Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Uszkodzenia genomowego DNA powstają w wyniku spontanicznego rozpadu, uszkodzeń wewnętrznych i czynników środowiskowych¹. Powstałe zmiany DNA obejmują uszkodzone zasady, niedopasowania, pęknięcia jedno- i dwuniciowe, wiązania krzyżowe między- i wewnątrzniciowe oraz wiązania krzyżowe DNA-białko (DPC). DPC powstaje, gdy białko związane z chromatyną jest uwięzione w DNA poprzez wiązanie kowalencyjne. DPC są indukowane przez endogenne uszkodzenia DNA i reaktywne metabolity, a także czynniki egzogenne, takie jak chemioterapeutyki i dwufunkcyjne środki sieciujące. W pewnych okolicznościach dysfunkcja enzymów może również prowadzić do powstawania DPCs². Ogromna różnica w induktorach DPC skutkuje różnicą w tożsamości białka związanego kowalencyjnie, regionie chromosomu, w którym powstaje DPC, typie struktury DNA usieciowanego z białkiem oraz właściwościach chemicznych wiązania kowalencyjnego między białkiem a DNA^2,3,4.

Ze względu na ich chemiczną naturę, DPC są zazwyczaj klasyfikowane na dwie grupy: enzymatyczne DPC i nieenzymatyczne DPC. Niektóre enzymy, takie jak topoizomerazy, glikozylazy i metylo/acylotransferazy, działają poprzez tworzenie odwracalnych produktów kowalencyjnych enzymu i DNA podczas ich normalnych reakcji katalitycznych. Są to krótkożyciowe produkty pośrednie enzymatycznego DNA i mogą być przekształcane w długożyciowe enzymatyczne DPC po ich wyłapaniu przez czynniki endogenne lub egzogenne, w szczególności przez chemotherapeutics³. DPC topoizomerazy są jednymi z najczęstszych enzymatycznych DPC w komórkach eukariotycznych, które mogą być generowane przez klinicznie użyteczne inhibitory topoizomerazy (topotekan i irynotekan dla topoizomerazy I [TOP1] oraz etopozyd i doksorubicyna dla topoizomerazy II [TOP2]) i są głównymi mechanizmami terapeutycznymi tych inhibitorów^5,6. Metylotransferazy DNA (DNMT) 1, 3A i 3B są celem 5-aza-2'-deoksycytydyny (znanej również jako decytabina) i tworzą DPC po ekspozycji na lek⁷. Czynniki reaktywne, a także światło ultrafioletowe i promieniowanie jonizujące, indukują nieenzymatyczne DPC poprzez niespecyficzne sieciowanie białek z DNA. Aldehydy reaktywne, takie jak aldehyd octowy i formaldehyd (FA), są często wytwarzane jako produkty uboczne metabolizmu komórkowego, wśród których FA jest wytwarzany w stężeniach mikromolowych podczas metabolizmu metanolu, peroksydacji lipidów i demetylacji histonów. Ponadto FA jest substancją chemiczną produkowaną na dużą skalę produkowaną na całym świecie, na którą wiele osób jest narażonych zarówno środowiskowo, jak i zawodowo^8,9.

