Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65311

⸱

2 czerwca 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce to metoda badania ruchów domen białek w czasie rzeczywistym. Modyfikacja tej techniki pod kątem jej zastosowania w komórkach natywnych umożliwia teraz wykrywanie i śledzenie ruchów pojedynczego czujnika napięcia z bramkowanych napięciem kanałów Ca2+ w mysich izolowanych włóknach mięśni szkieletowych.

Streszczenie

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce była techniką z wyboru do badania zależności struktura-funkcja wielu białek błonowych, w tym kanałów jonowych bramkowanych napięciem. Podejście to było stosowane głównie w heterologicznych systemach ekspresyjnych do jednoczesnego pomiaru prądów błonowych, elektrycznej manifestacji aktywności kanałów i pomiarów fluorescencji, raportujących lokalne rearanżacje domen. Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce łączy elektrofizjologię, biologię molekularną, chemię i fluorescencję w jedną szeroko zakrojoną technikę, która umożliwia badanie przegrupowań strukturalnych i funkcji w czasie rzeczywistym odpowiednio za pomocą fluorescencji i elektrofizjologii. Zazwyczaj takie podejście wymaga zaprojektowanego kanału membranowego bramkowanego napięciem, który zawiera cysteinę, którą można przetestować za pomocą tiolowo-reaktywnego barwnika fluorescencyjnego. Do niedawna chemia tiolowo-reaktywna stosowana do fluorescencyjnego znakowania białek była przeprowadzana wyłącznie w oocytach i liniach komórkowych Xenopus, co ograniczało zakres podejścia do pierwotnych komórek niepobudliwych. W niniejszym raporcie opisano zastosowanie funkcjonalnej fluorometrii ukierunkowanej na miejsce w dorosłych komórkach mięśni szkieletowych do badania wczesnych etapów sprzężenia pobudzenie-skurcz, procesu, w którym depolaryzacja elektryczna włókien mięśniowych jest powiązana z aktywacją skurczu mięśni. Niniejszy protokół opisuje metodologie projektowania i transfekcji kanałów Ca2 + bramkowanych napięciem za pomocą cysteiny (CaV1.1) do włókien mięśniowych zginacza palca brevis dorosłych myszy przy użyciu elektroporacji in vivo oraz kolejne kroki wymagane do funkcjonalnych pomiarów fluorometrii skierowanej w miejsce. Podejście to można zaadaptować do badania innych kanałów jonowych i białek. Zastosowanie funkcjonalnej fluorometrii mięśni ssaków jest szczególnie istotne dla badania podstawowych mechanizmów pobudliwości.

Wprowadzenie

Możliwość śledzenia reorganizacji konformacyjnych kanałów jonowych w odpowiedzi na znany bodziec elektryczny w żywej komórce jest źródłem cennych informacji dla fizjologii molekularnej1. Kanały jonowe bramkowane napięciem to białka błonowe, które wyczuwają zmiany napięcia transbłonowego, a na ich funkcję wpływają również zmiany napięcia2. Rozwój technik cęgów napięcia w ubiegłym stuleciu pozwolił fizjologom badać w czasie rzeczywistym prądy jonowe przenoszone przez kanały jonowe bramkowane napięciem w odpowiedzi na depolaryzację membrany3. Zastosowanie technologii cęgów napięciowych miało kluczowe znaczenie dla zrozumienia właściwości elektrycznych komórek pobudliwych, takich jak neurony i mięśnie. W latach siedemdziesiątych XX wieku udoskonalenie cęgów napięciowych pozwoliło na wykrycie prądów bramkujących (lub ruchu ładunku) w kanałach wapniowych (CaV) i sodowych (NaV) bramkowanych napięciem4,5. Prądy bramkowania to nieliniowe prądy pojemnościowe, które powstają w wyniku ruchu czujników napięcia w odpowiedzi na zmiany pola elektrycznego przez błonę komórkową6. Prądy bramkowania są uważane za elektryczną manifestację przegrupowań molekularnych, które poprzedzają lub towarzyszą otwarciu kanału jonowego7. Podczas gdy te pomiary prądu dostarczają cennych informacji na temat funkcji kanału, zarówno prądy jonowe, jak i prądy bramkowania są pośrednimi odczytami między- i wewnątrzcząsteczkowych rearanżacji konformacyjnych kanałów bramkowanych napięciem7.

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce (FSDF; określana również jako fluorometria zacisków napięcia, VCF) została opracowana na początku lat 90. < klasa sup="xref">8 i po raz pierwszy zapewniła możliwość bezpośredniego podglądu lokalnych zmian konformacyjnych i funkcji białka kanałowego w czasie rzeczywistym. Korzystając z kombinacji mutagenezy kanałowej, elektrofizjologii i heterologicznych systemów ekspresji, możliwe jest fluorescencyjne znakowanie i śledzenie ruchomych części określonych kanałów lub receptorów w odpowiedzi na bodziec aktywujący9,10. Podejście to jest szeroko stosowane do badania mechanizmów wykrywania napięcia w kanałach jonowych bramkowanych napięciem8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Aby uzyskać wiarygodne recenzje, zobacz10,20,21,22,23.

Kanały CaV i NaV, kluczowe dla inicjacji i propagacji sygnałów elektrycznych, składają się z głównej podjednostki α1, która posiada centralny por i cztery nieidentyczne domeny wykrywania napięcia2. Oprócz ich odrębnej struktury podstawowej, kanały CaV i NaV są wyrażone jako kompleksy wielopodjednostkowe z podjednostkami pomocniczymi24. Kanały potasowe zależne od napięcia (KV) składają się z czterech podjednostek, które wyglądają jak pojedyncza domena NaV lub CaV25. Tworząca pory i wykrywająca napięcie podjednostka α1 kanałów CaV i NaV jest tworzona przez pojedynczy polipeptyd kodujący cztery indywidualne domeny sześciu unikalnych segmentów transbłonowych (S1-S6; Rysunek 1A)24,26. Obszar składający się z segmentów transbłonowych S1 do S4 tworzy domenę wykrywania napięcia (VSD), a segmenty transbłonowe S5 i S6 tworzą domenę porów26. W każdym VSD α-helisa S4 zawiera dodatnio naładowaną argininę lub lizynę ( Rysunek 1A,B), które poruszają się w odpowiedzi na depolaryzację błony7. Kilka dekad badań i wyniki bardzo zróżnicowanych podejść eksperymentalnych wspierają założenie, że segmenty S4 poruszają się na zewnątrz, generując prądy bramkowania, w odpowiedzi na depolaryzację błony6.

FSDF mierzy zmiany fluorescencji barwnika reagującego tiolem sprzężonego z określoną resztą cysteiny (tj. α-helisą S4) na kanale jonowym lub innym białku, zaprojektowanym za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, ponieważ kanał działa w odpowiedzi na depolaryzację błony lub inne bodźce10. W rzeczywistości FSDF został pierwotnie opracowany w celu zbadania, czy segment S4 w kanałach KV, zaproponowany jako główny czujnik napięcia kanału, porusza się, gdy ładunki bramkowania poruszają się w odpowiedzi na zmiany potencjału błony8,10. W przypadku kanałów jonowych bramkowanych napięciem, FSDF może rozwiązać niezależne rearanżacje konformacyjne czterech VSD (śledząc jeden VSD w danym momencie), jednocześnie z pomiarami funkcji kanału. Rzeczywiście, stosując to podejście, wykazano, że poszczególne VSD wydają się być w różny sposób zaangażowane w określone aspekty aktywacji i dezaktywacji kanałów12,27,28,29,30. Określenie udziału każdego VSD w funkcjonowaniu kanałów ma duże znaczenie i może być wykorzystane do dalszego wyjaśnienia działania kanału i potencjalnej identyfikacji nowych celów dla rozwoju leków.

