Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65314

⸱

14 kwietnia 2023

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

W tym artykule

Podsumowanie

Kurczliwość aktomyozyny odgrywa ważną rolę w morfogenezie komórek i tkanek. Jednak trudno jest dokładnie manipulować kurczliwością aktomiozyny in vivo. Protokół ten opisuje system optogenetyczny, który szybko hamuje kurczliwość aktomiozyny za pośrednictwem Rho1 w zarodkach Drosophila, ujawniając natychmiastową utratę napięcia nabłonka po inaktywacji aktomiozyny in vivo.

Streszczenie

Siły skurczu generowane przez aktynę i miozynę II bez mięśni ("kurczliwość aktomiozyny") są kluczowe dla zmian morfologicznych komórek i tkanek w wielu skalach długości, takich jak podział komórek, migracja komórek, fałdowanie nabłonka i morfogeneza rozgałęzień. Dogłębne zrozumienie roli kurczliwości aktomiozyny w morfogenezie wymaga podejść umożliwiających szybką inaktywację aktomiozyny, co jest trudne do osiągnięcia przy użyciu konwencjonalnych podejść genetycznych lub farmakologicznych. Przedstawiony protokół demonstruje zastosowanie systemu dimeryzacji optogenetycznej opartego na CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, do hamowania kurczliwości aktomiozyny w zarodkach Drosophila z precyzyjną kontrolą czasową i przestrzenną. W tym systemie CRY2 jest połączony z dominującą ujemną formą Rho1 (Rho1DN), podczas gdy CIBN jest zakotwiczony w błonie plazmatycznej. Dimeryzacja CRY2 i CIBN za pośrednictwem światła niebieskiego powoduje szybką translokację Rho1DN z cytoplazmy do błony komórkowej, gdzie inaktywuje aktomiozynę poprzez hamowanie endogennego Rho1. Ponadto w artykule przedstawiono szczegółowy protokół sprzężenia inaktywacji aktomiozyny za pośrednictwem Opto-Rho1DN z ablacją laserową w celu zbadania roli aktomiozyny w generowaniu napięcia nabłonka podczas tworzenia bruzd brzusznych Drosophila. Protokół ten można zastosować do wielu innych procesów morfologicznych, które obejmują kurczliwość aktomiozyny w zarodkach Drosophila przy minimalnych modyfikacjach. Ogólnie rzecz biorąc, to narzędzie optogenetyczne jest potężnym podejściem do analizy funkcji kurczliwości aktomiozyny w kontrolowaniu mechaniki tkanek podczas dynamicznej przebudowy tkanek.

Wprowadzenie

Kurczliwość aktomyozyny, siła skurczu wywierana przez niemięśniową miozynę II (dalej 'miozynę') na sieć F-aktyny, jest jedną z najważniejszych sił w zmianie kształtu komórki i sterowaniu morfogenezą na poziomie tkanki1,2. Na przykład aktywacja kurczliwości aktomiozyny w domenie wierzchołkowej komórek nabłonka powoduje zwężenie wierzchołkowe, co ułatwia różne procesy morfogenetyczne, w tym fałdowanie nabłonka, wytłaczanie komórek, delaminację i gojenie się ran3,4,5,6,7. Aktywacja miozyny wymaga fosforylacji jej regulatorowego łańcucha lekkiego. Modyfikacja ta łagodzi hamującą konformację cząsteczek miozyny, umożliwiając im tworzenie dwubiegunowych wiązek włókien miozyny z wieloma domenami głowy na obu końcach. Dwubiegunowe włókna miozyny napędzają antyrównoległy ruch włókien aktyny i powodują generowanie siły skurczowej1,8,9.

Ewolucyjnie zachowana mała GTPaza rodziny Rho RhoA (Rho1 u Drosophila) odgrywa kluczową rolę w aktywacji kurczliwości aktomiozyny w różnych kontekstach komórkowych10,11. Rho1 działa jako przełącznik dwumolekularny, wiążąc GTP (forma aktywna) lub GDP (forma nieaktywna)12. Cykl między Rho1 związanym z GTP lub GDP jest regulowany przez białka aktywujące GTPazę (GAP) i czynniki wymiany nukleotydów guaniny (GEF)13. GEF funkcjonują w celu ułatwienia wymiany PKB na GTP, a tym samym aktywowania aktywności Rho1. Z drugiej strony GAP zwiększają aktywność GTPazy Rho1, a tym samym dezaktywują Rho1. Aktywowany Rho1 promuje kurczliwość aktomiozyny poprzez interakcję i aktywację jej efektorów, kinazy związanej z Rho (Rok) i Diaphanous14. Rok indukuje aktywację miozyny i kurczliwość aktomiozyny poprzez fosforylację regulatorowego łańcucha lekkiego miozyny15. Ponadto, Rok hamuje również fosfatazę łańcucha lekkiego regulatora miozyny, a tym samym dodatkowo promuje składanie włókien miozyny16. Rok może również fosforylować kinazy LIM, które po aktywacji zapobiegają rozkładowi aktyny poprzez fosforylację i hamowanie czynnika depolimeryzacji aktyny cofilin17,18. Przeźroczysty to nukleator aktyny z rodziny formin, który wspomaga polimeryzację aktyny, zapewniając bazę dla miozyny do interakcji z19,20,21.

