Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena wpływu mszyc grzybów entomopatogenicznych na owada partenogenetycznego, mszycę musztardową, Lipaphis erysimi (Kalt.)

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65312

⸱

21 lipca 2023

 , 
1Department of Entomology, National Chung Hsing University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia zoptymalizowany system testów biologicznych z oderwanymi liśćmi do oceny skuteczności grzybów entomopatogenicznych (EPF) przeciwko mszycy musztardowej (Lipaphis erysimi (Kalt.)), owadowi partenogenetycznemu. Metoda ta przedstawia w zarysie proces gromadzenia danych podczas eksperymentów na szalce Petriego, umożliwiając naukowcom konsekwentne mierzenie zjadliwości EPF wobec mszyc musztardowych i innych owadów partenogenetycznych.

Streszczenie

Mszyca musztardowa (L. erysimi) jest szkodnikiem, który atakuje różne rośliny krzyżowe i przenosi wirusy roślinne. Aby osiągnąć przyjazną dla środowiska ochronę przed szkodnikami, grzyby entomopatogeniczne (EPF) są potencjalnymi środkami zwalczania mikrobiologicznego do zwalczania tego szkodnika. W związku z tym przed zastosowaniem w terenie konieczne jest badanie przesiewowe zjadliwości izolatów EPF na szalce Petriego. Jednak mszyca musztardowa jest owadem partenogenetycznym, co utrudnia rejestrowanie danych podczas eksperymentów na szalce Petriego. Aby rozwiązać ten problem, opracowano zmodyfikowany system do testów biologicznych na oderwanych liściach, wykorzystując mikrorozpylacz do inokulacji konidiów na mszycach i zapobiegania utonięciom poprzez ułatwienie suszenia powietrzem po zawieszeniu zarodników. System utrzymywał wysoką wilgotność względną przez cały okres obserwacji, a tarcza liściowa pozostawała świeża przez ponad dziesięć dni, umożliwiając partenogenetyczną reprodukcję mszyc. Aby zapobiec gromadzeniu się potomstwa, wdrożono proces codziennego usuwania za pomocą pędzla malarskiego. Protokół ten demonstruje stabilny system oceny zjadliwości izolatów EPF wobec mszyc gorczycowych lub innych mszyc, umożliwiając wybór potencjalnych izolatów do zwalczania mszyc.

Wprowadzenie

Mszyca musztardowa (L. erysimi) jest znanym szkodnikiem, który atakuje różne rośliny krzyżowe, powodując znaczne straty ekonomiczne1. Chociaż zalecono kilka systematycznych środków owadobójczych w celu zwalczania inwazji mszyc, częste stosowanie tych insektycydów budzi obawy o odporność na pestycydy2,3. W związku z tym, jeśli chodzi o przyjazną dla środowiska ochronę przed szkodnikami, grzyby entomopatogeniczne (EPF) mogą służyć jako odpowiednia alternatywna strategia zwalczania. EPF jest patogenem owadziem, który ma zdolność infekowania żywicieli poprzez wnikanie w ich skórki, co czyni go silnym środkiem do zwalczania mszyc i innych owadów wysysających rośliny4. Co więcej, EPF okazał się wykonalną i zrównoważoną techniką ochrony przed szkodnikami, oferującą korzyści, takie jak antagonizm patogenów roślinnych i promowanie wzrostu roślin5.

EPF można uzyskać za pomocą przynęty na owady lub wyizolować ze zwłok owadów na polu6,7. Jednak przed dalszym stosowaniem izolatów grzybów konieczne jest badanie przesiewowe chorobotwórczości. Przeprowadzono kilka badań nad skutecznością EPF przeciwko mszycom, które są znaczącymi szkodnikami upraw, które mogą powodować poważne szkody8,9. Mszyce musztardowe, wśród różnych gatunków mszyc, zostały przetestowane pod kątem wrażliwości na kilka szczepów Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., a nawet Alternaria, która jest znana przede wszystkim jako grzyb saprofityczny i chorobotwórczy dla roślin, ale wykazała pewne śmiertelne działanie przeciwko mszycom musztardowym10,11,12.

