Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena wpływu nowego systemu procesorów komórek chłodzących na izolację komórek wysp trzustkowych

782 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65321

⸱

11 sierpnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół tutaj opisuje niestandardowy system procesora komórek chłodzących, który jest zgodny z czystym pomieszczeniem dobrych praktyk produkcyjnych (GMP) w celu poprawy żywotności komórek po przetwarzaniu.

Streszczenie

Standardowy sprzęt do terapii komórkowej, w tym złoty standard procesora komórkowego do oczyszczania ludzkich wysp trzustkowych do klinicznego przeszczepu, jest rzadko chłodzony, potencjalnie narażając komórki na podwyższone temperatury podczas etapu wirowania. Niestandardowe systemy chłodzenia mają bezpośredni wpływ na żywotność i funkcję ludzkich wysepek. Obecne badanie miało na celu przetestowanie skuteczności nowo opracowanego, łatwo dostępnego systemu procesora komórek chłodzonych, wymagającego minimalnych modyfikacji, oraz ocenę jego wpływu na żywotność komórek ludzkich i środowisko pomieszczeń czystych GMP. System chłodzenia, mechanicznie chłodzony wymiennik ciepła ustawiony na -30 °C, został wykorzystany do dostarczania schłodzonego, suchego powietrza klasy medycznej do misy procesora komórkowego przez otwór wywiercony w pokrywie wirówki. Ze względu na ograniczoną dostępność dawców trzustki w Katarze, walidację systemu przeprowadzono z ciągłym oczyszczaniem w gradionym gradieniu gęstości puli ludzkiego szpiku kostnego. Sterylność, turbulencje i liczbę cząstek mierzono w pomieszczeniach czystych klasy C i B. Wokół chłodzonego procesora komórkowego nie powstały żadne turbulencje i nie wygenerowano nadmiaru cząstek unoszących się w powietrzu o wielkości 0,5 μm i 5 μm, zgodnie ze standardami GMP w pomieszczeniach czystych. Na początku i na końcu etapów zbierania temperatura wzrosła odpowiednio do 21,50 °C ± 0,34 °C i 21,93 °C ± 0,20 °C w niechłodzonym procesorze komórkowym i tylko do 10,9 °C ± 0,17 °C i 11,16 °C ± 0,35 °C w procesorze z chłodzonymi komórkami (p <0,05). Schłodzony procesor komórkowy doprowadził zarówno do lepszego odzyskiwania (98%) frakcji komórek jednojądrzastych, jak i do przetwarzania końcowego (100% ± 2%). Nowy system chłodzenia skutecznie redukuje ciepło wytwarzane przez procesor ogniwa, nie wywierając jednocześnie wpływu cząstek stałych na środowisko czystego pomieszczenia GMP. Opisany tutaj procesor z chłodzonymi ogniwami jest niedrogą (16 000 USD bez podatków, odprawy celnej i transportu) i minimalnie inwazyjną metodą zapewniającą solidne chłodzenie. Obecnie technologia ta w ośrodku terapii komórkowej GMP jest stosowana do izolacji i przeszczepiania ludzkich komórek wysp trzustkowych w ramach programu klinicznego.

Wprowadzenie

Przeszczep wysp trzustkowych w przypadku ciężkiej cukrzycy typu 1 może przywrócić endogenne wydzielanie insuliny i stał się standardem opieki w wielu krajach1. Izolacja wysp trzustkowych to wieloetapowa procedura, która obejmuje ciepłe, enzymatyczne i mechaniczne trawienie trzustki, a następnie fazy schładzane w celu odzyskania strawionej tkanki i oczyszczanie wysp trzustkowych z ciągłymi lub nieciągłymi gradientami gęstości na procesorze komórkowym. Szybkie chłodzenie spowalnia fazę trawienia enzymatycznego i chroni wyspy trzustkowe przed enzymami trawiennymi uwalnianymi przez zanieczyszczające komórki groniaste. Procesor komórkowy został pierwotnie zaprojektowany do oddzielania składników krwi komórkowej w temperaturze otoczenia2. W 1989 roku został ponownie wykorzystany do oczyszczania ludzkich wysp trzustkowych Langerhansa3. Przez trzy dekady ludzkie wyspy trzustkowe były oczyszczane do badań klinicznych, a ostatnio do standardowej opieki, albo w procesorze komórkowym z nieciągłymi gradientami4 lub ciągłych gradientach gęstości1 wykonane za pomocą gradientu maker1 lub równoważnego miksera sterowanego komputerowo5,6,7. Inne grupy donosiły o oczyszczaniu wysepek z dużych ssaków i ludzi za pomocą dużych cylindrycznych plastikowych butelek8,7,9, co znacznie poprawiło skuteczność oczyszczania i jakość wysepek.