Chociaż mechanizmy komórkowe aktywujące kurczliwość aktomiozyny zostały dobrze wyjaśnione, nasze zrozumienie jej funkcji w regulacji dynamicznej przebudowy tkanek pozostaje niekompletne. Wypełnienie tej luki w wiedzy wymaga podejść, które mogą szybko dezaktywować aktomiozynę w określonych regionach tkanek in vivo i rejestrować natychmiastowy wpływ na zachowanie i właściwości tkanek. Protokół ten opisuje zastosowanie podejścia optogenetycznego w celu ostrego zahamowania kurczliwości aktomiozyny podczas inwazji mezodermy Drosophila, a następnie pomiaru napięcia nabłonka za pomocą ablacji laserowej. Podczas gastrulacji Drosophila zlokalizowane brzusznie komórki prekursorowe mezodermy ulegają zwężeniu wierzchołkowemu i wnikają z powierzchni zarodka, tworząc bruzdę zorientowaną przednio-tylnie22,23. Powstawanie bruzd brzusznych od dawna służy jako model do badania mechanizmu fałdowania nabłonka. Tworzenie bruzd brzusznych jest zarządzane przez system wzorca grzbietowo-brzusznego u Drosophila24,25,26,27. Ekspresja dwóch czynników transkrypcyjnych, Twist i Snail, zlokalizowanych po brzusznej stronie zarodka, kontroluje tworzenie bruzd brzusznych i określa los komórek mezodermalnych28. Twist i Snail aktywują rekrutację Rho1 GEF RhoGEF2 do wierzchołka komórek prekursorowych mezodermy poprzez szlak receptora sprzężony z białkiem G i białko adaptorowe RhoGEF2, T4829,30,31,32,33. Następnie RhoGEF2 aktywuje miozynę na całej wierzchołkowej powierzchni potencjalnej mezodermy poprzez szlak kinazy Rho-Rho 34,35,36,37,38,39. Aktywowana miozyna tworzy nadkomórkową sieć aktomiozyny na całej wierzchołkowej powierzchni zawiązka mezodermy, której skurcze powodują zwężenie wierzchołkowe i powodują szybki wzrost napięcia tkanki wierzchołkowej14,37,40.

Narzędzie optogenetyczne opisane w tym protokole, Opto-Rho1DN, hamuje kurczliwość aktomiozyny poprzez zależną od niebieskiego światła rekrutację błony plazmatycznej dominującej negatywnej formy Rho1 (Rho1DN)41. Mutacja T19N w Rho1DN eliminuje zdolność zmutowanego białka do wymiany GDP na GTP, a tym samym sprawia, że białko jest wiecznie nieaktywne34. Kolejna mutacja w Rho1DN, C189Y, eliminuje jego naiwny sygnał ukierunkowany na błonę42,43. Kiedy Rho1DN jest podawany do błony komórkowej, wiąże się i gromadzi Rho1 GEF, blokując w ten sposób aktywację Rho1, a także aktywację miozyny i aktyny za pośrednictwem Rho1, w 34,44. Rekrutacja Rho1DN przez błonę plazmatyczną odbywa się za pomocą zależnego od światła modułu dimeryzacji pochodzącego z Cryptochrome 2 i jego partnera wiążącego CIB1. Kryptochrom 2 to aktywowany niebieskim światłem fotoreceptor kryptochromu u Arabidopsis thaliana45. Kryptochrom 2 wiąże się z CIB1, podstawowym białkiem helisa-pętla-helisa, tylko w stanie fotowzbudzonym45. Później odkryto, że konserwatywny N-końcowy region homologii fotoliazy (PHR) z kryptochromu 2 (CRY2PHR, dalej określany jako CRY2) i domena N-końcowa (aa 1-170) CIB1 (dalej CIBN) są ważne dla dimeryzacji indukowanej światłem46. Opto-Rho1DN zawiera dwa składniki. Pierwszym składnikiem jest białko CIBN połączone z kotwicą CAAX, która lokalizuje białko w błonie plazmatycznej47. Drugim komponentem jest CRY2 oznaczony mCherry połączony z Rho1DN41. Przy braku światła niebieskiego CRY2-Rho1DN pozostaje w cytoplazmie. Po stymulacji światłem niebieskim CRY2-Rho1DN jest kierowany do błony plazmatycznej poprzez interakcję między CIBN zakotwiczonym w błonie a wzbudzonym CRY2. Opto-Rho1DN może być aktywowany światłem ultrafioletowym A (UVA) i światłem niebieskim (400-500 nm, aktywacja szczytowa przy 450-488 nm) lub laserem impulsowym 830-980 nm podczas wykonywania stymulacji dwufotonowej 41,46,47,48. Dlatego Opto-Rho1DN jest stymulowany przez długości fal zwykle używane do wzbudzania GFP (488 nm dla obrazowania pojedynczych fotonów i 920 nm dla obrazowania dwufotonowego). W przeciwieństwie do tego, długości fal powszechnie używane do wzbudzania mCherry (561 nm dla obrazowania pojedynczych fotonów i 1,040 nm dla obrazowania dwufotonowego) nie stymulują modułu optogenetycznego i dlatego mogą być używane do obrazowania przed stymulacją. Protokół opisuje podejścia stosowane w celu zminimalizowania ryzyka niepożądanej stymulacji podczas manipulacji próbką.