Zarówno enzymatyczne, jak i nieenzymatyczne DPC są wysoce toksyczne dla komórek, ponieważ ich masywne składniki białkowe skutecznie utrudniają prawie wszystkie procesy oparte na chromatynie, w tym replikację i transkrypcję, prowadząc do zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy, jeśli nie zostaną naprawione. W ciągu ostatnich dwóch dekad naprawa DPC była intensywnie badana, a kilka białek/szlaków zostało zidentyfikowanych jako kluczowe czynniki, które albo bezpośrednio naprawiają DPC, albo modulują ich procesy naprawy. Na przykład, dobrze ustalono, że proteoliza masy białkowej DPC jest kluczowym etapem naprawy DPC i że proteoliza może być katalizowana przez proteazy SPRTN^{10,11,12,13,14}, FAM111A¹⁵, GCNA^16,17, lub proteasom 26S complex^{18,19,20,21,22,23,24,25,26,27} w sposób zależny od typu komórki lub kontekstu komórkowego. Identyfikacja i charakterystyka tych proteaz w dużej mierze opierała się na kompleksie in vivo testu enzymatycznego (ICE)^28,29 oraz szybkim podejściu do odzyskiwania adduktów DNA (RADAR) class<="xref">30^,31, z których oba izolują cząsteczki DNA i ich białka związane kowalencyjnie z wolnych białek komórkowych, aby umożliwić wykrycie DPC przez slot-blot przy użyciu przeciwciał ukierunkowanych na białka usieciowane. Również test immunobarwienia DNA z pułapką agarozy (TARDIS) został wykorzystany jako sposób wykrywania i ilościowego oznaczania DPC na poziomie pojedynczej komórki³². Obecnie naukowcy wybierają test RADAR zamiast testu ICE do pomiaru DPC, ponieważ test ICE opiera się na oczyszczaniu kwasów nukleinowych za pomocą ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu, co jest niezwykle czasochłonne, podczas gdy test RADAR wytrąca kwasy nukleinowe przy użyciu etanolu w znacznie krótszym czasie.

W ostatnich latach pojawiło się coraz więcej dowodów na to, że wiele modyfikacji potranslacyjnych (PTM) jest zaangażowanych w sygnalizację i rekrutację proteaz ukierunkowanych na DPC^3,33,34,35. Na przykład stwierdzono, że zarówno TOP1, jak i TOP2-DPC są sprzężone z małym modyfikatorem podobnym do ubikwityny (SUMO)-2/3, a następnie SUMO-1 przez ligazę SUMO E3 PIAS4, niezależnie od replikacji i transkrypcji DNA. Sekwencyjne modyfikacje SUMO wydają się być celem ubikwityny, która jest deponowana w SUMOylowanych TOP-DPC i tworzy łańcuchy polimerowe poprzez resztę lizyny 48 przez ligazę ubikwityny ukierunkowaną na SUMO, zwaną RNF4. Następnie polimer ubikwityny wysyła sygnał i rekrutuje proteasom 26S do TOP-DPCs^23,36. Niedawno wykazano, że ten sam szlak SUMO-ubikwityny działa na DNMT1-DPC, a także na kompleksy PARP-DNA w celu ich naprawy^37,38. Ponadto, niezależna od SUMO ubikwitylacja przez ligazę ubikwityny E3 TRAIP została zgłoszona do głównych DPC w celu degradacji proteasomalnej w sposób sprzężony z replikacją³⁹. Podobnie jak proteasomalna degradacja TOP-DPC, proteoliza enzymatycznych i nieenzymatycznych DPC przez sprzężoną z replikacją metaloproteazę SPRTN wymaga również ubikwitylacji substratów DPC jako mechanizmu angażującego SPRTN^40,41. Określenie roli SUMOylacji i ubikwitylacji wymaga wykrycia DPC, które są oznaczone tymi PTM. Ponieważ oryginalny test ICE i test RADAR opierają się na aparacie slot-blot/dot-blot do pomiaru niestrawionych próbek DNA, żaden z tych dwóch testów nie jest w stanie rozpoznać i uwidocznić gatunków DPC sprzężonych z PTM o różnej masie cząsteczkowej. Aby przezwyciężyć ten problem, przetrawiliśmy próbki DNA po ich oczyszczeniu przez wytrącanie etanolu i normalizację próbki za pomocą nukleazy mikrokokowej, endoegzonukleazy DNA i RNA w celu uwolnienia usieciowanych białek, co umożliwiło nam rozwiązanie białek, a także ich kowalencyjnych PTM za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Elektroforeza pozwoliła nam wykryć i określić ilościowo DPC sprzężone z PTM przy użyciu specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko PTM. Początkowo nazwaliśmy tę ulepszoną metodę testem DUST, aby podkreślić jej solidność w wykrywaniu ubikwitylowanych i SUMOylowanych TOP-DPCs²³. Później rozszerzyliśmy zastosowanie testu do ilościowej oceny ADP-rybozylacji TOP1-DPC in vivo, używając przeciwciał przeciwko polimerom poli-ADP-rybozy²⁰.

