Artykuł metodologiczny

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

DOI:

10.3791/65311

⸱

2 czerwca 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce to metoda badania ruchów domen białek w czasie rzeczywistym. Modyfikacja tej techniki pod kątem jej zastosowania w komórkach natywnych umożliwia teraz wykrywanie i śledzenie ruchów pojedynczego czujnika napięcia z bramkowanych napięciem kanałów Ca2+ w mysich izolowanych włóknach mięśni szkieletowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce była techniką z wyboru do badania zależności struktura-funkcja wielu białek błonowych, w tym kanałów jonowych bramkowanych napięciem. Podejście to było stosowane głównie w heterologicznych systemach ekspresyjnych do jednoczesnego pomiaru prądów błonowych, elektrycznej manifestacji aktywności kanałów i pomiarów fluorescencji, raportujących lokalne rearanżacje domen. Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce łączy elektrofizjologię, biologię molekularną, chemię i fluorescencję w jedną szeroko zakrojoną technikę, która umożliwia badanie przegrupowań strukturalnych i funkcji w czasie rzeczywistym odpowiednio za pomocą fluorescencji i elektrofizjologii. Zazwyczaj takie podejście wymaga zaprojektowanego kanału membranowego bramkowanego napięciem, który zawiera cysteinę, którą można przetestować za pomocą tiolowo-reaktywnego barwnika fluorescencyjnego. Do niedawna chemia tiolowo-reaktywna stosowana do fluorescencyjnego znakowania białek była przeprowadzana wyłącznie w oocytach i liniach komórkowych Xenopus, co ograniczało zakres podejścia do pierwotnych komórek niepobudliwych. W niniejszym raporcie opisano zastosowanie funkcjonalnej fluorometrii ukierunkowanej na miejsce w dorosłych komórkach mięśni szkieletowych do badania wczesnych etapów sprzężenia pobudzenie-skurcz, procesu, w którym depolaryzacja elektryczna włókien mięśniowych jest powiązana z aktywacją skurczu mięśni. Niniejszy protokół opisuje metodologie projektowania i transfekcji kanałów Ca2 + bramkowanych napięciem za pomocą cysteiny (CaV1.1) do włókien mięśniowych zginacza palca brevis dorosłych myszy przy użyciu elektroporacji in vivo oraz kolejne kroki wymagane do funkcjonalnych pomiarów fluorometrii skierowanej w miejsce. Podejście to można zaadaptować do badania innych kanałów jonowych i białek. Zastosowanie funkcjonalnej fluorometrii mięśni ssaków jest szczególnie istotne dla badania podstawowych mechanizmów pobudliwości.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość śledzenia reorganizacji konformacyjnych kanałów jonowych w odpowiedzi na znany bodziec elektryczny w żywej komórce jest źródłem cennych informacji dla fizjologii molekularnej1. Kanały jonowe bramkowane napięciem to białka błonowe, które wyczuwają zmiany napięcia transbłonowego, a na ich funkcję wpływają również zmiany napięcia2. Rozwój technik cęgów napięcia w ubiegłym stuleciu pozwolił fizjologom badać w czasie rzeczywistym prądy jonowe przenoszone przez kanały jonowe bramkowane napięciem w odpowiedzi na depolaryzację membrany3. Zastosowanie technologii cęgów napięciowych miało kluczowe znaczenie dla zrozumienia właściwości elektrycznych komórek pobudliwych, takich jak neurony i mięśnie. W latach siedemdziesiątych XX wieku udoskonalenie cęgów napięciowych pozwoliło na wykrycie prądów bramkujących (lub ruchu ładunku) w kanałach wapniowych (CaV) i sodowych (NaV) bramkowanych napięciem4,5. Prądy bramkowania to nieliniowe prądy pojemnościowe, które powstają w wyniku ruchu czujników napięcia w odpowiedzi na zmiany pola elektrycznego przez błonę komórkową6. Prądy bramkowania są uważane za elektryczną manifestację przegrupowań molekularnych, które poprzedzają lub towarzyszą otwarciu kanału jonowego7. Podczas gdy te pomiary prądu dostarczają cennych informacji na temat funkcji kanału, zarówno prądy jonowe, jak i prądy bramkowania są pośrednimi odczytami między- i wewnątrzcząsteczkowych rearanżacji konformacyjnych kanałów bramkowanych napięciem7.

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce (FSDF; określana również jako fluorometria zacisków napięcia, VCF) została opracowana na początku lat 90. < klasa sup="xref">8 i po raz pierwszy zapewniła możliwość bezpośredniego podglądu lokalnych zmian konformacyjnych i funkcji białka kanałowego w czasie rzeczywistym. Korzystając z kombinacji mutagenezy kanałowej, elektrofizjologii i heterologicznych systemów ekspresji, możliwe jest fluorescencyjne znakowanie i śledzenie ruchomych części określonych kanałów lub receptorów w odpowiedzi na bodziec aktywujący9,10. Podejście to jest szeroko stosowane do badania mechanizmów wykrywania napięcia w kanałach jonowych bramkowanych napięciem8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Aby uzyskać wiarygodne recenzje, zobacz10,20,21,22,23.

Kanały CaV i NaV, kluczowe dla inicjacji i propagacji sygnałów elektrycznych, składają się z głównej podjednostki α1, która posiada centralny por i cztery nieidentyczne domeny wykrywania napięcia2. Oprócz ich odrębnej struktury podstawowej, kanały CaV i NaV są wyrażone jako kompleksy wielopodjednostkowe z podjednostkami pomocniczymi24. Kanały potasowe zależne od napięcia (KV) składają się z czterech podjednostek, które wyglądają jak pojedyncza domena NaV lub CaV25. Tworząca pory i wykrywająca napięcie podjednostka α1 kanałów CaV i NaV jest tworzona przez pojedynczy polipeptyd kodujący cztery indywidualne domeny sześciu unikalnych segmentów transbłonowych (S1-S6; Rysunek 1A)24,26. Obszar składający się z segmentów transbłonowych S1 do S4 tworzy domenę wykrywania napięcia (VSD), a segmenty transbłonowe S5 i S6 tworzą domenę porów26. W każdym VSD α-helisa S4 zawiera dodatnio naładowaną argininę lub lizynę ( Rysunek 1A,B), które poruszają się w odpowiedzi na depolaryzację błony7. Kilka dekad badań i wyniki bardzo zróżnicowanych podejść eksperymentalnych wspierają założenie, że segmenty S4 poruszają się na zewnątrz, generując prądy bramkowania, w odpowiedzi na depolaryzację błony6.

FSDF mierzy zmiany fluorescencji barwnika reagującego tiolem sprzężonego z określoną resztą cysteiny (tj. α-helisą S4) na kanale jonowym lub innym białku, zaprojektowanym za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, ponieważ kanał działa w odpowiedzi na depolaryzację błony lub inne bodźce10. W rzeczywistości FSDF został pierwotnie opracowany w celu zbadania, czy segment S4 w kanałach KV, zaproponowany jako główny czujnik napięcia kanału, porusza się, gdy ładunki bramkowania poruszają się w odpowiedzi na zmiany potencjału błony8,10. W przypadku kanałów jonowych bramkowanych napięciem, FSDF może rozwiązać niezależne rearanżacje konformacyjne czterech VSD (śledząc jeden VSD w danym momencie), jednocześnie z pomiarami funkcji kanału. Rzeczywiście, stosując to podejście, wykazano, że poszczególne VSD wydają się być w różny sposób zaangażowane w określone aspekty aktywacji i dezaktywacji kanałów12,27,28,29,30. Określenie udziału każdego VSD w funkcjonowaniu kanałów ma duże znaczenie i może być wykorzystane do dalszego wyjaśnienia działania kanału i potencjalnej identyfikacji nowych celów dla rozwoju leków.