Ablacja laserowa jest szeroko stosowana do wykrywania i mierzenia napięcia w komórkach i tkankach49. Wcześniejsze badania wykazały, że gdy intensywność lasera jest odpowiednio kontrolowana, dwufotonowa ablacja laserowa z użyciem femtosekundowego lasera bliskiej podczerwieni może fizycznie upośledzać niektóre struktury subkomórkowe (np. korowe sieci aktomiozyny) bez powodowania pęknięcia błony komórkowej50,51. Jeśli tkanka jest napięta, ablacja laserowa obszaru zainteresowania w tkance powoduje natychmiastowy odrzut na zewnątrz komórek sąsiadujących z obszarem poddanym ablacji. Prędkość odrzutu jest funkcją wielkości napięcia i lepkości ośrodka (cytoplazmy) otaczającego struktury poddawane odrzutowi49. Ze względu na doskonałą głębokość penetracji laserów bliskiej podczerwieni i zdolność do uzyskania dobrze ograniczonej ablacji ogniskowej, dwufotonowa ablacja laserowa jest szczególnie przydatna do wykrywania napięcia tkanek in vivo. Jak wykazano w tym protokole, metodę tę można łatwo połączyć z inaktywacją kurczliwości aktomiozyny za pośrednictwem Opto-Rho1DN w celu zbadania bezpośredniego wpływu zależnej od Rho1 kurczliwości komórkowej na mechanikę tkanek podczas dynamicznej przebudowy tkanki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ustawianie krzyżówki genetycznej i przygotowanie kubka do pobierania jaj

  1. Wybierz samice much (dziewicze) z linii optogenetycznej UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) na podkładce CO2 pod mikroskopem stereoskopowym i założył krzyżówkę z samcami much z matczynej linii kierowcy GAL4 67 Sqh-mCherry; 15 E-kadheryna-GFP.
    UWAGA: 67 i 15 oznaczają matczyną tubulinę-GAL4 wstawioną odpowiednio do drugiego (II) i trzeciego (III) chromosomu52. Linia GAL4 używana w tym protokole wyraża również oznaczony mCherry łańcuch lekki regulacji miozyny Sqh (Spaghetti squash)37 i oznaczony GFP E-cadherin53. Muchy z linii optogenetycznej mogą nadal zawierać chromosomy równoważące FM7 i TM6. Muchy z matczynej linii kierowcy GAL4 mogą nadal zawierać chromosomy równoważące CyO i TM3.
  2. Po ~10 dniach wybierz samice much F1 o następującym genotypie: UASp-CIBNpm/+; 67 Sqh-mCherry/+; 15 E-cadherin-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. Ustaw kubek na jaja z samcami much.
    1. Upewnij się, że samice much o prawidłowym genotypie nie zawierają żadnych chromosomów równoważących (tj. nie powinny zawierać kręconych skrzydeł [Cy], krótkiego włosia [Sb], oczu w kształcie pasków lub nerek [B] lub szczeciny pozaramiennej [Hu]), które są markerami dla równoważników CyO, TM3, FM7 i TM6 używanych odpowiednio do generowania stad. Przykryj filiżankę talerzem z sokiem jabłkowym z odcieniem świeżej pasty drożdżowej na powierzchni.
      UWAGA: U samic F1 składniki optogenetyczne ulegają ekspresji matczynej. Dlatego samice F1 używane do ustawiania kubka nie muszą być dziewicami. Dla wygody zaleca się używanie samców much z tej samej populacji F1 do kubka.
  3. Przechowuj kubek w kartonowym pudełku przykrytym folią aluminiową, aby uniknąć ewentualnego wycieku światła z otoczenia. Zmieniaj talerz na sok jabłkowy codziennie w przypadku filiżanek przechowywanych w temperaturze pokojowej (~21-23 °C) lub co dwa dni w przypadku filiżanek przechowywanych w temperaturze 18 °C.
    1. Bezpośrednio przed wymianą talerza uderz kubkiem o płaską powierzchnię (np. blat stołu), aby muchy pozostały na dnie kubka i uniemożliwiły ich ucieczkę. Zmień talerz na sok jabłkowy w ciemnym pomieszczeniu i użyj reflektora z czerwonym światłem do oświetlenia (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Aby zwiększyć ekspresję konstruktów, które są pod kontrolą matczynej tubuliny-GAL4 i UASp, zaleca się przechowywanie kubka w temperaturze 18 °C przez co najmniej 3 dni przed pobraniem zarodków. Ten okres inkubacji pozwala również muchom przystosować się do kubka i dobrze odżywiać się pastą drożdżową, aby osiągnąć optymalną produkcję jaj.