Rzeczywiście, biorąc pod uwagę złoty standard oczyszczania ludzkich wysp trzustkowych do klinicznego przeszczepu10,11, wyprodukowany procesor komórkowy był bez chłodzenia. Bezpośrednią konsekwencją braku chłodzenia było to, że wysepki były narażone na działanie rosnących temperatur na etapie oczyszczania. Podczas wirowania dochodzi do niekontrolowanego wzrostu temperatury spowodowanego tarciem mechanicznym wirnika12,13. Procesory komórkowe zostały przystosowane do systemu chłodzenia w centrach izolacji wysp trzustkowych, który statystycznie zwiększał wydzielanie insuliny indukowane glukozą i żywotność komórek, potwierdzając zaletę utrzymywania wysp trzustkowych w niskich temperaturach podczas procedury oczyszczania14,15.

Należy zauważyć, że pod koniec lat 80. zbudowano 10 prototypów chłodni w celu zmniejszenia uszkodzeń wysepek podczas oczyszczania gradientu gęstości, ale nie zwrócono na nie większej uwagi. Prototypy procesorów ogniw oparto na chłodzeniu wrzeciona i misy schłodzonym glikolem polietylenowym. W szczególności roztwory do oczyszczania wysp trzustkowych, w tym roztwory do konserwacji narządów i gradienty gęstości polisacharydów, mogą być szkodliwe dla żywotności wysp trzustkowych, gdy są stosowane w temperaturze pokojowej lub wyższej16,17,18. Porównano różne strategie chłodzenia procesora komórkowego w celu oczyszczania komórek wysp trzustkowych w porównaniu z oryginalnym procesorem komórkowym bez chłodzenia, aby zwalczyć niekontrolowany wzrost temperatury, który występuje w wyniku tarcia wirnika. Podjęto kilka prób schłodzenia procesora komórkowego podczas oczyszczania ludzkich wysp trzustkowych. Procesor komórkowy może być tymczasowo lub na stałe umieszczony w specjalnie zaprojektowanej chłodni, aby utrzymać temperaturę 0-8 °C19 podczas wirowania gradientowego, które jest obecnie stosowane w centrach izolacji wysepek na Uniwersytecie Illinois w Chicago19, University of Miami14, University of Oxford facilities15oraz Uniwersytet w San Francisco (niestandardowa jednostka chłodząca otacza procesor komórkowy). Kolejną modyfikacją jest chłodzenie rdzenia wrzeciona procesora komórkowego za pomocą systemu chłodzenia wykorzystującego elektronicznie sterowane chłodzenie ciekłym azotem w Genewie, Szwecji i Czechach15,19. Inną alternatywą w połowie 2000 r. było chłodzenie rdzenia procesora komórkowego za pomocą jednostki klimatyzacyjnej12 lub chłodzenie wału cieczą na Uniwersytecie w Lille.

Modyfikacje chłodzenia procesora komórkowego nie są łatwo dostępne i wiążą się z ryzykiem (wilgotność, nagromadzenie kondensatu) w pomieszczeniach czystych GMP, w tym utratą gwarancji i odmową serwisowania maszyny przez konstruktora. W związku z tym niektóre centra wysepek, w tym Mediolan we Włoszech, Oslo w Norwegii i Edynburg w Szkocji, nie używają systemu chłodzenia procesorów komórek podczas procesu oczyszczania wysepek15.