Użycie FSDF w heterologicznych systemach ekspresji było niezwykle pomocne w pogłębianiu naszego zrozumienia funkcji kanału z perspektywy redukcjonistycznej10,23. Podobnie jak wiele podejść redukcjonistycznych, ma ono zalety, ale ma również ograniczenia. Na przykład jednym z głównych ograniczeń jest częściowa rekonstrukcja nanośrodowiska kanału w układzie heterologicznym. Często kanały jonowe oddziałują z licznymi podjednostkami pomocniczymi i wieloma innymi białkami, które modyfikują ich funkcję31. Zasadniczo, różne kanały i ich podjednostki pomocnicze mogą być wyrażane w układach heterologicznych za pomocą wielu konstruktów kodujących białka lub plazmidów policistronicznych, ale ich natywne środowisko nie może być w pełni odtworzone30,32.

Nasza grupa niedawno opublikowała wariant FSDF w natywnych zdysocjowanych włóknach mięśni szkieletowych do badania wczesnych etapów sprzężenia pobudzenie-skurcz (ECC)33,34, proces, w którym depolaryzacja elektryczna włókien mięśniowych jest powiązana z aktywacją skurczu mięśni35,36. Po raz pierwszy podejście to pozwoliło na śledzenie ruchu poszczególnych czujników napięcia S4 z bramkowanego napięciem kanału Ca2+ typu L (CaV1.1, znanego również jako DHPR) w natywnym środowisku dorosłego zróżnicowanego włókna mięśniowego37. Osiągnięto to, biorąc pod uwagę wiele cech tego typu komórek, w tym aktywność elektryczną komórki umożliwiającą szybką samopropagującą się depolaryzację wywołaną stymulacją, zdolność do ekspresji plazmidu cDNA poprzez elektroporację in vivo, naturalną wysoką ekspresję i organizację kompartmentów kanałów w komórce oraz jego kompatybilność z szybkimi urządzeniami do obrazowania i rejestracji elektrofizjologicznej. Wcześniej używaliśmy szybkiego liniowego skaningowego mikroskopu konfokalnego jako urządzenia wykrywającego37. Teraz przedstawiono odmianę tej techniki wykorzystującą fotodiodę do akwizycji sygnału. Ten oparty na fotodiodach system detekcji może ułatwić wdrożenie tej techniki w innych laboratoriach.

Tutaj opisany jest krok po kroku protokół do wykorzystania FSDF w natywnych komórkach do badania ruchu poszczególnych czujników napięcia z CaV1.1. Podczas gdy kanał CaV1.1 został użyty jako przykład w całym tym manuskrypcie, technika ta może być zastosowana do zewnątrzkomórkowych domen innych kanałów jonowych, receptorów lub białek powierzchniowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejszy protokół został zatwierdzony przez Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Maryland. Poniższy protokół został podzielony na kilka podsekcji, obejmujących (1) projekt konstrukcji molekularnej i wybór barwnika reagującego z cysteiną, (2) elektroporację in vivo, (3) sekcję mięśnia i izolację włókien, (4) opis konfiguracji systemu akwizycji, (5) ocenę aktywności elektrycznej włókien pozytywnych pod kątem wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP) oraz barwienie cysteiny, a także (6) akwizycję i przetwarzanie sygnałów. Dodatkowo na początku każdej sekcji szczegółowo omówiono istotne kwestie związane z zastosowaniem FSDF w włóknie mięśnia szkieletowego. Wszystkie etapy protokołu należy przeprowadzać z zastosowaniem odpowiednich środków ochrony osobistej, w tym fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.

1. Projekt konstrukcji molekularnej i wybór barwnika reagującego z cysteiną

  1. Projekt konstrukcji jest kluczowym elementem sukcesu eksperymentu. Najpierw należy stworzyć konstrukt cDNA CaV1.1 typu dzikiego z fluorescencyjnym znacznikiem i ocenić jego ekspresję w odpowiednim typie komórek. W przypadku włókien mięśniowych wysoką wydajność transfekcji można osiągnąć, stosując plazmid zawierający promotor cytomegalowirusa (CMV). W niniejszym protokole zastosowano już scharakteryzowany króliczy plazmid EGFP-CaV1.138.
    UWAGA: Podczas projektowania konstruktu cDNA w celu wprowadzenia reszty cysteiny do napięciowo zależnego kanału jonowego, pozycja cysteiny jest krytyczna i powinna zostać starannie rozważona. Cysteina powinna być dostępna z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, aby umożliwić reakcję z barwnikiem sprzężonym z grupą tiolową (Rycyna 1C,D) oraz powinna znajdować się blisko regionu S4, aby precyzyjnie śledzić jego ruch w odpowiedzi na depolaryzację. Jednakże, aby umożliwić wygaszanie fluorescencji barwnika w odpowiedzi na ruch białka, wprowadzony fluorofor sprzężony z cysteiną powinien znajdować się na styku dwóch różnych środowisk (np. błony i płynu zewnątrzkomórkowego; Rycyna 1E). Ponadto kluczowe jest upewnienie się, że wstawiona cysteina nie zakłóca funkcji białka.
  2. Aby uzyskać orientację co do właściwej lokalizacji cysteiny, należy zebrać informacje o strukturze kanału lub z innych eksperymentów fluorometrycznych dotyczących powiązanych białek kanałowych. W celu zaprojektowania konstruktów CaV1.1 z inżynieryjnie wprowadzoną cysteiną, należy przeanalizować rozdzielczą strukturę kanału uzyskaną metodą kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM)26 i porównać pozycje wstawienia cysteiny w poprzednich pracach nad powiązanymi kanałami, takimi jak CaV1.212, lub innymi kanałami, takimi jak Shaker11 oraz NaChBac39.
  3. Po wyborze odpowiedniej pozycji cysteiny, należy użyć komercyjnego zestawu do mutogenezy celowanej w celu wprowadzenia substytucji cysteiny. W niniejszym protokole następujące modyfikacje cystein zostały niezależnie wprowadzone na każdym cytosolowym końcu segmentu czujnego napięciowo S4 białka CaV1.1: VSD-I (L159C), VSD-II (L522C), VSD-III (V893C), VSD-IV (S1231C) oraz UniProtKB: P07293 (Rycyna 1B).
  4. W przypadku włókien mięśni szkieletowych należy zastosować 5-karboksytetrametylrodaminy metanotiosulfonian (MTS-5-TAMRA), który wykazuje prawidłową i szybką dyfuzję do systemu błon tubules poprzecznych, będących invaginacjami błony powierzchniowej i głównym miejscem lokalizacji kanałów CaV1.1. MTS-5-TAMRA wykazuje spadek fluorescencji podczas przechodzenia z błony lipidowej do środowiska wodnego (Rycyna 1E).
    UWAGA: Pochodne Dylight lub Alexa-maleimid barwią błonę powierzchniową, ale nie system tubules poprzecznych.