2. Pobranie zarodków na pożądanym etapie i przygotowanie ich do stymulacji optogenetycznej

UWAGA: Wszystkie kroki pobierania i przygotowania próbek muszą być wykonywane w ciemnym pomieszczeniu, przy użyciu "bezpiecznego światła" (np. czerwonego światła) do oświetlenia. Komponenty optogenetyczne są niezwykle wrażliwe na światło otoczenia. Nawet najmniejsza ekspozycja na światło otoczenia prowadzi do przedwczesnej stymulacji preparatu. Zazwyczaj światła w zakresie zielono-czerwonym (>532 nm) nie powodują niepożądanej stymulacji.

  1. W celu pobrania zarodków we wczesnej fazie embriogenezy należy umieścić nową płytkę z sokiem jabłkowym na filiżance na 8–16 godzin przed pobraniem zarodków (w temperaturze 18 °C).
  2. W momencie pobierania zarodków zmień talerz z sokiem jabłkowym. Oznacz płytkę zdjętą z kubka i przykryj powierzchnię płytki cienką warstwą oleju halowęglowego 27 (patrz Tabela materiałów). Poczekaj 30-60 sekund, aż skorupka jajka stanie się przezroczysta.
  3. Umieść pomarańczowo-czerwoną plastikową osłonę (patrz Tabela materiałów) na stage pionowego stereoskopu. Umieszczenie pomarańczowo-czerwonej osłony zapobiega niepożądanej stymulacji podczas oświetlania próbki poprzez blokowanie niebiesko-zielonych długości fal od przepuszczanego światła.
    UWAGA: W tym protokole do pobierania zarodków używa się pionowego stereoskopu (patrz Tabela materiałów).
  4. Umieść talerz z sokiem jabłkowym na pomarańczowo-czerwonej tarczy. Włącz światło przechodzące mikroskopu stereoskopowego, aby oświetlić próbkę. Zbierz 5-15 zarodków na odpowiednim etapie z talerza z sokiem jabłkowym za pomocą pęsety. Nie ściskaj zarodków pęsetą.
    UWAGA: W tym protokole odpowiedni zarodek powinien znajdować się na wczesnym i środkowym etapie celularyzacji. Zarodek na tym etapie powinien mieć ciemne, nieprzezroczyste żółtko otoczone przezroczystą, jednolitą warstwą peryplazmatyczną, która zawiera tworzące się komórki blastodermy. Krawędź czołowa bruzd łupliwych ("front celularyzacji"), która pojawia się jako ciągła linia równoległa do powierzchni zarodka, nie powinna przechodzić przez połowę głębokości peryplazmy.
  5. Delikatnie osusz zarodki na ręczniku papierowym (~1,5 cm × 1,5 cm), aby usunąć nadmiar sebum z zarodków za pomocą pęsety.
  6. Dodaj kilka kropli świeżo przygotowanego 40% wybielacza (~3% podchlorynu sodu; patrz Tabela materiałów) do nowego małego kwadratowego kawałka ręcznika papierowego (~1,5 cm × 1,5 cm) za pomocą plastikowej pipety transferowej, tak aby ręcznik papierowy był pokryty cienką warstwą wybielacza. Przenieś zarodek z suchego ręcznika papierowego na ręcznik papierowy nasączony wybielaczem za pomocą pęsety i upewnij się, że zarodki są namoczone w wybielaczu. Odczekaj 2-4 minuty, aż zarodek ulegnie dekorionacji.
  7. Po dechorionacji użyj pęsety, aby osuszyć kwadratowy ręcznik papierowy na dużym kawałku bibuły, aby usunąć nadmiar wybielacza. Upewnij się, że strona z zarodkami jest skierowana do góry.
  8. Aby wypłukać zarodki, za pomocą pęsety delikatnie namocz kwadratowy ręcznik papierowy w kropli dejonizowanej wody i szybko osusz go na dużym kawałku bibuły. Powtórz ten proces osiem razy, aby upewnić się, że usunięte są wszelkie pozostałości wybielacza.
  9. Za pomocą narzutki do rzęs przenieś zarodek z ręcznika papierowego do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (patrz Tabela materiałów). Dodaj wodę dejonizowaną do naczynia, aby całkowicie przykryć zarodki. Dostosuj pozycję i orientację zarodków za pomocą narzędzia do rzęs.
    UWAGA: Po dechorionacji zarodek ma tendencję do przyklejania się do powierzchni szkła i jest nieruchomy bez perturbacji, więc nie jest konieczne stosowanie dodatkowego leczenia (takiego jak klej) w celu unieruchomienia zarodka na naczyniu ze szklanym dnem.
  10. Umieścić naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm z zarodkami w odpornym na światło czarnym pudełku (patrz tabela materiałów) w celu ochrony próbki przed światłem podczas procesu przenoszenia. Przynieś pudełko do pokoju z mikroskopem wielofotonowym.