Użycie FSDF w heterologicznych systemach ekspresji było niezwykle pomocne w pogłębianiu naszego zrozumienia funkcji kanału z perspektywy redukcjonistycznej10,23. Podobnie jak wiele podejść redukcjonistycznych, ma ono zalety, ale ma również ograniczenia. Na przykład jednym z głównych ograniczeń jest częściowa rekonstrukcja nanośrodowiska kanału w układzie heterologicznym. Często kanały jonowe oddziałują z licznymi podjednostkami pomocniczymi i wieloma innymi białkami, które modyfikują ich funkcję31. Zasadniczo, różne kanały i ich podjednostki pomocnicze mogą być wyrażane w układach heterologicznych za pomocą wielu konstruktów kodujących białka lub plazmidów policistronicznych, ale ich natywne środowisko nie może być w pełni odtworzone30,32.

Nasza grupa niedawno opublikowała wariant FSDF w natywnych zdysocjowanych włóknach mięśni szkieletowych do badania wczesnych etapów sprzężenia pobudzenie-skurcz (ECC)33,34, proces, w którym depolaryzacja elektryczna włókien mięśniowych jest powiązana z aktywacją skurczu mięśni35,36. Po raz pierwszy podejście to pozwoliło na śledzenie ruchu poszczególnych czujników napięcia S4 z bramkowanego napięciem kanału Ca2+ typu L (CaV1.1, znanego również jako DHPR) w natywnym środowisku dorosłego zróżnicowanego włókna mięśniowego37. Osiągnięto to, biorąc pod uwagę wiele cech tego typu komórek, w tym aktywność elektryczną komórki umożliwiającą szybką samopropagującą się depolaryzację wywołaną stymulacją, zdolność do ekspresji plazmidu cDNA poprzez elektroporację in vivo, naturalną wysoką ekspresję i organizację kompartmentów kanałów w komórce oraz jego kompatybilność z szybkimi urządzeniami do obrazowania i rejestracji elektrofizjologicznej. Wcześniej używaliśmy szybkiego liniowego skaningowego mikroskopu konfokalnego jako urządzenia wykrywającego37. Teraz przedstawiono odmianę tej techniki wykorzystującą fotodiodę do akwizycji sygnału. Ten oparty na fotodiodach system detekcji może ułatwić wdrożenie tej techniki w innych laboratoriach.

Tutaj opisany jest krok po kroku protokół do wykorzystania FSDF w natywnych komórkach do badania ruchu poszczególnych czujników napięcia z CaV1.1. Podczas gdy kanał CaV1.1 został użyty jako przykład w całym tym manuskrypcie, technika ta może być zastosowana do zewnątrzkomórkowych domen innych kanałów jonowych, receptorów lub białek powierzchniowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Maryland. Poniższy protokół został podzielony na wiele podsekcji, składających się z (1) projektowania konstruktu molekularnego i selekcji barwnika reagującego na cysteinę, (2) elektroporacji in vivo, (3) rozwarstwienia mięśni i izolacji włókien, (4) opisu konfiguracji akwizycji, (5) oceny zwiększonej aktywności elektrycznej włókien dodatnich włókien białka zielonej fluorescencji (EGFP) i barwienia cysteiną oraz (6) akwizycji i przetwarzania sygnału. Dodatkowo, na początku każdej sekcji, szczegółowo opisano kilka istotnych kwestii dotyczących stosowania FSDF we włóknie mięśni szkieletowych. Wszystkie sekcje protokołu powinny być wykonywane przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej, w tym fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.

1. Projekt konstruktu molekularnego i wybór barwnika reagującego na cysteinę

  1. Projekt konstrukcji jest kluczowym elementem sukcesu eksperymentu. Najpierw wygeneruj dziki, fluorescencyjnie znakowany konstrukt cDNA CaV1.1 i oceń jego ekspresję w odpowiednim typie komórki. W przypadku włókien mięśniowych dużą skuteczność transfekcji można osiągnąć poprzez zastosowanie plazmidu przenoszącego promotor wirusa cytomegalii (CMV). W tym protokole użyto już scharakteryzowanego plazmidu królika EGFP-CaV1.138.
    UWAGA: Podczas projektowania konstruktu cDNA w celu wprowadzenia reszty cysteiny do kanału jonowego bramkowanego napięciem, pozycja cysteiny jest krytyczna i powinna być dokładnie rozważona. Cysteina powinna być dostępna z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, aby umożliwić reakcję barwnika sprzężonego z tiolem (Rysunek 1C, D) i powinna znajdować się proksymalnie do obszaru S4, aby precyzyjnie śledzić jego ruch w odpowiedzi na depolaryzację. Jednak, aby umożliwić wygaszanie fluorescencji barwnika w odpowiedzi na ruch białka, wprowadzony fluorofor sprzężony z cysteiną powinien znajdować się na styku dwóch różnych środowisk (np. błony i płynu zewnątrzkomórkowego; Rysunek 1E). Ponadto bardzo ważne jest, aby upewnić się, że wprowadzona cysteina nie zakłóca funkcji białka.
  2. Aby uzyskać wyobrażenie o prawidłowej lokalizacji cysteiny, zbierz informacje na temat struktury kanału lub z innych eksperymentów fluorometrycznych innych powiązanych białek kanałowych. W celu zaprojektowania konstruktów CaV1.1 zaprojektowanych przez cysteinę, oceń strukturę mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) w rozdzielczości channel26 i porównaj insercję cysteiny w poprzednich pracach z powiązanych kanałów, takich jak CaV1.212, lub innych kanałów, takich jak Shaker11 i NaChBac39.
  3. Po wybraniu właściwej pozycji cysteiny użyj komercyjnego zestawu do mutagenezy skierowanej do miejsca, aby wprowadzić substytucje cysteiny. W niniejszym protokole następujące modyfikacje cystein zostały niezależnie zaprojektowane na każdym cytozolowym końcu segmentu S4 wykrywającego napięcie CaV1.1: VSD-I (L159C), VSD-II (L522C), VSD-III (V893C), VSD-IV (S1231C) i UniProtKB: P07293 (Rysunek 1B).
  4. Do włókien mięśni szkieletowych należy zastosować metanatosulfonian 5-karboksytetrametylodaminy (MTS-5-TAMRA), który wykazuje prawidłową i szybką dyfuzję do układu błony kanalików poprzecznych, który jest wgłębieniem błony powierzchniowej i dominującym położeniem kanałów CaV1,1. MTS-5-TAMRA wykazuje spadek fluorescencji podczas przejścia z błony lipidowej do środowiska wodnego (Rysunek 1E).
    UWAGA: Pochodne Dylight lub Alexa-maleimidu plamią błonę powierzchniową, ale nie system kanalików poprzecznych.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat reakcji tiol-cysteina na granicy faz transbłonowej α-helisy. (A) Topologia membrany CaV1.1 typu L. Znaki plus reprezentują podstawowe reszty w α-helisie S4, a pomarańczowe gwiazdy wskazują miejsce, w którym cysteina została wprowadzona poprzez mutagenezę ukierunkowaną. (B) Wyrównanie sekwencji S4I do S4IV królika CaV1.1 (UniProtKB: P07293). Dodatnio naładowane reszty argininy i lizyny krytyczne dla wykrywania napięcia są podświetlone na czerwono, podczas gdy zmodyfikowane substytucje cysteiny są oznaczone na pomarańczowo. Ten panel został zaadaptowany z reference37. (C) Reakcja cząsteczek fluorescencyjnych cysteiny-tiolu. (D) Schemat ilustrujący insercję mutagenezy cysteiny w transbłonowej α-helisie wrażliwej na napięcie. Cysteina powinna być zakopana w błonie w spoczynku i być dostępna zewnątrzkomórkowo po depolaryzacji (ΔV; Śledzenie cysteiny jest zazwyczaj mało prawdopodobne, jeśli docelowa cysteina jest już dostępna z przestrzeni zewnątrzkomórkowej przed depolaryzacją (II) lub jeśli cysteina nie jest dostępna z przestrzeni zewnątrzkomórkowej po depolaryzacji (III). (E) Po reakcji z cząsteczką fluorescencyjną tiolu, ruch α-helisy w odpowiedzi na depolaryzację zmniejsza emisję fluorescencji MTS-5-TAMRA. Sygnał fluorometryczny jest generowany przez ruch helisy S4 i następujący po nim ruch barwnika względem płaszczyzny membrany i środowiska wodnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Elektroporacja in vivo

