Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

DOI:

10.3791/65304

⸱

12 maja 2023

 , 
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria to dynamiczne organelle kluczowe dla homeostazy metabolicznej poprzez kontrolowanie produkcji energii poprzez syntezę ATP. Aby wspierać metabolizm komórkowy, różne mechanizmy kontroli jakości mitochondriów współpracują ze sobą w celu utrzymania zdrowej sieci mitochondrialnej. Jednym z takich szlaków jest mitofagia, w której kinaza 1 indukowana przez PTEN (PINK1) i fosfo-ubikwitynacja uszkodzonych mitochondriów Parkiny ułatwiają sekwestrację autofagosomów, a następnie usuwanie z komórki poprzez fuzję lizosomów. Mitofagia jest ważna dla homeostazy komórkowej, a mutacje w parkinie są związane z chorobą Parkinsona (PD). Ze względu na te odkrycia położono znaczny nacisk na badanie uszkodzeń i obrotu mitochondriów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne i dynamikę kontroli jakości mitochondriów. W tym przypadku wykorzystano obrazowanie żywych komórek do wizualizacji sieci mitochondrialnej komórek HeLa, w celu ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych po leczeniu m-chlorofenylohydrazonem cyjanku karbonylu (CCCP), środkiem rozprzęgającym mitochondria. Ponadto mutacja Parkiny związana z PD (ParkinT240R), która hamuje mitofagię zależną od Parkiny, została wyrażona w celu określenia, w jaki sposób zmutowana ekspresja wpływa na sieć mitochondrialną w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję Parkiny typu dzikiego. Przedstawiony tutaj protokół opisuje prosty przepływ pracy wykorzystujący podejścia oparte na fluorescencji w celu skutecznego ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sieć mitochondrialna to szereg połączonych ze sobą organelli, które odgrywają kluczową rolę w produkcji energii1, odporność wrodzona2,3, oraz sygnalizacja komórkowa4,5. Rozregulowanie mitochondriów jest związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Parkinsona (PD)6,7. PD to postępująca choroba neurodegeneracyjna atakująca neurony dopaminergiczne istoty czarnej, która dotyka prawie 10 milionów ludzi na całym świecie8. PD została genetycznie powiązana z mitofagią, mitochondrialnym szlakiem kontroli jakości niezbędnym do utrzymania homeostazy komórkowej, który selektywnie usuwa uszkodzone mitochondria9,10. Badania zidentyfikowały wiele niezależnych szlaków mitofagii, w tym domenę FUN14 zawierającą mitofagię za pośrednictwem 1 (FUNDC1), mitofagię wspomaganą białkiem oddziałującym z Bcl-2 3 (BNIP3), mitofagię zależną od NIX i dobrze scharakteryzowaną kinazę 1 indukowaną przez PTEN (PINK1)/mitofagię regulowaną przez parkinę10,11. PINK1 (przypuszczalna kinaza) i Parkina (ligaza ubikwityny E3) działają w tandemie, aby fosfo-ubikwitynacja uszkodzone mitochondria, co napędza tworzenie autofagosomów, które pochłaniają uszkodzone organelle i łączą się z lizosomami, aby zainicjować degradację12,13,14,15,16. Mutacje w parkinie są związane z fenotypami związanymi z chorobą Parkinsona, takimi jak neurodegeneracja poprzez utratę neuronów dopaminergicznych17,18.

Tutaj opisany jest protokół, w którym komórki HeLa, rutynowo używane unieśmiertelnione komórki pochodzące z raka szyjki macicy, są używane do badania roli Parkiny w utrzymaniu zdrowia sieci mitochondrialnej. Komórki HeLa wyrażają znikome poziomy endogennej Parkiny i dlatego wymagają egzogennej ekspresji Parkiny19. Aby zbadać rolę Parkiny w zdrowiu sieci mitochondrialnej, komórki HeLa są transfekowane Parkiną typu dzikiego (ParkinWT), mutantem Parkiny (ParkinT240R) lub pustym wektorem kontrolnym. ParkinaT240R jest autosomalną recesywną mutacją parkinsonizmu młodzieńczego, która wpływa na aktywność ligazy Parkin E3, znacznie zmniejszając wydajność szlaku mitofagii20. Komórki HeLa są poddawane łagodnym (5 μM) lub ciężkim (20 μM) stężeniom m-chlorofenylohydrazonu cyjanku karbonylu (CCCP), środka rozprzęgającego mitochondria. Leczenie ciężkimi stężeniami CCCP jest rutynowo stosowane w celu wywołania mitofagii za pośrednictwem Parkiny w różnych liniach komórkowych, takich jak komórki HeLa i COS-721,22,23.