3. Stymulacja optogenetyczna, ablacja laserowa i obrazowanie zarodka

UWAGA: System wielofotonowy użyty w tym eksperymencie (patrz Tabela Materiałów) jest zdolny do jednoczesnego obrazowania na dwóch długościach fali. Zawiera również jednostkę fotostymulacji z laserem 458 nm i oddzielnym skanerem galwanometrycznym, umożliwiającym fotoaktywację/stymulację w określonym obszarze zainteresowania (ROI). Warto zauważyć, że laser o długości fali 920 nm, który służy do wzbudzania zielono-żółtych białek fluorescencyjnych, będzie stymulował Opto-Rho1DN, choć wolniej w porównaniu ze stymulacją za pośrednictwem niebieskiego lasera.

  1. Przykryj mikroskop wielofotonowy światłoszczelną czarną szmatką (patrz Tabela materiałów), aby uniknąć niepożądanej stymulacji zarodków podczas pobierania próbki i obrazowania.
    UWAGA: To samo podejście jest stosowane podczas zwykłego obrazowania wielofotonowego w celu ochrony detektorów światłoczułych wyposażonych w mikroskop.
  2. Wyłącz światło w pomieszczeniu i ekrany komputerów. Wyłącz kontroler panelu dotykowego, klikając OFF w sekcji "Podświetlenie kontrolera panelu dotykowego" w oprogramowaniu. Upewnij się, że w pomieszczeniu nie ma innego światła otoczenia.
    1. Otwórz przednią stronę czarnej osłony mikroskopu. Wyjmij naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm z czarnego pudełka i umieść je na stoliku mikroskopu.
  3. Oświetl zarodki zielonym światłem zwykle używanym jako światło wzbudzające dla epifluorescencji. Aby to zrobić, włącz jednostkę oświetlenia fluorescencyjnego, wybierz Okular w panelu "Okular" w oprogramowaniu i zmień "Wieżyczkę Cube" na 4:TRITC. Użyj okularu, aby zidentyfikować interesujący nas zarodek i ustawić na nim ostrość.
    UWAGA: Wizualizację zielonego światła uzyskuje się poprzez przepuszczenie białego światła generowanego przez jednostkę oświetlenia fluorescencyjnego przez wbudowaną standardową kostkę filtrującą TRITC, która zawiera filtr wzbudzenia 528-553 nm, rozdzielacz wiązki 565 nm i filtr emisyjny 590-650 nm. Inne światła inne niż niebieskie powinny również działać dobrze w przypadku oświetlenia próbki. Na tym etapie nie jest konieczne noszenie okularów ochronnych, ponieważ światło wzbudzające ma niską intensywność i nie będzie kierowane na okular. Zarodek będzie wyglądał na jednolicie czerwony z powodu autofluorescencji.
  4. Zamknij czarną osłonę z tkaniny, tak aby próbka była w pełni chroniona przed światłem. Włącz ekran komputera, aby uzyskać dostęp do oprogramowania sterującego mikroskopem. Zmień "Ocular" na LSM w oprogramowaniu do akwizycji obrazu.
  5. Wykonaj ablację laserową w kontrolnych, niestymulowanych zarodkach za pomocą obiektywu z 25-krotnym zanurzeniem w wodzie.
    1. Kliknij Bright Z, Sequence Manager i LSM Stimulation w "Oknie narzędzi" w oprogramowaniu. Ustaw typ skanera na Galvano, a rozmiar skanowania na 512 × 512. Włącz CH1 i CH3 w panelu "Ustawienia PMT", aby umożliwić korzystanie z lasera 1,040 nm, a następnie kliknij Live × 4, aby wyświetlić zarodek.
    2. Obróć zarodek za pomocą funkcji Rotacja w oprogramowaniu tak, aby oś przednio-tylna zarodka była zorientowana pionowo. Ustaw powiększenie na 3. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia kształtu w obszarze "Ustawienia skanowania" i ustaw rozmiar obszaru zainteresowania w panelu "Odniesienie". Ustaw ROI na 512 pikseli szerokości i 100 pikseli wysokości (171 × 33 μm2).
    3. Ustaw parametry akwizycji dla stosu Z przed ablacją.