Aby ocenić skuteczność EPF przeciwko mszycom w warunkach laboratoryjnych, testy biologiczne można podzielić na dwie główne części: komorę inokulacyjną i inokulację grzybów. Obecny protokół opisuje budowę komory do zaszczepiania, w której mszyce mogą być utrzymywane przy użyciu różnych metod, takich jak wycięty liść z ogonkiem owiniętym wilgotną bawełną, wycięty krążek liściowy z szalką Petriego wyłożoną zwilżoną bibułą filtracyjną, bezpośrednia konserwacja roślin doniczkowych lub wycięta tarcza liściowa osadzona w agarze wodnym na szalce Petriego lub pojemniku10, 11,13. Typowe metody inokulacji grzybów obejmują opryskiwanie konidiów, zanurzanie mszyc w zawiesinie konidiów, zanurzanie liści w zawiesinie konidiów i inokulację endofitów roślinnych11,14,15,16. Chociaż istnieją różne metody inokulacji, testy biologiczne powinny symulować warunki aplikacji w terenie. Na przykład w przypadku metody zanurzania w liściach12,17, można ocenić skuteczność EPF, ale ponieważ mszyce atakują liście obciążone grzybem, grzbietowa strona mszycy, która jest preferencyjnym miejscem penetracji, zwykle nie jest narażona na działanie grzyba.

Aby ocenić efekt afidiobójczy EPF w warunkach laboratoryjnych, ten protokół sugeruje użycie metody oderwanych liści opisanej przez Yokomi i Gottwalda18 z pewnymi modyfikacjami, a następnie inokulację konidiów za pomocą mikro-opryskiwacza. Ta metoda utrzymuje około 100% wilgotności w komorze testu biologicznego przez co najmniej siedem dni bez konieczności dodatkowego uzupełniania wody18,19. Dodatkowo, ograniczenie mszyc do jednej powierzchni zapewnia ich ekspozycję na opryskiwanie konidiami i ułatwia obserwacje20. Jednak mszyce mogą utknąć w odsłoniętej powierzchni agaru podczas poruszania się w komorze zaszczepiającej. Ponadto rejestrowanie danych w eksperymencie na szalce Petriego z mszycami musztardowymi, które są owadami partenogenetycznymi, może być trudne ze względu na ich szybki rozwój i rozmnażanie. Trudno jest odróżnić zaszczepione dorosłe osobniki od ich potomstwa bez usunięcia. Szczegóły dotyczące tego, jak postępować na tym etapie, są rzadko wspominane, a niektóre niespójne czynniki, takie jak powierzchnia zużycia liści, muszą zostać zoptymalizowane.

Ten protokół demonstruje stabilny system do badania zjadliwości izolatów EPF przeciwko mszycom musztardowym, umożliwiając wybór potencjalnych izolatów przeciwko różnym gatunkom mszyc z obszernej biblioteki EPF. Można zidentyfikować mszyce zebrane w terenie i ustalić wystarczającą laboratoryjną populację mszyc musztardowych, aby ocenić działanie mszyc na mszyce przy użyciu łatwej i wykonalnej metodologii o spójnych wynikach. Mszyce rozwinęły wiele mechanizmów ewolucyjnych w odpowiedzi na intensywne i powtarzające się naciski antropogeniczne w agroekosystemach, co stanowi wyzwanie dla bezpieczeństwa żywnościowego9. W związku z tym opisana metoda może zostać rozszerzona o ocenę potencjalnych izolatów EPF w odniesieniu do różnych gatunków mszyc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Kompletny schemat blokowy jest pokazany w Rysunek 1.

