Method Article

Pomiary rozpraszania Ramana wzmocnionego powierzchniowo pojedynczej cząsteczki możliwe dzięki nanoantenom origami plazmonicznego DNA

DOI:

10.3791/65310

⸱

July 21st, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, University of Potsdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje pomiary jednocząsteczkowego wzmocnionego powierzchniowo rozpraszania Ramana (SERS) za pomocą nanoanteny DNA origami (DONA) w połączeniu z kolokalizowaną mikroskopią sił atomowych (AFM) i pomiarami Ramana.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powierzchniowo wzmocnione rozpraszanie Ramana (SERS) ma zdolność wykrywania pojedynczych cząsteczek, dla których wymagane jest wysokie wzmocnienie pola. Jednocząsteczkowa (SM) SERS jest w stanie dostarczyć specyficznych dla cząsteczki informacji spektroskopowych o poszczególnych cząsteczkach, a zatem dostarcza bardziej szczegółowych informacji chemicznych niż inne techniki wykrywania SM. Jednocześnie istnieje potencjał do rozwikłania informacji z pomiarów SM, które pozostają ukryte w pomiarach ramanowskich materiałów sypkich. Protokół ten przedstawia pomiary SM SERS przy użyciu nanoanteny DNA origami (DONA) w połączeniu z mikroskopią sił atomowych (AFM) i spektroskopią Ramana. Struktura widelca DNA origami i dwie nanocząstki złota są łączone w celu utworzenia DONA, z przerwą 1,2-2,0 nm między nimi. Pozwala to na nawet 10-krotne wzmocnienie sygnału SERS, umożliwiając pomiary pojedynczych cząsteczek. Protokół dodatkowo demonstruje umieszczenie pojedynczej cząsteczki analitu w gorącym punkcie SERS, proces obrazowania AFM, a następnie nałożenie obrazowania Ramana w celu zmierzenia analitu w pojedynczym DONA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Origami DNA to technika nanotechnologiczna, która polega na składaniu nici DNA w określone kształty i wzory. Możliwość tworzenia struktur z precyzyjną kontrolą w nanoskali jest jedną z kluczowych zalet DNA origami1. Możliwość manipulowania materią na tak małą skalę może zrewolucjonizować szeroki zakres dziedzin, w tym medycynę, elektronikę i materiałoznawstwo2. Na przykład struktury origami DNA zostały wykorzystane do dostarczania leków bezpośrednio do komórek nowotworowych3,4, twórz nanoskalowe czujniki do wykrywania chorób5,6, i twórz skomplikowane wzory na powierzchniach materiałów6,7. Co więcej, możliwość wykorzystania origami DNA do tworzenia złożonych struktur w nanoskali stworzyła nowe możliwości badania podstawowych procesów biologicznych w nanoscale8.

Powierzchniowo wzmocnione rozpraszanie Ramana (SERS) to solidna technika analityczna, która wykrywa i identyfikuje cząsteczki o ekstremalnie niskich stężeniach9. Opiera się na efekcie Ramana, który jest zmianą długości fali rozproszonego światła10. SERS wymaga plazmonicznego podłoża metalowego, aby wzmocnić sygnał Ramana zaadsorbowanych na nim cząsteczek. Wzmocnienie to może być do 1011 razy większe niż sygnał uzyskany z tej samej cząsteczki mierzony konwencjonalną spektroskopią Ramana, co sprawia, że SERS jest bardzo czułą metodą analizy śladowych ilości substancji11.