      1. Zarejestrować powierzchnię zarodka jako 0 w sekcji Z. Ustaw początek jako 0, a koniec jako 100 μm. Ustaw rozmiar kroku na 2 μm. Aktywuj tryb akwizycji Z, zaznaczając Z w zakładce "Seria".
      2. Ustaw intensywność lasera 1 040 nm, aby zwiększyć liniowo od 3% do 7% za pomocą funkcji Bright Z.
      3. Zapisz bieżące ustawienie obrazowania jako pierwsze zadanie potoku, klikając LSM w 'Menedżer sekwencji'.
        UWAGA: Stos Z przed ablacją uzyskuje się w celu potwierdzenia stadium zarodka. W tym eksperymencie CRY2-Rho1DN-mCherry i Sqh-mCherry zostaną wzbudzone przez laser o długości fali 1040 nm. Podczas zwężenia wierzchołkowego sygnał Sqh-mCherry jest wzmacniany w obszarze przyśrodkowym brzusznych komórek mezodermalnych, podczas gdy CRY2-Rho1DN-mCherry jest cytozolowy przed stymulacją. Intensywność lasera zastosowanego do obrazowania przed i po stymulacji jest określana empirycznie na podstawie równowagi między optymalnym stosunkiem sygnału do szumu a unikaniem fotowybielania.
    4. Ustaw parametry akwizycji dla filmu przed ablacją.
      1. Usuń wszelkie istniejące ROI, aby umożliwić obrazowanie całego obszaru pikseli 512 × 512 (171 × 171 μm2, 3-krotne powiększenie) w pobliżu brzusznej powierzchni zarodka, jak opisano w kroku 3.5.2. Ustaw intensywność lasera 1,040 nm na 3%.
      2. Sprawdź czas i odznacz Z w panelu "Seria". Zachowaj "Interwał" jako FreeRun w panelu "Upływ czasu". Ustaw cykl na 10.
      3. Zapisz bieżące ustawienia jako następne zadanie potoku, klikając LSM w 'Menedżer sekwencji'.
        UWAGA: Celem tego zadania jest uzyskanie 10-klatkowego filmu wstępnej ablacji w pojedynczej płaszczyźnie Z za pomocą lasera o długości fali 1 040 nm do akwizycji obrazu. Szybkość akwizycji obrazu wynosi około 1 s na klatkę.
    5. Ustaw parametry ablacji laserowej.
      1. Zdefiniuj obszar 3D od bezpośrednio pod membraną witeliny do głębokości ~20 μm dla ablacji laserowej (Rysunek 1A). Ustaw początek stosu Z jako płaszczyznę, która znajduje się bezpośrednio pod membraną witeliny, a koniec jako 20 μm głębiej niż płaszczyzna początkowa. Ustaw rozmiar kroku na 1,5 μm.
        UWAGA: Zwrot z inwestycji obszaru poddanego ablacji wynosi ~30 pikseli szerokości i ~10 pikseli wysokości (~10 μm wzdłuż osi przyśrodkowo-bocznej i ~3,3 μm wzdłuż osi A-P). Celem ablacji próbki w wielu płaszczyznach Z jest zapewnienie, że powierzchnia wierzchołkowa komórek brzusznych zostanie poddana ablacji. Jest to szczególnie ważne dla stymulowanych zarodków, ponieważ komórki brzuszne doświadczają szybkiego rozluźnienia wierzchołkowego po zahamowaniu Rho1.
      2. Włącz CH2 i CH4 w panelu "Ustawienia PMT", aby umożliwić korzystanie z lasera 920 nm. Ustaw intensywność lasera 920 nm na 30%. Ustaw akwizycję obrazu za pomocą lasera 920 nm dla pojedynczego stosu Z w obszarze 3D zdefiniowanym w kroku 3.5.5.1 dla ablacji laserowej.
        UWAGA: Intensywność lasera wybrana w tym kroku jest wystarczająca do ablacji tkanki (na co wskazuje odrzut tkanki bezpośrednio po zabiegu laserowym), ale w międzyczasie nie uszkadza w oczywisty sposób błony plazmatycznej (na co wskazuje brak śladów oparzeń na błonie komórkowej) (Rysunek 1B, C).
      3. Zapisz bieżące ustawienie jako następne zadanie potoku, klikając LSM w "Menedżerze sekwencji".
    6. Ustaw parametry akwizycji dla filmu po ablacji.