1. Zbieranie i pielęgnacja mszyc musztardowych

  1. Kolekcja mszyc musztardowych
    1. Odwróć liście i sprawdź wzrokowo, czy mszyce gorczycowe nie są poszkodowane na uprawach krzyżowych na polu.
    2. Zapisz informacje o miejscu pobierania próbek (tj. GPS) i roślinie żywicielskiej (roślinach) żywicielskiej oraz potwierdź historię stosowania insektycydów z rolnikami.
    3. Za pomocą aspiratora do owadów lub cienkiego pędzla malarskiego (patrz tabela materiałów) zebrać około 50 mszyc gorczycowych do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z upraw kapustnych na polu i przynieść próbkę do laboratorium w ciągu 3 godzin.
    4. Przygotuj tymczasową szalkę Petriego do konserwacji z wyciętymi liśćmi krzyżowymi i bibułą filtracyjną infiltracyjną infiltrowaną wodą na dnie.
    5. Umieść pięć mszyc na tymczasowej szalce Petriego w temperaturze pokojowej (25 ± 2 °C) o wilgotności względnej 70% i fotoperiodzie 12:12 h (światło: ciemność) przez 14 dni, aby potwierdzić, że mszyce są naturalne wolne od wrogów przed dalszą hodowlą.
      UWAGA: Aby upewnić się, że mszyce zbierane na polu są wolne od naturalnych wrogów, takich jak osy parazytoiczne lub grzyby entomopatogeniczne, ważne jest, aby potwierdzić brak tych organizmów przed przystąpieniem do dalszej hodowli.
  2. Utrzymanie mszyc musztardowych
    UWAGA: Aby utrzymać mszyce musztardowe, używaj liści krzyżowych wolnych od pestycydów (w tym biopestycydów).
    1. Zapewnić stabilne i wystarczające zaopatrzenie w liście krzyżowe (około 25 cm2).
      UWAGA: Zdobądź liście krzyżowe z rynku lub wyhoduj rośliny. Przed długotrwałym, masowym hodowaniem mszyc musztardowych można przetestować kilka różnych rodzajów krzyżówek, aby znaleźć odpowiedniego krzyżowego. Po ustaleniu gatunku liścia krzyżowego nie zmieniaj go. W niniejszej pracy wykorzystano Komatsunę (Brassica rapa var. perviridis) w fazie 6-7 liści (patrz tabela materiałów). Dodatkowo wyrzuć 2-3 najstarsze liście.
    2. Dodaj wodę, zanim bibuła filtracyjna na dole całkowicie wyschnie.
    3. Codziennie obserwuj gęstość zaludnienia mszyc musztardowych. Populacja powinna wzrosnąć do 2-3 razy po 7 dniach.
    4. Gdy liczba mszyc wzrośnie, pokrój pierwotnie wycięte liście z mszycami musztardowymi na 4-6 mniejszych kawałków i włóż każdy mały kawałek liścia z mszycami musztardowymi na jedną szalkę Petriego ze świeżo wyciętymi liśćmi i bibułą filtracyjną infiltracyjną infiltrowaną wodą.
    5. Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 25 °C z fotoperiodem 12:12 h (światło:ciemność) i codziennie obserwować gęstość populacji mszyc musztardowych.
    6. Usuń pierwotnie wycięte liście po tym, jak większość mszyc migruje do świeżych wyciętych liści, zanim oryginalne liście zgniją.

2. Identyfikacja molekularna mszycy musztardowej

UWAGA: Aby potwierdzić gatunek mszycy musztardowej zebranej w terenie, przeprowadzono identyfikację molekularną przy użyciu dwóch markerów molekularnych: sekwencji charakteryzującej amplifikowany region (SCAR) opartej na A05Le, zaprojektowanej przez Lu et al.21, oraz regionu mszycy musztardowej podjednostki 1 (COI) mszycy musztardowej.