Wzmocnienie sygnału Ramana nanocząstek wynika głównie ze wzmocnienia elektromagnetycznego opartego na wzbudzeniu zlokalizowanego powierzchniowego rezonansu plazmonowego (LSPR)12. W tym zjawisku elektrony w nanocząstce metalu oscylują kolektywnie wokół powierzchni nanocząstki metalu podczas padania światła. Powoduje to powstanie fali stojącej elektronów znanej jako plazmon powierzchniowy, która może rezonować z padającym światłem. LSPR znacznie wzmacnia pole elektryczne w pobliżu powierzchni cząstki, a absorpcja optyczna cząstki jest maksymalna przy częstotliwości rezonansowej plazmonu. Energia plazmonu powierzchniowego zależy od kształtu i wielkości nanocząstki metalu, a także od właściwości otaczającego ją ośrodka13. Większe wzmocnienie można osiągnąć za pomocą sprzężeń plazmonicznych, na przykład gdy dwie nanocząstki znajdują się blisko siebie w odległości około 2,5 razy większej niż długość średnicy lub mniej14. Bliskość powoduje, że LSPR obu nanocząstek oddziałuje ze sobą, zwiększając pole elektryczne w przerwie między cząstkami o kilka rzędów wielkości, znacznie przewyższając wzmocnienie pojedynczej nanocząstki15,16,17. Wielkość wzmocnienia jest odwrotnie proporcjonalna do odległości między nanocząstkami; wraz ze zmniejszaniem się odległości pojawia się punkt krytyczny, w którym wzmocnienie jest wystarczające do wykrycia pojedynczych cząsteczek (SM)18.

Origami DNA reprezentuje kluczową technologię, która może efektywnie rozmieszczać plazmoniczne nanocząstki w celu wykorzystania i optymalizacji sprzężenia plazmonicznego19. Jednocześnie interesujące cząsteczki można umieścić dokładnie w miejscu, w którym detekcja optyczna jest najbardziej efektywna. Zostało to zademonstrowane za pomocą nanoanten plazmonicznych opartych na origami DNA do wykrywania fluorescencji20. W przeciwieństwie do detekcji etykiet fluorescencyjnych, SERS zapewnia możliwość wykrycia bezpośredniego chemicznego odcisku palca cząsteczki, co sprawia, że jednocząsteczkowy SERS jest bardzo atrakcyjny do wykrywania, a także monitorowania reakcji chemicznych i badań mechanistycznych. Origami DNA może być również używane jako maska do wytwarzania plazmonicznych nanostruktur o dobrze zdefiniowanych kształtach21, chociaż możliwość precyzyjnego umieszczania docelowych cząsteczek w gorącym punkcie jest wtedy tracona.

Korzystając z kolokalizowanej mikroskopii sił atomowych (AFM) i pomiarów Ramana, możemy uzyskać widma Ramana z pojedynczej nanoanteny DNA origami (DONA) i potencjalnie pojedynczej cząsteczki, jeśli umieścimy ją w pozycji o najwyższym wzmocnieniu sygnału. DONA składa się z widelca origami DNA i dwóch precyzyjnie rozmieszczonych nanocząstek, w pełni pokrytych DNA komplementarnym do wydłużonych nici zszywek dołączonych do origami DNA. Po hybrydyzacji DNA nanocząstki są wiązane z widelcem origami DNA z przerwą 1,2-2,0 nm między powierzchniami nanocząstek22. Takie połączenie tworzy gorący punkt pomiędzy nanocząstkami o wzmocnieniu sygnału do 1011-krotnym, zgodnie z obliczeniami z symulacji w dziedzinie czasu skończonej różnicy (FDTD)22, umożliwiając w ten sposób pomiary SM SERS. Jednak objętość najwyższego wzmocnienia jest niewielka (w zakresie 1-10nm3), w związku z czym cząsteczki docelowe muszą być precyzyjnie umieszczone w tym gorącym punkcie. Widelec origami DNA umożliwia umieszczenie pojedynczej cząsteczki między dwiema nanocząstkami za pomocą mostka widelca DNA i odpowiedniej chemii sprzęgającej. Niemniej jednak, obserwacja takich SM w widmach Ramana jest bardzo trudna22. Alternatywnie, nanocząstki mogą być w pełni pokryte cząsteczką docelową, taką jak barwnik TAMRA, aby umożliwić pojedyncze pomiary DONA o wyższej intensywności SERS21. W tym przypadku TAMRA jest kowalencyjnie przyłączona do nici powlekającej DNA (Ryc. 1).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zespół widelca DNA origami