      1. Ustaw akwizycję obrazu dla 100-klatkowego filmu po ablacji w pojedynczej płaszczyźnie Z przy użyciu laserów 1,040 nm i 920 nm. Ustaw intensywność lasera 1 040 nm i lasera 920 nm odpowiednio na 3% i 0.3%. Obszar określony w kroku 3.5.4 zostanie zobrazowany z identyczną szybkością akwizycji obrazu.
      2. Zapisz bieżące ustawienie jako następne zadanie potoku, klikając LSM w 'Menedżer sekwencji'.
        UWAGA: Celem przechowywania parametrów opisanych w krokach 3.5.3-3.5.6 jako zadań sekwencyjnych w "Menedżerze sekwencji" przed faktycznym pobraniem danych jest zapewnienie uchwycenia natychmiastowej odpowiedzi tkanek po ablacji laserowej.
    7. Wybierz Sekwencja w sekcji "Pobierz". W razie potrzeby zmień ścieżkę zapisywania danych i nazwę pliku. Kliknij przycisk Gotowe i poczekaj, aż oprogramowanie zainicjuje potok. Następnie kliknij przycisk Start, aby uruchomić potok.
  6. Wykonaj ablację laserową w stymulowanych zarodkach.
    1. Ustaw parametry akwizycji dla stosu Z przed ablacją, zgodnie z opisem w krokach 3.5.1-3.5.3. Zapisz bieżące ustawienie jako pierwsze zadanie potoku, klikając LSM w "Menedżerze sekwencji".
    2. Ustaw parametry stymulacji optogenetycznej w ramach zdefiniowanego ROI.
      1. Zmień powiększenie na 1 i wybierz ROI, który obejmuje brzuszną powierzchnię zarodka (~512 × 300 μm2). Wyłącz detektory CH1-CH4.
      2. Kliknij opcję LSM Stimulation (Stymulacja LSM). Usuń zaznaczenie opcji Ciągły w czasie trwania i wpisz 12 s. Sprawdź 458 nm z natężeniem lasera 0,3%.
      3. Zapisz bieżące ustawienie jako następne zadanie potoku, klikając Stymulacja w 'Menedżer sekwencji'.
        UWAGA: Szybszą stymulację można osiągnąć poprzez zwiększenie intensywności lasera 458 nm. Jednak przy użyciu lasera o wyższej intensywności rozproszone światło laserowe może stymulować obszar przylegający do ROI, co nie jest idealne, jeśli wymagana jest stymulacja ograniczona przestrzennie.
    3. Ustaw 3-minutowy czas oczekiwania po stymulacji, aby zapewnić całkowitą inaktywację miozyny i demontaż wierzchołkowej F-aktyny oraz uzyskać statyczną morfologię tkanki przed ablacją laserową. Można to osiągnąć, klikając Wait/Pause w "Menedżerze sekwencji" i ustawiając żądany czas dla "Wait".
      UWAGA: Rekrutacja CRY2-Rho1DN-mCherry do błony spowodowana pojedynczą rundą stymulacji (0,3% lasera 458 nm przez 12 s) jest wyraźnie wykrywalna 10-15 minut po stymulacji. Jest to zgodne z opublikowanym okresem połowicznego zaniku dysocjacji wynoszącym ~9 min47.
    4. Ustawić parametry akwizycji dla pojedynczego filmu przed ablacją w płaszczyźnie Z, zgodnie z opisem w kroku 3.5.4, z tą różnicą, że do akwizycji obrazu używane są zarówno lasery 1 040 nm, jak i 920 nm. Włącz detektory CH1-CH4. Ustaw intensywność lasera 1 040 nm i lasera 920 nm odpowiednio na 3% i 0.3%. Zapisz bieżące ustawienie jako następne zadanie potoku, klikając LSM w "Menedżerze sekwencji".
    5. Ustaw parametry ablacji laserowej zgodnie z opisem w kroku 3.5.5. Zapisz bieżące ustawienie jako następne zadanie potoku, klikając LSM w "Menedżerze sekwencji".
    6. Ustaw parametry akwizycji dla pojedynczego filmu po ablacji w płaszczyźnie Z, zgodnie z opisem w kroku 3.5.6. Zapisz bieżące ustawienie jako następne zadanie potoku, klikając LSM w "Menedżerze sekwencji".
    7. Wybierz Sekwencja w sekcji "Pobierz". W razie potrzeby zmień ścieżkę zapisywania danych i nazwę pliku. Kliknij przycisk Gotowe i poczekaj, aż oprogramowanie zainicjuje potok. Następnie kliknij przycisk Start, aby wykonać potok.

