Artykuł metodologiczny

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

DOI:

10.3791/65315

⸱

21 kwietnia 2023

1Developmental Therapeutics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiązania krzyżowe DNA-białko (DPC) to częste, wszechobecne i szkodliwe uszkodzenia DNA, które powstają w wyniku endogennego uszkodzenia DNA, nieprawidłowego działania enzymów (topoizomerazy, metylotransferazy itp.) lub czynników egzogennych, takich jak chemioterapeutyki i środki sieciujące. Po indukowaniu DPC, kilka rodzajów modyfikacji potranslacyjnych (PTM) jest natychmiast sprzężonych z nimi jako mechanizmy wczesnej reakcji. Wykazano, że DPC mogą być modyfikowane przez ubikwitynę, mały modyfikator podobny do ubikwityny (SUMO) i poli-ADP-rybozę, które przygotowują substraty do sygnalizowania odpowiednich wyznaczonych enzymów naprawczych i, w niektórych przypadkach, koordynują naprawę w sposób sekwencyjny. Ponieważ PTM rozprzestrzeniają się szybko i są wysoce odwracalne, wyzwaniem było wyizolowanie i wykrycie DPC sprzężonych z PTM, które zwykle pozostają na niskim poziomie. Przedstawiono tutaj test immunologiczny do oczyszczania i ilościowego wykrywania ubikwitylowanych, SUMOylowanych i ADP-rybozylowanych DPC (DPC topoizomerazy indukowane lekiem i niespecyficzne DPC indukowane aldehydem) in vivo. Test ten wywodzi się z testu RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery), który jest stosowany do izolacji genomowego DNA zawierającego DPC poprzez wytrącanie etanolu. Po normalizacji i trawieniu nukleazy, PTM DPC, w tym ubikwitylacja, SUMOylacja i ADP-rybozylacja, są wykrywane przez immunoblotting przy użyciu odpowiadających im przeciwciał. Ten solidny test może być wykorzystany do identyfikacji i scharakteryzowania nowych mechanizmów molekularnych, które naprawiają enzymatyczne i nieenzymatyczne DPC, a także ma potencjał do odkrycia małocząsteczkowych inhibitorów ukierunkowanych na określone czynniki, które regulują PTM w celu naprawy DPC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uszkodzenia genomowego DNA powstają w wyniku spontanicznego rozpadu, uszkodzeń wewnętrznych i czynników środowiskowych1. Powstałe zmiany DNA obejmują uszkodzone zasady, niedopasowania, pęknięcia jedno- i dwuniciowe, wiązania krzyżowe między- i wewnątrzniciowe oraz wiązania krzyżowe DNA-białko (DPC). DPC powstaje, gdy białko związane z chromatyną jest uwięzione w DNA poprzez wiązanie kowalencyjne. DPC są indukowane przez endogenne uszkodzenia DNA i reaktywne metabolity, a także czynniki egzogenne, takie jak chemioterapeutyki i dwufunkcyjne środki sieciujące. W pewnych okolicznościach dysfunkcja enzymów może również prowadzić do powstawania DPCs2. Ogromna różnica w induktorach DPC skutkuje różnicą w tożsamości białka związanego kowalencyjnie, regionie chromosomu, w którym powstaje DPC, typie struktury DNA usieciowanego z białkiem oraz właściwościach chemicznych wiązania kowalencyjnego między białkiem a DNA2,3,4.

Ze względu na ich chemiczną naturę, DPC są zazwyczaj klasyfikowane na dwie grupy: enzymatyczne DPC i nieenzymatyczne DPC. Niektóre enzymy, takie jak topoizomerazy, glikozylazy i metylo/acylotransferazy, działają poprzez tworzenie odwracalnych produktów kowalencyjnych enzymu i DNA podczas ich normalnych reakcji katalitycznych. Są to krótkożyciowe produkty pośrednie enzymatycznego DNA i mogą być przekształcane w długożyciowe enzymatyczne DPC po ich wyłapaniu przez czynniki endogenne lub egzogenne, w szczególności przez chemotherapeutics3. DPC topoizomerazy są jednymi z najczęstszych enzymatycznych DPC w komórkach eukariotycznych, które mogą być generowane przez klinicznie użyteczne inhibitory topoizomerazy (topotekan i irynotekan dla topoizomerazy I [TOP1] oraz etopozyd i doksorubicyna dla topoizomerazy II [TOP2]) i są głównymi mechanizmami terapeutycznymi tych inhibitorów5,6. Metylotransferazy DNA (DNMT) 1, 3A i 3B są celem 5-aza-2'-deoksycytydyny (znanej również jako decytabina) i tworzą DPC po ekspozycji na lek7. Czynniki reaktywne, a także światło ultrafioletowe i promieniowanie jonizujące, indukują nieenzymatyczne DPC poprzez niespecyficzne sieciowanie białek z DNA. Aldehydy reaktywne, takie jak aldehyd octowy i formaldehyd (FA), są często wytwarzane jako produkty uboczne metabolizmu komórkowego, wśród których FA jest wytwarzany w stężeniach mikromolowych podczas metabolizmu metanolu, peroksydacji lipidów i demetylacji histonów. Ponadto FA jest substancją chemiczną produkowaną na dużą skalę produkowaną na całym świecie, na którą wiele osób jest narażonych zarówno środowiskowo, jak i zawodowo8,9.