Schemat aktywacji czujnika napięcia w kanałach jonowych; obejmuje sekwencje, reakcje i stany błonowe.
Rysunek 1: Schemat reakcji tiol-cysteina na styku transbłonowej helisy α. (A) Topologia błonowa CaV1.1 typu L. Znaki plus reprezentują reszty zasadowe w helisie α S4, a pomarańczowe gwiazdki wskazują miejsce wprowadzenia cysteiny poprzez mutogenezę celowaną. (B) Dopasowanie sekwencji od S4I do S4IV królika CaV1.1 (UniProtKB: P07293). Pozytywnie naładowane reszty argininy i lizyny, kluczowe dla detekcji napięcia, są wyróżnione na czerwono, natomiast wprowadzone podstawienia cysteiną zaznaczono na pomarańczowo. Panel ten został zaadaptowany z referencji37. (C) Reakcja fluorescencyjnej cząsteczki tiolowej z cysteiną. (D) Schemat ilustrujący insercję mutagenezy cysteinowej w transbłonowej, czułej na napięcie helisie α. Cysteina powinna być ukryta w błonie w stanie spoczynku i stać się dostępna od strony zewnątrzkomórkowej po depolaryzacji (ΔV; I). Śledzenie cysteiny jest zazwyczaj mało prawdopodobne, jeśli docelowa cysteina jest już dostępna z przestrzeni zewnątrzkomórkowej przed depolaryzacją (II) lub jeśli cysteina nie jest dostępna z przestrzeni zewnątrzkomórkowej po depolaryzacji (III). (E) Po reakcji z fluorescencyjną cząsteczką tiolową, ruch helisy α w odpowiedzi na depolaryzację zmniejsza emisję fluorescencji MTS-5-TAMRA. Sygnał fluorometryczny jest generowany przez ruch helisy S4 i następujący po nim ruch barwnika względem płaszczyzny błony oraz środowiska wodnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Elektroporacja in vivo

UWAGA: Eksperymenty z elektroporacją przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem38 z wprowadzonymi modyfikacjami. W następnej sekcji protokół został opracowany dla elektroporacji jednej poduszeczki stopy myszy. Objętości muszą zostać dostosowane w przypadku przygotowania obu łap.

  1. Odmierz 25-100 µL roztworu plazmidu o stężeniu 2-5 µg/µL do probówki 1,5 mL umieszczonej w lodzie.
  2. Przygotuj 0,5 mL roztworu hialuronidazy o stężeniu 2 mg/mL w sterylnym roztworze soli fizjologicznej i przefiltruj roztwór przez sterylny filtr białkowy o niskim wiązaniu (low binding) o rozmiarze porów 0,2 µm, zamocowany do strzykawki 1 mL. Przechowuj w probówce 1,5 mL w temperaturze pokojowej.
  3. Używając skalibrowanego aparatu do znieczulania, znieczul mysz, stosując 3%-4,5% izofluran w O2 (1 L/min), umieszczając zwierzę w komorze znieczulającej. Potwierdź odpowiednie znieczulenie zwierzęcia, uciśnięciem końcówki ogona za pomocą pęsety. Po osiągnięciu optymalnego znieczulenia nie powinna wystąpić żadna reakcja.
  4. Wyjmij mysz z komory znieczulającej i załóż na nią maskę do znieczulania. Połóż zwierzę na plecach na izotermicznej macie grzewczej przykrytej sterylną podkładką laboratoryjną. Kontynuuj znieczulenie za pomocą maski dla gryzoni, stosując 3% izofluran w O2 (1 L/min).
  5. Aby zapobiec wysychaniu oczu podczas procedury, nanieś cienką warstwę kremu do sztucznych łez na oczy zwierzęcia za pomocą sterylnego patyczka z bawełną. Zdezynfekuj łapę zwierzęcia, używając sterylnej chusteczki nasączonej alkoholem etylowym.
  6. Używając sterylnej igły insulinowej 29 G o długości 0,5 cala, pobierz 20 µL roztworu hialuronidazy. Przebij skórę na wysokości pięty i przesuń igłę podskórnie w kierunku podstawy palców (Rycina 2A). Powoli wstrzyknij roztwór, stopniowo cofając igłę. Pod łapą powinien pojawić się bolus lub wybrzuszenie (Rycina 2B).
    UWAGA: W zależności od wieku zwierzęcia i wielkości łapy możliwe jest, że nie uda się wstrzyknąć pełnej ilości roztworu. Często może wystąpić niewielki wyciek w miejscu wstrzyknięcia.
  7. Jeśli jest to wymagane, powtórz krok 2.6 w drugiej łapie, używając innej sterylnej igły po odpowiedniej dezynfekcji łapy, zgodnie z krokiem 2.5.
  8. Przerwij znieczulenie, zdejmując zwierzę z maski, i przenieś mysz do klatki z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Pełna regeneracja po znieczuleniu powinna nastąpić w ciągu ok. 5 min. Postaw probówkę z roztworem plazmidu na stole laboratoryjnym, aby osiągnął temperaturę pokojową.
  9. Po 1 h znieczul zwierzę po raz drugi, połóż je na macie grzewczej i zdezynfekuj łapę zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.5.
  10. Wstrzyknij 10-20 µL konstrukcji cDNA, stosując tę samą technikę, która została opisana w kroku 2.6. Całkowita ilość wstrzykniętej konstrukcji to 50-100 µg na łapę. Jeśli jest to wymagane, powtórz procedurę w przeciwległej łapie, używając innej sterylnej strzykawki.
  11. Utrzymaj zwierzę pod znieczuleniem na izotermicznej macie grzewczej przez 5 min, aby roztwór cDNA mógł równomiernie rozprzestrzenić się w tkance.
  12. Włącz aparat do elektroporacji i podłącz go do podwójnego układu elektrod zgodnie z zaleceniami producenta.
  13. Zdezynfekuj podwójny układ elektrod chusteczką nasączoną alkoholem etylowym. Ustabilizuj łapę jedną ręką i najpierw wprowadź jedną elektrodę pod skórę z tyłu pięty. Następnie wprowadź drugą elektrodę u podstawy palców, upewniając się, że orientacja obu elektrod jest prostopadła do osi stopy (Rycina 2C). Ustaw sondę w pozycji, która nie wymusza ekstremalnego zgięcia stopy lub nogi.
    UWAGA: Wprowadzanie elektrod można ułatwić za pomocą pęsety oraz poprzez regularne ostrzenie końcówek elektrod. W zależności od wieku zwierzęcia wielkość łapy może się różnić, a odstępy między elektrodami powinny być odpowiednio dostosowane.
  14. Przeprowadź elektroporację mięśni, przykładając 20 impulsów o czasie trwania 20 ms każdy, przy częstotliwości 1 Hz. Dla igieł elektrod rozstawionych w odległości 1 cm ustaw napięcie na ~100 V. Napięcie to należy dostosować, jeśli zmieniono rozstaw elektrod, aby uzyskać wartość ~100 V/cm. Przy prawidłowym rozmieszczeniu elektrod podczas podawania impulsów powinno być obserwowane lekkie zgięcie palców.
  15. Jeśli jest to wymagane, powtórz kroki 2.13 i 2.14 w przeciwległej łapie.
  16. Przerwij znieczulenie i umieść zwierzę w klatce, odizolowane od towarzysza, który nie został poddany elektroporacji, z dostępem do pożywienia i wody ad libitum przez 2 h. Pełna regeneracja po znieczuleniu powinna nastąpić w ciągu ok. 10 min. Umieść zwierzę z powrotem w klatce.
    UWAGA: Ekspresja konstrukcji cDNA w dużym stopniu zależy od kodowanego białka. Na ekspresję konstrukcji mogą wpływać m.in. obrót białek, ilość i jakość cDNA oraz promotor plazmidowy. W tym eksperymencie optymalna ekspresja podjednostki α1S kanału CaV1.1 z promotorem CMV wymaga od 4 do 6 tygodni, ale może być wykrywalna od 2 tygodni do nawet 12-15 miesięcy.

