Method Article

Ocena wpływu nowego systemu procesorów komórek chłodzących na izolację komórek wysp trzustkowych

DOI:

10.3791/65321

⸱

August 11th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół tutaj opisuje niestandardowy system procesora komórek chłodzących, który jest zgodny z czystym pomieszczeniem dobrych praktyk produkcyjnych (GMP) w celu poprawy żywotności komórek po przetwarzaniu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standardowy sprzęt do terapii komórkowej, w tym złoty standard procesora komórkowego do oczyszczania ludzkich wysp trzustkowych do klinicznego przeszczepu, jest rzadko chłodzony, potencjalnie narażając komórki na podwyższone temperatury podczas etapu wirowania. Niestandardowe systemy chłodzenia mają bezpośredni wpływ na żywotność i funkcję ludzkich wysepek. Obecne badanie miało na celu przetestowanie skuteczności nowo opracowanego, łatwo dostępnego systemu procesora komórek chłodzonych, wymagającego minimalnych modyfikacji, oraz ocenę jego wpływu na żywotność komórek ludzkich i środowisko pomieszczeń czystych GMP. System chłodzenia, mechanicznie chłodzony wymiennik ciepła ustawiony na -30 °C, został wykorzystany do dostarczania schłodzonego, suchego powietrza klasy medycznej do misy procesora komórkowego przez otwór wywiercony w pokrywie wirówki. Ze względu na ograniczoną dostępność dawców trzustki w Katarze, walidację systemu przeprowadzono z ciągłym oczyszczaniem w gradionym gradieniu gęstości puli ludzkiego szpiku kostnego. Sterylność, turbulencje i liczbę cząstek mierzono w pomieszczeniach czystych klasy C i B. Wokół chłodzonego procesora komórkowego nie powstały żadne turbulencje i nie wygenerowano nadmiaru cząstek unoszących się w powietrzu o wielkości 0,5 μm i 5 μm, zgodnie ze standardami GMP w pomieszczeniach czystych. Na początku i na końcu etapów zbierania temperatura wzrosła odpowiednio do 21,50 °C ± 0,34 °C i 21,93 °C ± 0,20 °C w niechłodzonym procesorze komórkowym i tylko do 10,9 °C ± 0,17 °C i 11,16 °C ± 0,35 °C w procesorze z chłodzonymi komórkami (p <0,05). Schłodzony procesor komórkowy doprowadził zarówno do lepszego odzyskiwania (98%) frakcji komórek jednojądrzastych, jak i do przetwarzania końcowego (100% ± 2%). Nowy system chłodzenia skutecznie redukuje ciepło wytwarzane przez procesor ogniwa, nie wywierając jednocześnie wpływu cząstek stałych na środowisko czystego pomieszczenia GMP. Opisany tutaj procesor z chłodzonymi ogniwami jest niedrogą (16 000 USD bez podatków, odprawy celnej i transportu) i minimalnie inwazyjną metodą zapewniającą solidne chłodzenie. Obecnie technologia ta w ośrodku terapii komórkowej GMP jest stosowana do izolacji i przeszczepiania ludzkich komórek wysp trzustkowych w ramach programu klinicznego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczep wysp trzustkowych w przypadku ciężkiej cukrzycy typu 1 może przywrócić endogenne wydzielanie insuliny i stał się standardem opieki w wielu krajach1. Izolacja wysp trzustkowych to wieloetapowa procedura, która obejmuje ciepłe, enzymatyczne i mechaniczne trawienie trzustki, a następnie fazy schładzane w celu odzyskania strawionej tkanki i oczyszczanie wysp trzustkowych z ciągłymi lub nieciągłymi gradientami gęstości na procesorze komórkowym. Szybkie chłodzenie spowalnia fazę trawienia enzymatycznego i chroni wyspy trzustkowe przed enzymami trawiennymi uwalnianymi przez zanieczyszczające komórki groniaste. Procesor komórkowy został pierwotnie zaprojektowany do oddzielania składników krwi komórkowej w temperaturze otoczenia2. W 1989 roku został ponownie wykorzystany do oczyszczania ludzkich wysp trzustkowych Langerhansa3. Przez trzy dekady ludzkie wyspy trzustkowe były oczyszczane do badań klinicznych, a ostatnio do standardowej opieki, albo w procesorze komórkowym z nieciągłymi gradientami4 lub ciągłych gradientach gęstości1 wykonane za pomocą gradientu maker1 lub równoważnego miksera sterowanego komputerowo5,6,7. Inne grupy donosiły o oczyszczaniu wysepek z dużych ssaków i ludzi za pomocą dużych cylindrycznych plastikowych butelek8,7,9, co znacznie poprawiło skuteczność oczyszczania i jakość wysepek.