4. Kwantyfikacja szybkości odrzutu tkanek po ablacji laserowej

  1. Otwórz film po ablacji w ImageJ.
  2. Narysuj mały ROI wzdłuż brzusznej linii środkowej, która obejmuje obszar poddany ablacji, za pomocą narzędzia Zaznaczanie prostokąta. Szerokość ROI wynosi dziewięć pikseli. Wysokość ROI jest ustawiona w taki sposób, aby ROI był wystarczająco duży, aby pokryć pełny zakres odrzutu tkanek po ablacji laserowej.
    1. Kliknij Duplikuj w zakładce "Obraz". W wyskakującym okienku zaznacz opcję Duplikuj stos, a następnie kliknij przycisk OK, aby zduplikować stos w ramach wybranego zwrotu z inwestycji.
  3. Wygeneruj montaż ze zduplikowanego stosu za pomocą opcji Image > Stacks > Make Montage. W wyskakującym okienku ustaw numer wiersza na 1, a numer kolumny na łączną liczbę ramek w stosie (w tym przypadku 100).
  4. Zmierz szerokość A-P obszaru poddanego ablacji w czasie na podstawie wygenerowanego montażu.
    1. Użyj narzędzia Wielopunktowy w obrazie ImageJ, aby wyznaczyć granice A-P obszaru poddanego ablacji dla każdego punktu czasowego w montażu.
    2. Zapisz współrzędne zaznaczonych punktów za pomocą polecenia Plik > Zapisz jako > współrzędnych XY.
    3. Zaimportuj zmierzone współrzędne XY do MATLAB. Oblicz szerokość A-P obszaru poddanego ablacji dla każdego punktu czasowego, odejmując współrzędną Y górnej granicy od współrzędnej Y dolnej granicy.
  5. Określ szybkość odrzutu tkanki, dopasowując pierwsze 20 s krzywej "szerokości w czasie" do linii za pomocą funkcji "polyfit" w MATLAB. Podać nachylenie dopasowanej linii jako szybkość odrzutu tkanki.
  6. Wykonaj testy statystyczne, aby porównać szybkość odrzutu tkanek między próbkami stymulowanymi i niestymulowanymi.
    UWAGA: Zaleca się uzyskanie danych z co najmniej pięciu zarodków na każdy stan. Do porównań statystycznych można użyć zarówno dwustronnego testu sumy rang Wilcoxona, jak i dwustronnego testu t-Studenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niestymulowanych embrionach podlegających konstrikcji apikalnej białko Sqh-mCherry uległo wzbogaceniu w regionie medioapikalnym brzusznych komórek mezodermalnych, podczas gdy CRY2-Rho1DN-mCherry znajdowało się w cytozolu (Rycina 1A). Ablacja laserowa w obrębie domeny konstrikcji doprowadziła do szybkiego cofnięcia się tkanki wzdłuż osi A-P (Rycina 1B,C). W embrionach stymulowanych sygnał CRY2-Rho1DN-mCherry zlokalizował się w błonie plazmatycz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisywał połączone zastosowanie optogenetyki i ablacji laserowej w celu zbadania zmian napięcia tkanek natychmiast po inaktywacji kurczliwości aktomiozyny. Opisane tutaj narzędzie optogenetyczne wykorzystuje dominującą negatywną formę Rho1 (Rho1DN) do ostrego hamowania endogennej kurczliwości Rho1 i zależnej od Rho1 aktomiozyny. Wcześniejsza charakterystyka Opto-Rho1DN w kontekście tworzenia bruzd brzusznych Drosophila wykazała, że narzędzie jest wysoce skuteczne w pośredniczeniu w szybkiej inaktywa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Ann Lavanway za wsparcie w zakresie obrazowania. Autorzy dziękują laboratorium Wieschaus i laboratorium De Renzis za udostępnienie odczynników oraz Bloomington Drosophila Stock Center za zasoby much. Badanie to jest wspierane przez NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 i American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 dla BH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie ze szklanym dnem 35 mmMatTekP35G-1.5-10-CSłuży do przygotowania próbek
60 mm i czas; 15 mm szalka Petriego z pokrywkąFalcon351007Służy do przygotowania próbki
ściereczka do przykrycia mikroskopuOnlineNASłuży do unikania niepożądanej stymulacji światłem
Wybielacz Clorox Ultra Germicadal Bleach (8,25% podchlorynu sodu)VWR10028-048Służy do dechorynacji zarodków
CO2podkładka Genesee Scientific59-114Służy do ustawiania krzyżowego
ddH2ONANA Służy do przygotowania próbki
Pęseta Dumont Style 5VWR102091-654Służy do przygotowania próbki
Narzędzie do rzęs (wykonane z okrągłej szczotki z czystego czerwonego sobola #2)VWR22940-834Służy do przygotowania próbki
FluoView (oprogramowanie)OlympusNASłuży do akwizycji obrazu i stymulacji optogenetycznej
Olej halowęglowy 27Sigma AldrichH8773-100MLUżywany do wizualizacji stadium zarodka
ImageJ/FIJINIHNAUżywany do analizy obrazu
MATLABMathWorksNAUżywany do analizy obrazu
Stereoskop Nikon SMZ-745NikonNAUżywany do przygotowania próbek
Mikroskop wielofotonowy Olympus FVMPE-RS z dwuliniowymi ultraszybkimi laserami InSight DS do jednoczesnego obrazowania wielofotonowego o podwójnej długości fali, obiektywem zanurzeniowym w wodzie (XLPLN25XWMP2) 25x/NA1.05 oraz jednostką stymulacji IR/VIS do fotoaktywacji/stymulacji. System ten jest również wyposażony w filtr TRITC (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M) oraz oświetlacz fluorescencyjny, który emituje światło białe.OlympusNASłuży do akwizycji obrazu i stymulacji optogenetycznej
SP Bel-Art 100-miejscowy polipropylenowy pojemnik do zamrażania (, światłoszczelny pojemnik do przenoszenia próbek)VWR30621-392Służy do unikania niepożądanej stymulacji światłem
Osłona filtra UV do fluory FM1403 (pomarańczowo-czerwona plastikowa osłona)BoliopticsFM14036151Służy do unikania niepożądanej stymulacji światłem
Latarka czołowa VITCHELO V800 z białymi i czerwonymi światłami LED AmazonNASłuży do unikania niepożądanej stymulacji światłem

Bibliografia

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. Developmental Biology. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. Genetics. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629(2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082(2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366(2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893(2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hamowanie Rho1ablacja laserowamorfogeneza tkanekformowanie bruzdy brzusznejsystem CRY2 CIBNkonstrykcja apikalna
Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.