UWAGA: Eksperymenty z elektroporacją zostały przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem38 z modyfikacjami. W następnej sekcji protokół jest przeznaczony do elektroporacji jednej opuszki stopy myszy. Objętości należy dostosować, jeśli obie łapy są przygotowane.

  1. Podwielokrotność 25-100 μl roztworu plazmidu o stężeniu 2-5 μg/μl w probówce o pojemności 1,5 ml umieszczonej na lodzie.
  2. Przygotować 0,5 ml roztworu hialuronidazy 2 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej i przefiltrować roztwór przez sterylny filtr 0,2 μm o niskiej zawartości białka wiążącego zamontowany w strzykawce o pojemności 1 ml. Przechowywać w probówce o pojemności 1,5 ml w temperaturze pokojowej.
  3. Za pomocą skalibrowanego aparatu anestezjologicznego znieczulij mysz za pomocą 3%-4,5% izofluranu wO2 (1 l/min), umieszczając mysz w komorze anestezjologicznej. Potwierdź odpowiednie znieczulenie zwierzęcia, ściskając czubek ogona za pomocą pęsety. Nie należy zaobserwować żadnej reakcji po osiągnięciu optymalnego znieczulenia.
  4. Wyjmij mysz z komory anestezjologicznej i umieść na niej anestezjologiczną maskę na nos. Ułóż zwierzę na plecach na izotermicznej poduszce grzewczej pokrytej sterylną podkładką na ławkę. Kontynuować znieczulenie za pomocą maski dla gryzoni z 3% izofluranem wO2 (1 l/min).
  5. Aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu, nałóż cienką warstwę sztucznego kremu na łzy na oczy zwierzęcia za pomocą sterylnej bawełnianej końcówki. Zdezynfekuj łapę zwierzęcia za pomocą sterylnej chusteczki nasączonej alkoholem etylowym.
  6. Za pomocą sterylnej igły insulinowej o długości 0,5 cala i wadze 29 G odessać 20 μl roztworu hialuronidazy. Wbić się w skórę na poziomie pięty i wsunąć igłę podskórnie w kierunku podstawy palców u nóg (Rysunek 2A). Powoli wstrzykiwać roztwór, stopniowo przesuwając igłę do tyłu. Pod łapą należy zaobserwować bolus lub guzek (Rysunek 2B).
    UWAGA: W zależności od wieku zwierzęcia i wielkości łapy, istnieje prawdopodobieństwo, że pełna ilość roztworu nie zostanie wstrzyknięta. Często może dojść do niewielkiego wycieku przez miejsce wstrzyknięcia.
  7. W razie potrzeby powtórzyć krok 2.6 z drugą łapą, używając innej sterylnej igły po prawidłowej dezynfekcji łapy, jak w kroku 2.5.
  8. Odłącz znieczulenie, wyjmując zwierzę z maski na nos i wróć mysz do klatki z dostępem do jedzenia i wody ad libitum. Pełne wyzdrowienie po znieczuleniu powinno nastąpić w ciągu ~5 minut. Umieść probówkę zawierającą roztwór plazmidu na stole, aby umożliwić mu osiągnięcie temperatury pokojowej.
  9. Po 1 godzinie znieczulij zwierzę po raz drugi, umieść je na poduszce grzewczej i zdezynfekuj łapę zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.5.
  10. Wstrzyknąć 10-20 μl konstruktu cDNA, stosując tę samą technikę opisaną w kroku 2.6. Całkowita ilość wstrzykiwanego konstruktu wynosi 50-100 μg na łapę. W razie potrzeby powtórzyć procedurę z łapą przeciwległą, używając innej sterylnej strzykawki.
  11. Trzymaj zwierzę pod narkozą na izotermicznej poduszce grzewczej przez 5 minut, aby umożliwić równomierne rozproszenie roztworu cDNA w tkance.
  12. Włącz urządzenie do elektroporacji i podłącz je do układu podwójnych elektrod, zgodnie z zaleceniami producenta.
  13. Zdezynfekuj układ podwójnych elektrod za pomocą chusteczki nasączonej alkoholem etylowym. Ustabilizuj łapę jedną ręką i najpierw włóż jedną elektrodę pod skórę z tyłu pięty. Następnie włóż drugą elektrodę u podstawy palców, upewniając się, że orientacje obu elektrod są prostopadłe do osi stopy (Rysunek 2C). Ustaw sondę w pozycji, która nie krępuje stopy ani nogi w skrajnej orientacji kątowej.
    UWAGA: Wprowadzanie elektrod można ułatwić za pomocą pęsety i regularnego ostrzenia końcówek elektrod. W zależności od wieku zwierzęcia wielkość łapy może się różnić, a rozstaw elektrod powinien być odpowiednio dostosowany.
  14. Naelektryzować mięśnie, stosując 20 impulsów o czasie trwania 20 ms każdy, o częstotliwości 1 Hz. W przypadku igieł elektrod rozstawionych co 1 cm ustaw napięcie na ~100 V. Należy to dostosować, jeśli odstępy między elektrodami są modyfikowane tak, aby osiągnąć ~100 V/cm. Podczas dostarczania impulsu należy zaobserwować lekkie zgięcie palców, jeśli elektrody są prawidłowo ustawione.
  15. W razie potrzeby powtórz kroki 2.13 i 2.14 z łapą przeciwległą.
  16. Odłącz znieczulenie i umieść zwierzę w klatce, odizolowanej od jego nieelektroporowanego partnera z dostępem do pożywienia i wody ad libitum na 2 godziny. Pełne wyzdrowienie po znieczuleniu powinno nastąpić w ciągu ~10 min. Umieść zwierzę z powrotem w klatce.
    UWAGA: Ekspresja konstruktu (konstruktów) cDNA jest w dużym stopniu zależna od kodowanego białka. Obrót białek, ilość i jakość cDNA, promotora plazmidu i inne zmienne mogą wpływać na ekspresję konstruktu. W tym eksperymencie optymalna ekspresja podjednostki α1S CaV1.1 z promotorem CMV wymaga od 4 do 6 tygodni, ale można ją wykryć od 2 tygodni przez okres do 12-15 miesięcy.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schemat iniekcji cDNA i elektroporacji elektroporancji w podkładce pod stopę myszy do elektroporacji. (A) Pozycja igły do iniekcji hialuronidazy i cDNA pod podkładką pod stopę myszy. Strzałka wskazuje punkt wprowadzenia przez skórę. (B) Po wstrzyknięciu należy przejściowo zaobserwować nieznaczne przebarwienie skóry i nieznaczne zwiększenie rozmiaru łapy. (C) Pozycjonowanie układu elektrod do elektroporacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Sekcja mięśni i izolacja włókien

UWAGA: Dysocjacja włókien mięśni szkieletowych została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem37,40,41 z modyfikacjami. W poniższej sekcji protokół jest odpowiedni dla dwóch opuszków stóp myszy.