Rzeczywiście, biorąc pod uwagę złoty standard oczyszczania ludzkich wysp trzustkowych do klinicznego przeszczepu10,11, wyprodukowany procesor komórkowy był bez chłodzenia. Bezpośrednią konsekwencją braku chłodzenia było to, że wysepki były narażone na działanie rosnących temperatur na etapie oczyszczania. Podczas wirowania dochodzi do niekontrolowanego wzrostu temperatury spowodowanego tarciem mechanicznym wirnika12,13. Procesory komórkowe zostały przystosowane do systemu chłodzenia w centrach izolacji wysp trzustkowych, który statystycznie zwiększał wydzielanie insuliny indukowane glukozą i żywotność komórek, potwierdzając zaletę utrzymywania wysp trzustkowych w niskich temperaturach podczas procedury oczyszczania14,15.

Należy zauważyć, że pod koniec lat 80. zbudowano 10 prototypów chłodni w celu zmniejszenia uszkodzeń wysepek podczas oczyszczania gradientu gęstości, ale nie zwrócono na nie większej uwagi. Prototypy procesorów ogniw oparto na chłodzeniu wrzeciona i misy schłodzonym glikolem polietylenowym. W szczególności roztwory do oczyszczania wysp trzustkowych, w tym roztwory do konserwacji narządów i gradienty gęstości polisacharydów, mogą być szkodliwe dla żywotności wysp trzustkowych, gdy są stosowane w temperaturze pokojowej lub wyższej16,17,18. Porównano różne strategie chłodzenia procesora komórkowego w celu oczyszczania komórek wysp trzustkowych w porównaniu z oryginalnym procesorem komórkowym bez chłodzenia, aby zwalczyć niekontrolowany wzrost temperatury, który występuje w wyniku tarcia wirnika. Podjęto kilka prób schłodzenia procesora komórkowego podczas oczyszczania ludzkich wysp trzustkowych. Procesor komórkowy może być tymczasowo lub na stałe umieszczony w specjalnie zaprojektowanej chłodni, aby utrzymać temperaturę 0-8 °C19 podczas wirowania gradientowego, które jest obecnie stosowane w centrach izolacji wysepek na Uniwersytecie Illinois w Chicago19, University of Miami14, University of Oxford facilities15oraz Uniwersytet w San Francisco (niestandardowa jednostka chłodząca otacza procesor komórkowy). Kolejną modyfikacją jest chłodzenie rdzenia wrzeciona procesora komórkowego za pomocą systemu chłodzenia wykorzystującego elektronicznie sterowane chłodzenie ciekłym azotem w Genewie, Szwecji i Czechach15,19. Inną alternatywą w połowie 2000 r. było chłodzenie rdzenia procesora komórkowego za pomocą jednostki klimatyzacyjnej12 lub chłodzenie wału cieczą na Uniwersytecie w Lille.

Modyfikacje chłodzenia procesora komórkowego nie są łatwo dostępne i wiążą się z ryzykiem (wilgotność, nagromadzenie kondensatu) w pomieszczeniach czystych GMP, w tym utratą gwarancji i odmową serwisowania maszyny przez konstruktora. W związku z tym niektóre centra wysepek, w tym Mediolan we Włoszech, Oslo w Norwegii i Edynburg w Szkocji, nie używają systemu chłodzenia procesorów komórek podczas procesu oczyszczania wysepek15.