Schemat procedury dewaskularyzacji: wstrzyknięcie, depigmentacja, konfiguracja urządzenia elektrycznego.
Rysunek 2: Schemat wstrzykiwania cDNA i rozmieszczenia elektrod do elektroporacji w poduszeczce stopy myszy do przeprowadzenia elektroporacji. (A) Położenie igły podczas wstrzykiwania hialuronidazy i cDNA pod poduszeczkę stopy myszy. Strzałka wskazuje punkt wkłucia przez skórę. (B) Po wstrzyknięciu powinno być przejściowo widoczne lekkie odbarwienie skóry i niewielkie zwiększenie rozmiaru łapy. (C) Rozmieszczenie zestawu elektrod do elektroporacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

3. Disekcja mięśnia i izolacja włókien

UWAGA: Dysocjację włókien mięśni szkieletowych przeprowadzono zgodnie z wcześniejszymi opisami37,40,41 z wprowadzonymi modyfikacjami. W następnej sekcji protokół został dostosowany do dwóch poduszek stopowych myszy.

  1. Przed dysocjacją włókien należy przygotować płytkę pokrytą Sylgardem, dodając jedną część utwardzacza do 10 części elastomeru (% m/m) do plastikowej płytki Petriego o średnicy 60 mm, aby uzyskać grubość ok. 5 mm. Płytkę pokrytą elastomerem należy pozostawić do utwardzenia przez noc przed użyciem. Można ją wykorzystać wielokrotnie, pod warunkiem właściwego przechowywania i dezynfekcji 70% alkoholem etylowym przed i po każdym użyciu.
  2. Przygotuj 4 mg kolagenazy typu I w 2 ml podłoża spinner minimum essential eagle's medium (S-MEM) uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS; stężenie końcowe 2 mg/ml). Przenieś roztwór na niepowlekaną plastikową płytkę o średnicy 35 mm i umieść naczynie w inkubatorze przy 37 °C, 5% CO22.
    UWAGA: S-MEM to zmodyfikowana formulacja MEM bez glutaminy i Ca2+Brak Ca2+2+ ten etap ogranicza kurczenie się włókien podczas trawienia enzymatycznego i trituracji.
  3. Do 60-milimetrowej, niepowlekanej płytki plastikowej dodać 5 ml pożywki S-MEM uzupełnionej o 10% FBS i przechowywać w inkubatorze w 37 °C, 5% CO22.
  4. Uśmierć zwierzęta poprzez uduszenie poprzez CO2 następnie wykonuje się zwichnięcie szyi. Aby ograniczyć zanieczyszczenie podczas izolacji pierwotnych komórek, należy zanurzyć truchło zwierzęcia w 70% alkoholu etylowym na ok. 10 s. Wyjąć i osuszyć truchło papierem chłonnym, a następnie odciąć stopy nożyczkami między kostką a kolanem (Rysunek 3A).
  5. Przymocuj jedną kończynę zwierzęcia, z łapą skierowaną do góry, za pomocą szpilek sekcyjnych do płytki pokrytej elastomerem, pod mikroskopem sekcyjnym przy powiększeniu 10x.
  6. Za pomocą nożyczek sekcyjnych i precyzyjnej pęsety należy usunąć skórę z łapy, aby odsłonić mięsień zginacz krótki palców (FDB) (Rycina 3B). Aby zapobiec wysychaniu tkanki, należy nanieść na mięsień kroplę pożywki S-MEM z 10% FBS za pomocą 1,000 µL pipeta
  7. Na poziomie pięty naciąć ścięgno i ostrożnie wypreparować mięsień FDB, prowadząc od pięty w kierunku palców (Rycina 3B). Podczas przeprowadzania sekcji należy w możliwie największym stopniu unikać napinania mięśnia. Zastosowanie zbyt dużej siły na tkanki spowoduje uszkodzenie włókien mięśniowych. Mięsień należy niezwłocznie umieścić w roztworze kolagenazy.
  8. Powtórz kroki 3.5-3.7 dla stopy przeciwstawnej. Umieść wypreparowany mięsień w roztworze kolagenazy w 37 °C, 5% CO22 inkubować przez 2 h 45 min do 3 h 15 min. Dostosować czas inkubacji w zależności od aktywności enzymatycznej kolagenazy oraz wieku zwierzęcia.
  9. Podczas inkubacji tkanki mięśniowej dodać 300 µL zimnego MEM bez surowicy i antybiotyków na środek szalki z szklanym dnem o średnicy 35 mm. Dodać 2 µL zimnej lamininy w stężeniu 1,20 mg/ml bezpośrednio do MEM. Powtórz ten proces dla pożądanej liczby naczyń. Umieść naczynia w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO22 przez co najmniej 1 h, aby umożliwić polimeryzację lamininy.
  10. Po zakończeniu trawienia enzymatycznego przenieść mięsień do 60 mm naczynia hodowlanego zawierającego S-MEM z 10% FBS, używając szklanej pipety Pasteura o dużym prześwicie (5 mm) z wypolerowanym ogniowo końcem oraz gumowej gruszki.
  11. Używając szklanej pipety Pasteura o mniejszej średnicy (2 mm) z wypalonym końcem oraz lateksowej gruszki, delikatnie rozcieraj mięsień pod mikroskopem sekcyjnym (Rycina 3C). Rozdzielone włókna mięśniowe powinny zacząć odrywać się od tkanki i uwalniać do roztworu.
    UWAGA: Co do zasady zawsze zaleca się ograniczanie liczby cykli trituracji (15–30 przejść pipetą), ponieważ zbyt długotrwała trituracja może doprowadzić do stresu, a nawet uszkodzenia włókien.
  12. Za pomocą pęsety precyzyjnej usuń wszelkie tkanki niemięśniowe, takie jak nerwy, ścięgna lub naczynia krwionośne (Rysunek 3D).
  13. Do każdej szalki z dna szklanego o średnicy 35 mm pokrytej lamininą dodaj 2 ml ocieplonego medium MEM z 2% FBS. Używając 200 µL za pomocą pipety i sterylnej plastikowej końcówki do pipety przenieść rozdzielone włókna mięśniowe do szalki z szklanym dnem o średnicy 35 mm pokrytej lamininą (Rycina 3E).
    UWAGA: Osiągnięcie niskiej gęstości włókien oraz zapewnienie ich odpowiedniego oddzielenia od siebie jest istotne w celu zapobiegania nakładaniu się włókien.
  14. Umieść szalkę z szklanym dnem o średnicy 35 mm w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO22Włókna można wykorzystać w przedziale czasowym od 2 do 20 h.

Schemat preparatyki i hodowli tkanek, obejmujący etapy przygotowania próbek i analizy wzrostu komórek.
Rycina 3; Disekcja i dysocjacja włókien mięśnia FDB. (A) Po przeprowadzeniu disekcji stopy powyżej stawu skokowego (linia przerywana) usuwa się skórę spod łapy, postępując zgodnie z linią przerywaną, aby odsłonić mięsień FDB (B). Mięsień zostaje wypreparowany i umieszczony w roztworze kolagenazy. (C) Po inkubacji mięsień jest homogenizowany w celu dysocjacji i uzyskania pojedynczych włókien mięśniowych. (D) Za pomocą precyzyjnej pęsety usuwa się tkankę niemięśniową oraz zanieczyszczenia przed przeniesieniem włókien mięśniowych do szalki hodowlanej z szklanym dnem pokrytym lamininą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Opis konfiguracji akwizycji

UWAGA: Konfiguracja akwizycji jest zbliżona do opisanej wcześniej42, z wprowadzonymi modyfikacjami (Rysunek 4A).