Po leczeniu, protokół wykorzystuje obrazowanie na żywo sieci mitochondrialnej przy użyciu dwóch obecnie dostępnych barwników fluorescencyjnych ukierunkowanych na mitochondria. Tetrametylorodamina, ester etylowy, nadchloran (TMRE) jest barwnikiem kationowym, który fluoryzuje w oparciu o potencjał błony mitochondrialnej24, podczas gdy MitoSOX to mitochondrialny wskaźnik ponadtlenkowy, w którym intensywność fluorescencji jest funkcją stężenia ponadtlenkowego25. Wreszcie, przedstawiony protokół wykorzystuje kwantyfikację opartą na fluorescencji i prosty przepływ pracy, aby skutecznie określić ilościowo potencjał błony mitochondrialnej i poziomy ponadtlenkowe przy minimalnym zakresie stronniczości użytkownika. Chociaż protokół ten został zaprojektowany do badania funkcji mitochondriów w komórkach HeLa, można go dostosować do dodatkowych linii komórkowych i pierwotnych typów komórek, aby ilościowo scharakteryzować zdrowie sieci mitochondrialnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbek biologicznych

UWAGA: Wykonaj następujące kroki przy użyciu sterylnej techniki w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Spryskaj powierzchnię szafki i wszystkie materiały 70% etanolem.

  1. Hodowla i transfekcja komórek HeLa
    1. Hodowla 30 000 komórek HeLa w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle (DMEM) zawierającej 4,5 g / L glukozy uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% roztworem L-glutaminy (pożywka HeLa; patrz tabela materiałów). Umieścić komórki na 35-milimetrowych szalkach do obrazowania ze szklanym dnem (patrzT able of Materials) zawierających 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki HeLa. Utrzymuj kultury HeLa na poziomie 5% CO2 i 37 °C26,27.
    2. Dzień po posiewie sprawdź czaszy obrazowania 35 mm za pomocą mikroskopu świetlnego, aby upewnić się, że komórki są zlewające się w ~50%-60%. Po zlewaniu się transfekuj komórki HeLa pustym wektorem żółtego białka fluorescencyjnego (YFP), YFP-ParkinWT lub YFP-ParkinT240R (Figura 1A).
    3. Przygotować dwie oddzielne mieszaniny w sterylnych probówkach do mikrowirówek dla każdej transfekcji. Mieszać, stukając w rurkę lub delikatnie pipetując w górę i w dół.
      1. W probówce 1 zmieszać 200 μl zredukowanej pożywki surowicy (patrz tabela materiałów) z 2 μg plazmidowego DNA.
      2. W probówce 2 wymieszaj 200 μl zredukowanej pożywki surowicy z 6 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów)28.
    4. Inkubować probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Dodać probówkę 2 do probówki 1, mieszać pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Dodawać kompleksy transfekcji kroplami do istniejących szalek obrazowania zawierających kultury komórek HeLa, zapewniając równomierne rozprowadzenie w całej naczyni. Umieść szalki do obrazowania w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 i temperaturze 37 °C na noc.
      UWAGA: Oznacz każde danie odpowiednim transfekowanym plazmidem. Dla każdego eksperymentu oznacz trzy szalki YFP-ParkinWT (dimetylosulfotlenek [DMSO; patrz tabela materiałów], 5 μM CCCP i 20 μM CCCP). Powtórz etykietowanie z trzema szalkami YFP-ParkinT240R i trzema pustymi szalkami wektorowymi YFP.
  2. Przygotowanie CCCP i barwników fluorescencyjnych
    UWAGA: Barwniki fluorescencyjne są często wrażliwe na światło. Przechowuj barwniki w ciemności za pomocą folii aluminiowej lub brązowych probówek wirówkowych, aby zmniejszyć ekspozycję na światło.
    1. Przygotować 5 mM zapasu roboczego CCCP (patrz Tabela materiałów) rozpuszczając 5 mg CCCP w 4,89 ml DMSO. Przygotować 20 mM zapasu roboczego CCCP, rozpuszczając 5 mg CCCP w 1,22 ml DMSO.
    2. Rozcieńczyć 10 μl 1 mM roztworu podstawowego MitoTracker Deep Red (patrz Tabela Materiałów) w 390 μl DMSO, aby uzyskać 25 μM materiału roboczego.
    3. Rozpuść 50 μg MitoSOX Red25 (patrz Tabela Materiałów) w 13 μL DMSO, aby utworzyć 5 mM zapasu roboczego.
    4. Rozpuścić 10 mg TMRE24 (patrz tabela materiałów) w 19,4 ml DMSO, aby uzyskać 1 mM roztwór podstawowy. Rozcieńczyć TMRE, dodając 10 μL z 1 mM TMRE do 990 μL DMSO, aby uzyskać 10 μM zapasu roboczego.