  1. Samodzielnie złóż strukturę origami DNA w jednym garnku. Najpierw dodaj 2,5 nM okrągłej nici rusztowania M13mp18 (7,249 nukleotydów, patrz tabela materiałów) i 100 nM 201 krótkich oligonukleotydów (tabela 1) w 1x TAE (tris[hydroksymetylo]aminometan [tris], kwas octowy, kwas etylenodiaminowy octowy [EDTA]) uzupełniony 15 mM buforem MgCl2. Następnie dostosuj całkowitą objętość do 100 μl za pomocą ultraczystej wody.
  2. Następnie wyżarzać roztwór za pomocą gradientu temperatury w termocyklerze, najpierw przez szybkie podgrzanie do 80 °C, następnie przez schłodzenie z 80 °C do 20 °C przy 1 °C/12 min, następnie z 20 °C do 16 °C przy 1 °C/6 min, a następnie przez szybkie schłodzenie z 16 °C do 8 °C.
  3. Użyj filtrów Amicon 100 kDa z odcięciem masy cząsteczkowej (MWCO) (patrz tabela materiałów), aby oczyścić mieszaninę z nadmiaru zszywek.
    1. Dodać 100 μl roztworu origami DNA do filtrów Amicon, a także 400 μl ultraczystej wody, a następnie odwirować przy 6 000 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Wyrzuć filtrat, wyjmując filtr i obracając rurkę, aby usunąć wypłukanie ze zlewu, a następnie dodaj 400 μl ultraczystej wody do filtra i ponownie odwiruj. Powtórz ten krok jeszcze raz.
    3. Aby zebrać oczyszczony roztwór nanostruktury, odwróć filtr do góry nogami w nowej probówce i odwiruj (1 000 x g, 2 min, RT) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Roztwór ten można przechowywać w lodówce w temperaturze 8 °C do 2 tygodni.
      UWAGA: Do etapu oczyszczania filtra Amicon należy użyć 1x buforu TAE lub 1x TAE uzupełnionego buforem 15 mM MgCl2 zamiast ultraczystej wody, ponieważ woda zmniejsza stabilność i obniża stężenie uzyskanych widelców origami DNA. W przypadku pomiaru pojedynczej cząsteczki barwnika, mieszaninę nici zszywkowej DNA zastępuje się zmodyfikowaną mieszaniną nici zawierającą barwnik TAMRA na końcu 5'. To zmodyfikowane pasmo znajduje się w środku mostka nanowidelcowego (tabela 2).

2. Powłoka z nanocząsteczek złota (AuNP)

UWAGA: Zmodyfikowana wersja protokołu Liu et al.23 została użyta do pokrycia AuNPs, a proces powlekania polegał na zamrożeniu roztworu AuNP-DNA.

  1. Odwirować (3 500 x g, 5 min, RT) 400 μl roztworu AuNP o średnicy 60 nm (otrzymanego w handlu; patrz tabela materiałów) i za pomocą pipety usunąć supernatant. Następnie rozpuść granulkę w 25 μl ultraczystej wody. Końcowe stężenie AuNPs wynosi ~0,3 nM.
  2. Dodać 1 μl 100 mM roztworu tris-(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) do 4 μl DNA modyfikowanego tiolem (100 μM dostarczonego przez producenta; patrz tabela materiałów) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Po inkubacji dodać mieszaninę 5 μl do stężonego roztworu AuNP (etap 2.1), wirować przez 5 s i zamrażać przez co najmniej 2 godziny w temperaturze -20 °C.
  4. Po rozmrożeniu w temperaturze pokojowej należy odwirować mieszaninę (3 500 x g, 5 min, RT) w celu usunięcia nadmiernie dodanego DNA powlekającego. Za pomocą pipety usunąć supernatant i ponownie rozpuścić osad w 10 μl wody.
    UWAGA: Na nanowidelcu znajdują się dwie nitki powłoki dla każdego z AuNP (Tabela 2). Kroki są takie same, z wyjątkiem sekwencji nici powlekającej DNA. Po pokryciu cząstki są bardzo stabilne; Mogą pozostać w takim stanie, w jakim są, przez wiele miesięcy w lodówce, a nawet można je zamrozić. W przypadku w pełni powlekanych AuNPs, powlekające nici DNA mają wewnętrzny barwnik TAMRA.