  1. Włącz wszystkie komponenty: komputer, przetwornik AD/DA i wzmacniacz patch-clamp, mikroskop, stół motorowy, manipulator(y), zasilacz fotodiody, źródło światła, migawkę światła, generator impulsów oraz edytor protokołu.
  2. Aktywuj sygnał wyzwalający OUT logiki tranzystor-tranzystor (TTL) z przetwornika AD/DA w celu sterowania generatorem impulsów, migawką światła i edytorem protokołu.
  3. Użyj sygnału wyjściowego TTL z generatora impulsów i podłącz go do kanału AD wzmacniacza, aby zweryfikować precyzyjne wyzwalanie czasowe. Odpowiednią kontrolę spójności wyzwalania należy dokładnie ocenić przed eksperymentem, aby zapewnić właściwą synchronizację aparatury.
    UWAGA: W przypadku CaV1.1 należy spodziewać się maksymalnego sygnału w czasie krótszym niż 4-10 ms po stymulacji (czas do wystąpienia maksymalnego przemieszczenia ładunku5). Sygnał jest szybki, a precyzyjna rozdzielczość czasowa jest kluczowa dla porównania z innymi pomiarami, takimi jak przejściowy wzrost stężenia wapnia lub przemieszczenie ładunku mierzone via clamp napięciowy.
  4. Aby skupić światło wzbudzenia w konkretnym obszarze lub punkcie włókna (Rysunek 4B), należy użyć przysłony umieszczonej na drodze światła wzbudzenia. Umożliwia to akwizycję sygnału tylko w obszarze, w którym sygnał EGFP-CaV1.1 jest maksymalny (Rysunek 4B).

Schemat zestawu optogenetycznego z LED, filtrami i obiektywem olejowym 60x do analizy wzbudzenia optycznego.
Rysunek 4: Opis systemu rejestracji. (A) Schemat ilustrujący połączenia pomiędzy różnymi komponentami systemu rejestracji. Zestaw składa się z mikroskopu odwróconego ze stolikiem zmotoryzowanym, źródła światła w postaci diody emitującej światło (LED), migawki świetlnej, specjalnie wykonanego obwodu monitorowania światła opartego na fotodiodzie z funkcją podtrzymania sygnału (track and hold)43, przetwornika AD/DA (z wzmacniacza patch clamp), analogowego generatora impulsów, jednostki zewnętrznej stymulacji pola sprzężonej z elektrodami do stymulacji pola, manipulatorami zmotoryzowanymi oraz komercyjnego oprogramowania do akwizycji, synchronizacji i generowania protokołów. Elektroda do stymulacji pola składa się z dwóch drucików platynowych przylutowanych do kabli miedzianych połączonych z generatorem impulsów poprzez złącze BMC. Do detekcji sygnałów EGFP i MTS-5-TAMRA stosuje się odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji. Do wzbudzenia EGFP używa się lampy ksenonowej z filtrem wzbudzenia (Ex) 488 nm (± 20 nm) i filtrem emisji (Em) LP510 nm. W przypadku MTS-5-TAMRA stosuje się źródło światła LED 530 nm i filtr Em LP550 nm. (B) Widok włókna z ekspresją konstruktu EGFP-CaV1.1-cys z dwiema elektrodami do stymulacji pola (czarne kółka) zorientowanymi prawidłowo (lewo) i nieprawidłowo (prawo) względem głównej osi włókien (linia przerywana). Czarne niezakreślone koło reprezentuje obszar akwizycji o średnicy regulowanej przez otwór przysłony, umieszczonej przed źródłem światła. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

5. Ocena aktywności elektrycznej włókien wykazujących ekspresję EGFP oraz barwienie cysteiną

UWAGA: Stymulacja polowa włókien mięśni szkieletowych jest przeprowadzana zgodnie z wcześniej opisaną metodą41 z wprowadzonymi modyfikacjami. Podejście to służy do (1) zidentyfikowania zdrowych, funkcjonalnych i elektrycznie reaktywnych włókien, (2) barwienia włókien fluorescencyjnym barwnikiem reaktywnym wobec cysteiny oraz (3) rejestracji sygnału fluorescencyjnego w odpowiedzi na rozprzestrzeniający się potencjał czynnościowy. Każdy etap tej sekcji oraz następnej powinien być przeprowadzany w warunkach słabego oświetlenia, aby ograniczyć fotowyblakanie barwnika fluorescencyjnego.

  1. Umieścić szalkę z szklanym dnem o średnicy 35 mm zawierającą rozdzielone włókna mięśniowe na stole mikroskopu. Ostrożnie usunąć pożywkę za pomocą pipety 1 000 µL i zastąpić ją 2 mL roztworu Ringera o temperaturze pokojowej (skład patrz: Tabela 1). Może być wymaganych kilka cykli wymiany pożywki, aby całkowicie usunąć oryginalną pożywkę do hodowli komórek zawierającą wolne cysteiny.
  2. Używając manipulatora mechanicznego lub zmotoryzowanego, umieścić dwa druty platynowe prostopadle do dna szalki. Upewnić się, że zaciski elektrod są wyrównane względem osi podłużnej włókna i znajdują się w odległości kilku milimetrów od końców włókna, a odstęp między elektrodami wynosi 5 mm (Rysunek 4B). Dalszą regulację położenia elektrod można przeprowadzić poprzez obrót szalki lub montaż każdej elektrody na niezależnym mikromanipulatorze (Rysunek 4B).
  3. Włączyć światło przechodzące i zlokalizować włókna w polu widzenia, korzystając z obiektywu 20x. Przesunąć kostkę filtra EGFP do drogi światła.
    UWAGA: Korzystając z mikroskopu wyposażonego w epifluorescencję i obiektyw o małym powiększeniu (2x), można ocenić wydajność transfekcji konstruktu w całym mięśniu przed rozdzieleniem włókien poprzez ocenę ekspresji EGFP (Rysunek 5A).
  4. Za pomocą zdalnie sterowanej migawki światła aktywować światło wzbudzenia 488 nm, aby zidentyfikować włókna EGFP-dodatnie. Zapisać współrzędne x-y włókna na szalce, korzystając z zmotoryzowanego stołu mikroskopu. Sygnał EGFP jest często niejednorodny w obrębie włókna (Rysunek 4B). Wycentrować zapisaną pozycję na najsilniejszy sygnał EGFP.
  5. Po zidentyfikowaniu włókien EGFP-dodatnich powrócić do pierwszej zapisanej lokalizacji. Używając ręcznego przełącznika wyzwalającego, podać dwa sekwencyjne impulsy stymulacyjne o czasie trwania 1 ms i amplitudzie 20 V. Ustawić polaryzację impulsów na naprzemienną.
  6. Po stymulacji zaobserwować dwa koncentryczne, jednorodne skurcze włókien w odpowiedzi na dwa impulsy o przeciwnej polaryzacji. Lokalny skurcz lub brak skurczu w odpowiedzi na impulsy o naprzemiennej polaryzacji wskazuje na lokalne, niepropagujące się odpowiedzi pasywne lub brak pobudliwości41. Wykluczyć takie włókna z dalszej części eksperymentu.
  7. Dodać 2 µL roztworu MTS-5-TAMRA 10 mM bezpośrednio do szalki i delikatnie wymieszać pipetą 1 000 µL (stężenie końcowe 10 µM). Należy uważać, aby nie przesunąć szalki, w przeciwnym razie zapisane pozycje włókien zostaną utracone. Inkubować przez 4-5 min, aby umożliwić dyfuzję fluorescencyjnej cząsteczki tiolowej do światła systemu kanalików poprzecznych.
  8. Zastosować bipolarną stymulację repetytywną, aby wywołać następujące po sobie serie potencjałów czynnościowych z częstotliwością 50 Hz przez 300 ms co 1 s przez 5 min.
    UWAGA: Serie impulsów umożliwiają reakcję cystein wstawionych do S4 EGFP-CaV1.1 z MTS-5-TAMRA. Zdolność włókna do mechanicznego skurczu w odpowiedzi na stymulację jest istotna dla wymiany zawartości światła kanalików poprzecznych z środowiskiem zewnętrznym.
  9. Usunąć roztwór barwiący z szalki pipetą 1 000 µL i zastąpić go 2 mL roztworu Ringera o temperaturze pokojowej. Może być wymaganych dwa lub trzy cykle, aby całkowicie usunąć niezwiązany MTS-5-TAMRA. Pozostawić zabarwione włókno na co najmniej 10 min w celu regeneracji po protokole barwienia.
  10. Podobnie jak w kroku 5.6, ponownie ocenić stan włókna i jego aktywność elektryczną, obserwując symetryczny skurcz włókna w odpowiedzi na naprzemienną polaryzację. Wykluczyć z dalszej części eksperymentu włókna, które nie reagują na obie stymulacje.
  11. Przesunąć kostkę filtra MTS-5-TAMRA do drogi światła. Za pomocą zdalnie sterowanej migawki światła aktywować światło wzbudzenia 533 nm, aby potwierdzić jednorodne barwienie włókien MTS-5-TAMRA.
    UWAGA: Po barwieniu MTS-5-TAMRA zarówno cysteiny zmodyfikowane, jak i endogenne reagują z pochodną maleimidu (Rysunek 5B). W związku z tym trudno jest ocenić prawidłową reakcję z interesującą nas cysteiną. CaV1.1 jest ekspresjonowany głównie w kanalikach poprzecznych, tworząc charakterystyczny wzór podwójnego pasma. Używając mikroskopu konfokalnego lub epifluorescencyjnego, można wykorzystać obraz x-y do potwierdzenia prawidłowego barwienia oraz wniknięcia i dyfuzji MTS-5-TAMRA do kanalików poprzecznych (Rysunek 5C).

