Artykuł metodologiczny

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

DOI:

10.3791/65316

⸱

21 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  , 
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czasoprzestrzenna transkrypcja genów jest ściśle regulowana przez dystalne elementy regulatorowe, takie jak wzmacniacze i tłumiki, które polegają na fizycznej bliskości z docelowymi promotorami genów w celu kontrolowania transkrypcji. Chociaż te elementy regulatorowe są łatwe do zidentyfikowania, ich geny docelowe są trudne do przewidzenia, ponieważ większość z nich jest specyficzna dla typu komórki i może być oddzielona setkami kilozasad w liniowej sekwencji genomu, pomijając inne geny niedocelowe. Od kilku lat Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) jest złotym standardem w zakresie łączenia dystalnych elementów regulatorowych z ich docelowymi genami. Jednak PCHi-C opiera się na dostępności milionów komórek, co uniemożliwia badanie rzadkich populacji komórek, takich jak te powszechnie uzyskiwane z tkanek pierwotnych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowano niskowejściową metodę Capture Hi-C (liCHi-C), opłacalną i konfigurowalną metodę identyfikacji repertuaru dystalnych elementów regulatorowych kontrolujących każdy gen genomu. liCHi-C opiera się na podobnej strukturze eksperymentalnej i obliczeniowej jak PCHi-C, ale dzięki zastosowaniu minimalnych zmian lampy, modyfikacji stężenia i objętości odczynnika oraz zamianie lub eliminacji kroków, odpowiada za minimalne straty materiału podczas budowy biblioteki. Reasumując, liCHi-C umożliwia badanie regulacji genów i czasoprzestrzennej organizacji genomu w kontekście biologii rozwojowej i funkcji komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czasowa ekspresja genów napędza różnicowanie komórek i ostatecznie rozwój organizmu, a jej zmiana jest ściśle związana z wieloma chorobami1,2,3,4,5. Transkrypcja genów jest precyzyjnie regulowana przez działanie elementów regulatorowych, które można sklasyfikować jako proksymalne (tj. promotory genów) i dystalne (np. wzmacniacze lub tłumiki), z których te ostatnie często znajdują się daleko od genów docelowych i fizycznie oddziałują z nimi poprzez pętlę chromatyny w celu modulacji ekspresji genów6,7,8.

Identyfikacja dystalnych regionów regulatorowych w genomie jest kwestią powszechnie zgodną, ponieważ regiony te posiadają specyficzne modyfikacje histonów9,10,11 i zawierają specyficzne motywy rozpoznawania czynników transkrypcyjnych, pełniąc dla nich rolę platform rekrutacyjnych12,13,14. Poza tym, w przypadku wzmacniaczy i super-wzmacniaczy15,16, mają one również niskie zajętość nukleosomów17,18 i są transkrybowane na niekodujące eRNAs19,20.

Niemniej jednak, geny docelowe każdego dystalnego elementu regulatorowego są trudniejsze do przewidzenia. Najczęściej interakcje między dystalnymi elementami regulatorowymi a ich celami są specyficzne dla typu komórki i bodźca21,22, obejmują setki kilozasad, mostkując inne geny w dowolnym kierunku23,24,25, a nawet mogą znajdować się w regionach intronowych docelowego genu lub innych genów, które nie występują między nimi26,27. Ponadto, dystalne elementy regulatorowe mogą również kontrolować więcej niż jeden gen w tym samym czasie i na odwrót28,29. Ta złożoność pozycyjna utrudnia wskazanie powiązań regulacyjnych między nimi, a zatem większość celów każdego elementu regulatorowego w każdym typie komórki pozostaje nieznana.

W ostatnich latach nastąpił znaczny boom w rozwoju technik wychwytywania konformacji chromosomów (3C) do badania oddziaływań chromatyny. Najczęściej stosowany z nich, Hi-C, pozwala na wygenerowanie mapy wszystkich interakcji pomiędzy każdym fragmentem genomu komórki 30. Jednakże, aby wykryć znaczące interakcje na poziomie fragmentu restrykcyjnego, Hi-C opiera się na ultragłębokim sekwencjonowaniu, co uniemożliwia jego stosowanie do rutynowego badania krajobrazu regulacyjnego poszczególnych genów. Aby przezwyciężyć to ekonomiczne ograniczenie, pojawiło się kilka technik 3C opartych na wzbogacaniu, takich jak ChIA-PET31, HiChIP32 i jego niskowejściowy odpowiednik HiCuT33. Techniki te polegają na wykorzystaniu przeciwciał do wzbogacenia w interakcje obejmujące cały genom, w których pośredniczy określone białko. Niemniej jednak unikalna cecha tych technik 3C jest również zmorą ich zastosowania; Użytkownicy liczą na dostępność wysokiej jakości przeciwciał dla interesującego ich białka i nie mogą porównywać warunków, w których wiązanie białka jest dynamiczne.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to kolejna technika wzbogacania 3C, która omija te ograniczenia34,35. Wykorzystując system wzbogacania sondy biotynylowanego RNA, PCHi-C jest w stanie wygenerować biblioteki całego genomu o wysokiej rozdzielczości regionów genomu oddziałujących z 28 650 promotorami genów z adnotacjami ludzkimi lub 27 595 myszymi, znanymi również jako interaktom promotora. Takie podejście pozwala na wykrycie znaczących oddziaływań dalekiego zasięgu z rozdzielczością na poziomie fragmentów restrykcyjnych zarówno aktywnych, jak i nieaktywnych promotorów, a także solidne porównanie interakcji promotorów między dowolnymi warunkami, niezależnie od dynamiki modyfikacji histonów lub wiązania białek. PCHi-C jest szeroko stosowany w ostatnich latach do identyfikacji reorganizacji interaktomu promotora podczas różnicowania komórek36,37, zidentyfikować mechanizm działania czynników transkrypcyjnych38,39, oraz odkryć nowe potencjalne geny i szlaki deregulowane w chorobie przez warianty niekodujące40,41,42,43,44,45,46,47,48, wraz z nowymi mutacjami niekodującymi sterownika49,50. Poza tym, po prostu modyfikując system przechwytywania, technikę tę można dostosować do pytania biologicznego, aby przesłuchać dowolny interaktom (np. wzmacniacz interactome51 lub interaktom, zbiór zmian niekodujących41,52).

Jednak PCHi-C wykorzystuje technikę do wykonania techniki na minimum 20 milionach komórek, co uniemożliwia badanie rzadkich populacji komórek, takich jak te często używane w biologii rozwojowej i zastosowaniach klinicznych. Z tego powodu opracowaliśmy niskowejściową metodę Capture Hi-C (liCHi-C), nową, opłacalną i konfigurowalną metodę opartą na eksperymentalnej strukturze PCHi-C do generowania oddziaływań promotorów o wysokiej rozdzielczości z danymi wejściowymi o niskiej liczbie komórek. Przeprowadzając eksperyment z minimalnymi zmianami w probówce, zamieniając lub eliminując kroki z oryginalnego protokołu PCHi-C, drastycznie zmniejszając objętości reakcji i modyfikując stężenia odczynników, złożoność biblioteki jest maksymalizowana i możliwe jest generowanie wysokiej jakości bibliotek zawierających zaledwie 50 000 komórek53.

Low input Capture Hi-C (liCHi-C) został porównany z PCHi-C i wykorzystany do wyjaśnienia przemiany interaktomii promotora podczas różnicowania ludzkich komórek krwiotwórczych, odkrycia potencjalnych nowych genów i szlaków związanych z chorobą zderegulowanych przez zmiany niekodujące oraz wykrywania nieprawidłowości chromosomalnych53. Protokół krok po kroku i różne kontrole jakości za pomocą tej techniki są szczegółowo opisane tutaj, aż do końcowego generowania bibliotek i ich analizy obliczeniowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zapewnić minimalną stratę materiału, (1) pracuj z probówkami i końcówkami o niskiej wiązalności DNA (zobacz Tabelę materiałów), (2) umieść odczynniki na ściance probówki zamiast wprowadzać końcówkę do wnętrza próbki i, (3) jeśli to możliwe, wymieszaj próbkę przez odwrócenie zamiast pipetowania próbki w górę i w dół, a następnie odkręć w dół, aby odzyskać próbkę.

1. Utrwalenie komórek

  1. Komórki rosnące w zawiesinie
    1. Zbierz od 50 000 do miliona komórek i umieść je w probówce o niskiej wiązalności DNA o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Typy komórek użyte w niniejszym badaniu są szczegółowo opisane w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych.
    2. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 600 x g (w temperaturze 4 °C) za pomocą wirówki z wirnikiem o stałym kącie nachylenia i usunąć supernatant przez pipetowanie.
    3. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml RPMI 1640 uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze pokojowej.
    4. Dodaj 143 μl 16% formaldehydu bez metanolu, aby osiągnąć stężenie 2% i wymieszaj.
    5. Inkubować komórki przez 10 minut, obracając je w temperaturze pokojowej, aby je utrwalić.
      UWAGA: Staraj się być jak najbardziej dokładny podczas 10-minutowej inkubacji. Nadmierna lub niedostateczna fiksacja komórek może prowadzić do obniżenia jakości biblioteki.
    6. Ugasić reakcję, dodając 164 μl lodowatej 1 M glicyny i wymieszać. Inkubować komórki przez 5 minut, obracając w temperaturze pokojowej.
    7. Dalej inkubować komórki przez 15 minut na lodzie, mieszając przez inwersję co ~5 minut.
    8. Odwirować komórki przez 10 minut przy 1 000 x g (w temperaturze 4 °C) za pomocą wirówki z wirnikiem o stałym kącie nachylenia i usunąć supernatant.
    9. Umyj komórki, ponownie zawieszając osad w 1 ml lodowato zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
    10. Odwirować komórki przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant.
      UWAGA: Granulowane komórki można błyskawicznie zamrażać w ciekłym azocie lub suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Komórki adherentne
    1. Umyj komórki w naczyniu hodowlanym 1x PBS.
    2. Przygotuj wystarczającą ilość RPMI 1640 uzupełnioną 10% FBS i 2% formaldehydu bez metanolu w temperaturze pokojowej, aby przykryć naczynie hodowlane.
    3. Dodaj uzupełnioną pożywkę do szalki hodowlanej z komórkami i inkubuj przez 10 minut, kołysząc w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki.
      UWAGA: Staraj się być jak najbardziej dokładny podczas 10-minutowej inkubacji. Nadmierna lub niedostateczna fiksacja komórek może prowadzić do obniżenia jakości biblioteki.
    4. Ugasić reakcję, dodając 1 M glicynę do 0,125 M i wymieszać przez kołysanie.
    5. Inkubuj komórki przez 5 minut, kołysząc się w temperaturze pokojowej.
    6. Dalej inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 4 °C, mieszając przez kołysanie co 3-4 minuty.
    7. Usuń pożywkę i umyj komórki zimnym 1x PBS.
    8. Zeskrob komórki i przenieś je do probówki o niskim poziomie wiązania DNA o pojemności 1,5 ml. Wytrzyj naczynie hodowlane do czysta 0,5-1 ml zimnego 1x PBS.
    9. Odwirować komórki przez 10 minut przy 1 000 x g (w temperaturze 4 °C) za pomocą wirówki z wirnikiem o stałym kącie nachylenia i usunąć supernatant. Granulowane komórki można błyskawicznie zamrażać w ciekłym azocie lub suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Liza i trawienie

  1. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy zimna (Tabela 1), aby przerwać błonę komórkową. Dodanie samego buforu powinno wystarczyć do ponownego zawieszenia komórek, ale w razie potrzeby można je ponownie zawiesić przez lekkie wirowanie.
  2. Inkubować na lodzie przez 30 minut, mieszając przez odwrócenie co ~5 minut. Odwirować jądra przez 10 minut przy 1 000 x g (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Zawiesić jądra za pomocą 500 μl zimnego buforu restrykcyjnego 1,25x 2 (patrz tabela materiałów).
  3. Odwirować jądra przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Zawiesić jądra w 179 μl 1,25x buforu restrykcyjnego 2.
  4. Dodać 5,5 μl 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS; patrz tabela materiałów) i wymieszać. Komórki mogą tworzyć grudki; Jest to normalne i musi być w jak największym stopniu zdezagregowane przez wirowanie. Inkubować próbkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w termobloku, wytrząsając przy 950 obr./min.
  5. Ugasić SDS, dodając 37,5 μl 10% Triton X-100 i wymieszać. Inkubować próbkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w termobloku, wytrząsając przy 950 obr./min.
  6. Trawić chromatynę, dodając 7,5 μl HindIII (100 U/μL; patrz Tabela Materiałów) i wymieszać. Inkubować próbkę przez noc w temperaturze 37 °C w termobloku, wytrząsając przy 950 obr./min.
  7. Następnego ranka dodać dodatkowe 2,5 μl HindIII (100 U/μL) i dalej inkubować próbkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w termobloku, z wytrząsaniem przy 950 obr./min, aby zapewnić prawidłowe trawienie chromatyny.
    UWAGA: W ramach kontroli wydajności trawienia (patrz krok 5.1) przenieś równowartość 20 000 do 40 000 jąder do innej probówki, aby reprezentowała niestrawioną kontrolę. Po strawieniu przenieś tę samą liczbę komórek ponownie do innej probówki, aby reprezentować strawioną kontrolę. Zaleca się przetestowanie wydajności mineralizacji jako osobnego doświadczenia, jeśli dostępność materiału wyjściowego jest niewielka.

3. Podwiązanie i decrosslinkowanie

  1. Schłodzić próbkę na lodzie. Przygotować mastermix i dodać następujące odczynniki w celu wypełnienia i biotynylacji zwisów fragmentów restrykcyjnych: 3 μL 10x buforu restrykcyjnego 2, 1 μL wody wolnej od nukleaz, 0,75 μL 10 mM dCTP, 0,75 μL 10 mM dTTP, 0,75 μL 10 mM dGTP, 18,75 μL 0,4 mM biotyny-14-dATP, i 5 μl 5 U/μL Klenowa (patrz tabela materiałów). Inkubować próbkę przez 75 minut w temperaturze 37 °C, mieszając przez odwrócenie co ~15 minut.
  2. Schłodzić próbkę na lodzie. Przygotuj mastermix i dodaj następujące odczynniki do podwiązania wypełnionych końcówek DNA: 50 μl 10x buforu ligacyjnego, 2,5 μl 20 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 12,5 μl 1 U/μL ligazy DNA T4 i 173 μl wody wolnej od nukleaz (patrz tabela materiałów).
  3. Inkubować próbkę przez 4-6 godzin w temperaturze 16 °C, mieszając przez odwrócenie co ~1 godzinę. Następnie inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odsieciuj chromatynę, dodając 30 μl 10 mg/ml proteinazy K i wymieszaj. Próbkę inkubować przez noc w temperaturze 65 °C.
  4. Następnego ranka dodać dodatkowe 15 μl 10 mg/ml proteinazy K i dalej inkubować próbkę przez 2 godziny w temperaturze 65 °C, aby zapewnić prawidłowe sieciowanie chromatyny.

4. Oczyszczanie DNA

  1. Schłodzić próbkę do temperatury pokojowej i przenieść ją do odpowiedniej probówki do oczyszczania fenolowo-chloroformowego.
  2. Dodać 1 objętość (545 μl) fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1) w celu oczyszczenia DNA i wymieszać przez energiczne potrząsanie.
  3. Odwirować próbkę przez 5 minut przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej i przenieść górną fazę wodną (545 μl) do probówki o niskim stopniu wiązania DNA o pojemności 2 ml.
  4. Dodaj następujące odczynniki, aby wytrącić DNA: 1 362,5 μl 100% etanolu schłodzonego do -20 °C, 54,5 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 2 μl 15 mg/ml glikogenu jako współpretensjonent.
  5. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze -80 °C lub przez noc w temperaturze -20 °C.
  6. Odwirować próbkę przez 30 minut w temperaturze 16 000-21 000 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Osad DNA musi być widoczny.
  7. Umyj granulkę, dodając 1 ml 70% etanolu, wirując i wirując przez 10 minut w temperaturze 16 000-21 000 x g w temperaturze pokojowej.
  8. Usunąć supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia na powietrzu. Zawiesić osad DNA w 130 μl wody wolnej od nukleaz
    9. .
  9. Ocenić stężenie za pomocą fluorometrycznej kwantyfikacji (patrz tabela materiałów). Oczyszczony materiał 3C należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy przed przystąpieniem do protokołu.

5. Opcjonalna kontrola jakości

  1. Oceń wydajność trawienia. Przeprowadzić desieciowanie i oczyszczanie DNA fenolo-chloroformu, jak opisano wcześniej, do niestrawionych i strawionych kontroli uzyskanych w kroku 2.13. Zawiesić osad DNA w 10 μl wody wolnej od nukleaz. Określić ilościowo stężenie i rozcieńczyć otrzymane DNA, jeśli to konieczne, do 4 ng/μl.
  2. Przeprowadzić ilościową reakcję PCR z 4 ng DNA zarówno niestrawionej, jak i strawionej kontroli, ze starterami obejmującymi otwarte locus chromatyny z celem HindIII i bez niego (patrz Tabela 2 dla projektu startera). Oblicz wydajność mineralizacji zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem35.
    UWAGA: Skuteczność ligacji oblicza się w procentach za pomocą wzoru: trawienie (%) = 100 -100/(2^[(Ct trawione z HindIII - Cttrawione bez HindIII) - (Ct niestrawione z HindIII - Ct niestrawione bez HindIII)]) (patrz Tabela 3), który uwzględnia różnicę różnych Ct uzyskanych dla każdej pary starterów w niestrawionych i strawionych kontrolach.
  3. Oceń czułość wykrywania interakcji, wykonując konwencjonalną reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) (0,2 mM dNTP, 0,4 μm zarówno startery F + R, 0,1 i U/μL polimerazy gorącego startu), ze starterami obejmującymi zarówno długo-, jak i krótkodystansowe interakcje niezmiennicze komórek (patrz Tabela 2 dla projektu startera). Użyj 50-100 ng materiału 3C (odpowiednio dla oddziaływań krótkiego i dalekiego zasięgu) i amplifikuj w następujących warunkach: 98 °C przez 15 min, a następnie 37 cykli po 98 °C przez 30 s, 60 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 minutę i zakończ w 72 °C przez 10 min. Utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Jeśli ilość uzyskanego DNA jest mniejsza niż 2 μg, sprawdź tylko interakcję dalekiego i krótkiego zasięgu, a nie cały panel interakcji.
  4. Uruchom produkt na 1x tris-boran-EDTA (TBE) używając 1,6% żelu agarozowego i poszukaj obecności odpowiedniego PCR amplicon54.
    UWAGA: Ze względu na nieprzewidywalne "wycinanie i wklejanie" genomu, mogą pojawić się niespecyficzne prążki. Tak długo, jak przestrzegany jest prawidłowy rozmiar pasma, jest on liczony jako prawidłowy.
  5. Oceń skuteczność wypełniania i ligacji biotyną poprzez zróżnicowane trawienie produktu PCR krótkiego zasięgu z HindIII, NheI (patrz tabela materiałów), oboma enzymami lub bez nich (woda) i uruchamiając produkt na 1x TBE 1,6% żelu agarozowym. Prawidłowe wypełnienie i ligacja eliminują poprzedni cel HindIII i tworzą nowy cel NheI, więc amplikon powinien być cięty tylko w obecności NheI.
    UWAGA: Aby zminimalizować straty materiału, pobierz 2,5 μl produktu PCR krótkiego zasięgu z kontrolek interakcji i ponownie amplifikuj go pięć razy, aby przeprowadzić kontrolę wypełniania i ligacji.

6. Sonikacja

  1. Przenieść 130 μl próbki (uzupełnić wodą wolną od nukleaz, jeśli taka była używana do kontroli) do kuwety odpowiedniej do sonikacji.
  2. Ustaw sonikator w kąpieli wodnej i sonikuj przy użyciu następujących parametrów (zoptymalizowanych dla modelu i kuwet opisanych w Tabeli Materiałów): współczynnik pracy: 20%; szczytowa moc padania: 50; cykle na serię: 200; czas: 65 s; i zakres temperatur: 6-10 °C (optymalnie 8 °C).
  3. Przenieś próbkę do nowej probówki o niskim poziomie wiązania DNA o pojemności 1,5 ml.

7. Naprawa końcowa

  1. Przygotować mastermix i dodać następujące odczynniki, aby naprawić nierówne końce fragmentów DNA powstałe podczas sonikacji: 18 μL 10x buforu ligacyjnego, 18 μL 2,5 mM mieszanki dNTP każdy, 6,5 μL 3 U/μL polimerazy DNA T4, 6,5 μL 10 U/μL T4 PNK, i 1,3 μl 5 U/μL Klenowa (patrz tabela materiałów).
  2. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 20 °C i uzupełnić buforem Tris-low EDTA (TLE) (patrz tabela 1) do 300 μl.