3. Montaż DONA

  1. Dodać powlekany roztwór AuNP do roztworu nanowidelców o stosunku molowym o stężeniu 1,5:1.
  2. Dodać MgCl2 do końcowego stężenia 4 mM za pomocą 50 mM roztworu podstawowego MgCl2. Dostosuj końcową objętość do 20 μl za pomocą ultraczystej wody.
  3. Hybrydyzuj DONA za pomocą gradientu temperatury w termocyklerze. Najpierw szybko podgrzać do 40 °C, następnie schłodzić z 40 °C do 20 °C w temperaturze 1 °C/10 min, a następnie szybko schłodzić z 20 °C do 8 °C.

4. Elektroforeza żelowa

UWAGA: Niezwiązane nanocząstki w roztworze DONA są usuwane przez elektroforezę w żelu agarozowym.

  1. Przygotuj 1% żel agarozowy. W tym celu rozpuść 0,8 g agarozy w 80 ml 1x TAE uzupełnionego 5 mM MgCl2.
  2. Dodać 2,25 μl buforu ładującego (30% glicerolu, 13 mM MgCl2; patrz Tabela Materiałów) do 18 μl roztworu DONA, aby osiągnąć końcowe stężenie 5 mM MgCl2 z 4 mM w kroku 3.2. Bufor załadowczy zapewnia również, że próbka pozostaje w kieszeni żelu.
  3. Uruchom żel na 60 minut przy napięciu 70 V w lodowatej kąpieli wodnej. Bieżący bufor to 1x TAE uzupełniony o 5 mM MgCl2.
  4. Wytnij interesującą nas opaskę i umieść ją na szkiełku mikroskopowym owiniętym folią parafinową z tworzywa sztucznego, a następnie wyciśnij roztwór za pomocą drugiego szkiełka mikroskopowego owiniętego folią parafinową z tworzywa sztucznego. Za pomocą pipety zebrać wyciśnięty płyn do probówki o pojemności 500 μl.