Prezentowany tutaj jest szczegółowy protokół testu, który wykrywa i mierzy ubikwitylowane, SUMOylowane i ADP-rybozylowane DPC, który został zoptymalizowany dla zmodyfikowanych TOP-DPC, które są indukowane przez ich inhibitory i niespecyficznych/nieenzymatycznych DPC, które są indukowane przez FA. Test ten izoluje DPC sprzężone z PTM poprzez lizę komórek środkiem chaotropowym, wytrącanie DNA etanolem i uwalnianie usieciowanych białek i ich modyfikatorów za pomocą nukleazy mikrokokowej. Białka związane z DNA i ich PTM są oznaczane ilościowo przez immunoblotting przy użyciu specyficznych przeciwciał. Test ten toruje nową drogę do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych, za pomocą których komórka naprawia zarówno enzymatyczne, jak i nieenzymatyczne DPC. W szczególności umożliwia szczegółowe badania indukcji i kinetyki PTM ważnych dla regulacji degradacji i naprawy TOP-DPC, a tym samym pozwala na odkrycie nowych czynników, takich jak ligazy E3 dyktujące PTM. a także inhibitory ukierunkowane na te czynniki. Ponieważ niektóre z PTM odpowiedzialnych za naprawę TOP-DPC są prawdopodobnie zaangażowane w naprawę DPC indukowaną przez inne chemioterapeutyki, takie jak leki na bazie platyny²², test ten ma również potencjał do zastosowania do odkrywania nowych leków i racjonalnej optymalizacji terapii skojarzonych z inhibitorami topoizomerazy lub antynowotworami na bazie platyny w komórkach pacjenta w celu kierowania schematami leczenia.

1. Hodowla komórkowa i leczenie farmakologiczne w ludzkiej linii komórkowej embrionalnej nerki 293 (HEK293)

1. Przygotuj pożywkę hodowlaną, zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% 2 mM L-glutaminy i 100 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny.
2. Wysiew 1 x 10⁶ komórek na płytce 60 mm lub 6-dołkowej na warunek leczenia plus kontrola.
3. Następnego dnia potraktuj komórki induktorami DPC z wyboru.
   1. Aby indukować TOP1-DPC oraz ich ubikwitylację i SUMOylację, dodaj inhibitor TOP1 kamptotecynę w ilości 20 μM do komórek i zbierz komórki po 20, 60 i 180 minutach.
   2. Aby indukować TOP2α i β-DPC oraz ich ubikwitylację i SUMOylację, należy wystawić komórki na dodanie inhibitora TOP2 etopozydu w temperaturze 200 μM do komórek i zebrać komórki po 20, 60 i 180 minutach.
   3. Aby indukować nieenzymatyczne DPC i ich ubikwitylację oraz SUMOylację, dodaj FA w 1 mM i zbierz komórki 2 godziny po ekspozycji.
   4. Aby indukować PARylację TOP1-DPC, należy wstępnie potraktować komórki przez 1 godzinę w celu zablokowania dePARylacji inhibitorem glikohydrolazy poli(ADP-rybozy) (PARG) PDD00017273 przy 10 μM, a następnie jednocześnie leczyć 20 μM kamptotekiną przez 20, 60 i 180 minut.