Obecne badanie miało na celu sprawdzenie skuteczności nowo opracowanej łatwo dostępnej chłodnicy w połączeniu z minimalnie zmodyfikowanym systemem procesorów komórkowych. Krótko mówiąc, opisana tutaj chłodnica powietrzna jest mechanicznie chłodzonym wymiennikiem ciepła kontrolującym temperaturę 1 standardowej stopy sześciennej na minutę (SCFM) suchego gazu w zakresie od -40 °C do -100 °C. Ten system chłodzenia wymaga dopływu suchego powietrza medycznego. Powietrze będzie przepływać przez przewód i wymiennik ciepła i na zewnątrz przez dyszę (7,9 mm). Grzałka umieszczona w dyszy dostarcza ciepło w celu kontrolowania temperatury strumienia powietrza. Zakupiono zapasową, solidną plastikową pokrywę wirówki i dokonano minimalnych modyfikacji. W pokrywie wywiercono otwór o średnicy 13,3 mm, a schłodzone powietrze było dostarczane z dyszy chłodnicy do procesora komórkowego przez otwór w pokrywie wirówki. Schłodzone powietrze medyczne było wtryskiwane do misy wirówkowej procesora komórkowego ze stałą kontrolą temperatury cieczy lub gradientów gęstości.

Oceniliśmy techniczną wydajność procesora chłodzonego ogniwa i wpływ elementu chłodzącego na środowisko czystego pomieszczenia GMP. Głównym celem było osiągnięcie bardzo niskiej (<10 °C) temperatury podczas oczyszczania ludzkich wysp trzustkowych w celu zachowania ich żywotności. Używając separacji gęstości kożuchy jako wskaźnika zastępczego dla izolacji wysp trzustkowych, określiliśmy skuteczność tego protokołu chłodzenia na żywotność komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W niniejszym protokole wykorzystano odrzuconą krew pełną, która nie nadawała się do użytku zgodnie z instytucyjnymi wytycznymi dotyczącymi utylizacji. Zgoda komisji bioetycznej (IRB) oraz świadoma zgoda nie mają zastosowania.

1. Konfiguracja chłodzonego procesora komórek

UWAGA: Wszystkie procedury muszą być wykonywane w środowisku pomieszczenia czystego, a personel musi przestrzegać procedur dotyczących odzieży stosowanej w pomieszczeniach czystych.