8. Ściąganie biotyny

  1. Przenieś 150 μl kulek streptawidyny C1 (patrz tabela materiałów) na próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml, umieść je na magnesie do probówki o pojemności 1,5 ml i odczekaj 2-3 minuty lub do momentu, gdy wszystkie kulki przykleją się do ściany. Usunąć supernatant, pozostawiając koraliki.
  2. Przemyć kulki 400 μl 1x buforu Tween (TB; patrz Tabela 1). Aby umyć koraliki, dodaj bufor i ponownie je zawieś przez delikatne wirowanie. Umieść rurkę z powrotem w magnesie i odczekaj 2-3 minuty lub do momentu, gdy wszystkie koraliki przykleją się do ściany. Usunąć supernatant, pozostawiając koraliki.
  3. Umyj kulki 300 μl 1x buforu bez pośrednictwa (NTB; patrz Tabela 1). Zawiesić kulki w 300 μl 2x NTB (patrz Tabela 1).
    UWAGA: Koraliki mogą tworzyć zakurzoną warstwę wokół ścianki rurki podczas mycia bez detergentu. Jest to normalne i nie ma wpływu na wynik protokołu.
  4. Połącz te 300 μl kulek w 2x NTB z 300 μl próbki. Inkubować przez 15 minut, obracając w temperaturze pokojowej, aby ściągnąć informacyjne fragmenty DNA za pomocą biotyny. Biblioteka jest teraz przyklejona do kulek streptawidyny C1.
  5. Umyj koraliki 400 μl 1x NTB. Przemyć kulki 100 μl buforu TLE, a następnie ponownie zawiesić je w 35,7 μl buforu TLE.

9. ogon dATP, ligacja adaptera i amplifikacja PCR

  1. Przygotować mastermix i dodać następujące odczynniki do próbki, aby dATP ogonować końce naprawionych fragmentów DNA: 5 μl 10x buforu restrykcyjnego 2, 2,3 μl 10 mM dATP i 7 μl 5 U/μL egzo-Klenowa. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Dezaktywować egzo-Klenow przez dalszą inkubację próbki przez 10 minut w temperaturze 65 °C. Schłodzić próbkę na lodzie. Umyj koraliki 300 μl 1x TB. Umyj koraliki 300 μl 1x NTB.
  3. Przemyć kulki 100 μl 1x buforu do podwiązywania, a następnie zawiesić je ponownie w 50 μl 1x buforu do podwiązywania. Do próbki dodać 4 μl wstępnie wyżarzonej mieszanki adaptera o stężeniu 15 μM (patrz Tabela 2) i 1 μl ligazy DNA T4 o stężeniu 2 000 μl (patrz tabela materiałów).
  4. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Umyj koraliki 400 μl 1x TB. Umyj koraliki 200 μl 1x NTB. Przemyć kulki 100 μl 1x buforu restrykcyjnego 2.
  5. Przemyć kulki 50 μl 1x buforu restrykcyjnego 2, a następnie ponownie zawiesić je w 50 μl 1x buforu restrykcyjnego 2.
  6. Wymieszaj następujące odczynniki, aby przygotować reakcję PCR w celu amplifikacji biblioteki: 50 μl kulek z biblioteką, 250 μl 2x PCR mastermix z enzymem, 12 μl starterów F + R (po 25 μM każdy; patrz tabela 2) i 188 μl wody wolnej od nukleaz.
  7. Wykonaj PCR w następujących warunkach (podziel mieszaninę odczynników PCR na 50 μl reakcji): 98 °C przez 40 s, następnie X cykli 98 °C przez 10 s, 65 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s i zakończ w 72 °C przez 10 min. Trzymaj w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Użyj następującej liczby cykli jako punktu wyjścia do optymalizacji protokołu w komórkach diploidalnych, dążąc do uzyskania 500-1,000 ng mocy wyjściowej przed przechwyceniem biblioteki: milion komórek na osiem cykli; 250 000 ogniw na 10 cykli; 50 000 ogniw przez 12 cykli.
  8. Zbierz wszystkie 50 μl reakcji z tej samej próbki w probówce o niskim poziomie wiązania DNA o pojemności 1,5 ml, umieść ją na magnesie w probówce o pojemności 1,5 ml i odczekaj 2-3 minuty lub do momentu, gdy wszystkie kulki przykleją się do ściany.
  9. Przenieść supernatant zawierający bibliotekę (500 μl) do nowej probówki o niskim stopniu wiązania DNA o pojemności 1,5 ml. Uzupełnić buforem TLE do 500 μl, jeżeli część supernatantu została utracona. Koraliki streptawidyny C1 nie są już potrzebne.
  10. Wykonaj zaznaczenie dwustronne55 przy użyciu paramagnetycznego oczyszczania kulek (objętość 0,4-1). Pozwala to na selektywną eliminację zbyt dużych (>1 000 pz) i zbyt małych fragmentów lub starterów PCR (<200 pz), w zależności od stężenia glikolu polietylenowego i soli dodawanych kulek paramagnetycznych.
  11. Dodaj 200 μl (0,4 tomu) kulek bulionowych do biblioteki i wymieszaj przez wirowanie. Inkubować przez 10 minut, obracając w temperaturze pokojowej.
  12. Umieść na magnesie, odczekaj 2-3 minuty lub do momentu, gdy wszystkie koraliki przykleją się do ściany, a następnie przenieś supernatant zawierający bibliotekę (bez większych fragmentów) do nowej probówki o niskim wiązaniu DNA o pojemności 1,5 ml.
  13. Zagęść kulki, biorąc 750 μl kulek zapasowych, umieść je w probówce o pojemności 1,5 ml na magnesie, odczekaj 2-3 minuty lub do momentu, gdy wszystkie koraliki przykleją się do ściany, usuń supernatant i ponownie zawieś koraliki, wprowadzając 300 μl nowych kulek podstawowych.
  14. Dodać te 300 μl skoncentrowanych kulek do próbki (1 objętość) i wymieszać przez wirowanie. Inkubować przez 10 minut, obracając w temperaturze pokojowej. Umieść na magnesie, odczekaj 2-3 minuty lub do momentu, gdy wszystkie koraliki przykleją się do ściany, a następnie usuń supernatant (zawierający mniejsze fragmenty i startery PCR).
  15. Umyj koraliki trzykrotnie 1 ml 70% etanolu. Aby to zrobić, dodaj etanol, gdy rurka z koralikami nadal znajduje się na magnesie, starając się nie naruszyć koralików i poczekaj 30-60 sekund. Następnie usuń supernatant bez naruszania kulek.
  16. Pozostawić kulki do wyschnięcia na powietrzu i ponownie zawiesić je w 21 μl buforu TLE przez wirowanie.
    UWAGA: Nadmierne wysuszenie kulek może zmniejszyć wydajność podczas elucji DNA. Staraj się je ponownie zawiesić w buforze TLE natychmiast po tym, jak przestaną być "błyszczące" od etanolu.
  17. Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C w termobloku w celu wymycia biblioteki z kulek. Umieść probówkę w magnesie i przenieś supernatant zawierający bibliotekę do nowej probówki o niskim stopniu wiązania DNA o pojemności 1,5 ml.
  18. Określić ilościowo wielkość i stężenie za pomocą automatycznej elektroforezy (patrz tabela materiałów). Oczyszczony materiał Hi-C może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy przed przystąpieniem do stosowania protokołu.