2. Leczenie CCCP i znakowanie mitochondriów za pomocą sond fluorescencyjnych w komórkach HeLa

UWAGA: Wykonaj szybko następujące kroki, aby upewnić się, że komórki HeLa nie są poza inkubatorem przez dłuższy czas.

  1. Następnego dnia po transfekcji dodać 2 μl 5 lub 20 mM CCCP (stężenie końcowe: odpowiednio 5 μM i 20 μM) do każdej płytki doświadczalnej. W przypadku płytek kontrolnych dodać 2 μl DMSO. Umieść płytki w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 i temperaturze 37 °C na 1,5 godziny (Rysunek 1A).
    UWAGA: Zabieg CCCP trwa łącznie 2 godziny. Jednak mitochondria są znakowane sondami fluorescencyjnymi podczas ostatnich 30 minut leczenia CCCP.
  2. Po 1,5 godziny wyjmij płytki z inkubatora i dodaj sondy fluorescencyjne do czaszy obrazowania. Włóż płytki do inkubatora o stężeniu 5%CO2 i temperaturze 37 °C na 30 minut (Rysunek 1A).
    1. Eksperyment TMRE: Dodać 2 μL 25 μM MitoTracker (stężenie końcowe: 25 nM) i 2 μL 10 μM TMRE (stężenie końcowe: 10 nM).
    2. Eksperyment MitoSOX: Dodać 2 μL 25 μM MitoTracker (stężenie końcowe: 25 nM) i 1 μL 5 mM MitoSOX (stężenie końcowe: 2,5 μM).
  3. Po 2 godzinach leczenia CCCP przygotuj komórki HeLa do obrazowania (Rysunek 1A,B).
    1. Eksperyment TMRE: Komórki HeLa są natychmiast gotowe do obrazowania; upewnij się, że TMRE pozostaje w pożywce do hodowli komórek HeLa.
    2. Eksperyment MitoSOX: Umyj komórki 3x 2 ml podgrzanej pożywki HeLa, aby usunąć wolny barwnik MitoOX. Dodaj 2 ml podgrzanego podłoża. Komórki HeLa są teraz gotowe do obrazowania.
      UWAGA: Umyj komórki HeLa świeżymi, wstępnie podgrzanymi pożywkami HeLa, które zawierają takie samo stężenie DMSO lub CCCP jak w warunkach eksperymentalnych; nie obejmują MitoSOX ani MitoTracker.

3. Ustawienia akwizycji obrazu mikroskopu konfokalnego

UWAGA: Zobrazuj komórki HeLa za pomocą mikroskopu konfokalnego (zobacz Tabelę Materiałów) wyposażonego w obiektyw immersyjny z aperturą numeryczną 63x/1,40 (NA) i komorę środowiskową (zobacz Tabelę materiałów).