6. Akwizycja i przetwarzanie sygnału

UWAGA: Przed przeprowadzeniem pomiarów fluorometrycznych należy starannie zaplanować akwizycję sygnału, aby uzyskać optymalny stosunek sygnału do szumu. Niższe częstotliwości próbkowania umożliwiają detekcję większej ilości światła, jednocześnie zmniejszając liczbę punktów rejestrowanych podczas reorganizacji konformacyjnej białka. W przypadku EGFP-CaV1.1-cys ruch ładunków indukowany kształtem potencjału czynnościowego zachodzi w czasie ~1-10 ms37. Aby uzyskać wiele punktów pozwalających śledzić przebieg tego ruchu w czasie, akwizycję ustawiono na 50 µs na punkt.

  1. Umieść włókno na środku pola widzenia, korzystając z odpowiedniego układu powiększającego. W tych eksperymentach zastosowano odwrócony obiektyw olejowy 60x o aperturze numerycznej (NA) 1,4. Zoptymalizuj oświetlenie i pozycję włókna za pomocą zmotoryzowanego stolika i przysłony, aby oświetlić obszar kolisty o średnicy odpowiadającej średnicy włókna, w miejscu, gdzie sygnał EGFP jest maksymalny (Rycina 4B).
  2. Po ustawieniu włókna do akwizycji, zorientuj dwa niezależnie zamocowane platynowe druty do stymulacji polowej na obu końcach włókna. Ustaw druty w linii prostej wzdłuż głównej osi włókien, zachowując odstęp 5 mm między nimi, tak aby włókno znajdowało się w centrum (Rycina 4B).
  3. Ustaw filtry wzbudzenia i emisji dla akwizycji zgodnie z parametrami dla MTS-5-TAMRA. Rozpocznij eksperyment, wykonując protokół zapisany w oprogramowaniu do akwizycji. Ten krok uruchamia wszystkie urządzenia wykonawcze (tj. edytor protokołu, migawkę światła, generator impulsów).
    UWAGA: Protokół ten przewiduje krótki okres (tj. 10 ms) akwizycji linii bazowej przed podaniem stymulacji polowej, aby umożliwić późniejsze pomiary fluorescencji spoczynkowej.
  4. Wzbudź pojedynczy potencjał czynnościowy lub serię potencjałów za pomocą prostokątnego impulsu 20 V o czasie trwania 0,5 lub 1 ms. Zminimalizuj całkowity czas akwizycji w możliwie największym stopniu, aby uniknąć blaknięcia sygnału.
    UWAGA: Nawet przy rejestracji w centrum włókna może wystąpić sygnał fluorescencyjny związany z ruchem, który może być mylony z sygnałem fluorescencyjnym wynikającym ze zmiany konformacyjnej białka-fluoroforu (Rycina 5D). Sygnał indukowany skurczem powinien być opóźniony w stosunku do oczekiwanego czasu przemieszczania się ładunku po stymulacji37.
  5. Aby dodatkowo odróżnić sygnał wynikający z ruchów S4 od sygnału spowodowanego skurczem włókna, dodaj 1 µL 100 mM N-benzylo-p-toluensulfonamidu (BTS; końcowe stężenie 50 µM) do roztworu rejestracyjnego w celu zminimalizowania odpowiedzi skurczowych i powtórz krok 6.4. Sygnały wykryte po raz drugi po farmakologicznej immobilizacji włókna odpowiadają ruchowi molekularnemu znakowanej helisy S4 (Rycina 5D).
    UWAGA: W kontrolnej grupie EGFP-CaV1.1 bez zmodyfikowanej cysteiny nie powinien być wykryty żaden sygnał po stłumieniu ruchu za pomocą BTS.
  6. Używając tych samych ustawień, zarejestruj analogiczny sygnał w miejscu na szalce, gdzie nie znajdują się włókna mięśniowe ani resztki komórkowe, aby uzyskać wartość fluorescencji tła.
  7. Zaimportuj do oprogramowania do analizy danych pliki zawierające przebieg czasowy surowej fluorescencji włókna [Fr(t)] oraz fluorescencji tła [Fb(t)]. Oblicz średnią z kolumny zawierającej Fb(t), aby uzyskać jednorodną wartość Fb. Odejmij Fb od Fr(t), aby otrzymać wartości bezwzględnej fluorescencji [F(t)]. W razie potrzeby wygładź otrzymany sygnał za pomocą funkcji wygładzającej.
    UWAGA: Przy tym systemie detekcji i częstotliwości akwizycji zdecydowaliśmy się zastosować funkcję uśredniania sąsiednich wartości z oknem 50 punktów do wygładzania.
  8. Oblicz średnią wartości F(t) linii bazowej w przedziale czasu 10 ms przed stymulacją, aby uzyskać wartość fluorescencji spoczynkowej (F0). Odejmij F0 od wygładzonego F(t), aby uzyskać bezwzględną zmianę fluorescencji [ΔF(t)]. Następnie, aby wyrazić zmianę fluorescencji w czasie względem fluorescencji spoczynkowej (ΔF/F0), podziel ΔF(t) przez F0.
  9. Aby ocenić stopień blaknięcia sygnału, wyznacz dwa punkty na sygnale ΔF/F0 w czasie – przed stymulacją i po stymulacji, z dala od sygnału fluorometrycznego. Dopasuj funkcję liniową do tych dwóch punktów, aby uzyskać przebieg linii bazowej. Odejmij linię bazową od ΔF/F0 w czasie, aby skorygować blaknięcie sygnału.
  10. Odejmij od kolumny czasu opóźnienie między rozpoczęciem akwizycji a sygnałem zwrotnym ze stymulacji, aby t = 0 odpowiadało rozpoczęciu stymulacji elektrycznej.
    UWAGA: Aby umożliwić wielokrotne porównania sygnałów, często konieczna jest normalizacja amplitudy sygnału. W zależności od celu eksperymentu można stosować różne podejścia. W następnej sekcji wyników interesowała nas kinetyka sygnału, dlatego zastosowaliśmy prostą metodę polegającą na normalizacji każdego sygnału przez osiągniętą wartość minimalną (tj. szczyt ujemny).