10. Przechwytywanie biblioteki

  1. Pracuj z 500-1,000 ng biblioteki. Zagęścić bibliotekę, susząc DNA za pomocą koncentratora próżniowego i ponownie zawieszając materiał w 3,4 μl wody wolnej od nukleaz
    2. .
  2. Dodać do próbki następujące blokery z docelowego zestawu wzbogacającego (patrz tabela materiałów): 2,5 μl Blockera 1, 2,5 μl Blockera 2 i 0,6 μl niestandardowego oligoblokera dla adapterów.
  3. Dokładnie zawiesić, przenieść roztwór na 0,2 ml paska PCR i inkubować w termocyklerze przez 5 minut w temperaturze 95 °C, a następnie 5 minut w temperaturze 65 °C pod podgrzewaną pokrywką. Pozostawić probówkę do inkubacji w temperaturze 65 °C.
  4. Przygotować roztwór do hybrydyzacji, łącząc następujące odczynniki z docelowego zestawu do wzbogacania (patrz tabela materiałów) na próbkę (13 μl). Przechowywać na stole w temperaturze pokojowej: 6,63 μl Hyb 1, 0,27 μl Hyb 2, 2,65 μl Hyb 3 i 3,45 μl Hyb 4.
  5. Rozcieńczyć 0,5 μl bloku RNazy z docelowego zestawu do wzbogacania w 1,5 μl wody wolnej od nukleaz na próbkę. Rozmrozić 5 μl biotynylowanego RNA na próbkę na lodzie i dodać do niego 2 μl rozcieńczonego bloku RNazy. Przechowywać na ławce w temperaturze pokojowej.
  6. Dodaj 13 μl roztworu hybrydyzacyjnego do 7 μl biotynylowanego RNA z RNazą i dobrze wymieszaj.
  7. Będąc na termocyklerze w temperaturze 65 °C, przenieś roztwór hybrydyzacyjny z biotynylowanym RNA (20 μl) do zablokowanej biblioteki. Dokładnie zamknij pokrywę probówki i inkubuj w termocyklerze przez noc w temperaturze 65 °C.
    UWAGA: Aby zminimalizować parowanie próbki (co może prowadzić do nieoptymalnej hybrydyzacji RNA-DNA) podczas wykonywania wielu próbek w tym samym czasie, należy użyć pipety wielokanałowej do przeniesienia biotynylowanego RNA do każdej biblioteki w tym samym czasie.