  1. Na 1 godzinę przed obrazowaniem włączyć CO2, otwierając zawór zbiornika. Naciśnij przycisk On, aby włączyć kontroler środowiskowy mikroskopu. Użyj strzałek w górę i w dół na panelu dotykowym, aby ustawić temperaturę na 37 °C, a CO2 na 5%. Naciśnij Set po zakończeniu.
    UWAGA: Upewnij się, że drzwi do komory środowiskowej są zamknięte i poczekaj, aż warunki się ustabilizują.
  2. Ustawienia lasera
    1. Włącz laser światła białego (WLL) i ustaw moc lasera na 85%, a kontrolę wzbudzenia na moc maksymalną. Kliknij kartę Pobieranie, wybierz opcję Dodaj laser, a następnie w wyświetlonym oknie dialogowym przełącz opcję WLL na Wł. Kliknij przycisk Moc lasera i wprowadź 85%. Kliknij przycisk Kontrola wzbudzenia i wybierz Moc maksymalna z menu rozwijanego (Rysunek 2A).
    2. Eksperyment TMRE: Ustaw widma wzbudzenia i emisji dla YFP, MitoTracker i TMRE.
      1. Dla YFP ustaw laser wzbudzający na 514 nm, a okno widm emisyjnych na 524-545 nm. Na karcie Acquire (Pobieranie) kliknij przycisk Add New Setting (Dodaj nowe ustawienie); następnie kliknij Dodaj laser i przeciągnij go do Ustawień 1. Kliknij dwukrotnie linię wzbudzenia i wprowadź 514 jako długość fali w oknie dialogowym. Kliknij dwukrotnie odpowiedni detektor i wprowadź 524 dla początkowej długości fali i 545 dla końcowej długości fali.
      2. W przypadku MitoTracker Deep Red ustaw laser wzbudzający na 641, a okno widm emisyjnych na 650-750 nm. Na karcie Acquire (Pobieranie) kliknij przycisk Add Laser (Dodaj laser) i przeciągnij go do Setting 1 (Ustawienie 1). Kliknij dwukrotnie linię wzbudzenia i wprowadź 641 jako długość fali w oknie dialogowym. Kliknij dwukrotnie odpowiedni detektor i wprowadź 650 dla początkowej długości fali i 750 dla końcowej długości fali.
      3. W przypadku TMRE ustaw laser wzbudzający na 555 nm, a okno widm emisyjnych na 557-643 nm. Na karcie Acquire (Pobieranie) kliknij przycisk Add New Setting (Dodaj nowe ustawienie); następnie kliknij przycisk Dodaj laser i przeciągnij go do Ustawień 2. Kliknij dwukrotnie linię wzbudzenia i wprowadź 555 jako długość fali w oknie dialogowym. Kliknij dwukrotnie odpowiedni detektor i wprowadź 557 dla początkowej długości fali i 643 dla końcowej długości fali.
    3. Eksperyment MitoSOX: Ustaw widma wzbudzenia i emisji dla YFP, MitoTracker i MitoSOX (Rysunek 2B).
      1. W przypadku YFP ustaw laser wzbudzający na 507 nm, a okno widm emisyjnych na 517-540 nm. Na karcie Acquire (Pobieranie) kliknij przycisk Add New Setting (Dodaj nowe ustawienie); następnie kliknij przycisk Dodaj laser i przeciągnij go do Ustawień 1. Kliknij dwukrotnie linię wzbudzenia i wprowadź 507 jako długość fali w oknie dialogowym. Kliknij dwukrotnie odpowiedni detektor i wprowadź 517 dla początkowej długości fali i 540 dla końcowej długości fali.
      2. W przypadku MitoSOX ustaw laser wzbudzenia na 547 nm, a okno widm emisyjnych na 564-636 nm. Na karcie Acquire (Pobieranie) kliknij przycisk Add New Setting (Dodaj nowe ustawienie); następnie kliknij przycisk Dodaj laser i przeciągnij go do Ustawień 2. Kliknij dwukrotnie linię wzbudzenia i wprowadź 547 jako długość fali w oknie dialogowym. Kliknij dwukrotnie odpowiedni detektor i wprowadź 564 dla początkowej długości fali i 636 dla końcowej długości fali.
      3. W przypadku MitoTracker Deep Red ustaw laser wzbudzenia na 641 nm, a okno widm emisyjnych na 652-742 nm. Na karcie Acquire (Pobieranie) kliknij przycisk Add New Setting (Dodaj nowe ustawienie); kliknij przycisk Dodaj laser i przeciągnij go do Ustawień 3. Kliknij dwukrotnie linię wzbudzenia i wprowadź 641 jako długość fali w oknie dialogowym. Kliknij dwukrotnie odpowiedni detektor i wprowadź 652 dla początkowej długości fali i 742 dla końcowej długości fali.
  3. Ustawienia akwizycji obrazu (Rysunek 2C)
    1. Ustaw format na 1 024 x 1 024, szybkość skanowania na 600 Hz, a średnią linii na 3.
      1. Wybierz kartę Pozyskiwanie i kliknij przycisk Formatuj. Z menu rozwijanego wybierz 1 024 x 1 024. Kliknij przycisk Prędkość i wybierz 600 z menu rozwijanego. Następnie kliknij przycisk Średnia liniowa i z menu rozwijanego wybierz 3.
      2. Włącz skanowanie dwukierunkowe i ustaw fazę oraz współczynnik powiększenia odpowiednio na 22,61 i 1,50.
        1. Na karcie Pobieranie przełącz przycisk Dwukierunkowy na Wł. Kliknij ustawienie Faza X i ustaw je na 22.61. Kliknij ustawienie Zoom Factor i ustaw je na 1.50.