Analiza mikroskopowa fluorescencji w tkance serca z wynikami elektrofizjologicznymi i wykresem sygnału.
Rysunek 5: Obrazowanie włókna mięśniowego wykazującego ekspresję EGFP-CaV1.1-cys bez i z barwieniem MTS-5-TAMRA oraz reprezentatywny surowy zapis fluorometryczny. (A) Przykłady obrazów w świetle przechodzącym (lewo) i fluorescencyjnych (prawo) wypreparowanego, niedysocjowanego mięśnia wykazującego ekspresję konstruktu EGFP-CaV1.1 VSD-III. Pasek skali: 100 µm. (B) Reprezentatywny obraz włókna mięśniowego wykazującego ekspresję konstruktu EGFP-CaV1.1 VSD-III przed (lewo) i po (prawo) barwieniu MTS-5-TAMRA. Endogenne cysteiny włókien nietransfekowanych są również barwione przez barwnik. Pasek skali: 30 µm. (C) Obraz konfokalny konstruktu EGFP-CaV1.1 VSD-III (lewo) oraz barwienia MTS-5-TAMRA (prawo) wykazuje klasyczny wzór podwójnego pasma charakterystyczny dla lokalizacji CaV1.1 w systemie rurek poprzecznych włókna mięśniowego (dół). Pasek skali: 25 µm. (D) Reprezentatywny zapis fluorometryczny w odpowiedzi na dwa bodźce, pomierzony za pomocą fotodiody przed (ślad niebieski) i po (ślad czerwony) unieruchomieniu włókna za pomocą N-benzylo-p-toluenosulfonamidu (BTS). Górna czarna linia wskazuje protokół depolaryzacji włókna via stymulacja polem zewnętrznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Gdy w odpowiedzi na powtarzalną stymulację polową wyzwalane są propagujące potencjały czynnościowe, możliwe jest śledzenie ruchu konkretnego czujnika napięcia w odpowiedzi na określoną częstotliwość depolaryzacji. Jak pokazano na Rysunku 6A, ruch helis znakowanych VSD-II można śledzić w odpowiedzi na każdą z dwóch następujących po sobie depolaryzacji przy częstotliwości 10 Hz (tj. w odstępach 100 ms). Wypalenie sygnału można skorygować poprzez odjęcie linii bazowej od zapisu (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisano krok po kroku protokół przeprowadzania FSDF we włóknach mięśniowych w celu badania ruchów poszczególnych czujników napięcia z kanału CaV1.1. Mimo że liczba etapów i różnorodność podejść, które są łączone w tej technice, może wydawać się złożona, większość z tych technik jest często rutynowo stosowana w laboratoriach biofizyków/biologów komórkowych. W związku z tym pozorna złożoność polega głównie na połączeniu wszystkich różnych podejść w jednej zintegrowanej technice. Często przy przepro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. J. Vergara (University of California, Los Angeles) za udostępnienie plazmidu dzikiego typu EGFP-CaV1.1 (królik). Dziękujemy Wydziałowi Fizjologii, Laboratorium Elektroniki Uniwersytetu Yale, a w szczególności Henrikowi Abildgaardowi za zaprojektowanie i zbudowanie fotodiody z obwodem torowania i podtrzymywania. Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health R01-AR075726 i R01-NS103777

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HialuronidazaSIGMA ALDRICHH3884-50mg
0,5 ml Probówka EppendorfMillipore SigmaEP022363719-500EA
Strzykawka 1 mlMillipore SigmaZ683531-100EArurkowa końcówka poślizgowa
Sterylna igła i strzykawka do insuliny o długości 1/2 cala i rozmiarze 29 BectonDikinson324702
35 mm niepowlekana plastikowa płytkaFalcon, Corning353001
60 mm niepowlekana płyta z tworzywa sztucznegoFalcon, Corning351007
Bicz alkoholowyPDIB60307
Alexa-533 kostka LPChroma49907Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Lampa łukowaSutter InstrumetsLB-LS 672
Krem ze sztucznymi łzamiAkornNDC 59399-162-35
Szkło borokrzemianowe Pipeta Pasteura 5 3/4"VWR14672-200
BTS (N-benzylo-p-toluenosulfonamid)SIGMA ALDRICH203895
kolagenaza typ ISIGMA ALDRICHC0130-1g
Bawełniana końcówkaVWRVWR-76048-960-BG
Układ podwójnych elektrod  (do elektroporacji)BTX harvard apparatus45-012010mm 2 końcówki igłowe
EGFP kostkaChroma39002ATEx: 480/30x; Zobacz materiał BS 505; Em: 535/40m
Aparatura do elektroporacjiBTX harvard apparatusECM 830
EPC10HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)895000
FBSBiotechne,  R& D SystemsRND-S11150HPłodowa surowica bydlęca - Premium, szkło inaktywowane termicznie
Nakrywka 35 mmMatTek Life ScienceP35G-1.5-14-C
IzofluranFluriso (Izofluran) Płyn do inhalacji502017-250ml
Izotermiczna poduszka grzewczaBraintree scientific inc39DP
LamininThermo FisherINV-23017015Białko myszy Laminin, żarówka z naturalnego
lateksuVWR82024-554
LED 530 nmSutter Instrumets5A-530
Białko o niskim poziomie wiązania 0,2 i mu; m sterylny filtrPallFG4579acrodisk  filtr strzykawkowy 0,2um membrana suporowa niskie wiązanie białek niepirogenny
MEMInvitrogenINV-11380037
MTS-5-TAMRABiotium89410-784MTS-5-TAMRA
Oprogramowanie analityczne OriginProOriginLab CorporationOriginPro 2022 (64-bitowa) SR1
FotodiodaWykonane na zamówienieNA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17OlympusBFPC2
Drut platynowy 0,5 mm, 99.9 % na bazie metaliSIGMA267228-1GDo produkcji elektrody do stymulacji pola
Generator impulsówWPIPulsemaster A300
Sterownik napędu migawkiUniblitz100-2B
ShuttterUniblitzVS2582T0-100
S-MEMInvitrogenINV-11380037
Sterylna podkładka stołowaVWRDSI-B1623
Sterylna sól fizjologicznaSIGMA ALDRICHS8776
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning1419447-1198
Waporyzator do znieczuleniaParkland ScientificV3000PK
Generator napięciaCustom MadeNA