11. Ściąganie biotyny i amplifikacja PCR

  1. Przenieś 50 μl kulek streptawidyny T1 na próbkę do probówki o niskim wiązaniu DNA o pojemności 1,5 ml, umieść je na magnesie w probówce o pojemności 1,5 ml i odczekaj 2-3 minuty lub do momentu, gdy wszystkie kulki przykleją się do ściany. Usunąć supernatant, pozostawiając koraliki. Przepłukać kulki trzykrotnie 200 μl buforu wiążącego z docelowego zestawu do wzbogacania.
  2. Zawiesić kulki w 200 μl buforu wiążącego. Będąc na termocyklerze w temperaturze 65 °C, przenieść próbkę do zawieszonych kulek streptawidyny T1 i inkubować przez 30 minut, obracając w temperaturze pokojowej.
  3. Przemyć kulki 200 μl buforu myjącego 1 z docelowego zestawu wzbogacającego. Inkubować przez 15 minut, obracając w temperaturze pokojowej. Przemyć kulki trzykrotnie 200 μl buforu płuczącego 2 z docelowego zestawu wzbogacającego podgrzanego do temperatury 65 °C. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 65 °C w termobloku, wytrząsając z prędkością 300 obr./min między praniami.
  4. Przemyć kulki 200 μl 1x buforu restrykcyjnego 2, a następnie zawiesić je ponownie w 30 μl 1x buforu restrykcyjnego 2.
  5. Wymieszaj następujące odczynniki, aby przygotować reakcję PCR w celu amplifikacji biblioteki: 30 μl kulek z biblioteką, 150 μl 2x PCR mastermix z enzymem, 7,2 μl starterów F + R (po 25 μM każdy; patrz tabela 2) i 112,8 μl wody wolnej od nukleaz.
  6. Wykonaj PCR w następujących warunkach (podziel mieszaninę odczynników PCR na 50 μl reakcji): 98 °C przez 40 s, następnie cztery cykle 98 °C przez 10 s, 65 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s i zakończ w 72 °C przez 10 min. Trzymaj w temperaturze 4 °C.
  7. Zbierz wszystkie 50 μl reakcji z tej samej próbki w probówce o niskim poziomie wiązania DNA o pojemności 1,5 ml, umieść ją na magnesie w probówce o pojemności 1,5 ml i odczekaj 2-3 minuty lub do momentu, gdy wszystkie kulki przykleją się do ściany.
  8. Przenieść supernatant zawierający bibliotekę (300 μl) do nowej probówki o niskim stopniu wiązania DNA o pojemności 1,5 ml. Uzupełnić buforem TLE do 300 μl, jeśli część supernatantu została utracona. Kulki streptawidyny T1 nie są już potrzebne.
  9. Przeprowadzić oczyszczanie DNA za pomocą kulek paramagnetycznych (0,9 objętości; patrz Tabela Materiałów). Dodać 270 μl kulek wyjściowych do próbki i wymieszać przez wirowanie.
  10. Inkubować przez 10 minut, obracając w temperaturze pokojowej.
  11. Umieść na magnesie, odczekaj 2-3 minuty lub do momentu, gdy wszystkie koraliki przykleją się do ściany i usuń supernatant.
  12. Umyj koraliki trzykrotnie 1 ml 70% etanolu. Aby to zrobić, dodaj etanol, gdy rurka z koralikami nadal znajduje się na magnesie, starając się nie naruszyć koralików i odczekaj 30-60 sekund. Następnie usuń supernatant bez naruszania kulek.
  13. Pozostawić kulki do wyschnięcia na powietrzu i ponownie zawiesić je w 21 μl buforu TLE przez wirowanie.
    UWAGA: Nadmierne wysuszenie kulek może zmniejszyć wydajność podczas elucji DNA. Staraj się je ponownie zawiesić w buforze TLE natychmiast po tym, jak przestaną być "błyszczące" od etanolu.
  14. Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C w termobloku w celu wymycia biblioteki z kulek.
  15. Umieść probówkę w magnesie i przenieś supernatant zawierający bibliotekę do nowej probówki o niskim stopniu wiązania DNA o pojemności 1,5 ml.
  16. Określ ilościowo wielkość i stężenie za pomocą automatycznej elektroforezy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C oferuje możliwość generowania wysokiej jakości i rozdzielczości bibliotek interaktoomów promotorowych w całym genomie z zaledwie 50 000 komórek53. Osiąga się to poprzez – oprócz drastycznego zmniejszenia objętości reakcji i zastosowania nisko wiążących DNA wyrobów z tworzyw sztucznych w całym protokole – usunięcie niepotrzebnych kroków z pierwotnego protokołu, w których dochodzi do znacznych strat materiałowych. Należą do nich oczyszczanie fenolu po usieciowaniu, usuwanie biotyny, a następ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C oferuje możliwość generowania bibliotek interaktoomów promotorowych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu podobnej eksperymentalnej struktury z PCHi-C, ale ze znacznie zmniejszoną liczbą komórek. Można to w znacznym stopniu osiągnąć poprzez wyeliminowanie niepotrzebnych kroków, takich jak oczyszczanie fenolu i usuwanie biotyny. W klasycznym protokole ligacji Hi-C57 w jądrze i jego późniejszej technice pochodnej PCHi-C, biotyna jest usuwana z nieligowanych fragmentów restrykcyjnych, aby uni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy pozostałym członkom laboratorium Javierre za ich opinie na temat manuskryptu. Dziękujemy programowi CERCA, Generalitat de Catalunya i Fundacji Josepa Carrerasa za wsparcie instytucjonalne. Prace te zostały sfinansowane przez FEDER/hiszpańskie Ministerstwo Nauki i Innowacji (RTI2018-094788-A-I00), Europejskie Towarzystwo Hematologiczne (4823998) oraz Hiszpańskie Stowarzyszenie Walki z Rakiem (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ jest finansowany przez projekt Junior Leader Fundacji Bankowej La Caixa (LCF/BQ/PI19/11690001), LR jest finansowany przez stypendium AGAUR FI (2019FI-B00017), a LT-D jest finansowany przez FPI Fellowship (PRE2019-088005). Dziękujemy programowi doktoranckiemu z biochemii i biologii molekularnej z Universitat Autònoma de Barcelona za wsparcie. Żaden z fundatorów nie był zaangażowany w żadnym momencie projektowania eksperymentu ani pisania manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,4 mM Biotin-14-dATPInvitrogen19524-016
0,5 M EDTA pH 8,0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8,0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SWymieniony jako bufor restrykcyjny 2 w manuskrypcie
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x bufor reakcyjny ligazy DNA T4New England BiolabsB0202S
16% roztwór formaldehydu (w/v), bez metanoluThermo Scientific28908