Zarówno enzymatyczne, jak i nieenzymatyczne DPC są wysoce toksyczne dla komórek, ponieważ ich masywne składniki białkowe skutecznie utrudniają prawie wszystkie procesy oparte na chromatynie, w tym replikację i transkrypcję, prowadząc do zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy, jeśli nie zostaną naprawione. W ciągu ostatnich dwóch dekad naprawa DPC była intensywnie badana, a kilka białek/szlaków zostało zidentyfikowanych jako kluczowe czynniki, które albo bezpośrednio naprawiają DPC, albo modulują ich procesy naprawy. Na przykład, dobrze ustalono, że proteoliza masy białkowej DPC jest kluczowym etapem naprawy DPC i że proteoliza może być katalizowana przez proteazy SPRTN10,11,12,13,14, FAM111A15, GCNA16,17, lub proteasom 26S complex18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 w sposób zależny od typu komórki lub kontekstu komórkowego. Identyfikacja i charakterystyka tych proteaz w dużej mierze opierała się na kompleksie in vivo testu enzymatycznego (ICE)28,29 oraz szybkim podejściu do odzyskiwania adduktów DNA (RADAR) class<="xref">30,31, z których oba izolują cząsteczki DNA i ich białka związane kowalencyjnie z wolnych białek komórkowych, aby umożliwić wykrycie DPC przez slot-blot przy użyciu przeciwciał ukierunkowanych na białka usieciowane. Również test immunobarwienia DNA z pułapką agarozy (TARDIS) został wykorzystany jako sposób wykrywania i ilościowego oznaczania DPC na poziomie pojedynczej komórki32. Obecnie naukowcy wybierają test RADAR zamiast testu ICE do pomiaru DPC, ponieważ test ICE opiera się na oczyszczaniu kwasów nukleinowych za pomocą ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu, co jest niezwykle czasochłonne, podczas gdy test RADAR wytrąca kwasy nukleinowe przy użyciu etanolu w znacznie krótszym czasie.

W ostatnich latach pojawiło się coraz więcej dowodów na to, że wiele modyfikacji potranslacyjnych (PTM) jest zaangażowanych w sygnalizację i rekrutację proteaz ukierunkowanych na DPC3,33,34,35. Na przykład stwierdzono, że zarówno TOP1, jak i TOP2-DPC są sprzężone z małym modyfikatorem podobnym do ubikwityny (SUMO)-2/3, a następnie SUMO-1 przez ligazę SUMO E3 PIAS4, niezależnie od replikacji i transkrypcji DNA. Sekwencyjne modyfikacje SUMO wydają się być celem ubikwityny, która jest deponowana w SUMOylowanych TOP-DPC i tworzy łańcuchy polimerowe poprzez resztę lizyny 48 przez ligazę ubikwityny ukierunkowaną na SUMO, zwaną RNF4. Następnie polimer ubikwityny wysyła sygnał i rekrutuje proteasom 26S do TOP-DPCs23,36. Niedawno wykazano, że ten sam szlak SUMO-ubikwityny działa na DNMT1-DPC, a także na kompleksy PARP-DNA w celu ich naprawy37,38. Ponadto, niezależna od SUMO ubikwitylacja przez ligazę ubikwityny E3 TRAIP została zgłoszona do głównych DPC w celu degradacji proteasomalnej w sposób sprzężony z replikacją39. Podobnie jak proteasomalna degradacja TOP-DPC, proteoliza enzymatycznych i nieenzymatycznych DPC przez sprzężoną z replikacją metaloproteazę SPRTN wymaga również ubikwitylacji substratów DPC jako mechanizmu angażującego SPRTN40,41. Określenie roli SUMOylacji i ubikwitylacji wymaga wykrycia DPC, które są oznaczone tymi PTM. Ponieważ oryginalny test ICE i test RADAR opierają się na aparacie slot-blot/dot-blot do pomiaru niestrawionych próbek DNA, żaden z tych dwóch testów nie jest w stanie rozpoznać i uwidocznić gatunków DPC sprzężonych z PTM o różnej masie cząsteczkowej. Aby przezwyciężyć ten problem, przetrawiliśmy próbki DNA po ich oczyszczeniu przez wytrącanie etanolu i normalizację próbki za pomocą nukleazy mikrokokowej, endoegzonukleazy DNA i RNA w celu uwolnienia usieciowanych białek, co umożliwiło nam rozwiązanie białek, a także ich kowalencyjnych PTM za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Elektroforeza pozwoliła nam wykryć i określić ilościowo DPC sprzężone z PTM przy użyciu specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko PTM. Początkowo nazwaliśmy tę ulepszoną metodę testem DUST, aby podkreślić jej solidność w wykrywaniu ubikwitylowanych i SUMOylowanych TOP-DPCs23. Później rozszerzyliśmy zastosowanie testu do ilościowej oceny ADP-rybozylacji TOP1-DPC in vivo, używając przeciwciał przeciwko polimerom poli-ADP-rybozy20.