  1. Przed dysocjacją włókien przygotuj płytkę pokrytą sylgardem, dodając jedną część utwardzacza do 10 części elastomeru (% w/w) na plastikowej szalce Petriego o średnicy 60 mm, aby osiągnąć grubość ~5 mm. Przed użyciem pozwól pokrytej elastomerem płytce utwardzić się przez noc. Może być ponownie użyty wiele razy, jeśli jest odpowiednio przechowywany i dezynfekowany 70% alkoholem etylowym przed i po użyciu.
  2. Przygotować 4 mg kolagenazy typu I w 2 ml pożywki dla niemowląt (S-MEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS; końcowe stężenie 2 mg/ml). Przenieść roztwór na niepowlekaną płytkę z tworzywa sztucznego o średnicy 35 mm i umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
    UWAGA: S-MEM to zmodyfikowany preparat MEM bez glutaminy iCa2+. Brak Ca2+ na tym etapie zmniejsza przykurcz włókien podczas trawienia enzymatycznego i rozcierania.
  3. Dodać 5 ml S-MEM uzupełnionego 10% FBS na niepowlekaną płytkę z tworzywa sztucznego o średnicy 60 mm i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. Poddać zwierzęta eutanazji przez uduszenie przez CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Aby zmniejszyć zanieczyszczenie podczas pierwotnej izolacji komórek, zanurz tuszę zwierzęcia w 70% alkoholu etylowym na ~10 s. Usuń i osusz tuszę papierem absorpcyjnym i odetnij stopy nożyczkami między kostką a kolanem (Rysunek 3A).
  5. Przygwoźdź jedną stopę zwierzęcia, łapą skierowaną do góry, za pomocą szpilek preparacyjnych na płytce pokrytej elastomerem pod mikroskopem preparacyjnym przy 10-krotnym powiększeniu.
  6. Za pomocą nożyczek preparacyjnych i cienkiej pęsety usuń skórę z łapy, aby odsłonić mięsień zginacza palca krótkiego (FDB) (Ryc. 3B). Aby zapobiec wysuszeniu tkanek, dodaj kroplę S-MEM 10% FBS do mięśnia za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
  7. Na poziomie pięty naciąć ścięgno i ostrożnie wypreparować mięsień FDB od pięty do palców (Ryc. 3B). Unikaj napięcia mięśnia w jak największym stopniu podczas wykonywania sekcji. Zbyt duża siła przyłożona do tkanek spowoduje uszkodzenie włókien mięśniowych. Umieść mięsień natychmiast w roztworze kolagenazy.
  8. Powtórz kroki 3.5-3.7 ze stopą przeciwległą. Umieścić wypreparowany mięsień w roztworze kolagenazy w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 2 godziny 45 minut do 3 godzin 15 minut. Dostosuj czas inkubacji w zależności od aktywności enzymatycznej kolagenazy i wieku zwierzęcia.
  9. Podczas inkubacji tkanki mięśniowej dodaj 300 μl zimnego MEM bez surowicy i antybiotyków na środek naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Dodać 2 μl zimnej lamininy w stężeniu 1,20 mg/ml bezpośrednio do MEM. Powtórz proces dla żądanej liczby potraw. Umieścić szalki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić polimeryzację lamininy.
  10. Po zakończeniu trawienia enzymatycznego przenieś mięsień do naczynia do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm zawierającego S-MEM 10% FBS za pomocą pipety Pasteura z polerowanego szkła o dużym otworze (5 mm) i bańki lateksowej.
  11. Używając pipety Pasteura z polerowanego szkła o mniejszym otworze (2 mm) i bańki lateksowej, delikatnie rozetnij mięsień pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 3C). Zdysocjowane włókna mięśniowe powinny zacząć odłączać się od tkanki i zostać uwolnione w roztworze.
    UWAGA: Z reguły zawsze preferowane jest mniejsze rozcieranie (15-30 przejść pipet), ponieważ zbyt długie rozcieranie może spowodować naprężenie lub nawet uszkodzenie włókien.
  12. Za pomocą cienkiej pęsety usuń wszelkie tkanki niemięśniowe, takie jak nerwy, ścięgna lub naczynia krwionośne (Rysunek 3D).
  13. Dodaj 2 ml ciepłego MEM 2% FBS do każdego naczynia ze szklanym dnem pokrytym lamininą o średnicy 35 mm. Używając pipety o pojemności 200 μl i sterylnej plastikowej końcówki do pipety, przenieś zdysocjowane włókna mięśniowe do 35-milimetrowego naczynia ze szklanym dnem pokrytym lamininą (Rysunek 3E).
    UWAGA: Osiągnięcie niskiej gęstości włókien i umożliwienie dobrego oddzielenia włókien od siebie jest ważne, aby zapobiec nakładaniu się włókien.
  14. Umieścić naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Włókna można stosować w czasie 2-20 godzin.

figure-protocol-3
Rysunek 3; Rozwarstwienie i dysocjacja włókien mięśniowych FDB. (A) Po rozwarstwieniu stopy powyżej stawu skokowego (linia przerywana), skóra pod łapą stopy jest usuwana, podążając za linią przerywaną, aby odsłonić mięsień FDB (B). Mięsień jest preparowany i umieszczany w roztworze kolagenazy. (C) Po inkubacji mięsień jest rozcierany w celu dysocjacji i uzyskania pojedynczych włókien mięśniowych. (D) Drobna pęseta służy do usuwania tkanki i zanieczyszczeń niezwiązanych z mięśniami przed przeniesieniem włókien mięśniowych do naczynia do hodowli ze szkła pokrytego lamininą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Opis konfiguracji przejęcia

UWAGA: Konfiguracja akwizycji jest porównywalna do opisanej wcześniej42 z modyfikacjami (Rysunek 4A).