4. Akwizycja obrazu

UWAGA: Eksperymentator musi dokonać wizualnego osądu, aby wybrać komórki na podstawie sygnału fluorescencji YFP. Unikaj przesyconych pikseli, ponieważ mogą one znacząco wpłynąć na kwantyfikację intensywności fluorescencji. Użyj tabeli przeglądowej powyżej/poniżej, która wskazuje nasycenie pikseli, aby uniknąć uzyskiwania nasyconych obrazów.

  1. Kliknij interesujące Cię ustawienie i naciśnij Fast Live, aby wyświetlić podgląd na żywo obrazu fluorescencji.
  2. Dostosuj wzmocnienie i intensywność, klikając dwukrotnie odpowiedni detektor. W wyświetlonym oknie dialogowym dostosuj ustawienie Wzmocnienie za pomocą suwaka. Aby zmienić intensywność, kliknij dwukrotnie linię wzbudzenia i użyj strzałek w górę iw dół w wyskakującym okienku, aby zmienić intensywność. Kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zakończyć podgląd.
    1. Eksperyment TMRE: Najpierw zobrazuj płytkę kontrolną DMSO. Dostosuj wzmocnienie i intensywność sygnału TMRE (ustawienie 2) tak, aby intensywność sieci mitochondrialnej była tuż poniżej nasycenia; Utrzymuj stałe wzmocnienie i intensywność dla eksperymentu. Dostosuj wzmocnienie i intensywność MitoTrackera i YFP (ustawienie 1) tak, aby sieć mitochondrialna była widoczna, ale przyciemniona.
    2. Eksperyment MitoSOX: Najpierw zobrazuj płytkę kontrolną DMSO. Dostosuj wzmocnienie i intensywność sygnału MitoSOX (ustawienie 2) tak, aby fluorescencja była widoczna, ale przyciemniona; Utrzymuj stałe wzmocnienie i intensywność dla eksperymentu. Dostosuj wzmocnienie i intensywność YFP (ustawienie 1) i MitoTracker (ustawienie 3) tak, aby sieć mitochondrialna była widoczna, ale przyciemniona.
      UWAGA: Zapisz wzmocnienie i intensywność TMRE i MitoSOX, ponieważ wartości te muszą pozostać stałe przez cały czas trwania eksperymentu. Sygnały fluorescencyjne YFP i MitoTracker nie są określane ilościowo w tym protokole. Dzięki temu wzmocnienie i intensywność można dostosować do każdego obrazu. Najbardziej efektywne jest ustawienie wzmocnienia i intensywności, w których komórki są dobrze widoczne, ale nadal przyciemnione, aby zapewnić, że komórki nie są narażone na nadmierną intensywność lasera, która powoduje uszkodzenie komórek lub fotowybielanie.
  3. Po zakończeniu ustawień wzmocnienia i intensywności kliknij przycisk Start, aby uzyskać obraz. Uzyskaj obrazy 20 komórek na warunki eksperymentalne (np. pięć obrazów z czterema komórkami na obraz; Rysunek 2D).