Obecne badanie miało na celu sprawdzenie skuteczności nowo opracowanej łatwo dostępnej chłodnicy w połączeniu z minimalnie zmodyfikowanym systemem procesorów komórkowych. Krótko mówiąc, opisana tutaj chłodnica powietrzna jest mechanicznie chłodzonym wymiennikiem ciepła kontrolującym temperaturę 1 standardowej stopy sześciennej na minutę (SCFM) suchego gazu w zakresie od -40 °C do -100 °C. Ten system chłodzenia wymaga dopływu suchego powietrza medycznego. Powietrze będzie przepływać przez przewód i wymiennik ciepła i na zewnątrz przez dyszę (7,9 mm). Grzałka umieszczona w dyszy dostarcza ciepło w celu kontrolowania temperatury strumienia powietrza. Zakupiono zapasową, solidną plastikową pokrywę wirówki i dokonano minimalnych modyfikacji. W pokrywie wywiercono otwór o średnicy 13,3 mm, a schłodzone powietrze było dostarczane z dyszy chłodnicy do procesora komórkowego przez otwór w pokrywie wirówki. Schłodzone powietrze medyczne było wtryskiwane do misy wirówkowej procesora komórkowego ze stałą kontrolą temperatury cieczy lub gradientów gęstości.

Oceniliśmy techniczną wydajność procesora chłodzonego ogniwa i wpływ elementu chłodzącego na środowisko czystego pomieszczenia GMP. Głównym celem było osiągnięcie bardzo niskiej (<10 °C) temperatury podczas oczyszczania ludzkich wysp trzustkowych w celu zachowania ich żywotności. Używając separacji gęstości kożuchy jako wskaźnika zastępczego dla izolacji wysp trzustkowych, określiliśmy skuteczność tego protokołu chłodzenia na żywotność komórek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół używał wyrzuconej pełnej krwi, która nie nadawała się do użycia zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi odrzucania. Zgoda IRB i świadoma zgoda nie mają zastosowania.

1. Konfiguracja procesora chłodzonego ogniwa

UWAGA: Wszystkie procedury muszą być wykonywane w pomieszczeniu czystym, a personel musi przestrzegać procedur dotyczących odzieży w pomieszczeniach czystych.

  1. Zakup sprzętu
    1. Kup zapasową pokrywę z pleksi. Należy zakupić układ urządzeń chłodzących, chłodnicę z mechanicznie chłodzonym regulatorem temperatury strumienia gazu, osuszacz powietrza, regulator ciśnienia i przepływu oraz gwarancję (opcjonalnie). Zobacz Spis materiałów dla referencji.
      UWAGA: Całkowity koszt to 16 133 USD bez opłat za wysyłkę i cła.
    2. Zamów suche powietrze medyczne, sprężony gaz medyczny, który jest zgodny ze standardową klasą (Farmakopea Europejska nr referencyjny 1238) u lokalnego dostawcy gazów medycznych. Kup 2 butle o długości 6,8m3 (47 l: 23 cm x 153 cm; średnica x długość).
  2. Konfiguracja sprzętu (Rysunek 1 i Rysunek 2)
    1. Wprowadź sprzęt do pomieszczenia czystego GMP (zdezynfekuj przed wejściem do pomieszczenia czystego zgodnie z procedurami GMP.
    2. W przypadku sprężonego powietrza klasy medycznej należy zainstalować przewód gazowy zamiast umieszczać butlę z gazem bezpośrednio w pomieszczeniu czystym.
  3. Modyfikacja procesora komórkowego do chłodzenia
    1. Najpierw zdejmij osłonę z pleksi. Zachowaj oryginalną osłonę z pleksi na wypadek problemów z gwarancją. Wywierć otwór w zapasowej pokrywie procesora komórkowego o średnicy pasującej i pasującej do zewnętrznej średnicy końcówki dyszy urządzenia chłodzącego, aby zapobiec pękaniu pokrywy wirówki (zalecane 13.3 mm).
    2. Przymocuj wsporniki razem za pomocą okrągłego kawałka pianki. Ma to na celu zapobieżenie pęknięciu i/lub zarysowaniu pokrywy, utrzymanie dyszy chłodnicy na miejscu nad procesorem komórkowym, ochronę pokrywy przed nadmiernym zginaniem z powodu wysokiego ciśnienia wtryskiwanego powietrza, utrzymanie ciężaru dyszy i wreszcie zapewnienie operatorowi maksymalnego bezpieczeństwa swobodnego i bezpiecznego dostępu do wszystkich wymaganych funkcji procesora komórkowego podczas procedury eksperymentalnej.
    3. Podłącz układ chłodzenia do procesora ogniw, mocując dyszę chłodzącą do otworu w pleksi. Zabezpiecz go za pomocą wsporników i piankowych poduszek.
    4. Umieść obudowę chłodniczą w odległości do 8 stóp (2.44 m) od dyszy. Umieść regulator temperatury w osobnej szafie i umieść go w odległości 6 stóp (1.83 m) od obudowy chłodniczej.
    5. Ustawić nastawę chłodnicy na -40 °C, aby schłodzić strumień powietrza w chłodnicy. Temperatura powietrza wylotowego jest stale wskazywana na wskaźniku cyfrowym z rozdzielczością 0,1 °C. Za pomocą regulatora temperatury należy ustawić cyfrowo temperaturę na wylocie na 0,1 °C.
    6. Kontroluj ciśnienie i natężenie przepływu powietrza doprowadzającego do modułu regulatora ciśnienia i przepływu (Rysunek 2) przed podaniem do chłodnicy. Ustaw je odpowiednio na 55 psi i 4 natężenia przepływu SCFM, aby osiągnąć optymalne warunki na strumieniu powietrza schłodzonym w temperaturze -30 °C ± 2 °C.
    7. Sprawdź, czy dopływ gazu medycznego jest regulowany na ciśnienie wyjściowe 5 barów i może trwać co najmniej 90 minut, ponieważ jest to wymagane, aby sprężone powietrze osiągnęło -30 °C.
      UWAGA: Suche powietrze medyczne jest sprężonym gazem medycznym, a suche powietrze pod pełnym ciśnieniem jest zgodne z klasą standardową.
    8. Dostarczyć 5 barów z dyszy chłodzącej podłączonej do pokrywy procesora komórkowego przez otwór wywiercony w pokrywie wirówki. Wstrzyknąć schłodzone powietrze medyczne do miski wirówkowej procesora komórkowego (Rysunek 2). Wybrać położenie wtrysku powietrza w taki sposób, aby schłodzone powietrze było kierowane prostopadle do aluminiowej obręczy wirnika wirówki.
    9. Przygotowując procesor ogniw, upewnij się, że wirnik ma temperaturę pokojową (18 °C). Ustawić automatyczny regulator temperatury układu chłodzenia na -30 °C i kierować wtrysk chłodnego powietrza do wirnika.
      UWAGA: Przetestowano różne warunki próbne, aby osiągnąć optymalny gradient temperatury +4 °C, który jest niezbędny do pokonania oporu termicznego układu separatora komórek procesora komórkowego i nagrzewania się wirnika podczas wirowania. Zaprogramowany termoregulator utrzymuje optymalną temperaturę docelową wewnątrz maszyny do przetwarzania komórek podczas zabiegu, szczególnie podczas wirowania, w temperaturze pomieszczenia czystego +18 °C.
      1. Ustaw procesor komórkowy z pierwszą fazą wstępnego chłodzenia, aby schłodzić procesor (bez zestawu procesora komórkowego) w temperaturze +3 °C przez 30 do 45 minut, a druga faza wstępnego chłodzenia procesora komórkowego powinna odbywać się przy zestawie wstępnie schłodzonym w temperaturze +4 °C przy 134 x g, przez 5 minut.