  1. Włącz wszystkie komponenty: komputer, konwerter AD/DA i wzmacniacz ścieżkowo-cęgowy, mikroskop, stolik z napędem, manipulator(y), zasilacz fotodiody, źródło światła, migawkę świetlną, generator impulsów i edytor protokołów.
  2. Aktywuj logikę tranzystor-tranzystor (TTL) wyzwalającą sygnał OUT z AD/DA, aby sterować generatorem impulsów, migawką światła i edytorem protokołów.
  3. Użyj sygnału wyjściowego TTL z generatora impulsów i podłącz do kanału AD wzmacniacza, aby sprawdzić precyzyjne wyzwalanie czasowe. Odpowiednia kontrola spójności wyzwalania powinna być dokładnie oceniona przed eksperymentem, aby zapewnić odpowiednią synchronizację aparatury.
    UWAGA: W przypadku CaV1.1 spodziewaj się zobaczyć maksymalny sygnał w czasie krótszym niż 4-10 ms po stymulacji (czas do rozwinięcia maksymalnego ruchu ładunku5). Sygnał jest szybki i precyzyjny, rozdzielczość czasowa ma kluczowe znaczenie dla porównania z innymi pomiarami, takimi jak stan nieustalony wapnia lub ruch ładunku mierzony za pomocą cęgów napięciowych.
  4. Aby skupić światło wzbudzenia w określonym obszarze lub miejscu światłowodu (Rysunek 4B), użyj membrany umieszczonej na ścieżce światła wzbudzenia. Umożliwia to akwizycję sygnału tylko w obszarze, w którym sygnał EGFP-CaV1.1 jest maksymalny (Rysunek 4B).

figure-protocol-4
Rysunek 4: Opis systemu nagrywania. (A) Diagram ilustrujący połączenie pomiędzy różnymi komponentami systemu nagrywania. Zestaw składa się z odwróconego mikroskopu ze zmotoryzowanym stolikiem, źródła światła z diodą elektroluminescencyjną (LED), migawki świetlnej, wykonanego na zamówienie obwodu monitorowania światła opartego na fotodiodzie z funkcją śledzenia i wstrzymywania43, konwertera AD/DA (ze wzmacniacza patch clamp), analogowego generatora impulsów, zewnętrznej jednostki stymulacji pola sprzężonej z elektrodami do stymulacji pola, zmotoryzowane manipulatory i komercyjne oprogramowanie do pozyskiwania, synchronizacji i generowania protokołów. Elektroda do stymulacji polowej wykonana jest z dwóch platynowych drutów przyspawanych do przewodów miedzianych połączonych z generatorem impulsów za pomocą złącza BMC. Specjalne filtry wzbudzenia i emisji są używane do wykrywania zarówno sygnałów EGFP, jak i MTS-5-TAMRA. Do wzbudzenia EGFP stosuje się lampę ksenonową z filtrem wzbudzenia (Ex) 488 nm (± 20 nm) i filtrem Em LP510 nm. W przypadku MTS-5-TAMRA zastosowano źródło światła LED o długości fali 530 nm oraz filtr Em LP550 nm. (B) Widok światłowodu wyrażającego konstrukt EGFP-CaV1.1-cys z dwupolowymi elektrodami stymulacyjnymi (czarne kółka) zorientowanymi prawidłowo (po lewej) i niewłaściwie (po prawej) w głównej osi włókien (linia przerywana). niewypełniony okrąg reprezentuje obszar akwizycji o średnicy kontrolowanej przez otwór przysłony, umieszczony przed źródłem światła. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Ocena aktywności elektrycznej włókien EGFP-dodatnich i barwienia cysteiną

UWAGA: Stymulacja pola włókien mięśni szkieletowych odbywa się zgodnie z opisem wcześniej41 z modyfikacjami. Podejście to służy do (1) identyfikacji zdrowych, funkcjonalnych i reagujących elektrycznie włókien, (2) barwienia włókien barwnikiem fluorescencyjnym reagującym z cysteiną oraz (3) rejestrowania sygnału fluorescencyjnego w odpowiedzi na propagowany potencjał czynnościowy. Każdy etap tej sekcji i następny powinien być wykonywany w słabym oświetleniu, aby zmniejszyć wybielanie barwnikiem fluorescencyjnym.

  1. Umieść naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm zawierające zdysocjowane włókna mięśniowe na stoliku mikroskopu. Ostrożnie usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i zastąpić 2 ml roztworu Ringera o temperaturze pokojowej (patrz Tabela 1 w celu uzyskania składu). Może być konieczne wielokrotne zastępowanie pożywki w celu całkowitego usunięcia oryginalnych pożywek do hodowli komórkowych zawierających wolne cysteiny.
  2. Za pomocą mechanicznego lub zmotoryzowanego manipulatora umieść dwa platynowe druty prostopadle do dna naczynia. Upewnij się, że końcówki elektrod są wyrównane względem osi podłużnej światłowodu i w odległości kilku milimetrów od końców światłowodu, a odległość między elektrodami wynosi 5 mm (Rysunek 4B). Następnie dostosuj położenie elektrody, obracając czaszę lub montując każdą elektrodę na niezależnym mikromanipulatorze (Rysunek 4B).
  3. Włącz przechodzące światło i znajdź włókna w polu widzenia za pomocą obiektywu 20x. Przesuń kostkę filtra EGFP do ścieżki światła.
    UWAGA: Za pomocą mikroskopu wyposażonego w epifluorescencję i obiektyw o małym powiększeniu (2x), można ocenić skuteczność transfekcji konstruktu w całym mięśniu przed dysocjacją włókien, oceniając ekspresję EGFP (Rysunek 5A).
  4. Za pomocą zdalnie sterowanej migawki świetlnej aktywuj światło wzbudzające 488 nm, aby zidentyfikować włókna EGFP-dodatnie. Przechowuj włókno x-y na czaszy za pomocą zmotoryzowanego stolika mikroskopowego. Sygnał EGFP jest często niejednorodny w obrębie światłowodu (Rysunek 4B). Wyśrodkuj zapisaną pozycję do najjaśniejszego sygnału EGFP.
  5. Po zidentyfikowaniu włókien EGFP-dodatnich wróć do pierwszej zapisanej lokalizacji. Za pomocą ręcznego przełącznika spustowego dostarcz dwa sekwencyjne impulsy stymulacyjne o czasie trwania 1 ms i amplitudzie 20 V. Ustaw biegunowość impulsów na naprzemienną.
  6. Po stymulacji obserwuj dwa koncentryczne skurcze jednorodnych włókien w odpowiedzi na dwa impulsy o przeciwnej polaryzacji. Lokalne skurczenie lub brak skurczu w odpowiedziach na impulsy o alternatywnej polaryzacji wskazują na lokalne niepropagowane reakcje pasywne lub brak pobudliwości41. Wyklucz te włókna do końca eksperymentu.
  7. Dodaj 2 μl 10 mM roztworu MTS-5-TAMRA bezpośrednio do naczynia i delikatnie wymieszaj pipetą o pojemności 1 000 μl (stężenie końcowe 10 μM). Uważaj, aby nie przesuwać naczynia, w przeciwnym razie przechowywane pozycje włókien zostaną utracone. Inkubować przez 4-5 minut, aby umożliwić dyfuzję fluorescencyjnej cząsteczki tiolu do światła systemu kanalików poprzecznych.
  8. Zastosuj dwubiegunowe stymulacje powtarzalne, aby wywołać kolejne ciągi potencjału czynnościowego z częstotliwością 50 Hz przez 300 ms co 1 s przez 5 min.
    UWAGA: Ciągi impulsów zapewniają dostęp do cystein wprowadzonych do S4 EGFP-CaV1.1 w celu reakcji z MTS-5-TAMRA. Zdolność włókna do mechanicznego kurczenia się w odpowiedzi na stymulację jest ważna dla przepływu światła kanalików poprzecznych ze środowiskiem zewnątrzkomórkowym.
  9. Usuń roztwór barwiący z naczynia za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i zastąp 2 ml roztworu Ringera o temperaturze pokojowej. Do całkowitego usunięcia niesprzężonego MTS-5-TAMRA mogą być wymagane dwie lub trzy rundy. Pozwól zabarwionemu włóknu zregenerować się po protokole barwienia przez co najmniej 10 minut.
  10. Podobnie jak w kroku 5.6, ponownie oceń stan włókien i aktywność elektryczną, obserwując symetryczne kurczenie się włókien w odpowiedzi na naprzemienną polaryzację. Wyklucz włókna, które nie reagują na obie stymulacje, z reszty eksperymentu.
  11. Przesuń kostkę filtrującą MTS-5-TAMRA na ścieżkę światła. Za pomocą zdalnie sterowanej migawki świetlnej aktywuj światło wzbudzające o długości fali 533 nm, aby potwierdzić jednorodne zabarwienie MTS-5-TAMRA na włóknach.
    UWAGA: Po barwieniu MTS-5-TAMRA, zarówno zmodyfikowane, jak i endogenne cysteiny reagują z pochodną maleimidu (Figura 5B). W związku z tym trudno jest ocenić prawidłową reakcję z interesującą nas cysteiną. CaV1.1 wyraża się głównie w kanaliku poprzecznym, tworząc charakterystyczny wzór dwupasmowy. Używając mikroskopu konfokalnego lub epifluorescencyjnego, obraz x-y może być wykorzystany do potwierdzenia prawidłowego barwienia i wejścia kanalików poprzecznych oraz dyfuzji MTS-5-TAMRA (Figura 5C).