5. Kwantyfikacja intensywności fluorescencji za pomocą ImageJ

UWAGA: Pliki obrazowania są zapisywane jako ".lif" i są kompatybilne z ImageJ29. Typy plików kompatybilne z ImageJ są określone na ich stronie internetowej. Może być konieczna konwersja typu pliku, jeśli jest on niezgodny.

  1. Utwórz i zapisz obszar zainteresowania (ROI).
    1. W ImageJ kliknij pozycję Plik | Nowość | Obraz. W wyświetlonym oknie dialogowym kliknij przycisk OK.
    2. Kliknij przycisk Narzędzie Prostokąt i narysuj pole o wymiarach 6 mikronów x 6 mikronów. Otwórz menedżera ROI, klikając Analizuj | Narzędzia | Menedżer ROI i poczekaj, aż pojawi się okno dialogowe z menedżerem ROI (Rysunek 3A). Dodaj prostokątny zwrot z inwestycji do menedżera, klikając przycisk Dodaj w oknie dialogowym menedżera. Zapisz zwrot z inwestycji, wybierając opcję Więcej, a następnie kliknij przycisk Zapisz i kliknij przycisk OK.
  2. Zmierz intensywność fluorescencji.
    1. Na obrazie J kliknij pozycję Plik i wybierz opcję Otwórz. W oknie dialogowym wybierz pliki obrazowania do eksperymentu i kliknij przycisk Otwórz.
    2. Poczekaj, aż pojawi się okno Opcje importu formatów biologicznych (Rysunek 3B). Wybierz opcję Podziel kanały i kliknij przycisk Open.
      UWAGA: Funkcja podziału kanałów umożliwia otwarcie każdego kanału na obrazie jako osobnego okna. Kolejność kanałów odpowiada kolejności pozyskiwania.
      1. Eksperymenty TMRE: YFP (ustawienie 1) to pierwszy kanał (c = 0); MitoTracker (ustawienie 1) to drugi kanał (c = 1); a TMRE (ustawienie 2) jest trzecim kanałem (c = 2).
      2. Eksperymenty MitoSOX: YFP (ustawienie 1) to pierwszy kanał (c = 0); MitoSOX (ustawienie 2) to drugi kanał (c = 1); a MitoTracker (ustawienie 3) to trzeci kanał (c = 2).
    3. Dostosuj jasność, wybierając Obraz | Dostosuj | Jasność (Rysunek 3C).
      UWAGA: Nie naciskaj przycisku Set (Ustaw) ani Apply (Zastosuj), aby upewnić się, że jasność obrazu nie zostanie trwale zmieniona. Zdarza się, że intensywność fluorescencji nie jest widoczna w kanałach TMRE lub MitoOX. Dostosuj jasność, aby umożliwić łatwiejszą wizualizację. Zmiana jasności nie wpływa na wartości intensywności surowej fluorescencji.
    4. Kliknij przycisk Analizuj i wybierz opcję Ustaw pomiary. Zaznacz pola Obszar i Średnia wartość szarości i kliknij OK (Rysunek 3D).
      UWAGA: Średnia wartość szarości to intensywność fluorescencji.
    5. Otwórz Menedżera zwrotu z inwestycji i załaduj zwrot z inwestycji zapisany w kroku 5.1, klikając przycisk Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji. W Menedżerze zwrotu z inwestycji kliknij przycisk Więcej, a następnie Otwórz z wyświetlonej listy i wybierz zapisany zwrot z inwestycji.
    6. Zmierz intensywność fluorescencji pięciu losowych regionów w jednej komórce, wybierając zapisany zwrot z inwestycji z menedżera ROI i przenieś zwrot z inwestycji do losowego miejsca w komórce (Rysunek 3E). Zmierz intensywność fluorescencji, naciskając M. Powtórz ten krok z czterema dodatkowymi, nienakładającymi się regionami. Gdy pojawi się okno dialogowe z wartościami obszaru i średniej szarości (Rysunek 3F), skopiuj i wklej wartości do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy.
      1. Eksperyment TMRE: Wybierz obraz (c = 2).
      2. Eksperyment MitoOX: Wybierz obraz (c = 2).
    7. Uzyskać średnie wartości intensywności fluorescencji. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego (patrz Spis materiałów), uśrednij pięć średnich wartości szarości. Powtórz ten proces dla każdej komórki.