2. Izolacja i normalizacja DNA zawierającego usieciowane białka

1. Po zabiegu szybko odessać pożywkę za pomocą pipety ssącej i przepłukać komórki lodowato zimną solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS). Natychmiast poddać komórki lizie w 600 μl odczynnika DNAzol zawierającego 1x inhibitor koktajlu proteazy, 1 mM ditiotreitol (DTT) i 20 mM N-etylomaleimidu (inhibitor enzymów desumo-ylujących i deubikwitylatujących).
2. Powoli mieszać płytkę na platformie wibracyjnej przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
3. Dodaj 1/2 objętości 100% zimnego etanolu (0,3 ml) bezpośrednio do płytki i powtarzaj krok 2.2, aż pojawi się nieprzezroczyste agregaty kwasu nukleinowego. Przenieść lizat komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i poddać probówkę wirowaniu z maksymalną prędkością (20 000 x g) przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia kwasu nukleinowego i jego usieciowanych białek.
4. Odessać supernatant za pomocą pipety ssącej i przemyć osad kwasu nukleinowego w 1 ml 75% etanolu, a następnie przez 2 minuty odwirowywać 20 000 x g w temperaturze 4 °C.
5. Zassać supernatant, odwirować z tą samą prędkością i usunąć pozostałą ciecz za pomocą pipety P20. Suszyć pelety na powietrzu przez 5 minut.
6. Szybko rozpuść osad kwasu nukleinowego w 0,1 ml ddH₂O. Ponownie zawiesić osad przez wielokrotne pipetowanie, a następnie inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż osad pęcznieje do co najmniej trzykrotnie większego (około 30 min).
7. Sonikować próbki za pomocą sondy ultradźwiękowej o amplitudzie 30% przez 10 sekund, aby całkowicie rozpuścić osad.
8. Krok opcjonalny: Próbki należy poddać działaniu mieszaniny RNazy A/T1 (10 μg RNazy A i 25 U RNazy T1) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu i dwie objętości lodowatego 100% etanolu do probówki, a następnie odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut w celu pobrania DNA. Usunąć supernatant i rozpuścić wytrącony DNA w 0,1 ml ddH₂O.
9. Etap opcjonalny: Odwirować próbkę przez 5 minut przy 20 000 x g i przenieść supernatant do nowej probówki.
10. Określić ilościowo stężenie DNA za pomocą spektrometru UV-Vis w ultrafiolecie. Typowa wydajność DNA wynosi około 600-800 ng/μl. Stosunek A260/A280 powinien zostać zmniejszony z 2,0-2,1 do 1,8-1,9 po usunięciu RNA.
11. Dostosuj stężenie DNA do 400-500 ng/μL w 0,12 ml ddH₂O. Przenieś 20 μl próbki do nowej probówki mikrowirówkowej jako kontrolę obciążenia niestrawionego DNA (patrz krok 2.4).
12. Aby strawić DNA rozpuszczone w pozostałych 100 μl ddH₂O, dodaj do próbki 2 000 jednostek żelu nukleazy mikrokokowej wraz z 1/10 objętości (~11 μl) 10x buforu reakcyjnego nukleazy mikrokokowej wapnia. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

3. Western blotting strawionych próbek DNA

1. Dodać 4x bufor do próbek Laemmli, a następnie gotować próbkę przez 5 minut.
2. Załaduj 5-6 μg strawionej próbki (~15 μL) na 4%-20% żelu poliakrylamidowego, a następnie SDS-PAGE⁴², aby rozpuścić niezmodyfikowane i sprzężone z PTM DPC.
3. Aby wykryć nieenzymatyczne gatunki DPC indukowane przez FA, należy inkubować żel z niebieską plamą Coomassie przez noc w temperaturze pokojowej. Przemyj żel ddH₂O przez 2 godziny i uzyskaj obraz za pomocą systemu obrazowania.
4. Przenieść żel i inkubować błony przez noc w temperaturze 4 °C, rozcieńczając odpowiednio pierwszorzędowe przeciwciało w buforze blokującym.
   1. Aby wykryć ubikwitylację, należy rozcieńczyć przeciwciało anty-ubikwityny w stosunku 1:100.
   2. Aby wykryć modyfikację SUMO-1 lub SUMO-2/3, wykonaj rozcieńczenie przeciwciała anty-SUMO-1 lub anty-SUMO-2/3 w stosunku 1:250.
   3. Aby wykryć ADP-rybozylację, należy rozcieńczyć przeciwciało anty-PAR w stosunku 1:500.
   4. Aby wykryć całkowite przeciwciała TOP1-, TOP2α- lub TOP2β-DPC, należy rozcieńczyć przeciwciało anty-TOP1, anty-TOP2α lub anty-TOP2β w stosunku 1:500.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat rozcieńczania przeciwciał można znaleźć w Tabeli materiałów.
5. Inkubować 1x PBS-T (0,1% tween 20) przemytą membranę z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym 5,000 razy w buforze blokującym przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
6. Wywołaj membranę za pomocą odczynnika o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i uzyskaj obraz za pomocą systemu obrazowania.