  1. Ekstrakcja genomowego DNA mszycy musztardowej
    1. Zbierz około 50 mszyc w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Mszyce używane do identyfikacji molekularnej powinny być potomkami jednej mszycy, a różne stadia mogą być również zebrane w tej samej probówce w celu ekstrakcji DNA.
    2. Homogenizuj mszyce za pomocą tłuczka do granulek i wyekstrahuj DNA za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA Gene-Spin, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
    3. Eluować genomowe DNA za pomocą 50 μl podgrzanej wody wolnej od nukleaz.
  2. Amplifikacja PCR i sekwencjonowanie DNA
    1. Amplifikuj docelowe sekwencje DNA z genomowego DNA mszyc za pomocą PCR Master Mix (2x) z parami starterów A05LeF/A05LeR i LeCO1F/LeCO1R (Tabela 1) z różnymi programami PCR21.
      UWAGA: Reakcja PCR o całkowitej objętości 20 μL składa się z 2 μl matrycy genomowego DNA mszycy, 1 μl starterów do przodu i 1 μl odwróconych starterów, 10 μl PCR Master Mix (patrz tabela materiałów) i 6 μL ddH2O.
    2. Przeprowadzić PCR w termocyklerze (patrz tabela materiałów) z następującym programem: 94 °C przez 5 minut, 25 cykli 94 °C przez 45 s, 61 °C (dla A05LeF/A05LeR) i 58 °C (dla LeCO1F/LeCO1R) przez 45 s, 72 °C przez 1 min, a następnie końcowe przedłużenie o 72 °C przez 5 min.
    3. Przeanalizuj produkt PCR za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym, aby potwierdzić tożsamość mszycy musztardowej (Rysunek 2).
      UWAGA: Jeśli para starterów A05LeF/A05LeR z powodzeniem amplifikuje prawidłowy rozmiar fragmentu DNA, przekonująco zidentyfikowała zebraną w terenie mszycę jako mszycę musztardową21. Pary starterów są wymienione w tabeli 2.
    4. Oczyścić produkt PCR z amplikonu COI mszycy musztardowej za pomocą dostępnego w handlu zestawu żelowego/PCR zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów) i zsekwencjonować produkt PCR za pomocą komercyjnej usługi sekwencjonowania.
  3. Analiza sekwencyjna
    UWAGA: Według Lu et al.21, wygięcie DNA A05Le jest fragmentem DNA specyficznym dla mszycy musztardowej; w związku z tym produkt A05Le PCR nie musi być dalej sekwencjonowany.
    1. Sprawdź jakość odczytu za pomocą oprogramowania Chromas (patrz Tabela materiałów) po uzyskaniu sekwencji LeCO1.
    2. Przycinanie odczytów o niskiej jakości w górę i w dół przez otwarcie pliku fasta (lub txt) i bezpośrednie usunięcie odczytów o niskiej jakości.
    3. Prześlij przyciętą sekwencję do NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) przy użyciu parametrów domyślnych.
      UWAGA: Jeśli rozmiary amplikonów zestawów starterów A05Le i LeCO1 są prawidłowe, teoretycznie wyszukiwanie sekwencyjne w stosunku do standardowych baz danych NCBI musi być zgodne z mszycą musztardową.

3. Przygotowanie grzybów entomopatogenicznych

UWAGA: EPF użyty w tym badaniu jest wymieniony w Tabeli 1.

  1. Odzyskiwanie EPF z biblioteki grzybów
    1. Rozmrozić zakonserwowany wywar grzybowy (konidia zawieszone w 30% glicerynie) w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    2. Przenieść niewielką ilość (około 10 μl) zawiesiny konidiów na 6 cm 1/4 płytki z agatorem dekstrozowym Sabouraud (SDA) (0,75 g bulionu z dekstrozy Sabouraud z 1,5 g agaru na 100 ml ddH2O) i równomiernie rozprowadzić za pomocą rozsiewacza komórek w okapie z przepływem laminarnym.
    3. Uszczelnić szalkę Petriego folią parafinową i inkubować w ciemności w temperaturze 25 °C przez 10-14 dni.
    4. Ponowna hodowla izolatów grzybów poprzez smugowanie masy grzybów na płytce 1/4 SDA i inkubację grzybów w ciemności w temperaturze 25 °C przez 10-14 dni przed zbiorem konidia22.
      UWAGA: Kulturę grzybów należy stosować około 10 dni przed zaszczepieniem mszyc. Posiew EPF, który ma więcej niż 14 dni, nie jest zalecany do stosowania w teście wirulencji.
  2. Przygotowanie zawiesiny konidiów
    1. Zeskrobać konidia z 10-14-dniowej kultury grzybów na 1/4 płytki SDA przez zaszczepianie pętli po dodaniu 2-3 ml 0,03% Tween 80 (patrz tabela materiałów).
    2. Zbierz zawiesinę grzybów do probówki wirówkowej.
    3. Wirować roztwór z największą prędkością, policzyć liczbę konidiów za pomocą hemocytometru pod mikroskopem świetlnym i dostosować stężenie zawiesiny konidiów do 10-8 konidiów / ml.
    4. Przenieś zawiesinę konidiów do mikroopryskiwacza sterylizowanego promieniami UV.
      UWAGA: Ponownie wymieszaj zawiesinę konidiów przed jej przeniesieniem, ponieważ konidia są podatne na wytrącanie się. Mikroopryskiwacz należy wystawić na działanie promieniowania ultrafioletowego w okapie z przepływem laminarnym przez 30 minut przed użyciem.