    8. Analizuj i porównuj średnie wartości szarości TMRE lub MitoSOX w różnych warunkach eksperymentalnych za pomocą oprogramowania statystycznego (patrz Tabela materiałów; Rysunek 4 i Rysunek 5). Prezentuj dane w postaci wykresów słupkowych lub wykresów skrzypcowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, kwantyfikacja oparta na fluorescencji została użyta do pomiaru potencjału błonowego i poziomów ponadtlenkowych sieci mitochondrialnej po leczeniu CCCP (Rysunek 1). W tym procesie pracy wykorzystano komórki HeLa, unieśmiertelnioną linię komórkową pochodzącą z raka szyjki macicy. Komórki HeLa są rutynowo wykorzystywane do badania biologii mitochondriów i są stosunkowo płaskie, co ułatwia wizualizację sieci mitochondrialnej za pomocą mikroskopii. Aby zbadać rolę Parkiny w utrzymaniu zdro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj przepływ pracy można wykorzystać do ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w sposób solidny i powtarzalny przy użyciu obrazowania opartego na fluorescencji30. Podczas projektowania tych eksperymentów należy wziąć pod uwagę ważne ograniczenia techniczne. Komórki HeLa transfekowano pustym wektorem YFP, YFP-ParkinWT lub YFP-ParkinT240R. Pusty wektor YFP został użyty jako kontrola w celu potwierdzenia, że wyniki eksperyme...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Evansa za ich wnikliwe opinie na temat tego manuskryptu. Praca ta jest wspierana przez Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars oraz Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Rysunek 1A został wykonany przy użyciu BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals, peptides and Recombinant Proteins
CCCP (m-chlorofenylohydrazon cyjanku karbonylu) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) z 4,5 g/L glukozyGibco11-965-084
DMSO, BezwodnyThermoFisher ScientificD12345
Hyklon płodu bydlęcegoSH3007103
FuGENE 6 (odczynnik do transfekcji)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (roztwór L-glutaminy) Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  Czerwony ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (Redued Serum media)ThermoFisher scientific31985070
Tetrametylodamina, ester etylowy, nadchloran (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
Modele eksperymentalne: Organizmy/Szczepy
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
Rekombinowane DNA
EYFP Pusty wektorNie dotyczyNie dotyczy
YFP-Parkin T240RTen artykułWygenerowany przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce z YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (oprogramowanie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych)Microsoft Office 
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statystyczne Oprogramowanie analityczne)Oprogramowanie GraphPadhttps://www.graphpad.com
Inne
35 mm Talerz, nr 1,5 Szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 20 mm, niepowlekanyMatTekP35G-1.5-20-C
(komora środowiskowa)Mikroskophttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiLOprogramowanie doN/A
LIGHTNING Mikroskop konfokalnyLeicaN/A
STELLARIS 8LeicaN/A
https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel Inkubator klatkowy odwrócony Okolab dekonwolucji Leica

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847(2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64(2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260(2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.25 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543(2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961(2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778(2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30(2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie ywych kom rekkwantyfikacja fluorescencjisie mitochondrialnabarwienie TMREfluorescencja MitoSOXmutacja Parkinkontrola jako ci mitochondri w

Powiązane artykuły