcego		SH3007103
FuGENE 6 (odczynnik do transfekcji)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (roztwór L-glutaminy)	Gibco	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX Czerwony	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Deep Red	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (Redued Serum media)	ThermoFisher scientific	31985070
Tetrametylodamina, ester etylowy, nadchloran (TMRE)	ThermoFisher Scientific	T669
Modele eksperymentalne: Organizmy/Szczepy
HeLa-M (Homo sapiens)	A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)	N/A
Rekombinowane DNA
EYFP Pusty wektor	Nie dotyczy	Nie dotyczy
YFP-Parkin T240R	Ten artykuł	Wygenerowany przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce z YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	Addgene; PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (oprogramowanie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych)	Microsoft Office
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statystyczne Oprogramowanie analityczne)	Oprogramowanie GraphPad	https://www.graphpad.com
Inne
35 mm Talerz, nr 1,5 Szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 20 mm, niepowlekany	MatTek	P35G-1.5-20-C
(komora środowiskowa)	Mikroskop	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL	Oprogramowanie do	N/A
LIGHTNING Mikroskop konfokalny	Leica	N/A
STELLARIS 8	Leica	N/A

https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel Inkubator klatkowy odwrócony Okolab dekonwolucji Leica

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mitochondrial Membrane Potential Superoxide Levels Live Cell Imaging HeLa Cells Fluorescence Quantification Mitochondrial Network TMRE Staining MitoSOX Fluorescence Parkin Mutation Mitochondrial Quality Control

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły