Artykuł metodologiczny

Elektryczne wykrywanie podłoża komórkowego do oceny profili toksykologicznych struktury metaloorganicznej w czasie rzeczywistym

DOI:

10.3791/65313

⸱

26 maja 2023

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Anthropology for Energy, West Virginia University, 3Department of Hospitality and Tourism, West Virginia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższe badanie ocenia profil toksykologiczny wybranego szkieletu metaloorganicznego za pomocą wykrywania impedancji ogniwa elektrycznego i substratu (ECIS), techniki badań przesiewowych w czasie rzeczywistym o wysokiej przepustowości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struktury metaloorganiczne (MOF) to hybrydy powstałe w wyniku koordynacji jonów metali i organicznych łączników w rozpuszczalnikach organicznych. Wdrożenie MOF w zastosowaniach biomedycznych i przemysłowych wzbudziło obawy dotyczące ich bezpieczeństwa. W tym artykule oceniono profil wybranego MOF, zeolitycznego szkieletu imidazolowego, po ekspozycji na ludzkie komórki nabłonka płuc. Platformą do oceny była technika działająca w czasie rzeczywistym (tj. wykrywanie impedancji podłoża elektrycznego [ECIS]). Badanie to identyfikuje i omawia niektóre ze szkodliwych skutków wybranego MOF na narażone komórki. Co więcej, badanie to pokazuje korzyści płynące z zastosowania metody czasu rzeczywistego w porównaniu z innymi testami biochemicznymi do kompleksowej oceny komórek. W badaniu stwierdzono, że zaobserwowane zmiany w zachowaniu komórek mogą wskazywać na możliwą toksyczność wywołaną ekspozycją na MOF o różnych właściwościach fizykochemicznych i dawkowaniu tych struktur. Rozumiejąc zmiany w zachowaniu komórek, można przewidzieć możliwość ulepszenia bezpiecznych strategii MOF-ów, które mają być wykorzystywane do zastosowań biomedycznych, poprzez specjalne dostosowanie ich charakterystyki fizykochemicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struktury metaloorganiczne (MOF) to hybrydy powstałe w wyniku połączenia jonów metali i organicznych łączników1,2 w rozpuszczalnikach organicznych. Ze względu na różnorodność takich kombinacji, MOF charakteryzują się różnorodnością strukturalną3, przestrajalną porowatością, wysoką stabilnością termiczną i dużą powierzchnią4,5. Takie cechy sprawiają, że są one atrakcyjnymi kandydatami w różnych zastosowaniach, od magazynowania gazu6,7 do katalizy8,9 oraz od środków kontrastowych10,11 do jednostek dostarczania leków12,13. Jednak implementacja MOF w takich aplikacjach wzbudziła obawy dotyczące ich bezpieczeństwa zarówno dla użytkowników, jak i środowiska. Wstępne badania wykazały na przykład, że funkcja komórkowa i wzrost zmieniają się pod wpływem jonów metali lub łączników używanych do syntezy MOF1,14,15. Na przykład Tamames-Tabar i in. wykazali, że ZIF-8 MOF, MOF oparty na Zn, prowadzi do większej liczby zmian komórkowych w ludzkiej linii komórkowej raka szyjki macicy (HeLa) i linii komórkowej mysich makrofagów (J774) w porównaniu z MOF na bazie Zr i Fe. Takie efekty były prawdopodobnie spowodowane metalowym składnikiem ZIF-8 (tj. Zn), który mógł potencjalnie indukować apoptozę komórek po rozpadzie struktury i uwolnieniu jonów Zn1. Podobnie Gandara-Loe i in. wykazali, że HKUST-1, MOF na bazie Cu, spowodował największe zmniejszenie żywotności komórek siatkówczaka myszy, gdy był stosowany w stężeniach 10 μg/ml lub większych. Było to prawdopodobnie spowodowane jonem metalu Cu włączonym podczas syntezy tego szkieletu, który po uwolnieniu mógł indukować stres oksydacyjny w odsłoniętych komórkach15.

Ponadto, analiza wykazała, że ekspozycja na MOF o różnych właściwościach fizykochemicznych może prowadzić do różnych reakcji narażonych komórek. Na przykład Wagner i wsp. wykazali, że ZIF-8 i MIL-160 (struktura oparta na Al), użyte w ekspozycji unieśmiertelnionej ludzkiej komórki nabłonka oskrzeli, doprowadziły do odpowiedzi komórkowych zależnych od właściwości fizykochemicznych ram, a mianowicie hydrofobowości, rozmiaru i cech strukturalnych16. Komplementarnie, Chen i in. wykazali, że stężenie 160 μg/ml MIL-100(Fe) wystawione na działanie ludzkich normalnych komórek wątroby (HL-7702) spowodowało największą utratę żywotności komórek, prawdopodobnie z powodu metalowego składnika tego specyficznego szkieletu (tj. Fe17).

Chociaż te badania kategoryzują szkodliwy wpływ MOF na systemy komórkowe na podstawie ich właściwości fizykochemicznych i stężeń ekspozycji, co budzi potencjalne obawy przy wdrażaniu ram, zwłaszcza w dziedzinach biomedycznych, większość tych ocen opiera się na testach kolorymetrycznych z pojedynczym punktem czasowym. Na przykład wykazano, że gdy zastosowano testy (bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu), tetrazolu (MTT) i rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazolowej (WST-1), te odczynniki biochemiczne mogą prowadzić do wyników fałszywie dodatnich po ich interakcjach z cząstkami, na które komórki były również narażone18. Wykazano, że sól tetrazolowa i neutralne czerwone odczynniki mają wysokie powinowactwo do adsorpcji lub wiązania na powierzchniach cząstek, co skutkuje zakłóceniami sygnału czynnika19. Co więcej, w przypadku innych rodzajów testów, takich jak cytometria przepływowa, która wcześniej okazała się być stosowana do oceny zmian w komórkach narażonych na MOFs20,21, wykazano, że główne problemy muszą zostać ominięte, jeśli ma być rozważana realna analiza szkodliwego wpływu cząstek. W szczególności należy zwrócić uwagę na zakresy wykrywania rozmiarów cząstek, zwłaszcza w populacjach mieszanych, takie jak te oferowane przez MOF lub odniesienia do cząstek używanych do kalibracji przed zmianami komórkowymi22. Wykazano również, że barwnik używany podczas znakowania komórek do takich testów cytometrycznych może również zakłócać działanie nanocząstek, na które narażone były komórki23.

Celem tego badania było użycie wysokoprzepustowego testu ewaluacyjnego w czasie rzeczywistym do oceny zmian w zachowaniu komórek po ekspozycji na wybrany MOF. Oceny w czasie rzeczywistym mogą pomóc w uzyskaniu wglądu w efekty zależne od czasu, w odniesieniu do okien ekspozycji16. Ponadto dostarczają informacji na temat zmian w interakcjach komórka-substrat, morfologii komórki i interakcji komórka-komórka, a także tego, jak takie zmiany zależą od właściwości fizykochemicznych materiałów będących przedmiotem zainteresowania i czasów ekspozycji24,25.

Aby zademonstrować słuszność i stosowalność proponowanego podejścia, użyto ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (BEAS-2B), ZIF-8 (hydrofobowy szkielet imidazolanu zeolitycznego16) oraz wykrywania impedancji elektrycznego podłoża komórkowego (ECIS). Komórki BEAS-2B reprezentują model ekspozycji płuc26 i były wcześniej wykorzystywane do oceny zmian po ekspozycji komórek na nanoglinki i ich termicznie degradowane produkty uboczne26,27,28, a także do oceny toksyczności nanomateriałów, takich jak jednościenne nanorurki węglowe (SWCNTs)18. Co więcej, takie komórki są używane od ponad 30 lat jako model funkcji nabłonka płuc29. ZIF-8 został wybrany ze względu na jego szerokie zastosowanie w katalizie30 oraz jako środki kontrastowe31 do bioobrazowania i dostarczania leków32, a tym samym ze względu na rozszerzony potencjał ekspozycji płuc podczas takich zastosowań. Wreszcie, ECIS, nieinwazyjna technika działająca w czasie rzeczywistym, była wcześniej wykorzystywana do oceny zmian w przyleganiu komórek, proliferacji, ruchliwości i morfologii16,26 w wyniku różnych interakcji między analitami (zarówno materiałami, jak i lekami) a narażonymi komórkami w czasie rzeczywistym16,18,28. ECIS wykorzystuje prąd przemienny (AC) do pomiaru impedancji ogniw unieruchomionych na złotych elektrodach, przy czym zmiany impedancji dają wgląd w zmiany rezystancji i pojemności na granicy faz komórka-złoty substrat, funkcję bariery indukowaną przez interakcje komórka-komórka oraz pokrycie warstwy nadkomórkowej takich złotych elektrod33,34. Korzystanie z ECIS umożliwia pomiary ilościowe w rozdzielczości nanoskali w nieinwazyjny sposób w czasie rzeczywistym26,34.

To badanie ocenia i porównuje prostotę i łatwość oceny zmian w zachowaniu komórek wywołanych przez MOF w czasie rzeczywistym z ocenami testów jednopunktowych. Takie badanie można by dalej ekstrapolować w celu oceny profili komórkowych w odpowiedzi na ekspozycję na inne interesujące cząstki, co pozwoliłoby na bezpieczne testowanie cząstek na etapie projektowania i późniejszą pomoc we wdrożeniu. Co więcej, badanie to może stanowić uzupełnienie testów genetycznych i komórkowych, które są ocenami jednopunktowymi. Może to prowadzić do bardziej świadomej analizy szkodliwego wpływu cząstek na populację komórkową i może być wykorzystane do badania toksyczności takich cząstek w sposób wysokoprzepustowy16,35,36.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza ZIF-8

  1. Na potrzeby tego przykładu należy użyć stosunku masowego 1:10:100 (metal:linker:rozpuszczalnik) do syntezy ZIF-8. W tym celu odmierz sześciowodny azotan i zapisz pomiar. Wykorzystać przykładowy stosunek masowy, aby obliczyć ilość potrzebną dla łącznika, 2-metyloimidazolu i rozpuszczalnika (tj. metanolu).
  2. Umieścić sześciowodny azotan i łącznik w dwóch różnych szklanych fiolkach. Dodaj połowę obliczonej ilości metanolu do sześciowodnego azotanu, a drugą połowę do łącznika. Poczekaj, aż każdy roztwór się rozpuści.
  3. Połącz te dwa roztwory (tj. roztwory zawierające odpowiednio metal i łącznik). Umieścić pojemnik z połączonym roztworem do przeprowadzenia reakcji na płytce mieszającej i mieszać z prędkością 700 obr./min przez 24 godziny w temperaturze pokojowej (RT).

2. Kolekcja ZIF-8

  1. Po zakończeniu powyższej reakcji (tj. po 24 godzinach) umieścić roztwór w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i wirować przy stężeniu 3,075 x g przez 5 minut (użyć równych ilości i zrównoważyć wirnik). Usunąć którykolwiek z supernatantów z odwirowanych probówek.
  2. Dodaj metanol (5-15 ml) do probówek wirówkowych i ponownie rozproszyć cząstki.
  3. Powtórz etapy wirowania i mycia jeszcze co najmniej dwa do czterech razy. Po ostatnim przepłukaniu spuścić supernatant.
    UWAGA: Etapy mycia usuwają wszelkie niewytrącone gatunki.
  4. Zdejmij pokrywki tubek i umieść taśmę parafilm na górze, a następnie zrób w parafilmie. Umieścić probówkę lub probówki zawierające próbkę w komorze próżniowej w temperaturze pokojowej do wyschnięcia przez 24 godziny.

3. Morfologia powierzchni ZIF-8 (skaningowa mikroskopia elektronowa [SEM])

  1. Zamontuj suche proszki ZIF-8 na taśmie węglowej i napylaj przez 120 s złotem-palladem, aby zapobiec ładowaniu, które mogłoby wystąpić podczas analizy SEM.
  2. Ustaw napięcie przyspieszające mikroskopu na 15 kV. Ustaw ostrość cząstek i dostosuj powiększenie (użyto powiększeń 500x, 1,000x, 1,500x, 4,000x, 10,000x, 20,000x, 30,000x i 40,000x).
  3. Zobrazuj cząstki w powiększeniu, które umożliwia zarówno wyraźną ocenę wielkości cząstek, jak i morfologii (zaleca się uwzględnienie zakresów dla cząstek 5 μm, 10 μm i 20 μm).
  4. Zbierz dane z co najmniej trzech różnych pól widzenia i dla każdego z nich weź pod uwagę różne powiększenia.

4. Skład pierwiastkowy ZIF-8

  1. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi obrazowania SEM.
  2. Korzystając ze spektroskopii rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX) w mikroskopie SEM, przeanalizuj skład pierwiastkowy próbki.
  3. Upewnij się, że napięcie i powiększenie przyspieszenia SEM są zgodne z monitorem EDX. Wyłącz kamerę na podczerwień w mikroskopie SEM.
  4. Na monitorze EDX przejdź do opcji Collect Spectrum (Zbieranie widma) i wprowadź czas zbierania wynoszący 200 s. Jest to zalecane, aby uniknąć ładowania i rozpadu cząstek, które mogłyby prowadzić do fałszywych ocen.
  5. Zbierz dane z co najmniej trzech różnych pól widzenia. Po zakończeniu zbierania przeanalizuj dane i zidentyfikuj interesujące Cię elementy.

5. Hodowla komórkowa

  1. Hodowla unieśmiertelnionych komórek BEAS-2B w pożywce uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 0,2% penicyliny/streptomycyny.
    UWAGA: Należy stosować pasaże między 5-10, aby upewnić się, że w używanej partii komórek nie zaszły wcześniej żadne zmiany fenotypowe37 (wszystkie odczynniki są wymienione w Tabeli Materiałów).
  2. Wziąć płytkę do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm i umieścić na niej 10 ml pożywki. Dodać 1 ml roztworu komórek BEAS-2B do płytki.
  3. Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) i pozwolić komórkom rosnąć.
  4. Sprawdź płytkę po 24 godzinach, aby określić, czy komórki osiągnęły 80% zbieżności. W tym przypadku 80% konfluencja odnosi się do procentu powierzchni pokrytej przylegającymi komórkami. Jeśli nie, zmień pożywkę i pozwól komórkom rosnąć, aż do osiągnięcia 80% poziomu konfluencji.

6. Liczenie komórek

  1. Gdy komórki na płytce osiągną zbieżność 80%, usuń pożywkę z płytki. Umyć płytkę 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. Wyjmij PBS z płyty. Dodać 2 ml trypsyny do płytki i umieścić ją w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 2 minuty.
  3. Dodać 2 ml pożywki do płytki i pipetować pożywkę w górę i w dół, aby usunąć komórki z płytki. Przenieść roztwór do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy sile 123 x g przez 5 minut.
  4. Usunąć sklarowany osad z probówki i dodać 2 ml pożywki. Pipetować pożywkę w górę iw dół, aby ponownie rozproszyć komórki.
  5. Za pomocą probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 20 μl błękitu trypanowego, a następnie 20 μl roztworu komórkowego (stosunek 1:1 roztworu błękitu trypanowego do komórek).
  6. Umieścić 10 μl mieszaniny komórek na szkiełku podstawowym i umieścić je na automatycznym liczniku komórek. Poczekaj, aż na ekranie pojawi się ostrość, a następnie wybierz opcję przechwytywania.
  7. Na ekranie wyświetlane są numery aktywnych komórek i żywotność komórek. Zakres pomiarowy rozciąga się od 1 x 104-1 x 107 komórek.
  8. Alternatywnie policz komórki ręcznie za pomocą hemocytometru.
    1. W tym celu dodaj 15-20 μl roztworu komórek poddanych działaniu błękitu trypanowego do hemocytometru.
    2. Użyj mikroskopu pionowego z 10-krotnym ogniskowaniem obiektywu na liniach siatki hemocytometru.
    3. Policz liczbę komórek w czterech zewnętrznych kwadratach i podziel liczbę przez cztery. Następnie pomnóż przez 10 000, aby uzyskać liczbę żywych komórek.
    4. Aby obliczyć żywotność komórek, zsumuj liczbę żywych i martwych komórek, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek, a następnie podziel liczbę żywych komórek przez całkowitą liczbę komórek.

7. Przygotowanie dawki ZIF-8

  1. Przygotować roztwór podstawowy ZIF-8 o stężeniu 1 mg/ml. W tym celu zmierz ilość ZIF-8 i dodaj wodę dejonizowaną (DI) do cząstek, aby osiągnąć stężenie 1 mg/ml.
  2. Sonikować (ustawić sonikator na dźwięki) roztwór podstawowy ZIF-8 przez 2 minuty w odstępach 30 s w łaźni wodnej.
  3. Wykonaj różne dawki ZIF-8 dla ekspozycji komórkowych, obliczając ilość roztworu podstawowego i zmodyfikowanego podłoża orła (DMEM) firmy Dulbecco potrzebnej do osiągnięcia pożądanych dawek, korzystając z równania C1V1 = C2V2. Dawki będą się wahać od 0 do 950 μg/ml.
    UWAGA: W tym eksperymencie wybrano dawki 0 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/ml i 950 μg/ml.

8. Połowa maksymalnego stężenia hamującego (IC 50)

  1. Po zliczeniu komórek wysiewaj komórki BEAS-2B o gęstości 4 x 104 komórki/ml na 96-dołkowej płytce o objętości 100 μl/basenik.
    1. Aby osiągnąć gęstość 4 x 104 komórek/ml, użyj C1V1 = C2V2 do obliczenia ilości roztworu komórkowego potrzebnego do połączenia z pożywką.
    2. Upewnij się, że utrzymujesz ślepe studzienki dla każdej dawki; pozostaw te studzienki puste do czasu ekspozycji na ZIF-8.
  2. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i pozwolić komórkom wyrosnąć do zlewającej się monowarstwy przez 24 godziny.
  3. Usuń pożywkę z dołków i wystaw komórki BEAS-2B na działanie dawek ZIF-8 w zakresie 0-950 μg/ml. Dodaj 100 μl ZIF-8 do odpowiednich studzienek ślepej próby i komórek.
  4. Umieścić 96-dołkowe płytki z powrotem w inkubatorze na czas naświetlania wynoszący 48 godzin.
  5. Po ekspozycji dodać 10 μl 4-[3-(4-idofenylo)-2-(4-nitrofenylo)-2H-5-tetrazolio]-1,3-disulfonianu benzenu (WST-1) do każdego dołka (ślepa próba i studzienka komórkowa) i inkubować przez 2 godziny. Media pozostają w studniach; Stosunek wynosi 1:10 (odczynnik:pożywka).
  6. Odczytać zmiany absorbancji na czytniku płytkowym przy użyciu absorbancji 485 nm.
  7. Oblicz żywotność ogniwa za pomocą oprogramowania, aby określić wartość IC50 (patrz sekcja 10).

9. Wykrywanie impedancji podłoża elektrycznego ogniwa (ECIS)

  1. Do przeprowadzenia analizy ECIS należy użyć płytki 96-dołkowej (96W10idf). Plate28 zawiera międzypalcowe elektrody połączeniowe z palcami o powierzchni około 4 mm2.
  2. Najpierw sprawdź, czy wszystkie studzienki są odczytywane przez czujniki. W tym celu umieść 96-dołkową płytkę na stacji studziennej i kliknij przycisk Setup.
  3. Jeśli studnie są prawidłowo podłączone, pojawi się kolor zielony; wszystkie niepodłączone studnie zostaną oznaczone jako czerwone. Jeśli wystąpi taki przypadek, wyjmij i ponownie włóż płytkę studzienki i ponownie kliknij przycisk Ustawienia, aż wszystkie studzienki oferują realne zielone odczyty.
  4. Ustabilizuj elektrody przez 40 minut za pomocą 200 μl pożywki na studzienkę, aby zapobiec dryfowaniu potencjału. Dodać 200 μl pożywki do każdego używanego studzienki, a następnie umieścić 96-dołkową płytkę na stacji ECIS. Kliknij Konfiguracja/Sprawdź, aby upewnić się, że płyta jest prawidłowo podłączona. Kliknij Ustabilizuj.
  5. Po zakończeniu stabilizacji wyjmij płytkę ze stacji i usuń pożywkę z każdej studzienki.
  6. Wysiać komórki BEAS-2B o gęstości 4 x 104 komórek/ml, o objętości 100 μl na studzienkę, do studzienek zawierających komórki i umieścić płytkę na stacji ECIS w inkubatorze.
  7. Na monitorze kliknij Sprawdź, aby ustalić, czy wszystkie elektrody są odczytywane przez czujniki na stacji.
  8. Skonfiguruj pomiar przebiegu czasu, wybierając opcję Wiele częstotliwości/czasu (MFT). Program będzie mierzył każdą studnię na siedmiu różnych częstotliwościach.
  9. Kliknij Start i pozwól mu działać przez 24 godziny, aby komórki mogły utworzyć zlewającą się monowarstwę.
  10. Po 24 godzinach studzienki zawierające ogniwa pokażą na monitorze zwiększoną rezystancję. Jest to wskaźnik, że ogniwa są przyczepione do elektrod.
  11. Naciśnij przycisk Pauza na monitorze, aby zatrzymać zbieranie danych.
  12. Dawki ZIF-8 należy ustawić na poziomie, powyżej i poniżej obliczonej wartości IC50, postępując zgodnie z czynnościami opisanymi w sekcji 7 powyżej.
  13. Poddaj nanocząstki ZIF-8 odpowiedniej ślepej próbie i dołkom komórkowym w objętości 100 μl na studzienkę i umieść 96-dołkową płytkę z powrotem na stacji.
  14. Kliknij ponownie Sprawdź na monitorze, aby upewnić się, że czujniki odczytują wszystkie elektrody. Kliknij Resume (Wnów) i pozwól systemowi działać przez 72 godziny, aby monitorować zachowanie sieci komórkowej i przywiązanie.
  15. Po zakończeniu zbierania danych kliknij Zakończ na monitorze. Aby zapisać plik, kliknij przycisk Plik > Zapisz jako. Zapisz dane jako plik arkusza kalkulacyjnego.
  16. Aby uzyskać parametry alfa, kliknij Model. W wyskakującym okienku ekranu kliknij Studnia tylko multimedia, a następnie wybierz studnię, która zawiera tylko multimedia.
  17. Kliknij Ustaw ref. Na monitorze kliknij Znajdź.
  18. Jeśli studnia pokazana w systemie nie jest taka sama, jak wybrana, powtórz krok 9.16.
  19. Kliknij Ustaw. Kliknij Dopasuj zakres T, aby określić żądany zakres czasu do zbierania danych.
  20. Podczas przetwarzania kliknij Alpha. Gdy system zakończy analizę, kliknij Zapisz RbA i zapisz go jako plik arkusza kalkulacyjnego.
    UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją ECIS, którą można znaleźć na stronie producenta38.

10. Analiza danych

  1. Sem
    1. Otwórz oprogramowanie do obrazowania, aby przeanalizować obrazy SEM. Kliknij pozycję Plik > Otwórz, a następnie wybierz obraz do analizy.
    2. Kliknij Obraz > Wpisz > 8 bitów, aby przekonwertować obraz na skalę szarości i wykonać operację progową.
    3. Skalibruj pomiar odległości pikseli z dokładnością do mikronów. Kliknij narzędzie Linia prosta i prześledź długość każdej cząstki, która ma być zmierzona.
    4. Kliknij przycisk Analizuj, a następnie ustaw skalę. Znana odległość zostanie ustawiona na długość rozmiaru paska skali na obrazie SEM. Znana jednostka długości zostanie ustawiona na mikrony. Zaznacz opcję Globalne i naciśnij przycisk OK.
    5. Kliknij narzędzie Linia prosta i prześledź średnicę cząstki, a następnie wybierz opcję Analizuj i mierz. Zapisz wynik długości.
    6. Powtórz te czynności dla wszystkich zebranych obrazów. Uśrednić wszystkie średnice z co najmniej 60 cząstek, aby uzyskać odpowiednią ocenę statystyczną.
  2. EDX (Biblioteka EDX
    1. Uśrednij wszystkie procenty wagowe każdego elementu razem ze wszystkich zebranych obrazów (patrz sekcja EDX powyżej).
    2. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, narysuj wykres słupkowy każdego elementu na osi x i ich średni procent wagi pierwiastków na osi y.
  3. Układ scalony50
    1. Uśrednić studzienki ślepej próby i uśrednić dołki dawkowe dla każdej kontrpróby.
    2. Obliczyć skorygowaną ślepą próbę, odejmując średnią próby kontrolnej od średniej ślepej próby dawki. Oblicz rzeczywistą wartość komórki dla każdej dawki, odejmując skorygowaną ślepą próbę od średniej wartości dawki.
    3. Skorygowaną wartość ślepej próby dla każdej dawki należy odjąć od średniej wartości kontrolnej. Oblicz żywotność komórek każdej dawki, korzystając z równania: żywotność komórek = (rzeczywista wartość komórki/(wartość kontrolna - skorygowana wartość ślepa)) x 100.
    4. Powtórz tę czynność dla wszystkich innych powtórzeń.
    5. Uśrednić żywotność komórek dla każdej kontrpróby, aby uzyskać ostateczną żywotność komórek dla każdej dawki.
    6. W oprogramowaniu wybierz zakładkę XY na ekranie.
    7. Wprowadzić wartości stężenia (dawki) do kolumny X, a żywotność komórek (%) z każdej dawki do kolumny Y.
    8. Przekształć wartości X, klikając Analizuj > Przekształć > OK i Przekształć X = Log(X).
    9. Znormalizuj wartości Y, wybierając arkusz Przekształcone dane, klikając pozycję Analizuj, a następnie wybierając pozycję Normalizuj.
    10. Wybierz arkusz danych Normalizacja transformacji, kliknij przycisk Analizuj i wybierz opcję Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej). Wybierz opcję Dose-Response-Inhibition i kliknij Log(Inhibitor) Vs. Nachylenie zmiennej odpowiedzi (cztery parametry). Kliknij OK, aby wyświetlić wyniki.
  4. ECIS (Europejski Urząd
    1. Z arkusza kalkulacyjnego weź kolumny rezystancji (omów) dla każdej kontrpróby (studzienki ślepe i studzienki dozujące) i uśrednij je razem z częstotliwości 4,000 Hz. Ta częstotliwość umożliwia ocenę kontaktu komórka-komórka38.
    2. Obliczyć skorygowaną oporność, odejmując uśrednioną próbę ślepą od uśrednionej dawki dla każdej kontrpróby. Uśrednić skorygowaną oporność dla kontrprób dla każdej dawki.
    3. Powtórz te same kroki dla wartości alfa, aby obliczyć średni parametr alfa. Wykreślić oś x jako czas (h), a oś y jako średnie wartości oporności/alfa dla każdej wartości dawki.

11. Analiza statystyczna

  1. Sem
    1. Wykonaj odchylenie standardowe w pliku arkusza kalkulacyjnego, w którym obliczono średnie średnice cząstek ZIF-8.
    2. Korzystając z funkcji ODCH.STANDARDOWE w arkuszu kalkulacyjnym, zaznacz dane 60 cząstek i kliknij Enter. Proszę przedstawić na wykresie odchylenie standardowe dla każdej obliczonej średniej średnicy.
  2. EDX (Biblioteka EDX
    1. Podobnie jak w przypadku SEM (kroki 11.1.1-11.1.2), oblicz odchylenie standardowe dla każdego średniego składu pierwiastkowego za pomocą funkcji ODCH.STANDARDOWE w arkuszu kalkulacyjnym. Rysuj na wykresie odchylenia standardowe dla każdego średniego składu pierwiastkowego.
  3. Układ scalony50
    1. Otwórz oprogramowanie używane do obliczenia IC50 i kliknij zgrupowany arkusz danych.
    2. Wprowadź dawki ZIF-8 w wierszach oznaczonych Grupa A, Grupa B itd. Wprowadź średnią żywotność komórek dla każdej dawki i powtórz w kolumnie odpowiadającej dawce ZIF-8.
    3. Kliknij pozycję Analizuj, a następnie w obszarze Analizy kolumnowe wybierz opcję ANOVA jednokierunkowa (oraz nieparametryczna lub mieszana).
    4. Na karcie Projekt eksperymentalny wybierz opcję Brak dopasowania lub parowania. W obszarze Rozkład gaussowski reszt wybierz opcję Tak użyj funkcji ANOVA. Na koniec wybierz opcję Tak Użyj zwykłego testu ANOVA w obszarze Załóżmy, że są równe SD.
    5. Na karcie Porównania wielokrotne wybierz opcję Porównaj średnią każdej kolumny ze średnią kolumny kontrolnej. Kliknij OK, aby wyświetlić wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z popularnego modelu linii komórkowej in vitro39 (BEAS-2B), to badanie miało na celu wykazanie wykonalności i możliwości zastosowania ECIS do oceny zmian w zachowaniu komórek po ekspozycji na zsyntetyzowany laboratoryjnie MOF. Ocenę tych zmian uzupełniono analizą za pomocą konwencjonalnych testów kolorymetrycznych.

Najpierw oceniono fizykochemiczne cechy struktury, aby zapewnić odtwarzalność zastosowanych metod, ważność otrzymanych wyników oraz isto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniejsza analiza wykazała, że ECIS można wykorzystać do oceny zachowania komórek narażonych na działanie analitów (tj. nanorurek węglowych35, leków43 lub nanoglinek16). Ponadto Stueckle i in. wykorzystali ECIS do oceny toksyczności komórek BEAS-2B narażonych na działanie nanoglinek i ich produktów ubocznych i stwierdzili, że zachowanie i przywiązanie komórek zależało od właściwości fizykochemicznych takich materiałów42. W ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów w tej pracy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została częściowo sfinansowana przez program T32 (GM133369 T32 Narodowego Instytutu Nauk Medycznych (NIGMS) oraz Narodową Fundację Nauki (NSF 1454230). Ponadto docenia się pomoc i wsparcie WVU Shared Research Facilities oraz Biofizyki Stosowanej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Disulfonian 4-[3-(4-idofenylo)-2-(4-nitrofenylo)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzenu disulfonian (oznaczenie WST-1) Roche5015944001
0,25% Trypsyna-EDTA (1x)Gibco25255-056
Płyty 100 mmOkap430167
1300 Series A2Thermo Scientific323TS
2510 Sonikator do kąpieli BransonSprzęt procesowy i Dostawa, Inc. 251OR-DTH
2-metyloimidazol, 97%Alfa Aesar693-98-1
5 mL sterylne mikroprobówkiArgos TechnologiesT2076S-CA
50 mL  probówki Płytki studzienne Falcon352098
96W10idfBiofizyka stosowana 96W10idf PET
96-dołkowe płytkiFisherbrandFB012931
BiorenderBiorenderN/A
Szkiełka komory do liczenia komórek CountessInvitrogenC10283
Countess II FL automatyczny licznik komórekLife TechnologiesC0916-186A-0303
Napylarka do drewna węglowego Denton Desk VDenton VacuumNie dotyczy
dimetylosulfotlenku Corning25-950-CQC
DPBS/Zmodyfikowany CytivaSH30028.02
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle mediumCorning10-014-CV
ECIS-ZΘBiofizyka stosowana ABP 1129
ExcelMicrosoft Version 2301
Probówki Falcon (15 ml)Corning352196
Surowica bydlęcapłodu Gibco16140-071
Czytnik płytek FLUOstar OPTIMABMG LABTECH413-2132
Oprogramowanie GraphPad Prism (9.0.0)Oprogramowanie GraphPad, LLCWersja 9.0.0
HERAcell 150i CO2 InkubatorThermo Scientific50116047
Hitachi S-4700 Skaningowy mikroskop elektronowy z emisją polową wyposażony w promieniowanie rentgenowskie dyspersyjne z dyspersją energii Oprogramowanie analityczne Hitachi High-Technologies CorporationS4700 i EDAX TEAM
Metanol, 99%Fisher Chemical67-56-1
Folia uszczelniająca ParafilmThe Lab DepotHS234526A
Penicylina/SteptomycynaGibco15140-122
Wirówka Sorvall Legend X1R Thermo Scientific75004220
Sorvall T 6000BDU PONT  T6000B
Błękit trypanowy, 0,4% roztwór w PBSMP Biomedicals, LLC1691049
Komora próżniowaBelart999320237
Azotan sześciowodny, 98% ekstra czystyAcros Organic101-96-18-9
biodymroczny Corning Oprogramowanie ImageJ National Institutes of Health N/A Unieśmiertelnione ludzkie komórki nabłonka oskrzeli American Type Culture Collection CRL-9609 Zamrażarka izotemperaturowa Fisher Scientific 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tamames-Tabar, C., et al. Cytotoxicity of nanoscaled metal-organic frameworks. Journal of Materials Chemistry. B. 2 (3), 262-271 (2014).
  2. Lin, W. X., et al. Low cytotoxic metal-organic frameworks as temperature-responsive drug carriers. ChemPlusChem. 81 (8), 804-810 (2016).
  3. Vasconcelos, I. B., et al. Cytotoxicity and slow release of the anti-cancer drug doxorubicin from ZIF-8. RSC Advances. 2 (25), 9437-9442 (2012).
  4. Yang, B. C., Shen, M., Liu, J. Q., Ren, F. Post-synthetic modification nanoscale metal-organic frameworks for targeted drug delivery in cancer cells. Pharmaceutical Research. 34 (11), 2440-2450 (2017).
  5. Lucena, M. A. M., et al. Application of the metal-organic framework Eu(BTC) as a luminescent marker for gunshot residues: A synthesis, characterization, and toxicity study. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (5), 4684-4691 (2017).
  6. Kayal, S., Sun, B. C., Chakraborty, A. Study of metal-organic framework MIL-101(Cr) for natural gas (methane) storage and compare with other MOFs (metal-organic frameworks). Energy. 91, 772-781 (2015).
  7. Gutov, O. V., et al. Water-stable zirconium-based metal-organic framework material with high-surface area and gas-storage capacities. Chemistry. 20 (39), 12389-12393 (2014).
  8. Ghorbanloo, M., Safarifard, V., Morsali, A. Heterogeneous catalysis with a coordination modulation synthesized MOF: morphology-dependent catalytic activity. New Journal of Chemistry. 41 (10), 3957-3965 (2017).
  9. Valvekens, P., et al. Base catalytic activity of alkaline earth MOFs: a (micro) spectroscopic study of active site formation by the controlled transformation of structural anions. Chemical Science. 5 (11), 4517-4524 (2014).
  10. Taylor, K. M. L., Rieter, W. J., Lin, W. B. Manganese-based nanoscale metal-organic frameworks for magnetic resonance imaging. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14358-14359 (2008).
  11. Taylor-Pashow, K. M. L., Della Rocca, J., Xie, Z. G., Tran, S., Lin, W. B. Postsynthetic modifications of iron-carboxylate nanoscale metal-organic frameworks for imaging and drug delivery. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14261-14263 (2009).
  12. Kundu, T., et al. Mechanical downsizing of a gadolinium(III)-based metal-organic framework for anticancer drug delivery. Chemistry. 20 (33), 10514-10518 (2014).
  13. Orellana-Tavra, C., et al. Drug delivery and controlled release from biocompatible metal-organic frameworks using mechanical amorphization. Journal of Materials Chemistry. B. 4 (47), 7697-7707 (2016).
  14. Su, H. M., et al. A highly porous medical metal-organic framework constructed from bioactive curcumin. Chemical Communications. 51 (26), 5774-5777 (2015).
  15. Gandara-Loe, J., et al. Metal-organic frameworks as drug delivery platforms for ocular therapeutics. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (2), 1924-1931 (2019).
  16. Wagner, A., et al. Toxicity screening of two prevalent metal organic frameworks for therapeutic use in human lung epithelial cells. International Journal of Nanomedicine. 14, 7583-7591 (2019).
  17. Chen, G. S., et al. In vitro toxicity study of a porous iron(III) metal-organic framework. Molecules. 24 (7), 1211(2019).
  18. Eldawud, R., Wagner, A., Dong, C. B., Rojansakul, Y., Dinu, C. Z. Electronic platform for real-time multi-parametric analysis of cellular behavior post-exposure to single-walled carbon nanotubes. Biosensors & Bioelectronics. 71, 269-277 (2015).
  19. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Current in vitro methods in nanoparticle risk assessment: Limitations and challenges. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (2), 370-377 (2009).
  20. Lucena, F. R. S., et al. Induction of cancer cell death by apoptosis and slow release of 5-fluoracil from metal-organic frameworks Cu-BTC. Biomedicine & Pharmacotherapy. 67 (8), 707-713 (2013).
  21. Orellana-Tavra, C., et al. Tuning the endocytosis mechanism of Zr-based metal-organic frameworks through linker functionalization. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (41), 35516-35525 (2017).
  22. Zucker, R. M., Ortenzio, J. N. R., Boyes, W. K. Characterization, detection, and counting of metal nanoparticles using flow cytometry. Cytometry. Part A. 89 (2), 169-183 (2016).
  23. Robson, A. L., et al. Advantages and limitations of current imaging techniques for characterizing liposome morphology. Frontiers in Pharmacology. 9, 80(2018).
  24. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  25. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  26. Wagner, A., et al. Toxicity evaluations of nanoclays and thermally degraded byproducts through spectroscopical and microscopical approaches. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861, 3406-3415 (2017).
  27. Wagner, A., et al. Early assessment and correlations of nanoclay's toxicity to their physical and chemical properties. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (37), 32323-32335 (2017).
  28. Wagner, A., et al. Incineration of nanoclay composites leads to byproducts with reduced cellular reactivity. Scientific Reports. 8 (1), 10709(2018).
  29. Zhao, F., Klimecki, W. T. Culture conditions profoundly impact phenotype in BEAS-2B, a human pulmonary epithelial model. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 945-951 (2015).
  30. Wu, S. X., Wang, W. H., Fang, Y. Z., Kong, X. J., Liu, J. H. Efficient Friedel-Crafts acylation of anisole over silicotungstic acid modified ZIF-8. Reaction Kinetics Mechanisms and Catalysis. 122, 357-367 (2017).
  31. Shu, F. P., et al. Fabrication of a hyaluronic acid conjugated metal organic framework for targeted drug delivery and magnetic resonance imaging. RSC Advances. 8 (12), 6581-6589 (2018).
  32. Shi, Z. Q., et al. FA-PEG decorated MOF nanoparticles as a targeted drug delivery system for controlled release of an autophagy inhibitor. Biomaterials Science. 6 (10), 2582-2590 (2018).
  33. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126(2022).
  34. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  35. Eldawud, R., et al. Carbon nanotubes physicochemical properties influence the overall cellular behavior and fate. Nanoimpact. 9, 72-84 (2018).
  36. An, Y., Jin, T. Y., Zhang, F., He, P. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) for profiling cytotoxicity of cigarette smoke. Journal of Electroanalytical Chemistry. 834, 180-186 (2019).
  37. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  38. Applied Biophysics, Allied Biophysics. , Available from: https://biophysics.com (2023).
  39. Park, Y. H., Kim, D., Dai, J., Zhang, Z. Human bronchial epithelial BEAS-2B cells, an appropriate in vitro model to study heavy metals induced carcinogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 287 (3), 240-245 (2015).
  40. Yang, F., et al. Morphological map of ZIF-8 crystals with five distinctive shapes: Feature of filler in mixed-matrix membranes on C3H6/C3H8 separation. Chemistry of Materials. 30 (10), 3467-3473 (2018).
  41. Rose, O. L., et al. Thin films of metal-organic framework interfaces obtained by laser evaporation. Nanomaterials. 11 (6), 1367(2021).
  42. Stueckle, T. A., et al. Impacts of organomodified nanoclays and their incinerated byproducts on bronchial cell monolayer integrity. Chemical Research in Toxicology. 32 (12), 2445-2458 (2019).
  43. Eldawud, R., et al. Potential antitumor activity of digitoxin and user-designed analog administered to human lung cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1864 (11), 129683(2020).
  44. Zhuang, J., et al. Optimized metal-organic-framework nanospheres for drug delivery: Evaluation of small-molecule encapsulation. ACS Nano. 8 (3), 2812-2819 (2014).
  45. Eldawud, R., et al. Combinatorial approaches to evaluate nanodiamond uptake and induced cellular fate. Nanotechnology. 27 (8), 085107(2016).
  46. Houthaeve, G., De Smedt, S. C., Braeckmans, K., De Vos, W. H. The cellular response to plasma membrane disruption for nanomaterial delivery. Nano Convergence. 9 (1), 6(2022).
  47. Otero-Gonzalez, L., Sierra-Alvarez, R., Boitano, S., Field, J. A. Application and validation of an impedance-based real time cell analyzer to measure the toxicity of nanoparticles impacting human bronchial epithelial cells. Environmental Science & Technology. 46 (18), 10271-10278 (2012).
  48. Ibarguren, M., Lopez, D. J., Escriba, P. V. The effect of natural and synthetic fatty acids on membrane structure, microdomain organization, cellular functions and human health. Biochimica et Biophysica Acta. 1838 (6), 1518-1528 (2014).
  49. Nor, Y. A., et al. Shaping nanoparticles with hydrophilic compositions and hydrophobic properties as nanocarriers for antibiotic delivery. ACS Central Science. 1 (6), 328-334 (2015).
  50. Farcal, L., et al. Comprehensive in vitro toxicity testing of a panel of representative oxide nanomaterials: First steps towards an intelligent testing strategy. PLoS One. 10 (5), e0127174(2015).
  51. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137(2012).
  52. Xiao, C. D., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: Concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  53. Coyle, J. P., et al. Carbon nanotube filler enhances incinerated thermoplastics-induced cytotoxicity and metabolic disruption in vitro. Particle and Fibre Toxicology. 17 (1), 40(2020).
  54. Yu, M. H., et al. Hyaluronic acid modified mesoporous silica nanoparticles for targeted drug delivery to CD44-overexpressing cancer cells. Nanoscale. 5 (1), 178-183 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metal organiczne sieci strukturalnetoksyczno MOFelektryczne sensory kom rkowemonitorowanie kom rek w czasie rzeczywistymnab onek p uc cz owiekazeolityczna sie imidazolowasensory impedancjitoksyczno nanomateria wzastosowania biomedyczneanaliza zachowania kom rek

Powiązane artykuły