2. Liczba cząstek stałych w powietrzu

  1. Oceń zgodność urządzenia chłodzącego ze środowiskiem pomieszczenia czystego GMP zgodnie z normą ISO 14644-1, aby ocenić wpływ urządzeń grzewczych w fazie eksploatacji.
  2. Wykorzystanie monitorowania liczby cząstek stałych w celu dostarczenia dowodów na to, że wymagany poziom czystości jest osiągany w krytycznych punktach kontroli w stanie spoczynku i podczas pracy.
    1. Minimalna liczba lokalizacji próbek zależy od mierzonego obszaru. Oblicz to za pomocą równania
      figure-protocol-1
      gdzie A oznacza powierzchnię pomieszczenia czystego lub pomieszczenia z kontrolowanym czystym powietrzem w m2, a NL oznacza liczbę miejsc pobierania próbek zaokrągloną w górę do liczby całkowitej.
    2. Objętość pobierania próbek z powietrza to minimalna objętość w każdym miejscu. Upewnij się, że objętość powietrza jest wystarczająco duża, aby policzyć 20 cząstek o największej określonej wielkości cząstek. Obliczyć objętość próbki powietrza za pomocą równania
      V= 20/C x 1000
      gdzie V jest minimalną objętością pojedynczej próbki na miejsce, wyrażoną w L, a C jest granicą klasy (liczba cząstek/m3).
    3. Dla każdej lokalizacji, w zależności od obszaru, użyj jednej lub więcej próbek. Upewnij się, że najmniejsza objętość próbki pobieranej w każdym miejscu wynosi 2 l, a minimalny czas pobierania próbki wynosi co najmniej 1 minutę.
  3. Przed pobraniem próbek należy przepłukać licznik cząstek stałych filtrem przedmuchującym. Wyjmij filtr i umieść go z sondą izokinetyczną w celu pobrania próbek.
  4. Umieść licznik cząstek w określonym miejscu pobierania próbek. Rozpocząć pobieranie próbki z ekranu głównego licznika cząstek.
  5. Po zakończeniu pobierania próbek należy przenieść licznik cząstek do następnego miejsca. Po zakończeniu wszystkich lokalizacji pobierania próbek przejrzyj dane i wydrukuj raport.
  6. W przypadku gdy średnie stężenie cząstek stałych we wszystkich punktach pobierania próbek na danym obszarze spadnie poniżej limitu klasy określonego w tabeli 1, należy wziąć pod uwagę pomieszczenie, w którym stwierdzono dopuszczalne stężenie cząstek.