4. Badanie przesiewowe przeciwko mszycy musztardowej

  1. Przygotowanie nowo wynurzonych dorosłych osobników
    1. Przenieś dojrzałe osobniki (bez skrzydeł) i uskrzydlone (skrzydlate) z szalki Petriego na świeżo wycięte liście, aby rozmnożyć nowe potomstwo w tym samym wieku. Usuń dorosłe osobniki po 24 godzinach, aby uniknąć przeludnienia i zminimalizować produkcję alated progenies23,24. W dalszych eksperymentach zostaną wykorzystane tylko zręczni dorośli.
    2. Cofnij potomstwo do stadium dorosłego i usuń potomstwo, które nie rozwinie się w stadium dorosłe po 48 godzinach (Rysunek 3), aby zapobiec różnicom wieku między mszycami w eksperymencie. Dodatkowo usuń alated dorosłych.
  2. Przygotowanie komory inokulacyjnej
    UWAGA: Zaleca się najpierw przygotowanie liści krzyżowych o średnicy 9 cm, tak aby krążek liściowy mógł zostać osadzony w agarze wodnym przed zestaleniem.
    1. Oczyść liście krzyżowe wodą z kranu, usuń brud i pozostałości oraz wszelkie inne stawonogi, jeśli są obecne.
    2. Wytrzyj nadmiar wody ręcznikiem papierowym i sprawdź, czy na powierzchni liści krzyżowych nie ma innych stawonogów za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Usuń wszystkie stawonogi, jeśli są obecne.
    3. Wytnij krążek liściowy o średnicy 9 cm, bezpośrednio naciskając dolną szalkę Petriego na liść jako formę lub używając nożyczek.
      UWAGA: Jeśli liście mają średnicę mniejszą niż 9 cm, połącz kilka wyciętych liści.
    4. Przygotuj 1,5% agar wodny na każdą szalkę Petriego, podgrzewając i rozpuszczając 450 mg agaru (patrz Tabela Materiałów) w 30 ml ddH2O za pomocą kuchenki mikrofalowej.
      UWAGA: Ilość 1,5% agaru wodnego można dostosować w zależności od skali eksperymentu.
    5. Wlać 30 ml 1,5% agaru wodnego do 9 cm szalki Petriego przed zestaleniem w okapie z przepływem laminarnym, a następnie poczekać, aż agar ostygnie do ~40 °C, aż powierzchnia agaru częściowo zestali się.
      UWAGA: Sprawdź, czy powierzchnia jest częściowo zestalona, delikatnie potrząsając poziomo szalką Petriego.
    6. Umieść krążek liściowy, powierzchnią akwadryjną do góry, na wierzchu agaru wodnego, zanurzając krążek liściowy w agarze.
      UWAGA: Zminimalizuj ekspozycję powierzchni agaru.
    7. Po całkowitym zestaleniu się agaru wodnego zamknij pokrywę szalki Petriego.
      UWAGA: Otwórz pokrywę w celu odparowania wody, jeśli na pokrywie natychmiast skrapla się dużo kropel.
    8. Umieść 20 dojrzałych osobników na krążku liściowym.
      UWAGA: Zaleca się pracę pod mikroskopem stereoskopowym, aby zapobiec uszkodzeniu ich aparatu gębowego.
  3. Inokulacja i obserwacja EPF
    1. Otwórz pokrywę komory do zaszczepiania i rozpyl 0,3 ml zawiesiny konidiów (od kroku 3.2) bezpośrednio na mszyce i krążek liściowy z około 15 cm powyżej krążka liściowego.
      UWAGA: Przed rozpyleniem ponownie wymieszać zawiesinę konidiów. Obszary opryskiwania powinny zostać przetestowane przed eksperymentem, ponieważ mogą się różnić w zależności od opryskiwacza. W takim przypadku zalecane jest 0,3 ml przy odległości 15 cm. Obszar opryskiwania powinien pokrywać całą tarczę liściową, a cienka warstwa zawiesiny konidiów powinna pokrywać krążek liściowy. Jeśli kropelki zbiegną się w stojącej wodzie na liściu, objętość inokulacji należy zmniejszyć. Oczyścić stół 70% etanolem przed inokulacją i między użyciem różnych izolatów.
    2. Poczekaj, aż zawiesina konidiów wyschnie, a następnie zamknij pokrywę, aby zapobiec utonięciu mszyc musztardowych.
      UWAGA: Mszyce rzadko wędrują podczas eksperymentu; Jednak nadal konieczne jest upewnienie się, że mszyce nie uciekną.
    3. Uszczelnić komorę inokulacyjną folią parafinową w celu utrzymania wysokiej wilgotności względnej i umieścić komorę inokulacyjną w inkubatorze w temperaturze 25 °C z fotoperiodem 12:12 h (światło: ciemność).
    4. Otwórz pokrywę komory do zaszczepiania, aby policzyć śmiertelność pod mikroskopem stereoskopowym co 12 godzin przez 5 dni.
    5. Wytrzyj spadź przylegającą do okładki ręcznikiem papierowym i usuń nowo powstałe mszyce drobnym pędzlem malarskim. Pokrywę należy czyścić wodą z kranu co 24 godziny < godzin /> UWAGA: Okres obserwacji może się różnić dla różnych gatunków mszyc w zależności od długości życia dorosłego osobnika.
    6. Trzymaj zwłoki na krążku liścia w celu wykrycia grzybicy, aby potwierdzić pomyślne zaszczepienie.
  4. Potwierdzenie zdolności kiełkowania konidiów
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Aby potwierdzić szybkość kiełkowania konidiów parami podczas wykonywania badania przesiewowego wirulencji, aby zapewnić aktywność konidiów.
    1. Upuść jedną kroplę 5 μl zawiesiny konidiów na 1/4 SDA dla trzech powtórzeń.
    2. Po 18 godzinach oblicz szybkość kiełkowania za pomocą mikroskopu świetlnego. Policz losowo co najmniej 100 zarodników w jednej kropli, aby potwierdzić szybkość kiełkowania grzybów.
      UWAGA: Zwykle szybkość kiełkowania izolatów użytych w eksperymencie powinna być wyższa niż 90%.