6. Akwizycja i przetwarzanie sygnału

UWAGA: Przed wykonaniem pomiarów fluorometrycznych, akwizycja sygnału musi być starannie zaplanowana, aby uzyskać optymalny stosunek sygnału do szumu. Wolniejsze tempo próbkowania pozwala na większą detekcję światła przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby punktów, które zostałyby uzyskane podczas rearanżacji konformacji białek. W przypadku EGFP-CaV1.1-cys ruch ładunku wywołany przebiegiem potencjału czynnościowego występuje w ~1-10 ms37. Aby uzyskać wiele punktów do śledzenia ewolucji ruchu w czasie, akwizycja została ustawiona na 50 μs na punkt.

  1. Umieść światłowód na środku pola widzenia z odpowiednim systemem powiększenia. Do tych eksperymentów użyto obiektywu z odwróconą aperturą 1,4 (NA) o 60-krotnej aperturze olejowej. Zoptymalizuj oświetlenie i położenie światłowodu za pomocą zmotoryzowanego stopnia i membrany, aby oświetlić okrągły obszar średnicy światłowodu, w którym sygnał EGFP jest maksymalny (Rysunek 4B).
  2. Po ustawieniu światłowodu do akwizycji zorientuj dwa niezależnie zamontowane platynowe druty do stymulacji pola na każdym końcu światłowodu. Ustaw przewody na głównej osi włókien w linii prostej i rozstaw je w odległości 5 mm od światłowodu pośrodku (Rysunek 4B).
  3. Ustaw filtry wzbudzenia akwizycji i emisji na odpowiednie ustawienia dla MTS-5-TAMRA. Rozpocznij eksperyment, wykonując protokół zapisany w oprogramowaniu do akwizycji. Ten krok uruchamia wszystkie urządzenia końcowe (tj. edytor protokołów, migawkę świetlną, generator impulsów).
    UWAGA: Protokół ten pozwala na krótki okres (tj. 10 ms) akwizycji linii bazowej przed dostarczeniem bodźca polowego, aby umożliwić późniejsze pomiary fluorescencji spoczynkowej.
  4. Zainicjuj pojedynczy lub ciąg potencjałów czynnościowych impulsem kwadratowym 0,5 lub 1 ms, 20 V. Zminimalizuj całkowity czas akwizycji tak bardzo, jak to możliwe, aby uniknąć blaknięcia sygnału.
    UWAGA: Nawet w przypadku nagrywania w środku światłowodu, może wystąpić sygnał fluorescencyjny związany z ruchem i może zostać pomylony z sygnałem fluorescencyjnym z powodu zmiany konformacyjnej białko-fluorofor (Rysunek 5D). Sygnał wywołany skurczem powinien być opóźniony w porównaniu z oczekiwanym czasem ruchu ładunku po stymulacji37.
  5. W celu dalszego odróżnienia sygnału powstającego w wyniku ruchów S4 od sygnału spowodowanego skurczem włókien, należy dodać 1 μl 100 mM N-benzylo-p-toluenosulfonamidu (BTS; stężenie końcowe 50 μM) do roztworu rejestrującego w celu zminimalizowania reakcji skurczowych i powtórzyć krok 6.4. Sygnały wykryte po raz drugi po farmakologicznym unieruchomieniu włókien odpowiadają ruchowi molekularnemu oznaczonej helisy S4 (Rysunek 5D).
    UWAGA: Po tłumieniu ruchu za pomocą BTS nie powinien być wykrywany żaden sygnał w sterowaniu EGFP-CaV1.1 bez zaprojektowanej cysteiny.
  6. Korzystając z tych samych ustawień, uzyskaj podobny sygnał w miejscu w naczyniu, w którym nie ma włókien mięśniowych ani zanieczyszczeń, aby uzyskać wartość fluorescencji tła.
  7. Zaimportuj pliki, które zawierają przebieg czasowy surowej fluorescencji [Fr(t)] z fluorescencji światłowodowej i tła [Fb(t)] do oprogramowania do analizy danych. Uśrednij kolumnę zawierającą Fb(t), aby uzyskać jednorodną wartość Fb. Odejmij Fb od Fr(t), aby uzyskać bezwzględne wartości fluorescencji [F(t)]. W razie potrzeby wygładź wynikowy sygnał za pomocą funkcji wygładzania.
    UWAGA: Ze względu na ten system wykrywania i częstotliwość akwizycji zdecydowaliśmy się użyć funkcji uśredniania sąsiedztwa z oknem 50 punktów do wygładzania.
  8. Uśrednić wyjściowe wartości F(t) w przedziale czasu 10 ms przed stymulacją, aby uzyskać spoczynkową wartość fluorescencji (F0). Odejmij F0 od wygładzonego F(t), aby uzyskać bezwzględną zmianę fluorescencji [ΔF(t)]. Następnie, aby wyrazić zmianę fluorescencji w czasie w stosunku do fluorescencji spoczynkowej (ΔF/F0), podziel ΔF(t) przez F0.
  9. Aby ocenić stopień bielenia sygnału, zdefiniuj dwa punkty od sygnału ΔF/F0 w czasie, przed i po stymulacji oraz z dala od sygnału fluorometrycznego. Dopasuj funkcję liniową do tych dwóch punktów, aby uzyskać ślad linii bazowej. Odejmij linię bazową od ΔF/F0 w czasie, aby skorygować bielenie sygnału.
  10. Odejmij od kolumny czasu opóźnienie między inicjacją akwizycji a sygnałem sprzężenia zwrotnego ze stymulacji, aby t = 0 odpowiadało początkowi bodźca elektrycznego.
    UWAGA: Aby umożliwić wielokrotne porównywanie sygnałów, często wymagana jest normalizacja amplitudy sygnału. W zależności od celu eksperymentu można zastosować różne podejścia. W poniższej sekcji wyników zainteresowała nas kinetyka sygnału, dlatego zastosowaliśmy prostą metodę polegającą na normalizacji każdego sygnału o minimalną osiągniętą wartość (czyli ujemny pik kroczący).