5. Kolokalizacja pomiarów AFM i Ramana

  1. Plazmę poddaje się obróbce chipa krzemowego (patrz tabela materiałów) przez 10 minut, a następnie inkubuje 10 μl oczyszczonego roztworu DONA plus 10 μl 100 mM MgCl2 na chipie przez 3 godziny. Następnie umyj frytki dwa razy mieszaniną 1:1 (objętościowo) etanolu i wody i wysusz sprężonym powietrzem. Następnie przyklej chip do dysku magnetycznego i włóż go do instrumentu w celu obrazowania.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem pomiarów pozycja lasera wzbudzenia Ramana jest dostosowywana tak, aby znajdowała się na górze końcówki sondy AFM. W niniejszej pracy zastosowano mikroskop ramanowski HORIBA LabRAM HR Evolution sprzężony z HORIBA Omegascope AFM. Urządzenie jest sterowane za pomocą oprogramowania LabSpec i AIST.
  2. Do pomiaru AFM należy użyć trybu stukania (tryb AC) z ACCESS-NC-A (częstotliwość rezonansowa: 300 kHz; stała sprężystości: 45 N/m) tips24. Tryb AC automatycznie steruje wszystkimi parametrami z wyjątkiem częstotliwości skanowania, która jest ustawiona na 1 Hz.
    UWAGA: Po obrazowaniu AFM końcówka AFM jest wycofywana, aby nie znajdowała się na drodze lasera Ramana. Odbywa się to za pomocą funkcji makra "Probe away", zaprogramowanej w systemie. W ten sposób dla dowolnie wybranego punktu na obrazie AFM laser będzie w tej samej pozycji bez przesunięcia w stosunku do AFM.
  3. Wybierz żądaną długość fali lasera, moc i czas akumulacji dla pomiarów Ramana, ponieważ wszystkie te parametry zależą od mierzonej próbki.
    1. Do pomiaru AuNP w pełni pokrytego TAMRA można użyć wymienionych parametrów: laser 633 nm, moc 100 μW i czas integracji 1 s.
    2. Użyj wymienionych parametrów dla pojedynczego pomiaru TAMRA: laser 633 nm, moc 400 μW i czas integracji 4 s.
  4. Po dostosowaniu parametrów umieść kursor na żądanym DONA na obrazie AFM; robi to funkcja "przesuń kursor" w oprogramowaniu. Następnie rozpocznij pomiar Ramana.
    UWAGA: Istnieją różne tryby pozyskiwania widm: pomiar jednopunktowy - jednowymiarowe mapowanie czasu - gdzie pojedynczy punkt jest mierzony w czasie25; oraz dwuwymiarowe mapowanie obszaru XY, w którym zmotoryzowany stopień jest przesuwany pod laserem w celu uzyskania widm z tablicy punktów w siatce XY26.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem, należy upewnić się, że widelec origami DNA jest prawidłowo złożony; preferowaną metodą badania struktury widelców jest obrazowanie AFM. Oczekuje się, że większość widelców będzie solidna, bez złamanych ramion. Z drugiej strony mostek między ramionami jest trudny do zobrazowania ze względu na jego małą średnicę i dużą elastyczność; wymaga również bardzo ostrej końcówki AFM (Rysunek 2).

Zmiana koloru roztworu na każdym etapie procesu powlekania AuNP wskazuje, że wszystko działa poprawnie. Kolor zaczyna się ciemnoczerwony tylko od AuNPs, ale gdy tylko DNA zostanie dodane, zmienia się na ciemnofioletowoczerwony. Zamrożenie zmienia kolor na fioletowy, a po rozmrożeniu przywraca go do głębokiej czerwieni (Rysunek 3A). Rysunek 3B przedstawia widma absorbancji gołych AuNP i AuNP pokrytych DNA.

Potem, na etapach montażu DONA, kolor pozostaje głęboki czerwony przez cały proces. Podczas oczyszczania w żelu agarozowym pasmo dimerów pojawia się nad wolnym pasmem AuNP, najszybciej działającym pasmem w próbce. To pasmo dimerów odpowiada DONA, a następnie jest wycinane i ściskane w celu ekstrakcji próbki ( Rysunek 4).

Na koniec, dla pomiarów kolokalizacji, obrazowanie AFM próbki jest wykonywane w poszukiwaniu DONA (Rysunek 5). Następnie zbierane są widma Ramana z pojedynczych DONA i porównywane w celu upewnienia się, że uzyskane widma pochodzą z cząsteczek TAMRA (Rysunek 6).