5. Test biologiczny wybranych izolatów EPF

UWAGA: Izolaty EPF, które wykazywały wysoką zjadliwość, które zostały wybrane z kroku 4, zostały poddane testowi biologicznemu przeciwko mszycom musztardowym przy użyciu czterech stężeń zawiesin konidiów (od 104 do 107 konidiów/ml).

  1. Przygotowanie zawiesiny konidiów
    1. Powtórz krok 3.1, aby odzyskać wybrane izolaty EPF.
    2. Powtórzyć krok 3.2, aby przygotować cztery stężenia zawiesiny konidiów, w tym 104, 105,10 6 i 107 konidiów/ml.
  2. Przygotowanie nowo wynurzonych dorosłych osobników
    1. Powtórz krok 4.1, aby przygotować nowo pojawiające się dorosłe osobniki.
  3. Przygotowanie komory do inokulacji
    1. Powtórzyć krok 4.1, aby przygotować komorę do zaszczepiania.
  4. Inokulacja i obserwacja EPF
    1. Powtórzyć krok 4.3, aby przeprowadzić inokulację EPF i obserwację odpowiednio dla czterech stężeń zawiesiny konidiów.

6. Analiza statystyczna

  1. Obliczanie skorygowanej śmiertelności
    1. Oblicz skorygowaną śmiertelność za pomocą wzoru Abbotta25, jak pokazano poniżej:
      Skorygowana śmiertelność (%) = [(MT− MC) × 100%] / (100− MC)
      MT oznacza śmiertelność w grupie leczonej, a MC oznacza śmiertelność w grupie kontrolnej.
      UWAGA: Śmiertelność grupy kontrolnej nie powinna być wyższa niż 20%.
    2. Otwórz platformę oprogramowania SPSS (patrz tabela materiałów), utwórz zmienne, w tym "leczenie" i "cor_mor" (reprezentujące skorygowaną śmiertelność), a następnie wprowadź obliczone wyniki inokulacji różnych izolatów w tym samym punkcie czasowym o tym samym zaszczepionym stężeniu.
    3. Wybierz Analizuj, Porównaj średnie i proporcje, Test t dla prób niezależnych w SPSS dla niezależnej analizy testu t.
    4. W programie SPSS wprowadź treatment w polu "Grouping Variable" (Zmienna grupująca), a następnie cor_mor w polu "Test Variable(s)". Zdefiniuj grupy według różnych izolatów grzybów. Naciśnij OK, aby przeanalizować.
  2. Obliczanie mediany czasu letalnego (LT50) i mediany stężenia śmiertelnego (LC50)
    1. Otwórz SPSS, utwórz zmienne "total", "response" i "duration"/"concentration" i wprowadź zarejestrowany wynik do arkusza kalkulacyjnego.
    2. Wybierz opcję Analizuj, Regresja, Probit w SPSS, aby obliczyć LT50 i/lub LC50.
      UWAGA: Jeśli skumulowana śmiertelność ostatecznie nie przekroczy 50%, nie można oszacować LT50 i/lub LC50.
    3. Wprowadź sumę w polu "Całkowita zaobserwowana", odpowiedź w polu "Częstotliwość odpowiedzi", czas trwania/stężenie w polu "Współzmienne(e)". Naciśnij OK, aby przeanalizować.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, naciśnij Opcje i ustaw "Poziom istotności dla użycia współczynnika niejednorodności" na 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony schemat blokowy ilustruje stabilny stan mszyc kapustnych od momentu ich zebrania w terenie do badań wirulencji. Utrzymanie mszyc zebranych w terenie zapewniło stabilny wzrost kolonii mszyc przy odpowiedniej podaży pokarmu. Tożsamość zebranych z terenu mszyc jako mszyc kapustnych potwierdzono przy użyciu markerów molekularnych, w tym wielkości amplikonu PCR oraz sekwencjonowania LeCO1. Badania wirulencji, przeprowadzone metodą odciętego liścia, wykazały stały poziom przeżywalności mszyc kapustnych, przy czym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Rośliny krzyżowe, grupa warzyw, są często atakowane przez wiele gatunków mszyc, w tym mszycę musztardową (L. erysimi) i mszycę kapuścianą (Brevicoryne brassicae)26. Oba gatunki zostały zgłoszone na Tajwanie27 i możliwe jest ich współistnienie w miejscu zbioru. Aby rozróżnić blisko spokrewnione gatunki mszyc, w badaniu wykorzystano technikę identyfikacji molekularnej przy użyciu multipleksowego zestawu starterów21. Projektując marker...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że w tej pracy nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez 109-2313-B-005 -048 -MY3 z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 μ L Pętla do zaszczepianiaNEST Scientific718201