Prezentowany tutaj jest szczegółowy protokół testu, który wykrywa i mierzy ubikwitylowane, SUMOylowane i ADP-rybozylowane DPC, który został zoptymalizowany dla zmodyfikowanych TOP-DPC, które są indukowane przez ich inhibitory i niespecyficznych/nieenzymatycznych DPC, które są indukowane przez FA. Test ten izoluje DPC sprzężone z PTM poprzez lizę komórek środkiem chaotropowym, wytrącanie DNA etanolem i uwalnianie usieciowanych białek i ich modyfikatorów za pomocą nukleazy mikrokokowej. Białka związane z DNA i ich PTM są oznaczane ilościowo przez immunoblotting przy użyciu specyficznych przeciwciał. Test ten toruje nową drogę do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych, za pomocą których komórka naprawia zarówno enzymatyczne, jak i nieenzymatyczne DPC. W szczególności umożliwia szczegółowe badania indukcji i kinetyki PTM ważnych dla regulacji degradacji i naprawy TOP-DPC, a tym samym pozwala na odkrycie nowych czynników, takich jak ligazy E3 dyktujące PTM. a także inhibitory ukierunkowane na te czynniki. Ponieważ niektóre z PTM odpowiedzialnych za naprawę TOP-DPC są prawdopodobnie zaangażowane w naprawę DPC indukowaną przez inne chemioterapeutyki, takie jak leki na bazie platyny22, test ten ma również potencjał do zastosowania do odkrywania nowych leków i racjonalnej optymalizacji terapii skojarzonych z inhibitorami topoizomerazy lub antynowotworami na bazie platyny w komórkach pacjenta w celu kierowania schematami leczenia.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa i leczenie farmakologiczne w ludzkiej linii komórkowej embrionalnej nerki 293 (HEK293)

  1. Przygotuj pożywkę hodowlaną, zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% 2 mM L-glutaminy i 100 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny.
  2. Wysiew 1 x 106 komórek na płytce 60 mm lub 6-dołkowej na warunek leczenia plus kontrola.
  3. Następnego dnia potraktuj komórki induktorami DPC z wyboru.
    1. Aby indukować TOP1-DPC oraz ich ubikwitylację i SUMOylację, dodaj inhibitor TOP1 kamptotecynę w ilości 20 μM do komórek i zbierz komórki po 20, 60 i 180 minutach.
    2. Aby indukować TOP2α i β-DPC oraz ich ubikwitylację i SUMOylację, należy wystawić komórki na dodanie inhibitora TOP2 etopozydu w temperaturze 200 μM do komórek i zebrać komórki po 20, 60 i 180 minutach.
    3. Aby indukować nieenzymatyczne DPC i ich ubikwitylację oraz SUMOylację, dodaj FA w 1 mM i zbierz komórki 2 godziny po ekspozycji.
    4. Aby indukować PARylację TOP1-DPC, należy wstępnie potraktować komórki przez 1 godzinę w celu zablokowania dePARylacji inhibitorem glikohydrolazy poli(ADP-rybozy) (PARG) PDD00017273 przy 10 μM, a następnie jednocześnie leczyć 20 μM kamptotekiną przez 20, 60 i 180 minut.

2. Izolacja i normalizacja DNA zawierającego usieciowane białka

  1. Po zabiegu szybko odessać pożywkę za pomocą pipety ssącej i przepłukać komórki lodowato zimną solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS). Natychmiast poddać komórki lizie w 600 μl odczynnika DNAzol zawierającego 1x inhibitor koktajlu proteazy, 1 mM ditiotreitol (DTT) i 20 mM N-etylomaleimidu (inhibitor enzymów desumo-ylujących i deubikwitylatujących).
  2. Powoli mieszać płytkę na platformie wibracyjnej przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Dodaj 1/2 objętości 100% zimnego etanolu (0,3 ml) bezpośrednio do płytki i powtarzaj krok 2.2, aż pojawi się nieprzezroczyste agregaty kwasu nukleinowego. Przenieść lizat komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i poddać probówkę wirowaniu z maksymalną prędkością (20 000 x g) przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia kwasu nukleinowego i jego usieciowanych białek.
  4. Odessać supernatant za pomocą pipety ssącej i przemyć osad kwasu nukleinowego w 1 ml 75% etanolu, a następnie przez 2 minuty odwirowywać 20 000 x g w temperaturze 4 °C.
  5. Zassać supernatant, odwirować z tą samą prędkością i usunąć pozostałą ciecz za pomocą pipety P20. Suszyć pelety na powietrzu przez 5 minut.
  6. Szybko rozpuść osad kwasu nukleinowego w 0,1 ml ddH2O. Ponownie zawiesić osad przez wielokrotne pipetowanie, a następnie inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż osad pęcznieje do co najmniej trzykrotnie większego (około 30 min).
  7. Sonikować próbki za pomocą sondy ultradźwiękowej o amplitudzie 30% przez 10 sekund, aby całkowicie rozpuścić osad.
  8. Krok opcjonalny: Próbki należy poddać działaniu mieszaniny RNazy A/T1 (10 μg RNazy A i 25 U RNazy T1) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu i dwie objętości lodowatego 100% etanolu do probówki, a następnie odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut w celu pobrania DNA. Usunąć supernatant i rozpuścić wytrącony DNA w 0,1 ml ddH2O.
  9. Etap opcjonalny: Odwirować próbkę przez 5 minut przy 20 000 x g i przenieść supernatant do nowej probówki.
  10. Określić ilościowo stężenie DNA za pomocą spektrometru UV-Vis w ultrafiolecie. Typowa wydajność DNA wynosi około 600-800 ng/μl. Stosunek A260/A280 powinien zostać zmniejszony z 2,0-2,1 do 1,8-1,9 po usunięciu RNA.
  11. Dostosuj stężenie DNA do 400-500 ng/μL w 0,12 ml ddH2O. Przenieś 20 μl próbki do nowej probówki mikrowirówkowej jako kontrolę obciążenia niestrawionego DNA (patrz krok 2.4).
  12. Aby strawić DNA rozpuszczone w pozostałych 100 μl ddH2O, dodaj do próbki 2 000 jednostek żelu nukleazy mikrokokowej wraz z 1/10 objętości (~11 μl) 10x buforu reakcyjnego nukleazy mikrokokowej wapnia. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

3. Western blotting strawionych próbek DNA

  1. Dodać 4x bufor do próbek Laemmli, a następnie gotować próbkę przez 5 minut.
  2. Załaduj 5-6 μg strawionej próbki (~15 μL) na 4%-20% żelu poliakrylamidowego, a następnie SDS-PAGE42, aby rozpuścić niezmodyfikowane i sprzężone z PTM DPC.
  3. Aby wykryć nieenzymatyczne gatunki DPC indukowane przez FA, należy inkubować żel z niebieską plamą Coomassie przez noc w temperaturze pokojowej. Przemyj żel ddH2O przez 2 godziny i uzyskaj obraz za pomocą systemu obrazowania.
  4. Przenieść żel i inkubować błony przez noc w temperaturze 4 °C, rozcieńczając odpowiednio pierwszorzędowe przeciwciało w buforze blokującym.
    1. Aby wykryć ubikwitylację, należy rozcieńczyć przeciwciało anty-ubikwityny w stosunku 1:100.
    2. Aby wykryć modyfikację SUMO-1 lub SUMO-2/3, wykonaj rozcieńczenie przeciwciała anty-SUMO-1 lub anty-SUMO-2/3 w stosunku 1:250.
    3. Aby wykryć ADP-rybozylację, należy rozcieńczyć przeciwciało anty-PAR w stosunku 1:500.
    4. Aby wykryć całkowite przeciwciała TOP1-, TOP2α- lub TOP2β-DPC, należy rozcieńczyć przeciwciało anty-TOP1, anty-TOP2α lub anty-TOP2β w stosunku 1:500.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat rozcieńczania przeciwciał można znaleźć w Tabeli materiałów.
  5. Inkubować 1x PBS-T (0,1% tween 20) przemytą membranę z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym 5,000 razy w buforze blokującym przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Wywołaj membranę za pomocą odczynnika o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i uzyskaj obraz za pomocą systemu obrazowania.

4. Slotting niestrawionych próbek DNA

  1. Rozcieńczyć 20 μl niestrawionej próbki DNA w 180 μl buforu fosforanu sodu (25 mM, pH 6,6).
  2. Przeciąć membranę nitrocelulozową (0,45 μm) i równoważyć przez 5 minut w buforze fosforanu sodu.
  3. Zmontuj aparat do szczelinowania zgodnie z instrukcjami producenta i podłącz go do systemu próżniowego.
  4. Przemyć studzienki buforem fosforanu sodu, stosując próżnię. Upewnij się, że studzienki nie przeciekają.
  5. Zatrzymaj próżnię i załaduj 200 μl DNA na próbkę (1 μg). Wypełnić puste studzienki 200 μl buforu fosforanu sodu.
  6. Zastosuj próżnię.
  7. Gdy wszystkie studzienki są całkowicie puste, zatrzymaj próżnię, załaduj 200 μl buforu fosforanu sodu do każdej studzienki i powtórz krok 4.6.
  8. Pobrać membranę i blok z 5% buforem blokującym przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  9. Sondę z przeciwciałem anty-dwuniciowym DNA (dsDNA) w rozcieńczeniu 1:5 000 przez noc w temperaturze 4 °C.
  10. Przemyć 3x 1x PBS-T i inkubować z rozcieńczonym 1:5 000 rozcieńczonym przeciwciałem wtórnym przeciwko mysiej peroksydazie chrzanowej (HRP).
  11. Wywołaj membranę za pomocą odczynnika o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i uzyskaj obraz za pomocą systemu obrazowania.