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie widelca origami DNA i w pełni zmontowanego DONA. (A) Wymiary widelca origami DNA z mostkiem o długości 90 nukleotydów. (B) Schematyczny widok z boku zmontowanego DONA, z dwoma AuNP i widelcem origami DNA pomiędzy nimi. (C) Schematyczny widok z góry zmontowanego DONA pokazujący położenie SM w środku mostu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Obraz AFM widelców DNA origami po złożeniu. Widelce są dobrze uformowane, a w niektórych widłach widoczny jest most. Widelce mają wysokość od 1,5 do 2 nm. Podziałka = 500 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Rozwój koloru i widma absorbancji AuNPs. (A) Probówki pokazujące kolor roztworu AuNP w różnych krokach. (1) Głęboki czerwony kolor gołego roztworu AuNP. (2) Ciemnopurpurowo-czerwony po dodaniu DNA powlekającego do AuNPs. (3) Kolor fioletowy po zamrożeniu mieszaniny powlekanej DNA-AuNP. (4) Kolor powraca do głębokiej czerwieni po rozmrożeniu mieszanki. (B) Widma absorbancji AuNP 60 nm, pokazujące przesunięcie piku absorbancji od gołych AuNP (rura 1) do AuNP pokrytych DNA (rura 4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Żel agarozowy roztworu DONA. Oba pasy mają tę samą próbkę, a zarówno pasmo dimerów (DONA), jak i wolne pasmo AuNP są wyraźnie widoczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Obraz AFM DONAs. (A) Obraz pokazuje wiele struktur DONA; ten obraz AFM jest używany do pomiarów kolokalizacji. (B) Powiększony obraz zakreślonego DONA i pionowego przekroju DONA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Widma SERS DONA wyposażone w pełni pokryte AuNP TAMRA i pojedynczą cząsteczkę TAMRA. Pionowe linie siatki wskazują główne szczyty TAMRA. Główne piki TAMRA są widoczne w całkowicie pokrytym TAMRA AuNP. Chociaż stosunek sygnału do szumu dla widm SM TAMRA jest niższy, główne piki są rozpoznawalne: 1 360 cm-1: rozciąganie C-C; 1,509 cm-1: rozciąganie C=C; 1,536 cm-1: C=C rozciąganie; 1,654 cm-1: rozciąganie C=O. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Lista zszywek do widelca origami DNA. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Lista zmodyfikowanych nici DNA. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SM SERS to potężne narzędzie, które pozwala naukowcom badać zachowanie i interakcje poszczególnych cząsteczek w próbce1. Taka technika pozwala na analizę układów na niespotykanym dotąd poziomie czułości, dostarczając nowych informacji na temat podstawowego zachowania pojedynczych cząsteczek oraz rozkładu właściwości chemicznych lub fizycznych w zespole cząsteczek, a także pomaga zidentyfikować odpowiednie produkty pośrednie w procesach chemicznych. Jednak umieszczenie pojedynczej cząsteczki w gorącym punkcie, przy jednoczesnym upewnieniu się, że gorący punkt ma wystarczające wzmocnienie powierzchni, może byćdość trudne. Opisane DONA w tym protokole mogą precyzyjnie umieścić pojedynczą cząsteczkę w gorącym punkcie między dwiema nanocząstkami złota, zapewniając jednocześnie osiągnięcie 10-11-krotnego zwiększenia powierzchni.

Przerwa między nanocząstkami ma kluczowe znaczenie dla montażu DONA, aby osiągnąć wymagane wzmocnienie powierzchni dla badań SM SERS. DONA są zoptymalizowane pod kątem sferycznych nanocząstek o rozmiarach od 60 do 80 nm. Co więcej, jakość nanocząstek może znacząco wpłynąć na hybrydyzację nanocząstek z widelcami origami DNA; Gdy nanocząstki używane na etapie powlekania są starsze niż 6 miesięcy, efektywność hybrydyzacji zaczyna spadać.

Innym krytycznym aspektem protokołu jest to, że kroki, które wymagają dokładnego stosunku między komponentami, muszą być dokładnie wykonane, w przeciwnym razie DONA nie zostaną prawidłowo utworzone. Widelec origami DNA jest niezwykle wrażliwy na protokół narastania temperatury, a zmiany wpływają na integralność struktury lub zapobiegają tworzeniu się widelców.

