Method Article

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

DOI:

10.3791/65304

⸱

May 12th, 2023

 , 
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria to dynamiczne organelle kluczowe dla homeostazy metabolicznej poprzez kontrolowanie produkcji energii poprzez syntezę ATP. Aby wspierać metabolizm komórkowy, różne mechanizmy kontroli jakości mitochondriów współpracują ze sobą w celu utrzymania zdrowej sieci mitochondrialnej. Jednym z takich szlaków jest mitofagia, w której kinaza 1 indukowana przez PTEN (PINK1) i fosfo-ubikwitynacja uszkodzonych mitochondriów Parkiny ułatwiają sekwestrację autofagosomów, a następnie usuwanie z komórki poprzez fuzję lizosomów. Mitofagia jest ważna dla homeostazy komórkowej, a mutacje w parkinie są związane z chorobą Parkinsona (PD). Ze względu na te odkrycia położono znaczny nacisk na badanie uszkodzeń i obrotu mitochondriów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne i dynamikę kontroli jakości mitochondriów. W tym przypadku wykorzystano obrazowanie żywych komórek do wizualizacji sieci mitochondrialnej komórek HeLa, w celu ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych po leczeniu m-chlorofenylohydrazonem cyjanku karbonylu (CCCP), środkiem rozprzęgającym mitochondria. Ponadto mutacja Parkiny związana z PD (ParkinT240R), która hamuje mitofagię zależną od Parkiny, została wyrażona w celu określenia, w jaki sposób zmutowana ekspresja wpływa na sieć mitochondrialną w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję Parkiny typu dzikiego. Przedstawiony tutaj protokół opisuje prosty przepływ pracy wykorzystujący podejścia oparte na fluorescencji w celu skutecznego ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sieć mitochondrialna to szereg połączonych ze sobą organelli, które odgrywają kluczową rolę w produkcji energii1, odporność wrodzona2,3, oraz sygnalizacja komórkowa4,5. Rozregulowanie mitochondriów jest związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Parkinsona (PD)6,7. PD to postępująca choroba neurodegeneracyjna atakująca neurony dopaminergiczne istoty czarnej, która dotyka prawie 10 milionów ludzi na całym świecie8. PD zo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbek biologicznych

UWAGA: Wykonaj następujące kroki przy użyciu sterylnej techniki w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Spryskaj powierzchnię szafki i wszystkie materiały 70% etanolem.

  1. Hodowla i transfekcja komórek HeLa
    1. Hodowla 30 000 komórek HeLa w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle (DMEM) zawierającej 4,5 g / L glukozy uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% roztworem L-glutaminy (pożywka HeLa; patrz tabela materiałów). Umieścić komórki na 35-milimetrowych szalkach do obrazowania ze szklanym dnem (patrzT able of Materials) zawierając....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, kwantyfikacja oparta na fluorescencji została użyta do pomiaru potencjału błonowego i poziomów ponadtlenkowych sieci mitochondrialnej po leczeniu CCCP (Rysunek 1). W tym procesie pracy wykorzystano komórki HeLa, unieśmiertelnioną linię komórkową pochodzącą z raka szyjki macicy. Komórki HeLa są rutynowo wykorzystywane do badania biologii mitochondriów i są stosunkowo płaskie, co ułatwia wizualizację sieci mitochondrialnej za pomocą mikroskopii. Aby zbadać rolę Parkiny w utrzymaniu zdro.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj przepływ pracy można wykorzystać do ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w sposób solidny i powtarzalny przy użyciu obrazowania opartego na fluorescencji30. Podczas projektowania tych eksperymentów należy wziąć pod uwagę ważne ograniczenia techniczne. Komórki HeLa transfekowano pustym wektorem YFP, YFP-ParkinWT lub YFP-ParkinT240R. Pusty wektor YFP został użyty jako kontrola w celu potwierdzenia, że wyniki eksperyme.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Evansa za ich wnikliwe opinie na temat tego manuskryptu. Praca ta jest wspierana przez Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars oraz Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Rysunek 1A został wykonany przy użyciu BioRender.com.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, peptides and Recombinant Proteins
CCCP (m-chlorofenylohydrazon cyjanku karbonylu) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) z 4,5 g/L glukozyGibco11-965-084
DMSO, BezwodnyThermoFisher ScientificD12345
Hyklon płodu bydlęcegoSH3007103
FuGENE 6 (odczynnik do transfekcji)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (roztwór L-glutaminy) Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  Czerwony ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (Redued Serum media)ThermoFisher scientific31985070
Tetrametylodamina, ester etylowy, nadchloran (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
Modele eksperymentalne: Organizmy/Szczepy
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
Rekombinowane DNA
EYFP Pusty wektorNie dotyczyNie dotyczy
YFP-Parkin T240RTen artykułWygenerowany przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce z YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (oprogramowanie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych)Microsoft Office 
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statystyczne Oprogramowanie analityczne)Oprogramowanie GraphPadhttps://www.graphpad.com
Inne
35 mm Talerz, nr 1,5 Szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 20 mm, niepowlekanyMatTekP35G-1.5-20-C
(komora środowiskowa)Mikroskophttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiLOprogramowanie doN/A
LIGHTNING Mikroskop konfokalnyLeicaN/A
STELLARIS 8LeicaN/A
https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel Inkubator klatkowy odwrócony Okolab dekonwolucji Leica

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial Membrane PotentialSuperoxide LevelsLive Cell ImagingHeLa CellsFluorescence QuantificationMitochondrial NetworkTMRE StainingMitoSOX FluorescenceParkin MutationMitochondrial Quality Control

Related Articles