  1. Zakup sprzętu
    1. Należy zakupić zapasową pokrywę z pleksiglasu. Należy zakupić system urządzenia chłodzącego: chłodziarkę z mechanicznym regulatorem temperatury strumienia gazu, osuszacz powietrza, regulator ciśnienia i przepływu oraz gwarancję (opcjonalnie). Patrz Tabela materiałów do bibliografii.
      UWAGA: Całkowity koszt wynosi 16 13 USD bez kosztów wysyłki i opłat celnych.
    2. Zamów medyczne suche powietrze, sprężony gaz medyczny zgodny ze standardową jakością (zgodnie z Europejską Farmakopeą 1238), u lokalnego dostawcy gazów medycznych. Zakup 2 butle o pojemności 6,8 m³3 (47 L: 23 cm x 153 cm; średnica x długość).
  2. Konfiguracja sprzętu (Rysunek 1 i Rycina 2)
    1. Wprowadź sprzęt do pomieszczenia czystego GMP (przed wprowadzeniem do pomieszczenia czystego należy przeprowadzić dezynfekcję zgodnie z procedurami GMP).
    2. W przypadku sprężonego powietrza klasy medycznej należy zainstalować linię gazową zamiast umieszczać butlę z gazem bezpośrednio w pomieszczeniu czystym.
  3. Modyfikacja procesora komórkowego w celu chłodzenia
    1. Najpierw zdejmij pokrywę z pleksiglasu. Zachowaj oryginalną pokrywę z pleksiglasu na wypadek problemów z gwarancją. W zapasowej pokrywie procesora komórkowego wywierć otwór o średnicy dopasowanej do średnicy zewnętrznej końcówki dyszy urządzenia chłodzącego, aby zapobiec pęknięciu pokrywy wirówki (zalecana średnica 13,3 mm).
    2. Przymocuj uchwyty za pomocą okrągłego kawałka pianki. Jest to konieczne, aby zapobiec pękaniu i/lub zarysowaniu pokrywy, utrzymać dyszę chłodzącą w miejscu nad procesorem komórkowym, chronić pokrywę przed nadmiernym wygięciem spowodowanym wysokim ciśnieniem wtryskiwanego powietrza, podtrzymać ciężar dyszy, a na koniec zapewnić operatorowi maksymalne bezpieczeństwo poprzez swobodny i bezpieczny dostęp do wszystkich niezbędnych funkcji procesora komórkowego podczas procedury eksperymentalnej.
    3. Podłącz system chłodzenia do procesora komórkowego, mocując dyszę chłodzącą do otworu w pleksiglasie. Zabeziecz ją za pomocą uchwytów i podkładek piankowych.
    4. Umieść obudowę chłodniczą w odległości do 8 stóp (2,4 m) od dyszy. Regulator temperatury umieść w oddzielnej szafce, w odległości do 6 stóp (1,83 m) od obudowy chłodniczej.
    5. Ustaw wartość zadania chłodziarki na -40 °C do chłodzenia strumienia powietrza w chłodnicy. Temperatura powietrza wylotowego jest na bieżąco wyświetlana na wskaźniku cyfrowym z rozdzielczością wynoszącą 0.1 °CCyfrowo ustaw temperaturę wylotu na 0.1 °C za pomocą kontrolera temperatury.
    6. Kontroluj ciśnienie i natężenie przepływu dopływu powietrza na module regulatora ciśnienia i przepływu (Rysunek 2) przed podaniem do chłodnicy. Ustawić je odpowiednio na 5 psi i natężenie przepływu 4 SCFM, aby osiągnąć optymalne warunki w strumieniu powietrza chłodzonym do -30 °C ± 2 °C.
    7. Należy zweryfikować, czy zasilanie gazem medycznym jest regulowane na ciśnienie wyjściowe 5 bar i może trwać co najmniej 90 min, ponieważ jest to wymagane, aby sprężone powietrze osiągnęło -30 °C.
      ​UWAGA: Medyczne suche powietrze to sprężony gaz medyczny, a w pełni sprężone suche powietrze jest zgodne ze standardową klasą jakości.
    8. Dostarczyć ciśnienie 5 bar z dyszy chłodzącej podłączonej do pokrywy procesora komórkowego przez otwór wykonany w osłonie wirówki. Wprowadzić schłodzone powietrze medyczne do wnętrza misy wirowej procesora komórkowego (Rysunek 2). Wybrać położenie wtrysku powietrza w taki sposób, aby chłodzone powietrze było skierowane prostopadle do aluminiowego obręcza wirnika wirówki.
    9. Podczas przygotowywania procesora tkankowego należy upewnić się, że rotor znajduje się w temperaturze pokojowej (18 °C). Ustaw automatyczny termoregulator układu chłodzenia na -30 °C or bezpośrednio kieruj strumień chłodnego powietrza na rotor.
      UWAGA: Przetestowano różne warunki próbne, aby osiągnąć optymalny gradient temperatury wynoszący +4 °C, co jest niezbędne do przełamania termo-oporności systemu separatora komórkowego procesora komórkowego oraz nagrzewania się rotora podczas wirowania. Zaprogramowany termoregulator utrzyma optymalną temperaturę docelową wewnątrz urządzenia do przetwarzania komórek podczas procedury, szczególnie w trakcie wirowania, przy temperaturze pomieszczenia czystego wynoszącej +18 °C.
      1. Skonfiguruj procesor komórkowy z pierwszą fazą wstępnego chłodzenia, aby ochłodzić procesor (bez zestawu do procesora komórkowego) w temperaturze +3 °C przez 30 do 45 min, a druga faza wstępnego chłodzenia podczas pracy procesora komórkowego powinna odbywać się przy zestawie wstępnie schłodzonym do +4 °C przy 134 x gprzez 5 min.

2. Pomiar liczby cząstek w powietrzu

  1. Oceń zgodność urządzenia chłodniczego z wymaganiami dla pomieszczeń czystych GMP zgodnie z normą ISO 14644-1, aby przeanalizować wpływ urządzeń grzejnych w fazie operacyjnej.
  2. Wykorzystaj monitorowanie liczby cząstek, aby dostarczyć dowodów na osiągnięcie wymaganego poziomu czystości w krytycznych punktach kontrolnych w stanie spoczynku oraz podczas pracy.
    1. Minimalna liczba punktów poboru próbek zależy od mierzonej powierzchni. Oblicz ją, korzystając z równania
      figure-protocol-1
      ​gdzie A to powierzchnia pomieszczenia czystego lub kontrolowanej strefy czystego powietrza w m2, a NL to liczba punktów poboru próbek zaokrąglona w górę do liczby całkowitej.
    2. Objętość próbkowania powietrza to minimalna objętość w każdym punkcie. Upewnij się, że objętość powietrza jest wystarczająco duża, aby doliczyć 20 cząstek o największym określonym rozmiarze. Oblicz objętość próbkowania powietrza za pomocą równania
      V= 20/C x 10
      gdzie V to minimalna pojedyncza objętość próbki na punkt, wyrażona w L, a C to limit klasyfikacji (liczba cząstek/m3).
    3. W każdym punkcie, w zależności od powierzchni, pobierz jedną lub więcej próbek. Upewnij się, że najmniejsza objętość pobrana w każdym punkcie wynosi 2 L, a minimalny czas próbkowania wynosi co najmniej 1 min.
  3. Przed pobieraniem próbek oczyść licznik cząstek za pomocą filtra płuczącego. Usuń filtr i zamocuj sondę izokinetyczną do pobierania próbek.
  4. Umieść licznik cząstek w wyznaczonym punkcie poboru. Rozpocznij zbieranie próbki z ekranu głównego urządzenia.
  5. Po zakończeniu pobierania próbki przenieś licznik cząstek do następnego punktu. Po zakończeniu pomiarów we wszystkich punktach przeanalizuj dane i wydrukuj raport.
  6. Jeśli średnia koncentracja cząstek dla wszystkich punktów poboru w obszarze spadnie poniżej limitu klasy określonego w Tabeli 1, uznaj pomieszczenie za zgodne z dopuszczalną koncentracją cząstek.