4. Slotting niestrawionych próbek DNA

1. Rozcieńczyć 20 μl niestrawionej próbki DNA w 180 μl buforu fosforanu sodu (25 mM, pH 6,6).
2. Przeciąć membranę nitrocelulozową (0,45 μm) i równoważyć przez 5 minut w buforze fosforanu sodu.
3. Zmontuj aparat do szczelinowania zgodnie z instrukcjami producenta i podłącz go do systemu próżniowego.
4. Przemyć studzienki buforem fosforanu sodu, stosując próżnię. Upewnij się, że studzienki nie przeciekają.
5. Zatrzymaj próżnię i załaduj 200 μl DNA na próbkę (1 μg). Wypełnić puste studzienki 200 μl buforu fosforanu sodu.
6. Zastosuj próżnię.
7. Gdy wszystkie studzienki są całkowicie puste, zatrzymaj próżnię, załaduj 200 μl buforu fosforanu sodu do każdej studzienki i powtórz krok 4.6.
8. Pobrać membranę i blok z 5% buforem blokującym przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej.
9. Sondę z przeciwciałem anty-dwuniciowym DNA (dsDNA) w rozcieńczeniu 1:5 000 przez noc w temperaturze 4 °C.
10. Przemyć 3x 1x PBS-T i inkubować z rozcieńczonym 1:5 000 rozcieńczonym przeciwciałem wtórnym przeciwko mysiej peroksydazie chrzanowej (HRP).
11. Wywołaj membranę za pomocą odczynnika o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i uzyskaj obraz za pomocą systemu obrazowania.

5. Analiza densytometryczna

1. Za pomocą ImageJ oblicz stosunek intensywności każdego prążka/rozmazu w stosunku do intensywności szczeliny niestrawionego DNA i znormalizuj stosunek do intensywności komórek bez / przed leczeniem farmakologicznym.

Reprezentatywne wyniki przedstawione w Rysunek 1 pokazuje powstawanie i kinetykę indukowanych przez leki TOP1-DPC oraz ich SUMOylację i ubikwitylację. TOP1 rozszczepił jedną nić dupleksu DNA i utworzył kowalencyjny produkt pośredni enzym-DNA, zwany kompleksem cięcia TOP1 (TOP1cc). Leczenie kamptotecyną (CPT), inhibitorem TOP1, wiązało się z TOP1cc i stabilizowało go, prowadząc do powstania TOP1-DPC o długim okresie życia. Zaobserwowano, że TOP1-DPC były indukowane i osiągały szczyt 20 minut po ekspozycji na CPT. Jednocześnie TOP1-DPC były modyfikowane przez SUMO-2/3, który również osiągnął szczyt 20 minut po leczeniu CPT. Ponieważ SUMO-2 i SUMO-3 mają 95% identyczności sekwencji, przeciwciało nie odróżnia jednego od drugiego. Po 60 minutach TOP1-DPC i ich modyfikacja SUMO-2/3 zmniejszyły się, czemu towarzyszyła kulminacja ich modyfikacji SUMO-1 i ubikwitylacji. Po 60 minutowej kuracji farmakologicznej poziom modyfikacji i ubikwitylacji TOP1-DPC SUMO-1 zaczął spadać. U ssaków izoenzymy TOP2 α i β działać poprzez wprowadzenie pęknięcia podwójnej nici DNA, a także poprzez tworzenie przejściowego i odwracalnego kompleksu kowalencyjnego enzym-DNA (TOP2cc). Inhibitory TOP2, takie jak etopozyd (ETOP), przekształcają TOP2cc w TOP2-DPC i indukują ich SUMOylację i ubikwitylację. Podobnie jak kinetyka TOP1-DPC i ich PTM, TOP2α- i β-DPC oraz ich modyfikacja SUMO-2/3 osiągnęły szczyt po 20 minutach, a następnie zaczęły spadać; tymczasem ich modyfikacje SUMO-1 i ubikwityny osiągnęły szczyt po 60 minutach (Ryc. 2). Wykazano, że klirens TOP-DPC wynika z degradacji proteasomalnej, a klirens TOP-DPC SUMOylacji i ubikwitylacji jest prawdopodobnie spowodowany recyklingiem przez deSUMOylację i deubikwitylację, odpowiednio, przez ich enzymy odwracające. Eksperymenty w Rysunek 3 badały nieenzymatyczne DPC indukowane przez FA i ich PTM. Zaobserwowano, że DPC i ich SUMO-2/3, SUMO-1 i ubikwitylacja tworzyły się i akumulowały w sposób zależny od dawki FA. Wreszcie, PARylacja TOP1-DPC została wykryta ilościowo za pomocą przeciwciała anty-PAR przy użyciu tej samej metody (Figura 4). PARylacja TOP1-DPC nie była wykrywalna, chyba że do komórki dodano inhibitor PAGR, co sugeruje, że PARylacja następuje szybko i jest bardzo dynamiczna. Zgodnie z poprzednim odkryciem, hamowanie dePARylacji przez PARGi wydaje się gromadzić TOP1-DPC, prawdopodobnie poprzez blokowanie degradacji proteolitycznej.

