Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mitochondria to dynamiczne organelle kluczowe dla homeostazy metabolicznej poprzez kontrolowanie produkcji energii poprzez syntezę ATP. Aby wspierać metabolizm komórkowy, różne mechanizmy kontroli jakości mitochondriów współpracują ze sobą w celu utrzymania zdrowej sieci mitochondrialnej. Jednym z takich szlaków jest mitofagia, w której kinaza 1 indukowana przez PTEN (PINK1) i fosfo-ubikwitynacja uszkodzonych mitochondriów Parkiny ułatwiają sekwestrację autofagosomów, a następnie usuwanie z komórki poprzez fuzję lizosomów. Mitofagia jest ważna dla homeostazy komórkowej, a mutacje w parkinie są związane z chorobą Parkinsona (PD). Ze względu na te odkrycia położono znaczny nacisk na badanie uszkodzeń i obrotu mitochondriów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne i dynamikę kontroli jakości mitochondriów. W tym przypadku wykorzystano obrazowanie żywych komórek do wizualizacji sieci mitochondrialnej komórek HeLa, w celu ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych po leczeniu m-chlorofenylohydrazonem cyjanku karbonylu (CCCP), środkiem rozprzęgającym mitochondria. Ponadto mutacja Parkiny związana z PD (ParkinT240R), która hamuje mitofagię zależną od Parkiny, została wyrażona w celu określenia, w jaki sposób zmutowana ekspresja wpływa na sieć mitochondrialną w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję Parkiny typu dzikiego. Przedstawiony tutaj protokół opisuje prosty przepływ pracy wykorzystujący podejścia oparte na fluorescencji w celu skutecznego ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych.
Wprowadzenie
Sieć mitochondrialna to szereg połączonych ze sobą organelli, które odgrywają kluczową rolę w produkcji energii1, odporność wrodzona2,3, oraz sygnalizacja komórkowa4,5. Rozregulowanie mitochondriów jest związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Parkinsona (PD)6,7. PD to postępująca choroba neurodegeneracyjna atakująca neurony dopaminergiczne istoty czarnej, która dotyka prawie 10 milionów ludzi na całym świecie8. PD zo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbek biologicznych
UWAGA: Wykonaj następujące kroki przy użyciu sterylnej techniki w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Spryskaj powierzchnię szafki i wszystkie materiały 70% etanolem.
- Hodowla i transfekcja komórek HeLa
- Hodowla 30 000 komórek HeLa w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle (DMEM) zawierającej 4,5 g / L glukozy uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% roztworem L-glutaminy (pożywka HeLa; patrz tabela materiałów). Umieścić komórki na 35-milimetrowych szalkach do obrazowania ze szklanym dnem (patrzT able of Materials) zawierając....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym protokole zastosowano ilościowe oznaczenie fluorescencyjne w celu pomiaru potencjału błonowego oraz poziomu ponadtlenków w sieci mitochondrialnej po traktowaniu CCCP (Rycina 1). W tym schemencie doświadczalnym wykorzystano komórki HeLa, unieśmiertelną linię komórkową pochodzącą z raka szyjki macicy. Komórki HeLa są rutynowo stosowane do badania biologii mitochondriów i są stosunkowo płaskie, co ułatwia wizualizację sieci mitochondrialnej za pomocą mikroskopii. Aby zbadać rolę bi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj przepływ pracy można wykorzystać do ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w sposób solidny i powtarzalny przy użyciu obrazowania opartego na fluorescencji30. Podczas projektowania tych eksperymentów należy wziąć pod uwagę ważne ograniczenia techniczne. Komórki HeLa transfekowano pustym wektorem YFP, YFP-ParkinWT lub YFP-ParkinT240R. Pusty wektor YFP został użyty jako kontrola w celu potwierdzenia, że wyniki eksperyme.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.
Podziękowania
Dziękujemy członkom laboratorium Evansa za ich wnikliwe opinie na temat tego manuskryptu. Praca ta jest wspierana przez Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars oraz Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Rysunek 1A został wykonany przy użyciu BioRender.com.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chemicals, peptides and Recombinant Proteins | |||
| CCCP (m-chlorofenylohydrazon cyjanku karbonylu) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| DMEM (1x) z 4,5 g/L glukozy | Gibco | 11-965-084 | |
| DMSO, Bezwodny | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Hyklon płodu bydlęcego | SH3007103 | ||
| FuGENE 6 (odczynnik do transfekcji) | Promega | E2691 | |
| GlutaMAX 100x (roztwór L-glutaminy) | Gibco | 35-050-061 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| MitoSOX Czerwony | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
| Tetrametylodamina, ester etylowy, nadchloran (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
| Modele eksperymentalne: Organizmy/Szczepy | |||
| HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
| Rekombinowane DNA | |||
| EYFP Pusty wektor | Nie dotyczy | Nie dotyczy | |
| YFP-Parkin T240R | Ten artykuł | Wygenerowany przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce z YFP-Parkin | |
| YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
| Software and Algorithms | |||
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
| Excel (oprogramowanie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych) | Microsoft Office | ||
| ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
| Prism9 (Statystyczne Oprogramowanie analityczne) | Oprogramowanie GraphPad | https://www.graphpad.com | |
| Inne | |||
| 35 mm Talerz, nr 1,5 Szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 20 mm, niepowlekany | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| (komora środowiskowa) | Mikroskop | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
| DMiL | Oprogramowanie do | N/A | |
| LIGHTNING Mikroskop konfokalny | Leica | N/A | |
| STELLARIS 8 | Leica | N/A |
Bibliografia
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