figure-protocol-5
Rysunek 5: Obrazowanie włókien mięśniowych wyrażających EGFP-CaV1.1-cys bez i z barwieniem MTS-5-TAMRA i reprezentatywnym surowym zapisem fluorometrycznym. (A) Przykłady transmitowanych (po lewej) i fluorescencyjnych (po prawej) obrazów wypreparowanego, niezdysocjowanego mięśnia wyrażającego konstrukt EGFP-CaV1.1 VSD-III. Pasek skali: 100 μm. (B) Reprezentatywny obraz włókna mięśniowego wyrażającego konstrukt EGFP-CaV1.1 VSD-III przed (po lewej) i po (prawej) barwieniu MTS-5-TAMRA. Endogenne cysteiny włókien nietransfekowanych są również barwione przez barwnik. Podziałka: 30 μm. (C) Konfokalny obraz konstruktu EGFP-CaV1.1 VSD-III (po lewej) i barwienie MTS-5-TAMRA (po prawej) pokazują klasyczny wzór dwupasmowy charakterystyczny dla lokalizacji CaV1.1 w układzie kanalików poprzecznych włókna mięśniowego (na dole). Podziałka skali: 25 μm. (D) Reprezentatywny zapis fluorometryczny w odpowiedzi na dwa bodźce i mierzony za pomocą fotodiody przed (niebieski ślad) i po (czerwony ślad) immobilizacji włókien N-benzylo-p-toluenem sulfonamidem (BTS). Górna linia wskazuje protokół depolaryzacji światłowodu poprzez stymulację polem zewnętrznym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gdy rozchodzące się potencjały czynnościowe są wyzwalane w odpowiedzi na powtarzające się stymulacje polem, możliwe jest śledzenie określonego ruchu czujnika napięcia w odpowiedzi na określoną częstotliwość depolaryzacji. Jak pokazano na rysunku Rysunek 6A, ruch helis oznaczonych VSD-II może być śledzony w odpowiedzi na każdą z dwóch kolejnych depolaryzacji zastosowanych przy 10 Hz (tj. w odstępie 100 ms). Bielenie sygnału można skorygować, odejmując linię bazową od śladu (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisano krok po kroku protokół przeprowadzania FSDF we włóknach mięśniowych w celu badania ruchów poszczególnych czujników napięcia z kanału CaV1.1. Mimo że liczba etapów i różnorodność podejść, które są łączone w tej technice, może wydawać się złożona, większość z tych technik jest często rutynowo stosowana w laboratoriach biofizyków/biologów komórkowych. W związku z tym pozorna złożoność polega głównie na połączeniu wszystkich różnych podejść w jednej zintegrowanej technice. Często przy przepro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. J. Vergara (University of California, Los Angeles) za udostępnienie plazmidu dzikiego typu EGFP-CaV1.1 (królik). Dziękujemy Wydziałowi Fizjologii, Laboratorium Elektroniki Uniwersytetu Yale, a w szczególności Henrikowi Abildgaardowi za zaprojektowanie i zbudowanie fotodiody z obwodem torowania i podtrzymywania. Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health R01-AR075726 i R01-NS103777