20 mg / ml albumina surowicy bydlęcejNew England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel ŚwietlówkiQiuantabio2302820Do oczyszczania fenolowo-chloroformowego w sekcji 4 (Oczyszczanie DNA). Probówki żelowe Phase Lock to komercyjny typ probówek specjalnie zaprojektowanych w celu maksymalizacji odzysku DNA po oczyszczeniu fenolowo-chloroformowym, unikając jednocześnie przenoszenia zanieczyszczeń w fazie organicznej poprzez zawartość żywicy o pośredniej gęstości, która osadza się między fazą organiczną a wodną i izoluje je. Probówki PLG należy przed użyciem wirować z prędkością 12 000 x g przez 30 s, aby upewnić się, że żywica jest dobrze umieszczona na dnie probówki
Adaptery i startery PCR do amplifikacji bibliotekiZintegrowane technologieDNA-Zakupione jako indywidualne startery z oczyszczaniem PAGE dla NGS
Skrobaki komórkoweNunc179693Lub dowolnej innej marki
Wirówka (wirnik o stałym kącie do probówek 1,5 ml)Dowolna marka
CHiCAGO R pakiet1.14.0
KoralikiCleanNGS CleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123ALub dowolnej innej marki
Probówka DNA LoBind, 1,5 mlEppendorf30108051
DNA LoBind probówka, 2 mlEppendorf30108078
polimeraza DNA I duża (Klenow) fragment 5000 jednostek/mlNew England BiolabsM0210L
Dynabeads Koraliki MyOne Streptavidin C1Invitrogen65002Do ściągania biotyny z biblioteki wstępnie przechwyconej w sekcji 8 (biotyna pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 koralikiInvitrogen65602Do ściągania biotyny z biblioteki po przechwyceniu w sekcji 11 (pobieranie biotyny i amplifikacja PCR)
DynaMag-2Invitrogen12321DLub dowolny inny magnes odpowiedni do 1,5 ml tubki L
Absolut etanoluVWR20821.321
FBS, kwalifikowanyGibco10270-106Lub dowolnej innej marki
GlicynaFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CoprecipitantInvitrogenAM9515Służy do koprecypitacji DNA w sekcji 4 (oczyszczanie DNA)
HiCUP0,8.2
HindIII, 100 U/µ LNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 jednostek/mlNew England BiolabsM0212L
Końcówki filtrów o niskiej retencji ( 10 &mikro; L, 20 i mikro; L, 200 i mikro; L oraz 1000 &mikro; L)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Skoncentrowany ultrasonografCovaris500295
Micro TUBE AFA Fiber Nasadka zatrzaskowa z nacięciem 6 x 16 mm FiolkiCovaris520045Do sonikacji w sekcji 6 (sonikacja)
NheI-HF, 100 U/µ LNew England BiolabsR3131M
Beznukleazowa klasa biologii molekularnej klasa wodySigma-AldrichW4502
Startery PCR do kontroli jakościZintegrowane technologieDNA-Paski
PCR  i czapkiAgilent Technologies410022, 401425
Fenol: Chloroform: Alkohol izoamylowy 25:24:1, Nasycony 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion  High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HFNew England BiolabsM0531LDo amplifikacji biblioteki w sekcjach 9 (dATP-tailing, ligacja adaptera i amplifikacja PCR)
i 11 (ściąganie biotyny i amplifikacja PCR)
Koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA)Roche11873580001
Proteinaza K, rekombinowana, Klasa PCRRoche3115836001
Qubit 1x zestaw dsDNA o wysokiej czułościInvitrogenQ33230Do oznaczania ilościowego DNA po wytrąceniu w sekcji 4 (oczyszczanie DNA)
Probówki do oznaczania kubitówInvitrogenQ32856
bufor rCutsmartNew England BiolabsB6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010Lub dowolnej innej marki
SDS - Roztwór 10% dla biologii molekularnejPanReac AppliChemA0676
Octan sodu pH 5,2Sigma-AldrichS7899-100ML
Niestandardowa biblioteka SureSelect 3-5,9 MbAgilent Technologies5190-4831Specjalnie zaprojektowany system przechwytywania myszy lub człowieka, używany do przechwytywania
SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent Technologies5190-8645Służy do przechwytywania
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full AdapterAgilent Technologies931107Służy do wychwytywania
T4 Ligazy DNA 1 U/&mikro; LInvitrogen15224025Do ligacji w sekcji 3 (ligacja i decrosslinkowanie)
Ligaza DNA T4 2000000/mlNew England BiolabsM0202TDo ligacji w sekcji 9 (dATP-tailing, ligacja adapterowa i amplifikacja PCR)
Polimeraza DNA T4 3000 jednostek/mlNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000 jednostek/mlNew England BiolabsM0201L
Tapestation 4200instrument Agilent TechnologiesDo automatycznej elektroforezy w sekcji 9 (dATP-tailing, ligacja adaptera i amplifikacja PCR) i
sekcja 11 (ściąganie biotyny i amplifikacja PCR). Każdy inny zautomatyzowany system elektroforezy jest ważny
Odczynniki TapestationAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,Do automatycznej elektroforezy w sekcji 9 (dATP-tailing, ligacja adaptera i amplifikacja PCR) i
sekcja 11 (ściąganie biotyny i amplifikacja PCR). Każdy inny zautomatyzowany system elektroforezy jest ważny
Triton X-100 dla biologii molekularnejPanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16(2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384(2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610(2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161(2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121(2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222(2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178(2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923(2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165(2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526(2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154(2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615(2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81(2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268(2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923(2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86(2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310(2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175(2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127(2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859(2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924(2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938(2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Promoter Capture Hi CCapture Hi C dla niskiej ilo ci materia u wej ciowegospatiotemporalna architektura genomuorganizacja chromatynyregulacja gen wtr jwymiarowa organizacja genomudystalne elementy regulacyjneinterakcja chromatynyprzygotowanie biblioteki DNA

Powiązane artykuły