5. Analiza densytometryczna

  1. Za pomocą ImageJ oblicz stosunek intensywności każdego prążka/rozmazu w stosunku do intensywności szczeliny niestrawionego DNA i znormalizuj stosunek do intensywności komórek bez / przed leczeniem farmakologicznym.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki przedstawione w Rysunek 1 pokazuje powstawanie i kinetykę indukowanych przez leki TOP1-DPC oraz ich SUMOylację i ubikwitylację. TOP1 rozszczepił jedną nić dupleksu DNA i utworzył kowalencyjny produkt pośredni enzym-DNA, zwany kompleksem cięcia TOP1 (TOP1cc). Leczenie kamptotecyną (CPT), inhibitorem TOP1, wiązało się z TOP1cc i stabilizowało go, prowadząc do powstania TOP1-DPC o długim okresie życia. Zaobserwowano, że TOP1-DPC były indukowane i osiągały szczyt 20 minut po ekspozycji na CPT. Jednocześnie TOP1-DPC były modyfikowane przez SUMO-2/3, który również osiągnął szczyt 20 minut po leczeniu CPT. Ponieważ SUMO-2 i SUMO-3 mają 95% identyczności sekwencji, przeciwciało nie odróżnia jednego od drugiego. Po 60 minutach TOP1-DPC i ich modyfikacja SUMO-2/3 zmniejszyły się, czemu towarzyszyła kulminacja ich modyfikacji SUMO-1 i ubikwitylacji. Po 60 minutowej kuracji farmakologicznej poziom modyfikacji i ubikwitylacji TOP1-DPC SUMO-1 zaczął spadać. U ssaków izoenzymy TOP2 α i β działać poprzez wprowadzenie pęknięcia podwójnej nici DNA, a także poprzez tworzenie przejściowego i odwracalnego kompleksu kowalencyjnego enzym-DNA (TOP2cc). Inhibitory TOP2, takie jak etopozyd (ETOP), przekształcają TOP2cc w TOP2-DPC i indukują ich SUMOylację i ubikwitylację. Podobnie jak kinetyka TOP1-DPC i ich PTM, TOP2α- i β-DPC oraz ich modyfikacja SUMO-2/3 osiągnęły szczyt po 20 minutach, a następnie zaczęły spadać; tymczasem ich modyfikacje SUMO-1 i ubikwityny osiągnęły szczyt po 60 minutach (Ryc. 2). Wykazano, że klirens TOP-DPC wynika z degradacji proteasomalnej, a klirens TOP-DPC SUMOylacji i ubikwitylacji jest prawdopodobnie spowodowany recyklingiem przez deSUMOylację i deubikwitylację, odpowiednio, przez ich enzymy odwracające. Eksperymenty w Rysunek 3 badały nieenzymatyczne DPC indukowane przez FA i ich PTM. Zaobserwowano, że DPC i ich SUMO-2/3, SUMO-1 i ubikwitylacja tworzyły się i akumulowały w sposób zależny od dawki FA. Wreszcie, PARylacja TOP1-DPC została wykryta ilościowo za pomocą przeciwciała anty-PAR przy użyciu tej samej metody (Figura 4). PARylacja TOP1-DPC nie była wykrywalna, chyba że do komórki dodano inhibitor PAGR, co sugeruje, że PARylacja następuje szybko i jest bardzo dynamiczna. Zgodnie z poprzednim odkryciem, hamowanie dePARylacji przez PARGi wydaje się gromadzić TOP1-DPC, prawdopodobnie poprzez blokowanie degradacji proteolitycznej.

figure-results-1
Rysunek 1: Analizy ilościowe powstawania i kinetyki TOP1-DPC oraz ich SUMOylacji i ubikwitylacji po leczeniu CPT w komórkach HEK293. (A) Komórki HEK293 były traktowane 20 μM CPT przez wskazane okresy czasu. Lizaty komórkowe pobrano i poddano zmodyfikowanemu testowi RADAR oraz western blot ze wskazanymi przeciwciałami. Niestrawione próbki DNA poddano slot-blotting przy użyciu przeciwciała anty-dsDNA jako kontroli obciążenia. (B) Natężenia pasma określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ i wykreślono za pomocą oprogramowania Prism. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analizy ilościowe powstawania i kinetyki TOP2-DPC oraz ich SUMOylacji i ubikwitylacji po leczeniu ETOP w komórkach HEK293. (A) Komórki HEK293 traktowano 200 μM ETOP przez wskazane okresy czasu. Lizaty komórkowe pobrano i poddano zmodyfikowanemu testowi RADAR oraz western blot ze wskazanymi przeciwciałami. Niestrawione próbki DNA poddano slot-blotting przy użyciu przeciwciała anty-dsDNA jako kontroli obciążenia. (B) Natężenia pasma określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ i wykreślono za pomocą oprogramowania Prism. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analizy ilościowe nieenzymatycznych DPC oraz ich SUMOylacji i ubikwitylacji po leczeniu FA w komórkach HEK293. (A) Komórki HEK293 traktowano FA o wskazanych stężeniach przez 2 godziny. Lizaty komórkowe pobrano i poddano zmodyfikowanemu testowi RADAR oraz western blot ze wskazanymi przeciwciałami. Niestrawione próbki DNA poddano slot-blotting przy użyciu przeciwciała anty-dsDNA jako kontroli obciążenia. (B) Natężenia pasma określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ i wykreślono za pomocą oprogramowania Prism. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analizy ilościowe TOP1-DPC i ich PARylacji po leczeniu CPT w komórkach HEK293. (A) Komórki HEK293 były wstępnie traktowane 10 μM PARGi przez 1 godzinę, a następnie współtraktowane CPT przez wskazane okresy czasu. Lizaty komórkowe pobrano i poddano zmodyfikowanemu testowi RADAR oraz western blot ze wskazanymi przeciwciałami. Niestrawione próbki DNA poddano slot-blotting przy użyciu przeciwciała anty-dsDNA jako kontroli obciążenia. (B) Natężenia pasma określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ i wykreślono za pomocą oprogramowania Prism. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana metoda pozwala na pomiar enzymatycznych i nieenzymatycznych wiązań krzyżowych DNA-białko w komórkach ssaków i jest jedynym odpowiednim podejściem do badania ich ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji. Slot-blotting po teście ICE lub RADAR umożliwia szybkie wykrycie specyficznych enzymatycznych DPC, takich jak TOP-DPC, przy użyciu ich przeciwciał. Jednak zastrzeżeniem do tej metody jest jej niezdolność do rozdzielenia białek o różnej masie cząsteczkowej, co uniemożliwia określenie rozmiarów DPC sprzężonych z PTM. Opisana metoda rozwiązuje problem poprzez uwalnianie usieciowanych białek za pomocą nukleazy mikrokokowej, która degraduje DNA do oligonukleotydów z końcowymi 3'-fosforanami, umożliwiając w ten sposób pełną separację białek (sprzężonych z oligonukleotydami) przez SDS-PAGE. DPC modyfikowane monomerami ubikwityny, SUMO lub ADP-rybozy oraz polimerami o różnych rozmiarach mogą być zatem wizualizowane i oznaczane ilościowo przez przeciwciała skierowane przeciwko tym PTM, umożliwiając szczegółowe badanie ich powstawania i kinetyki. Aby zapewnić odtwarzalność i obliczyć istotność statystyczną, wymagane są powtórzenia biologiczne eksperymentów.