Bibliografia

  1. Catterall, W. A., Wisedchaisri, G., Zheng, N. The chemical basis for electrical signaling. Nature Chemical Biology. 13 (5), 455-463 (2017).
  2. Armstrong, C. M., Hille, B. Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron. 20 (3), 371-380 (1998).
  3. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  4. Armstrong, C. M., Bezanilla, F. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature. 242 (5398), 459-461 (1973).
  5. Schneider, M. F., Chandler, W. K. Voltage dependent charge movement of skeletal muscle: a possible step in excitation-contraction coupling. Nature. 242 (5395), 244-246 (1973).
  6. Bezanilla, F. Gating currents. The Journal of General Physiology. 150 (7), 911-932 (2018).
  7. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiological Reviews. 80 (2), 555-592 (2000).
  8. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  9. Akabas, M. H. Cysteine modification: probing channel structure, function and conformational change. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 25-54 (2015).
  10. Priest, M., Bezanilla, F. Functional site-directed fluorometry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 55-76 (2015).
  11. Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
  12. Pantazis, A., Savalli, N., Sigg, D., Neely, A., Olcese, R. Functional heterogeneity of the four voltage sensors of a human L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 18381-18386 (2014).
  13. Savalli, N., Kondratiev, A., Toro, L., Olcese, R. Voltage-dependent conformational changes in human Ca(2+)- and voltage-activated K(+) channel, revealed by voltage-clamp fluorometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (33), 12619-12624 (2006).
  14. Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
  15. Bannister, J. P. A., Chanda, B., Bezanilla, F., Papazian, D. M. Optical detection of rate-determining ion-modulated conformational changes of the ether-à-go-go K+ channel voltage sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (51), 18718-18723 (2005).
  16. Bruening-Wright, A., Elinder, F., Larsson, H. P. Kinetic relationship between the voltage sensor and the activation gate in spHCN channels. The Journal of General Physiology. 130 (1), 71-81 (2007).
  17. Osteen, J. D., et al. KCNE1 alters the voltage sensor movements necessary to open the KCNQ1 channel gate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22710-22715 (2010).
  18. Smith, P. L., Yellen, G. Fast and slow voltage sensor movements in HERG potassium channels. The Journal of General Physiology. 119 (3), 275-293 (2002).
  19. Gonzalez, C., Koch, H. P., Drum, B. M., Larsson, H. P. Strong cooperativity between subunits in voltage-gated proton channels. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 51-56 (2010).
  20. Gandhi, C. S., Olcese, R. The voltage-clamp fluorometry technique. Methods in Molecular Biology. 491, 213-231 (2008).
  21. Horne, A. J., Fedida, D. Use of voltage clamp fluorimetry in understanding potassium channel gating: a review of Shaker fluorescence data. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 87 (6), 411-418 (2009).
  22. Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
  23. Cowgill, J., Chanda, B. The contribution of voltage clamp fluorometry to the understanding of channel and transporter mechanisms. The Journal of General Physiology. 151 (10), 1163-1172 (2019).
  24. Catterall, W. A., Lenaeus, M. J., Gamal El-Din, T. M. Structure and pharmacology of voltage-gated sodium and calcium channels. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 60, 133-154 (2020).
  25. MacKinnon, R. Determination of the subunit stoichiometry of a voltage-activated potassium channel. Nature. 350 (6315), 232-235 (1991).
  26. Wu, J., et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 at 3.6 Å resolution. Nature. 537 (7619), 191-196 (2016).
  27. Capes, D. L., Goldschen-Ohm, M. P., Arcisio-Miranda, M., Bezanilla, F., Chanda, B. Domain IV voltage-sensor movement is both sufficient and rate limiting for fast inactivation in sodium channels. The Journal of General Physiology. 142 (2), 101-112 (2013).
  28. Cha, A., Ruben, P. C., George, A. L., Fujimoto, E., Bezanilla, F. Voltage sensors in domains III and IV, but not I and II, are immobilized by Na+ channel fast inactivation. Neuron. 22 (1), 73-87 (1999).
  29. Muroi, Y., Arcisio-Miranda, M., Chowdhury, S., Chanda, B. Molecular determinants of coupling between the domain III voltage sensor and pore of a sodium channel. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (2), 230-237 (2010).
  30. Savalli, N., et al. The distinct role of the four voltage sensors of the skeletal CaV1.1 channel in voltage-dependent activation. The Journal of General Physiology. 153 (11), e202112915(2021).
  31. Muller, C. S., et al. Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (34), 14950-14957 (2010).
  32. Perni, S., Lavorato, M., Beam, K. G. De novo reconstitution reveals the proteins required for skeletal muscle voltage-induced Ca2+ release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (52), 13822-13827 (2017).
  33. Beam, K. G., Horowicz, P. Excitation-Contraction Coupling in Skeletal Muscle. , McGraw-Hill. New York. (2004).
  34. Schneider, M. F., Hernandez-Ochoa, E. O. Muscle: Fundamental Biology and Mechanisms of Disease. , Academic Press, Elsevier. 811-822 (2012).
  35. Rios, E., Pizarro, G. Voltage sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiological Reviews. 71 (3), 849-908 (1991).
  36. Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage sensing mechanism in skeletal muscle excitation-contraction coupling: coming of age or midlife crisis. Skeletal Muscle. 8 (1), 22(2018).
  37. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of CaV1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (40), e2026116118(2021).
  38. DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1520(2009).
  39. Blunck, R., Starace, D. M., Correa, A. M., Bezanilla, F. Detecting rearrangements of shaker and NaChBac in real-time with fluorescence spectroscopy in patch-clamped mammalian cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3966-3980 (2004).
  40. Liu, Y., Carroll, S. L., Klein, M. G., Schneider, M. F. Calcium transients and calcium homeostasis in adult mouse fast-twitch skeletal muscle fibers in culture. The American Journal of Physiology. 272 (6), C1919-C1927 (1997).
  41. Hernandez-Ochoa, E. O., Vanegas, C., Iyer, S. R., Lovering, R. M., Schneider, M. F. Alternating bipolar field stimulation identifies muscle fibers with defective excitability but maintained local Ca(2+) signals and contraction. Skeletal Muscle. 6, 6(2016).
  42. Klein, M. G., Simon, B. J., Szucs, G., Schneider, M. F. Simultaneous recording of calcium transients in skeletal muscle using high- and low-affinity calcium indicators. Biophysical Journal. 53 (6), 971-988 (1988).
  43. Irving, M., Maylie, J., Sizto, N. L., Chandler, W. K. Intrinsic optical and passive electrical properties of cut frog twitch fibers. The Journal of General Physiology. 89 (1), 1-40 (1987).
  44. Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca(2+) release in adult skeletal muscle fibres. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 108 (3), 98-118 (2012).
  45. Banks, Q., et al. Optical recording of action potential initiation and propagation in mouse skeletal muscle fibers. Biophysical Journal. 115 (11), 2127-2140 (2018).
  46. Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap II: more recent advances in skeletal muscle excitation-contraction coupling. The Journal of Experimental Biology. 219, 175-182 (2016).
  47. Bannister, R. A., Beam, K. G. Ca(V)1.1: The atypical prototypical voltage-gated Ca2+ channel. Biochimica et Biophysica Acta. 1828 (7), 1587-1597 (2013).
  48. Beard, N. A., Wei, L., Dulhunty, A. F. Ca(2+) signaling in striated muscle: the elusive roles of triadin, junctin, and calsequestrin. European Biophysics Journal. 39 (1), 27-36 (2009).
  49. Polster, A., Perni, S., Bichraoui, H., Beam, K. G. Stac adaptor proteins regulate trafficking and function of muscle and neuronal L-type Ca2+ channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 602-606 (2015).
  50. Perni, S. The builders of the junction: roles of Junctophilin1 and Junctophilin2 in the assembly of the sarcoplasmic reticulum-plasma membrane junctions in striated muscle. Biomolecules. 12 (1), 109(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Napięziozależne kanały jonowesprzężenie wzbudzenie-skurcztechniki elektrofizjologiczneznakowanie białkami fluorescencyjnymimutogeneza cysteinowaaktywacja kanałów wapniowychtransfekcja włókien mięśniowychmikroskopia konfokalna
Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.