Rysunek 1: Analizy ilościowe powstawania i kinetyki TOP1-DPC oraz ich SUMOylacji i ubikwitylacji po leczeniu CPT w komórkach HEK293. (A) Komórki HEK293 były traktowane 20 μM CPT przez wskazane okresy czasu. Lizaty komórkowe pobrano i poddano zmodyfikowanemu testowi RADAR oraz western blot ze wskazanymi przeciwciałami. Niestrawione próbki DNA poddano slot-blotting przy użyciu przeciwciała anty-dsDNA jako kontroli obciążenia. (B) Natężenia pasma określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ i wykreślono za pomocą oprogramowania Prism. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analizy ilościowe powstawania i kinetyki TOP2-DPC oraz ich SUMOylacji i ubikwitylacji po leczeniu ETOP w komórkach HEK293. (A) Komórki HEK293 traktowano 200 μM ETOP przez wskazane okresy czasu. Lizaty komórkowe pobrano i poddano zmodyfikowanemu testowi RADAR oraz western blot ze wskazanymi przeciwciałami. Niestrawione próbki DNA poddano slot-blotting przy użyciu przeciwciała anty-dsDNA jako kontroli obciążenia. (B) Natężenia pasma określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ i wykreślono za pomocą oprogramowania Prism. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analizy ilościowe nieenzymatycznych DPC oraz ich SUMOylacji i ubikwitylacji po leczeniu FA w komórkach HEK293. (A) Komórki HEK293 traktowano FA o wskazanych stężeniach przez 2 godziny. Lizaty komórkowe pobrano i poddano zmodyfikowanemu testowi RADAR oraz western blot ze wskazanymi przeciwciałami. Niestrawione próbki DNA poddano slot-blotting przy użyciu przeciwciała anty-dsDNA jako kontroli obciążenia. (B) Natężenia pasma określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ i wykreślono za pomocą oprogramowania Prism. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analizy ilościowe TOP1-DPC i ich PARylacji po leczeniu CPT w komórkach HEK293. (A) Komórki HEK293 były wstępnie traktowane 10 μM PARGi przez 1 godzinę, a następnie współtraktowane CPT przez wskazane okresy czasu. Lizaty komórkowe pobrano i poddano zmodyfikowanemu testowi RADAR oraz western blot ze wskazanymi przeciwciałami. Niestrawione próbki DNA poddano slot-blotting przy użyciu przeciwciała anty-dsDNA jako kontroli obciążenia. (B) Natężenia pasma określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ i wykreślono za pomocą oprogramowania Prism. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autor deklaruje brak sprzecznych interesów.