Jednym z najczęstszych problemów związanych z tym testem jest niska wydajność DNA po wytrąceniu etanolu. Z jednej strony wydajność DNA można zwiększyć przy użyciu większej ilości materiału wyjściowego (komórek). Z drugiej strony, inkubacja lizatów komórkowych z etanolem na płaskiej płytce, a nie w probówce Eppendorfa, może znacznie poprawić agregację cząsteczek DNA, a tym samym ułatwić ich wytrącanie. Niespecyficzne sygnały obserwowane w próbkach bez leczenia farmakologicznego mogą wskazywać na zanieczyszczenie białkami niekowalencyjnymi. W takim przypadku można rozważyć mycie granulek DNA buforem o wysokiej zawartości soli w celu usunięcia zanieczyszczeń przed sonikacją. Zaleca się również odwirowanie próbek DNA po sonikacji i trawieniu nukleazy mikrokokowej i odrzucenie wszelkich nierozpuszczalnych. W przypadku słabego sygnału lub jego braku można spróbować kilku potencjalnych rozwiązań. Po pierwsze, można zwiększyć ilość ładunku DNA dla SDS-PAGE i immunoblottingu. Aby umożliwić wykrywanie gatunków DPC SUMOylowanych i ubikwitylowanych, zaleca się załadowanie do żelu co najmniej 4 μg DNA. Po drugie, można zwiększyć stężenie leku, aby wywołać wyższe poziomy DPC i związanych z nimi PTM. Po trzecie, sugeruje się inkubację blot z pierwotnymi przeciwciałami przez kolejny dzień, jeśli prążki/rozmazy wydają się słabe. 2-dniowa inkubacja może znacznie wzmocnić sygnał, a tym samym zmniejszyć zmienność biologiczną wynikającą z niezależnych eksperymentów23. Usuwanie membrany w celu ponownego barwienia nieuchronnie prowadzi do utraty pewnej ilości gatunków DPC sprzężonych z PTM, które są już w niskiej liczebności. Dlatego zdecydowanie zaleca się stosowanie oddzielnych żeli do wykrywania ubikwityny i SUMO, zamiast ponownego sondowania jednego blota. Ponadto granulki DNA muszą być przemyte 75% etanolem w celu usunięcia pozostałego DNAzolu zawierającego sól guanidyny przed rozpuszczeniem w H2O lub innych rozpuszczalnikach, co w przeciwnym razie powoduje krystalizację próbki po dodaniu buforu ładującego Laemmli.

Przebieg pracy opisanej metody jest znacznie bardziej efektywny czasowo w porównaniu z kłopotliwym testem ICE, ponieważ opiera się na szybkim wytrącaniu etanolu zamiast czasochłonnego ultrawirowania chlorku cezu w celu wyizolowania genomowego DNA. Oczyszczanie oparte na etanolu ma swoją cenę i powoduje niewielką ilość zanieczyszczeń białkowych, które zwykle są pomijalne dla immunodetekcji. Jednak jeśli chodzi o badania analityczne, takie jak analiza proteomiczna oparta na spektrometrii mas lub sekwencjonowanie nowej generacji, które wymagają dokładności i precyzji, wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu jest nadal bardziej niezawodnym podejściem do izolowania czystego DNA o wysokiej obfitości. Metoda ta może być również potencjalnie zastosowana do profilowania miejsc modyfikacji na usieciowanych białkach oraz do określania typów sprzężeń poli-ubikwitylacji i poli-SUMOylacji przy użyciu odpowiednich metod opartych na spektrometrii mas.