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HialuronidazaSIGMA ALDRICHH3884-50mg
0,5 ml Probówka EppendorfMillipore SigmaEP022363719-500EA
Strzykawka 1 mlMillipore SigmaZ683531-100EArurkowa końcówka poślizgowa
Sterylna igła i strzykawka do insuliny o długości 1/2 cala i rozmiarze 29 BectonDikinson324702
35 mm niepowlekana plastikowa płytkaFalcon, Corning353001
60 mm niepowlekana płyta z tworzywa sztucznegoFalcon, Corning351007
Bicz alkoholowyPDIB60307
Alexa-533 kostka LPChroma49907Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Lampa łukowaSutter InstrumetsLB-LS 672
Krem ze sztucznymi łzamiAkornNDC 59399-162-35
Szkło borokrzemianowe Pipeta Pasteura 5 3/4"VWR14672-200
BTS (N-benzylo-p-toluenosulfonamid)SIGMA ALDRICH203895
kolagenaza typ ISIGMA ALDRICHC0130-1g
Bawełniana końcówkaVWRVWR-76048-960-BG
Układ podwójnych elektrod  (do elektroporacji)BTX harvard apparatus45-012010mm 2 końcówki igłowe
EGFP kostkaChroma39002ATEx: 480/30x; Zobacz materiał BS 505; Em: 535/40m
Aparatura do elektroporacjiBTX harvard apparatusECM 830
EPC10HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)895000
FBSBiotechne,  R& D SystemsRND-S11150HPłodowa surowica bydlęca - Premium, szkło inaktywowane termicznie
Nakrywka 35 mmMatTek Life ScienceP35G-1.5-14-C
IzofluranFluriso (Izofluran) Płyn do inhalacji502017-250ml
Izotermiczna poduszka grzewczaBraintree scientific inc39DP
LamininThermo FisherINV-23017015Białko myszy Laminin, żarówka z naturalnego
lateksuVWR82024-554
LED 530 nmSutter Instrumets5A-530
Białko o niskim poziomie wiązania 0,2 i mu; m sterylny filtrPallFG4579acrodisk  filtr strzykawkowy 0,2um membrana suporowa niskie wiązanie białek niepirogenny
MEMInvitrogenINV-11380037
MTS-5-TAMRABiotium89410-784MTS-5-TAMRA
Oprogramowanie analityczne OriginProOriginLab CorporationOriginPro 2022 (64-bitowa) SR1
FotodiodaWykonane na zamówienieNA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17OlympusBFPC2
Drut platynowy 0,5 mm, 99.9 % na bazie metaliSIGMA267228-1GDo produkcji elektrody do stymulacji pola
Generator impulsówWPIPulsemaster A300
Sterownik napędu migawkiUniblitz100-2B
ShuttterUniblitzVS2582T0-100
S-MEMInvitrogenINV-11380037
Sterylna podkładka stołowaVWRDSI-B1623
Sterylna sól fizjologicznaSIGMA ALDRICHS8776
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning1419447-1198
Waporyzator do znieczuleniaParkland ScientificV3000PK
Generator napięciaCustom MadeNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Catterall, W. A., Wisedchaisri, G., Zheng, N. The chemical basis for electrical signaling. Nature Chemical Biology. 13 (5), 455-463 (2017).
  2. Armstrong, C. M., Hille, B. Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron. 20 (3), 371-380 (1998).
  3. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  4. Armstrong, C. M., Bezanilla, F. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature. 242 (5398), 459-461 (1973).
  5. Schneider, M. F., Chandler, W. K. Voltage dependent charge movement of skeletal muscle: a possible step in excitation-contraction coupling. Nature. 242 (5395), 244-246 (1973).
  6. Bezanilla, F. Gating currents. The Journal of General Physiology. 150 (7), 911-932 (2018).
  7. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiological Reviews. 80 (2), 555-592 (2000).
  8. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  9. Akabas, M. H. Cysteine modification: probing channel structure, function and conformational change. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 25-54 (2015).
  10. Priest, M., Bezanilla, F. Functional site-directed fluorometry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 55-76 (2015).
  11. Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
  12. Pantazis, A., Savalli, N., Sigg, D., Neely, A., Olcese, R. Functional heterogeneity of the four voltage sensors of a human L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 18381-18386 (2014).
  13. Savalli, N., Kondratiev, A., Toro, L., Olcese, R. Voltage-dependent conformational changes in human Ca(2+)- and voltage-activated K(+) channel, revealed by voltage-clamp fluorometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (33), 12619-12624 (2006).
  14. Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
  15. Bannister, J. P. A., Chanda, B., Bezanilla, F., Papazian, D. M. Optical detection of rate-determining ion-modulated conformational changes of the ether-à-go-go K+ channel voltage sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (51), 18718-18723 (2005).
  16. Bruening-Wright, A., Elinder, F., Larsson, H. P. Kinetic relationship between the voltage sensor and the activation gate in spHCN channels. The Journal of General Physiology. 130 (1), 71-81 (2007).
  17. Osteen, J. D., et al. KCNE1 alters the voltage sensor movements necessary to open the KCNQ1 channel gate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22710-22715 (2010).
  18. Smith, P. L., Yellen, G. Fast and slow voltage sensor movements in HERG potassium channels. The Journal of General Physiology. 119 (3), 275-293 (2002).
  19. Gonzalez, C., Koch, H. P., Drum, B. M., Larsson, H. P. Strong cooperativity between subunits in voltage-gated proton channels. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 51-56 (2010).
  20. Gandhi, C. S., Olcese, R. The voltage-clamp fluorometry technique. Methods in Molecular Biology. 491, 213-231 (2008).
  21. Horne, A. J., Fedida, D. Use of voltage clamp fluorimetry in understanding potassium channel gating: a review of Shaker fluorescence data. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 87 (6), 411-418 (2009).
  22. Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
  23. Cowgill, J., Chanda, B. The contribution of voltage clamp fluorometry to the understanding of channel and transporter mechanisms. The Journal of General Physiology. 151 (10), 1163-1172 (2019).
  24. Catterall, W. A., Lenaeus, M. J., Gamal El-Din, T. M. Structure and pharmacology of voltage-gated sodium and calcium channels. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 60, 133-154 (2020).
  25. MacKinnon, R. Determination of the subunit stoichiometry of a voltage-activated potassium channel. Nature. 350 (6315), 232-235 (1991).
  26. Wu, J., et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 at 3.6 Å resolution. Nature. 537 (7619), 191-196 (2016).
  27. Capes, D. L., Goldschen-Ohm, M. P., Arcisio-Miranda, M., Bezanilla, F., Chanda, B. Domain IV voltage-sensor movement is both sufficient and rate limiting for fast inactivation in sodium channels. The Journal of General Physiology. 142 (2), 101-112 (2013).
  28. Cha, A., Ruben, P. C., George, A. L., Fujimoto, E., Bezanilla, F. Voltage sensors in domains III and IV, but not I and II, are immobilized by Na+ channel fast inactivation. Neuron. 22 (1), 73-87 (1999).
  29. Muroi, Y., Arcisio-Miranda, M., Chowdhury, S., Chanda, B. Molecular determinants of coupling between the domain III voltage sensor and pore of a sodium channel. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (2), 230-237 (2010).
  30. Savalli, N., et al. The distinct role of the four voltage sensors of the skeletal CaV1.1 channel in voltage-dependent activation. The Journal of General Physiology. 153 (11), e202112915(2021).
  31. Muller, C. S., et al. Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (34), 14950-14957 (2010).
  32. Perni, S., Lavorato, M., Beam, K. G. De novo reconstitution reveals the proteins required for skeletal muscle voltage-induced Ca2+ release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (52), 13822-13827 (2017).
  33. Beam, K. G., Horowicz, P. Excitation-Contraction Coupling in Skeletal Muscle. , McGraw-Hill. New York. (2004).
  34. Schneider, M. F., Hernandez-Ochoa, E. O. Muscle: Fundamental Biology and Mechanisms of Disease. , Academic Press, Elsevier. 811-822 (2012).
  35. Rios, E., Pizarro, G. Voltage sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiological Reviews. 71 (3), 849-908 (1991).
  36. Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage sensing mechanism in skeletal muscle excitation-contraction coupling: coming of age or midlife crisis. Skeletal Muscle. 8 (1), 22(2018).
  37. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of CaV1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (40), e2026116118(2021).
  38. DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1520(2009).
  39. Blunck, R., Starace, D. M., Correa, A. M., Bezanilla, F. Detecting rearrangements of shaker and NaChBac in real-time with fluorescence spectroscopy in patch-clamped mammalian cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3966-3980 (2004).
  40. Liu, Y., Carroll, S. L., Klein, M. G., Schneider, M. F. Calcium transients and calcium homeostasis in adult mouse fast-twitch skeletal muscle fibers in culture. The American Journal of Physiology. 272 (6), C1919-C1927 (1997).
  41. Hernandez-Ochoa, E. O., Vanegas, C., Iyer, S. R., Lovering, R. M., Schneider, M. F. Alternating bipolar field stimulation identifies muscle fibers with defective excitability but maintained local Ca(2+) signals and contraction. Skeletal Muscle. 6, 6(2016).
  42. Klein, M. G., Simon, B. J., Szucs, G., Schneider, M. F. Simultaneous recording of calcium transients in skeletal muscle using high- and low-affinity calcium indicators. Biophysical Journal. 53 (6), 971-988 (1988).
  43. Irving, M., Maylie, J., Sizto, N. L., Chandler, W. K. Intrinsic optical and passive electrical properties of cut frog twitch fibers. The Journal of General Physiology. 89 (1), 1-40 (1987).
  44. Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca(2+) release in adult skeletal muscle fibres. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 108 (3), 98-118 (2012).
  45. Banks, Q., et al. Optical recording of action potential initiation and propagation in mouse skeletal muscle fibers. Biophysical Journal. 115 (11), 2127-2140 (2018).
  46. Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap II: more recent advances in skeletal muscle excitation-contraction coupling. The Journal of Experimental Biology. 219, 175-182 (2016).
  47. Bannister, R. A., Beam, K. G. Ca(V)1.1: The atypical prototypical voltage-gated Ca2+ channel. Biochimica et Biophysica Acta. 1828 (7), 1587-1597 (2013).
  48. Beard, N. A., Wei, L., Dulhunty, A. F. Ca(2+) signaling in striated muscle: the elusive roles of triadin, junctin, and calsequestrin. European Biophysics Journal. 39 (1), 27-36 (2009).
  49. Polster, A., Perni, S., Bichraoui, H., Beam, K. G. Stac adaptor proteins regulate trafficking and function of muscle and neuronal L-type Ca2+ channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 602-606 (2015).
  50. Perni, S. The builders of the junction: roles of Junctophilin1 and Junctophilin2 in the assembly of the sarcoplasmic reticulum-plasma membrane junctions in striated muscle. Biomolecules. 12 (1), 109(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Site Directed FluorometrySkeletal Muscle ExcitabilityVoltage Gated Ion ChannelsExcitation Contraction CouplingElectrophysiology TechniquesFluorescent Protein LabelingCysteine MutagenesisCalcium Channel ActivationMuscle Fiber TransfectionConfocal Microscopy

Powiązane artykuły