Wytwarzanie węgla amorficznego jest istotnym problemem podczas pomiarów SER, ponieważ jego piki zwykle mieszczą się w tym samym zakresie, co obszar odcisków palców dla wielu cząsteczek (1200-1700 cm-1). Chociaż formacja ta nie jest jeszcze w pełni poznana, zwykle wiąże się z dużą mocą lasera lub długim czasem integracji28. Na wszelki wypadek należy stosować najniższą moc lasera i możliwie najkrótszy czas integracji. Nie jest to jednak łatwe do osiągnięcia, ponieważ należy osiągnąć równowagę między uzyskaniem pożądanego sygnału SERS a uniknięciem wytwarzania amorficznego węgla.

DONA są bardzo wszechstronne jako system SM pod względem różnych typów i kształtów nanocząstek, które mogą być użyte, takich jak srebrne kule, złote kwiaty lub gwiazdy. Dodatkowo, badaną cząsteczkę można łatwo zastąpić, zmieniając tylko nić DNA w środku mostu, bez żadnych zmian w procedurze. Przejście na białka takie jak cytochrom C można przeprowadzić poprzez umieszczenie w mostku nici wychwytującej DNA zmodyfikowanej pirydyną, która związałaby cytochrom C i zapewniłaby, że znajduje się on w gorącym miejscu dla pomiarów SM SERS22. Przekłada się to również na elastyczny wybór lasera do naświetlania, potencjalnie przy użyciu lasera, który daje maksymalne wzmocnienie.

Podsumowując, metoda ta jest niezawodna w łączeniu struktur DONA i wykorzystywaniu ich do pomiarów spektroskopii Ramana wzmocnionych powierzchniowo pojedynczych cząsteczek.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC; grant konsolidacyjny nr 772752).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Filtry 100 kDa MWCO Amicon, 0,5 mlMerckUFC5100BK
10x bufor TAE (0,4 M Tris, 0,2 M kwas octowy, 0,01 M EDTA)SIGMA AldrichT9650
60 nm goldspheres, gołe (cytrynian)NanoComposixAUCN60
ACCESS-NC-A Sondy AFMSCHÄFER-TEC
Agaroza w proszkuSIGMA Aldrich9012-36-6
Nici powlekające DNA AuNP Nici powlekająceAuNP
(TAMRA)SIGMA Aldrich
GlycerolSIGMA Aldrich56-81-5
Wirówka Heraeus Fresco 17Thermo Fisher Scientific
HORIBA OmegaScope z LabRAM HR evolutionHORIBA
Chlorek magnezuSIGMA Aldrich7786-30-3
Nić mostkowa DNA Nanofork (TAMRA)Nici
NanoforkSIGMA Aldrich
ParafilmMCarl RothCNP8.1
Primus 25 ThermocyclerPeqlab/VWR
Wafelkrzemowy Siegertwafel BW14076
Rusztowanie jednoniciowe DNA, typ p7249 (M13mp18)Tilibit nanosystems
TCEP solutionSIGMA Aldrich51805-45-9
DNA zszywkowe DNA Metabion