Warto zauważyć, że test ten pozwala na identyfikację i scharakteryzowanie czynników regulujących PTM w celu naprawy DPC. Na przykład bezstronne, wysokoprzepustowe metody badań przesiewowych (interferencja RNA i CRISPR) są potężnymi narzędziami do odkrywania ligaz ubikwityny E3, ligaz SUMO E3 i powiązanych z nimi kofaktorów łagodzących cytotoksyczność induktorów DPC. Opisana metoda umożliwia walidację molekularną tych białek poprzez określenie, czy pomagają one komórkom przetrwać induktory DPC poprzez naprawę DPC. Za pomocą tego protokołu można również zwalidować nowe małocząsteczkowe inhibitory ukierunkowane na te białka, zidentyfikowane na przykład za pomocą wirtualnych badań przesiewowych. Biorąc pod uwagę, że inhibitory topoizomerazy są jednymi z najczęściej przepisywanych chemioterapeutyków, ten solidny test może zostać opracowany jako narzędzie do opracowywania leków, które działają synergistycznie z klinicznymi inhibitorami topoizomerazy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor deklaruje brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez National Cancer Institute Center for Cancer ResearchExcellence in Postdoctoral Research Transition Award.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher70011069
4– 20% prefabrykowany żel poliakrylamidowyBio-Rad4561096
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610747
AcquaStain (coomassie blue)Bulldog BioAS001000
anty-dsDNA (monoklonalny myszy)Abcam271561: 5,000 zalecane jest rozcieńczenie
anty-PAR (monoklonalne mysie)R& Systemy D4335-MC-1001: Zalecane jest rozcieńczenie 1: 500
anty-SUMO-1 (monoklonalny królik)Technologia sygnalizacji komórkowej4940Zalecane jest rozcieńczenie
anty-SUMO-2/3 (monoklonalne królika)Technologia sygnalizacji komórkowej4971Zalecane jest rozcieńczenie 1: 250
anty-TOP1 (monoklonalne myszy)BD Biosciences5565971: Zalecane
jest rozcieńczenie 1: 500anty-TOP2&alfa; (mysz monoklonalna)Santa Cruz BiotechnologySC-3657991: 250 zaleca się rozcieńczenie
anty-TOP2 i beta; (mysz monoklonalna)Santa Cruz BiotechnologySC-25330Zalecane jest rozcieńczenie 1: 250
anty-ubikwityna (monoklonalna mys)Santa Cruz BiotechnologySC-80171: 100 zalecane jest rozcieńczenie
Chlorek wapniaSigma-Aldrich499609Stosowany do trawienia nukleazy mikrokokowej
ChemiDoBio-Rad12003154
Fosforan disodowySigma-Aldrich5438380100Służy do wytwarzania buforu fosforanowego sodu
DNAzolThermo Fisher10503027
DTT (ditiotreitol)Thermo FisherR0861
Zmodyfikowane podłoże orła DulbeccoSigma-Aldrich11965084
Alkohol etylowy, 200 proofSigma-AldrichE7023
EtopozydSigma-Aldrich1268808
FormaldehydSigma-Aldrich47608
Oprogramowanie Graphpad PrismGraphStatsPrism 9.0.0
IgG myszy sprzężonej z HRPCytivaNA931Zalecane jest rozcieńczenie 1: 5,000
IgG królika sprzężonego z HRPCytivaNA934Zalecane jest rozcieńczenie 1: 5,000
ImageJ SoftwareNIH, USAImageJ 1.53e
L-GlutaminaFisher Scientific25030081
Maksymalna czułość Podłoże ECLThermo Fisher34095
Nukleaza mikrokokkowaNew England BioLabsM0247S
Fosforan monosodowySigma-AldrichS3139Służy do wytwarzania buforu fosforanu sodu
Spektrofotometr NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000
N-etylomaleimidThermo Fisher23030Inhibitor deSUMOylacji/deubikwitylacji
Membrana nitrocelulozowa, 0,45 i mikro; mBio-Rad1620115
Beztłuszczowe mleko w proszkuBio-Rad1706404XTU
PDD00017273SelleckchemS8862Inhibitor glikohydrolazy poli(ADP-rybozy)
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher15140122
Koktajl inhibitorów proteazySonikator
Q700QsonicaQ700-110
Gotowy do montażu zestaw transferowy PVDFBio-Rad1704274
Aparat do blokosówBio-Rad1706542
Bibuła filtracyjna do bloksówBio-Rad1620161
System turbotransferu Trans-BlotBio-Rad1704150
Bufor do elektroforezy Tris/Glycine/SDSBio-Rad
Tween-20Sigma-AldrichP3179
Pionowe ogniwo do elektroforezyBio-Rad1658004
System obrazowania Sigma-Aldrich PHL89593 Thermo Fisher 78430 1610732