3. Przygotowanie gradientu i proces separacji komórek

  1. Przed przystąpieniem do eksperymentu schłodzić gradienty o niskiej i wysokiej gęstości oraz zestawy do procesora komórkowego przez noc w lodówce w temperaturze +4 °C.
  2. Wstępnie schłodzić procesor komórkowy przez 45 min w stanie spoczynku (tzn. włączyć procesor komórkowy przed użyciem). Utrzymywać temperaturę między +2 °C a +5 °C. Włożyć zestaw do procesora komórkowego schłodzony wcześniej w temperaturze +4 °C.
  3. W przypadku standardowego etanolowego chłodzonego generatora gradientu z podwójnym płaszczem (opcjonalnie; Rysunek 3) połączyć 2 komory szklane i umieścić je na mieszadle magnetycznym. Zaciśnąć zacisk na rurkach między obiema komorami. Schłodzić generator gradientu za pomocą chłodnicy z obiegiem etanolu w temperaturze 0 °C.
  4. W pierwszej kolejności przygotować załadunek warstwy ciężkiej na dno worka, napełniając komorę 130 mL gradientu o wysokiej gęstości (HD; 1,087 g/mL). Ładować przy prędkości pompy 150 mL/min.
  5. Po wprowadzeniu gradientu ciężkiego do worka, dodać 130 mL gradientu o wysokiej gęstości (HD) do przedniego zlewka oraz 140 mL gradientu o niskiej gęstości (LD; 1,063 g/mL) do tylnego (zacisk zamknięty).
  6. Zwolnić zacisk/hemostat pomiędzy 2 komorami i stworzyć ciągły gradient przy prędkości pompy 50 mL/min.
  7. Przygotować wcześniej ludzkie monocyty i limfocyty (MNC) z warstwy leukocytarnej (buffy coat) do oczyszczania z wielu połączonych anonimowych warstw leukocytarnych zebranych z produktów odpadowych krwi pełnej (do 10 worków z warstwą leukocytarną dodano od 40 mL do 60 mL krwi pełnej), w zależności od dostępności w banku krwi.
    1. Separacja MNC
      1. Do izolacji ludzkich monocytów i limfocytów o niskiej gęstości zastosować wirowanie w gradiencie gęstości. W tym celu postępować zgodnie z poniższymi krokami.
      2. W celu przygotowania komórek obliczyć objętość krwi (antykoagulowanej krwi pełnej lub zawiesiny z warstwy leukocytarnej). Rozcieńczyć krew 2x-4x roztworem buforowym, mieszając przez odwracanie. Im bardziej rozcieńczona krew, tym wyższa czystość monocytów i limfocytów.
      3. Przygotować bufor, mieszając bufor fosforanowy z antykoagulantem. Obliczyć liczbę potrzebnych probówek, dzieląc objętość krwi przez 35 mL, i wlać 15 mL roztworu gradientu gęstości 1,073 do każdej probówki.
      4. Stopniowo nanieść 35 mL rozcieńczonej zawiesiny krwi na gradient gęstości, delikatnie rozprowadzając ją po powierzchni gradientu za pomocą strzykawki 60 mL z igłą; w przypadku małych objętości użyć pipety. Należy starać się nie zaburzyć interfazy, ponieważ spowoduje to uzyskanie słabej warstwy monocytów i limfocytów.
      5. Wirować przy 400 x g przez 20 min w temperaturze 20 °C bez przerw (przyspieszenie 0, zwalnianie 0). Po wirowaniu delikatnie zebrać warstwę interfazy z monocytami i limfocytami za pomocą sterylnej pipety transferowej. Przenieść komórki do nowej probówki stożkowej 50 mL.
      6. Przemyć komórki 2x buforem (PBS z dodatkiem antykoagulantu). Podczas pierwszego płukania napełnić probówkę z komórkami buforem do objętości 50 mL. Wirować przy 30 x g przez 10 min w temperaturze 20 °C w celu osadzenia komórek (przyspieszenie 9, zwalnianie 0). Delikatnie i uważnie usunąć cały nadsącz.
      7. Przeprowadzić drugie płukanie w celu usunięcia płytek krwi. Resuspendować osad do objętości 50 mL buforem. Wirować przy 20-30 x g przez 10 min w temperaturze 20 °C (przyspieszenie 9, zwalnianie 0).
      8. Zrekonstytuować komórki do końcowej objętości 5 mL; komórki te powinny mieć gęstość zbliżoną do MNC o niskiej gęstości <1,073. Zmierzyć gęstość właściwą gradientu densytometrem.
      9. Resuspendować osad do końcowej objętości 10 mL, używając 95 mL medium gradientu o wysokiej gęstości (1,083 g/mL) w worku transferowym. Produkt ten wykorzystać do oczyszczania za pomocą separatora komórkowego. Końcowa objętość 10 mL zawiera komórki i medium gradientu o wysokiej gęstości 1,083.
        UWAGA: Warstwę leukocytarną można przechowywać w lodówce przez noc w PBS zawierającym 0,5% BSA lub w osoczu autologicznym. Warstwę leukocytarną można również przemyć.
  8. Na wierzch gotowych gradientów nanieść maksymalnie 30 mL MNC wyizolowanych z warstwy leukocytarnej, zawieszonych w 10 mL skoncentrowanego medium konserwacyjnego, używając pompy perystaltycznej przy 25 mL/min. Przechowywać gradient w temperaturze +4 °C.
  9. Ciągle mierzyć temperaturę wewnątrz procesora komórkowego za pomocą skalibrowanej sondy termicznej. Monitorować temperaturę gradientów i komórek podczas procesu, używając cyfrowego termopary podłączonej do sterylnej sondy termicznej.

4. Optymalizacja poszczególnych etapów nakładania gradientu

  1. Włóż zestaw procesora komórkowego schłodzony wcześniej do +4 °C. Załaduj gradient ciężki (130 mL) w temperaturze +4,5 °C. Po zakończeniu ładowania gradientu ustaw wirówkę na stosunkowo niską prędkość (537 x g), aby zminimalizować ciepło generowane przez rotor.
  2. Wyłącz procesor komórkowy, aby system hydrauliczny mógł powrócić do poziomów sprzed uruchomienia i usunąć powietrze.
  3. Uruchom ponownie procesor komórkowy przy 537 x g i dodaj gradienty o gęstości ciężkiej (130 mL) oraz niskiej (140 mL), aby stworzyć ciągły gradient gęstości w temperaturze +4,3 °C i przy szybkości przepływu 50 mL/min.
  4. Załaduj warstwę leukocytową (buffy coat) (30 mL) z 10 mL zimnego medium przechowującego w temperaturze +6 °C i przy szybkości przepływu 25 mL/min. Dodaj 50 mL (25 mL x 2) roztworu płuczącego.
  5. Po 5 min w temperaturze +5 °C zbierz odwirowany gradient do 12 butelek przy szybkości przepływu 10 mL/min.
  6. Napełnij probówki medium płuczącym (M19 + 20% albuminy ludzkiej + 10% penicyliny i streptomycyny). Napełnij probówkę 1 10 mL medium płuczącego i 150 mL komórek, a probówki 2-12 25 mL medium płuczącego i 25 mL komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W pierwszej kolejności określono wpływ chłodzonego procesora komórkowego na czystą przestrzeń GMP. W ramach ustandaryzowanych metod wykorzystano licznik cząstek do pomiaru zanieczyszczenia powietrza cząstkami w środowisku czystej przestrzeni klasy C i klasy B według standardów GMP, w punktach krytycznych w pobliżu procesora komórkowego oraz systemu chłodzenia powietrza pod ciśnieniem. Wyniki wykazały, że wokół urządzenia nie powstały turbulencje. Odnotowane dane wskazały, że nie stwierdzono nadmiernej ilości cząstek zawi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zakłady izolacji wysepek na całym świecie od dziesięcioleci stosują oczyszczanie ludzkich wysp trzustkowych w procesorze komórkowym o zmienionym przeznaczeniu. Chociaż niektóre zakłady produkujące wysepki nadal przetwarzają wysepki w niechłodzonym procesorze komórkowym, większość ośrodków korzysta z chłodzonej wersji procesora komórkowego 10,11,15. Centra albo umieszczają procesor komórkowy w zimnym pomieszczeniu, którego główną...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować europejskiemu instytutowi genomicznemu dla diabetologicznego (ANR-10- LABEX-0046 do FP) oraz katarskiemu instytutowi metabolicznemu - Hamad medical corporation, Katar. Autorzy dziękują również Centrum Badań Medycznych w Hamad Medical Corporation za wsparcie w opłatach za przetwarzanie artykułów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Air - licznik cząstek LasairIII 
AirJet XR40 SP ScientificFTS system XR40
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoThermo ScientificEQ-1301
Cyrkulacyjny agregat chłodniczyJulaboCF30
COBE 2991 Terumo BCT
BiorepCCT-01
Ekspres gradientowy z podwójnym płaszczem dostosowany w domu
Termometr termoparowy KJTHanna InstrumentsHI93551NDo pomiaru temperatury cieczy
Mieszadło magnetyczne Thermo Scientific88880014
Pompa perystaltyczna MasterFlexMK-77921-79
 Extech InstrumentsRMS 430Do temperatury COBE
Bezwodna kąpiel perełkowaCole-Parmer10122-00
Materiały i odczynniki
BD zestaw do oznaczania liczby komórek macierzystychBD Biosciences 
Zestaw wężyków COBE 2911Terumo BCT90819
Rurki stożkowe 250mlCorning430776
Gęstość gradientu 1,1Biochrom L6155
Butelki jednorazowe z podziałkąThermo fisher382019-1000
Albumina ludzka 20% Kedrion Biopharma 8091600
M199 roztwór myjący Corning 99-784-CM 
Rurki MasterflexMasterflex96400-6
Medyczne suche powietrzeLinde HealthcareMedi On 22
Pencillin-streptomycyna Gibco 
ThermoprobeBiorepTC-02Thermosensor
Trypan niebieski Sigma Aldrich15250061
Uniwersytet Wisconsin Belzer (UW) Most Życia RM/N 4055Podłoże konserwujące
Stożkowa taca chłodząca Termometr 34456315140122

Bibliografia

  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  2. Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates. Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).
  3. Lake, S. P., et al. Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator. Diabetes. 38, 143-145 (1989).
  4. Ricordi, C., et al. Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases. Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).
  5. Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. Human islet separation utilizing a closed automated purification system. Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).
  6. Bampton, T. J., et al. Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis. ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).
  7. Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique. Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).
  8. Shimoda, M., et al. Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas. Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).
  9. Noguchi, H. Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles. Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).
  10. Shapiro, A. M., et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).
  11. Ricordi, C. National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities. Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).
  12. Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. Comparison of cooling systems during islet purification. Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).
  13. Rilo, H. L. R., et al. Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator. Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).
  14. Chadwick, D. R., et al. Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality. Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).
  15. Nano, R., et al. Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study. Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).
  16. Chadwick, D. R., et al. Storage of pancreatic digest before islet purification. Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).
  17. Amrani, M., et al. Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C. Circulation. 86, 280-288 (1992).
  18. Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).
  19. Adewola, A., et al. Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans. Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).
  20. Keymeulen, B., et al. Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft. Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).
  21. de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. Islet transplantation in type 1 diabetes. BMJ. 342, (2011).
  22. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).
  23. Lemarie, C., et al. A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells. Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Chłodzony procesor komórekoczyszczanie gradientem gęstościżywotność ludzkich wysepeksprzęt do terapii komórkowejstandardy GMP dla pomieszczeń czystychfrakcja komórek mononuklearnychetap wirowaniaocena stężenia cząstek w powietrzupomiar żywotności komórek
Ocena wpływu nowego systemu procesorów komórek chłodzących na izolację komórek wysp trzustkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.