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heck, C., Kanehira, Y., Kneipp, J., Bald, I. Placement of single proteins within the SERS hot spots of self-assembled silver nanolenses. Angewandte Chemie. 57 (25), 7444-7447 (2018).
  2. Dey, S., et al. DNA origami. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 13(2021).
  3. Tasciotti, E. Smart cancer therapy with DNA origami. Nature Biotechnology. 36 (3), 234-235 (2018).
  4. Ijäs, H., et al. Unraveling the interaction between doxorubicin and DNA origami nanostructures for customizable chemotherapeutic drug release. Nucleic Acids Research. 49 (6), 3048-3062 (2021).
  5. Wang, S., et al. DNA origami-enabled biosensors. Sensors. 20 (23), 6899(2020).
  6. Kabusure, K. M., et al. Optical characterization of DNA origami-shaped silver nanoparticles created through biotemplated lithography. Nanoscale. 14 (27), 9648-9654 (2022).
  7. Kershner, R. J., et al. Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces. Nature Nanotechnology. 4 (9), 557-561 (2009).
  8. Dutta, A., et al. Molecular states and spin crossover of hemin studied by DNA origami enabled single-molecule surface-enhanced Raman scattering. Nanoscale. 14 (44), 16467-16478 (2022).
  9. Langer, J., et al. Present and future of surface-enhanced Raman scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
  10. Jones, R. R., Hooper, D. C., Zhang, L., Wolverson, D., Valev, V. K. Raman techniques: fundamentals and frontiers. Nanoscale Research Letters. 14 (1), 231(2019).
  11. Blackie, E. J., Le Ru, E. C., Etchegoin, P. G. Single-molecule surface-enhanced Raman spectroscopy of nonresonant molecules. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14466-14472 (2009).
  12. Sepúlveda, B., Angelomé, P. C., Lechuga, L. M., Liz-Marzán, L. M. LSPR-based nanobiosensors. Nano Today. 4 (3), 244-251 (2009).
  13. Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The optical properties of metal nanoparticles: The influence of size, shape, and dielectric environment. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).
  14. Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon coupling of gold nanorods at short distances and in different geometries. Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).
  15. Niu, R., et al. DNA origami-based nanoprinting for the assembly of plasmonic nanostructures with single-molecule surface-enhanced Raman scattering. Angewandte Chemie. 60 (21), 11695-11701 (2021).
  16. Fang, W., et al. Quantizing single-molecule surface-enhanced Raman scattering with DNA origami metamolecules. Science Advances. 5 (9), (2019).
  17. Zhan, P., et al. DNA origami directed assembly of gold bowtie nanoantennas for single-molecule surface-enhanced Raman scattering. Angewandte Chemie. 57 (11), 2846-2850 (2018).
  18. Choi, H. K., et al. Single-molecule surface-enhanced Raman scattering as a probe of single-molecule surface reactions: promises and current challenges. Accounts of Chemical Research. 52 (11), 3008-3017 (2019).
  19. Liu, N., Liedl, T. DNA-assembled advanced plasmonic architectures. Chemical Reviews. 118 (6), 3032-3053 (2018).
  20. Acuna, G. P., et al. Fluorescence enhancement at docking sites of DNA-directed self-assembled nanoantennas. Science. 338 (6106), 506-510 (2012).
  21. Shen, B., Kostiainen, M. A., Linko, V. DNA origami nanophotonics and plasmonics at interfaces. Langmuir. 34 (49), 14911-14920 (2018).
  22. Tapio, K., et al. A versatile DNA origami-based plasmonic nanoantenna for label-free single-molecule surface-enhanced Raman spectroscopy. ACS Nano. 15 (4), 7065-7077 (2021).
  23. Liu, B., Liu, J. Freezing-driven DNA adsorption on gold nanoparticles: tolerating extremely low salt concentration but requiring high DNA concentration. Langmuir. 35 (19), 6476-6482 (2019).
  24. Aliano, A., et al. AFM, tapping mode. Encyclopedia of Nanotechnology. , 99(2012).
  25. Recording Raman spectral images and profiles. Horiba Scientific. , Available from: https://www.horiba.com/int/scientific/technologies/raman-imaging-and-spcetroscopy/recording-spectral-images-and=profiles/ (2023).
  26. Raman Images Explained. Renishaw. , Available from: https://www.renishaw.com/en/raman-images-explained-25810 (2023).
  27. Kogikoski, S., Tapio, K., von Zander, R. E., Saalfrank, P., Bald, I. Raman enhancement of nanoparticle dimers self-assembled using DNA origami nanotriangles. Molecules. 26 (6), 1684(2021).
  28. Heck, C., Kanehira, Y., Kneipp, J., Bald, I. Amorphous carbon generation as a photocatalytic reaction on DNA-assembled gold and silver nanostructures. Molecules. 24 (12), 2324(2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule SERSSurface Enhanced RamanDNA Origami NanoantennasPlasmonic NanoantennasAtomic Force MicroscopyRaman SpectroscopyGold NanoparticlesSERS HotspotDNA Origami AssemblyGel Purification

Related Articles