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  2. Klages-Mundt, N. L., Li, L. Formation and repair of DNA-protein crosslink damage. Science China. Life Sciences. 60 (10), 1065-1076 (2017).
  3. Weickert, P., Stingele, J. DNA-protein crosslinks and their resolution. Annual Review of Biochemistry. 91, 157-181 (2022).
  4. Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein cross-links: formation, structural identities, and biological outcomes. Accounts of Chemical Research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
  5. Pommier, Y., Nussenzweig, A., Takeda, S., Austin, C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (6), 407-427 (2022).
  6. Pommier, Y., Sun, Y., Huang, S. N., Nitiss, J. L. Roles of eukaryotic topoisomerases in transcription, replication and genomic stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 703-721 (2016).
  7. Ruggiano, A., Ramadan, K. DNA-protein crosslink proteases in genome stability. Communications Biology. 4 (1), 11(2021).
  8. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  9. Moretton, A., Loizou, J. I. Interplay between cellular metabolism and the DNA damage response in cancer. Cancers. 12 (8), 2051(2020).
  10. Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
  11. Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4564-4576 (2017).
  12. Stingele, J., et al. Mechanism and regulation of DNA-protein crosslink repair by the DNA-dependent metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
  13. Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 orchestrates replication-coupled DNA-protein crosslink repair. Molecular Cell. 64 (4), 704-719 (2016).
  14. Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491(2016).
  15. Kojima, Y., et al. FAM111A protects replication forks from protein obstacles via its trypsin-like domain. Nature Communications. 11 (1), 1318(2020).
  16. Dokshin, G. A., et al. GCNA interacts with spartan and topoisomerase II to regulate genome stability. Developmental Cell. 52 (1), 53-68 (2020).
  17. Borgermann, N., et al. SUMOylation promotes protective responses to DNA-protein crosslinks. The EMBO Journal. 38 (8), e101496(2019).
  18. Sun, Y., Zhang, Y., Schultz, C. W., Pommier, Y., Thomas, A. CDK7 inhibition synergizes with topoisomerase I inhibition in small cell lung cancer cells by inducing ubiquitin-mediated proteolysis of RNA polymerase II. Molecular Cancer Therapeutics. 21 (9), 1430-1438 (2022).
  19. Sun, Y., et al. Requirements for MRN endonuclease processing of topoisomerase II-mediated DNA damage in mammalian cells. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1007064(2022).
  20. Sun, Y., et al. PARylation prevents the proteasomal degradation of topoisomerase I DNA-protein crosslinks and induces their deubiquitylation. Nature Communications. 12 (1), 5010(2021).
  21. Sun, Y., et al. Excision repair of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC). DNA Repair. 89, 102837(2020).
  22. Sun, Y., Saha, L. K., Saha, S., Jo, U., Pommier, Y. Debulking of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC) by the proteasome, non-proteasomal and non-proteolytic pathways. DNA Repair. 94, 102926(2020).
  23. Sun, Y., et al. A conserved SUMO pathway repairs topoisomerase DNA-protein cross-links by engaging ubiquitin-mediated proteasomal degradation. Science Advances. 6 (46), (2020).
  24. Saha, S., et al. DNA and RNA cleavage complexes and repair pathway for TOP3B RNA- and DNA-protein crosslinks. Cell Reports. 33 (13), 108569(2020).
  25. Swan, R. L., Cowell, I. G., Austin, C. A. Mechanisms to repair stalled topoisomerase II-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 101 (1), 24-32 (2022).
  26. Swan, R. L., Poh, L. L. K., Cowell, I. G., Austin, C. A. Small molecule inhibitors confirm ubiquitin-dependent removal of TOP2-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 98 (3), 222-233 (2020).
  27. Sciascia, N., et al. Suppressing proteasome mediated processing of topoisomerase II DNA-protein complexes preserves genome integrity. eLife. 9, e53447(2020).
  28. Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 1703, 283-299 (2018).
  29. Subramanian, D., Furbee, C. S., Muller, M. T. ICE bioassay. Isolating in vivo complexes of enzyme to DNA. Methods in Molecular Biology. 95, 137-147 (2001).
  30. Nitiss, J. L., Kiianitsa, K., Sun, Y., Nitiss, K. C., Maizels, N. Topoisomerase assays. Current Protocols. 1 (10), e250(2021).
  31. Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104(2013).
  32. Cowell, I. G., Tilby, M. J., Austin, C. A. An overview of the visualisation and quantitation of low and high MW DNA adducts using the trapped in agarose DNA immunostaining (TARDIS) assay. Mutagenesis. 26 (2), 253-260 (2011).
  33. Leng, X., Duxin, J. P. Targeting DNA-protein crosslinks via post-translational modifications. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 944775(2022).
  34. Kuhbacher, U., Duxin, J. P. How to fix DNA-protein crosslinks. DNA Repair. 94, 102924(2020).
  35. Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. Mechanisms of DNA-protein crosslink repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 563-573 (2017).
  36. Sun, Y., Nitiss, J. L., Pommier, Y. SUMO: A Swiss army knife for eukaryotic topoisomerases. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 871161(2022).
  37. Krastev, D. B., et al. The ubiquitin-dependent ATPase p97 removes cytotoxic trapped PARP1 from chromatin. Nature Cell Biology. 24 (1), 62-73 (2022).
  38. Liu, J. C. Y., et al. Mechanism and function of DNA replication-independent DNA-protein crosslink repair via the SUMO-RNF4 pathway. The EMBO Journal. 40 (18), e107413(2021).
  39. Larsen, N. B., et al. Replication-coupled DNA-protein crosslink repair by SPRTN and the proteasome in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 73 (3), 574-588 (2019).
  40. Zhao, S., et al. A ubiquitin switch controls autocatalytic inactivation of the DNA-protein crosslink repair protease SPRTN. Nucleic Acids Research. 49 (2), 902-915 (2021).
  41. Ruggiano, A., et al. The protease SPRTN and SUMOylation coordinate DNA-protein crosslink repair to prevent genome instability. Cell Reports. 37 (10), 110080(2021).
  42. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie DPCanaliza ubikwitynacjiwykrywanie SUMOylacjiADP rybozylacjaanaliza RADARWestern blottrawienie nukleazinhibitory topoizomerazy

Powiązane artykuły