100 pz Drabinka DNA IIIGeneaidDL007
2x SuperRed PCR Master MixBiotoolsTE-SR01
50 ml probówka wirówkowaBioman ScientificET5050-12
6 cm szalka PetriegoAlpha Plus Scientific16021
Aspirator do owadów 6 mmMegaView ScienceBA6001
Bibuła filtracyjna 70 mm NO.1Toyo Roshi Kaisha
70% etanol
9 cm szalka PetriegoAlpha Plus Scientific16001
AgarBioman ScientificAGR001.1Klasa mikrobiologiczna
AgarozaBioman ScientificPB1200
BioGreen Bezpieczny bufor żelowy DNABioman ScientificSDB001T
ChromasTechnelysium
GeneDoc
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH300https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf
Gene-Spin Zestaw do izolacji genomowego DNATechnologia ProtechPT-GD112-V3http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
HemocytometrPaul Marienfeld640030
Liście Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis)Tai Cheng Farm1-010-300410
Mikroopryskiwacz
MiniAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA37834
Mszyca musztardowa (Lipaphis erysimi)
Pędzel malarskifirmy Tian Cheng pędzel 4716608400352
Parafilm MBemisPM-996
Tłuczek do pelletuBioman ScientificGT100R
Sabouraud Bulion dekstrozowyHiMediaMH033-500G
SPSS StatystykiIBM
TAE buffer 50xBioman ScientificTAE501000
Tween 80PanReac AppliChem142050.1661

Bibliografia

  1. Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626(2019).
  2. Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070(2022).
  3. Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144(2019).
  4. Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33(2019).
  5. Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804(2021).
  6. Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
  7. Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882(2021).
  8. Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081(2022).
  9. Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
  10. Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
  11. Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
  12. Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138(2022).
  13. Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
  14. Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
  15. Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
  16. Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
  17. Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2(2022).
  18. Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
  19. Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
  20. Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
  21. Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
  22. Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882(2021).
  23. Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
  24. Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754(2019).
  25. Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
  26. Liu, T. X., Sparks, A. N. Jr Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , Texas A&M AgriLife Extension Service. 9-11 (2001).
  27. Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
  28. Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088(2022).
  29. Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
  30. Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
  31. Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
  32. Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , 23 North Dakota State University Extension Publication: North Dakota, USA. (2021).
  33. Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
  34. Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zwalczanie mszycy gorczycowejbioassay na oddzielonych li ciachbadanie wirulencjiinokulacja konidiamiodzyskiwanie izolat w grzybowychekstrakcja genomowego DNAamplifikacja PCRmiertelno mszyc
Ocena wpływu mszyc grzybów entomopatogenicznych na owada partenogenetycznego, mszycę musztardową, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.