3. Przygotowanie gradientu i przetwarzanie separacji komórek

  1. Przed eksperymentem należy wstępnie schłodzić lekkie i ciężkie gradienty gęstości oraz zestawy procesora komórkowego przez noc w temperaturze +4 °C w lodówce.
  2. Wstępnie schłodzić procesor ogniw przez 45 minut w stanie spoczynku (tj. włączyć procesor ogniw przed użyciem). Utrzymuj temperaturę w zakresie od +2 °C do +5 °C. Włóż zestaw procesora ogniw wstępnie schłodzony do +4 °C.
  3. Do standardowego chłodzonego etanolem ekspresu gradientowego z podwójnym płaszczem (opcjonalnie; Rysunek 3) Połącz 2 szklane komory i umieść je na mieszadle magnetycznym. Clamp rurkę między 2 komorami. Schłodzić ekspres gradientowy za pomocą agregatu chłodniczego z obiegiem etanolu w temperaturze 0 °C.
  4. Najpierw przygotuj się do załadowania ciężkiej warstwy na dno worka, wypełniając komorę 130 ml gradientu gęstości (HD; 1,087 g/ml). Obciążenie przy prędkości pompy 150 ml/min.
  5. Gdy ciężki gradient znajdzie się w torebce, dodaj 130 ml o wysokiej gęstości (HD) do przedniej zlewki i 140 ml gradientów o niskiej gęstości (LD; 1,063 g/ml) z tyłu (zacisk zamknięty).
  6. Odblokuj hemostat/zacisk między 2 komorami i utwórz ciągły gradient przy prędkości pompy 50 ml/min.
  7. Przygotuj z wyprzedzeniem ludzkie jednojądrzaste komórki kożucha do oczyszczenia z wielu połączonych anonimowych kożuchów kożuchów pobranych z produktów przemiany materii krwi pełnej (40 ml do 60 ml pełnej krwi dodano do 10 worków z kożuchem), w zależności od dostępności w banku krwi.
    1. Separacja MNC
      1. Wirowanie w gradionym gradieniu gęstości służy do izolacji ludzkich komórek jednojądrzastych o niskiej gęstości. Aby to zrobić, wykonaj czynności opisane poniżej.
      2. W celu przygotowania komórek oblicz objętość krwi (antykoagulowana krew pełna lub zawieszona kożuchówka). Rozcieńczyć krew 2x-4x roztworem buforowym, mieszając inwersję. Im bardziej rozcieńczona krew, tym lepsza czystość komórek jednojądrzastych.
      3. Przygotować bufor, mieszając bufor fosforanowy z antykoagulantem. Oblicz liczbę potrzebnych probówek, dzieląc objętość krwi przez 35 ml i wlej 15 ml roztworu gradientu gęstości 1,073 do każdej probówki.
      4. Stopniowo nakładać 35 ml rozcieńczonej zawiesiny krwi na gradient gęstości, delikatnie przesuwając po powierzchni gradientu gęstości za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml podłączonej do igły; w przypadku małych objętości użyć pipety. Staraj się nie zakłócać interfejsu, ponieważ spowoduje to słabą warstwę jednojądrzastą.
      5. Wirować przy 400 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C bez żadnych przerw (przyspieszenie 0, opóźnienie 0). Po odwirowaniu delikatnie pobrać warstwę graniczną komórek jednojądrzastych za pomocą sterylnej pipety transferowej. Przenieś komórki do innej nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
      6. Przemyć komórki 2x buforem (PBS z dodatkiem antykoagulantu). Do pierwszego przepłukania napełnij probówkę zawierającą komórki buforem do objętości 50 ml. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C do osadzania komórek (przyspieszenie 9, opóźnienie 0). Delikatnie usunąć cały supernatant.
      7. Wykonaj drugie płukanie w celu usunięcia płytek krwi. Zawiesić osad do objętości 50 ml z buforem. Wirować przy 200-300 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C (przyspieszenie 9, opóźnienie 0).
      8. Rozpuść komórki do końcowej objętości 5 ml, komórki te powinny mieć ciężar właściwy przypominający MNC o niskiej gęstości <1,073. Zmierz gęstość właściwą gradientu za pomocą densjometru.
      9. Zawiesić osad do końcowej objętości 100 ml za pomocą 95 ml podłoża gradientowego o dużej gęstości (1,083 g/ml) w worku transferowym. Użyj tego produktu do oczyszczania za pomocą separatora komórek. Ostateczna objętość 100 ml zawiera komórki i 1,083 pożywki gradientowej o dużej gęstości.
        UWAGA: Płaszcz buffy może być przechowywany w lodówce przez noc w PBS zawierającym 0,5% BSA lub osocza autologicznego. Płaszcz buffy można również prać.
  8. Wstępnie uformowane gradienty należy załadować maksymalnie 30 ml MNC wyizolowanego z kożucha zawieszonego w 100 ml stężonej pożywki konserwującej za pomocą pompy perystaltycznej o prędkości 25 ml/min. Utrzymać gradient na poziomie +4 °C.
  9. Ciągły pomiar temperatury wewnątrz procesora ogniwa za pomocą wstępnie skalibrowanej sondy termometrycznej. Za pomocą cyfrowej termopary podłączonej do sterylnej sondy termodynamicznej monitoruj temperaturę gradientów i komórek podczas procesu.

4. Optymalizacja różnych etapów ładowania gradientu

  1. Włóż zestaw procesora ogniw wstępnie schłodzony w temperaturze +4 °C. Załaduj ciężki gradient (130 ml) w temperaturze + 4,5 °C. Pod koniec załadunku gradientowego należy ustawić wirówkę na stosunkowo niską prędkość (537 x g), aby zminimalizować ciepło wytwarzane przez wirnik.
  2. Wyłącz procesor ogniw, aby umożliwić układowi hydraulicznemu powrót do poziomu sprzed pracy i uwolnienie powietrza.
  3. Uruchom ponownie procesor komórkowy przy 537 x g i dodaj gradienty gęstości ciężkiej (130 ml) i niskiej (140 ml), aby utworzyć ciągły gradient gęstości w temperaturze +4,3 °C i natężeniu przepływu 50 ml/min.
  4. Załadować kożuchową powłokę (30 ml) 100 ml chłodnego podłoża o temperaturze +6 °C i natężeniu przepływu 25 ml/min. Dodać 50 ml (25 ml x 2) roztworu myjącego.
  5. Po 5 minutach w temperaturze +5 °C zebrać gradient przędzy do 12 butelek z natężeniem przepływu 100 ml/min.
  6. Napełnij probówki środkiem myjącym (M199 + 20% albuminy ludzkiej + 10% penicyliny streptomycyny). Napełnij probówkę 1 100 ml środka myjącego i 150 ml komórek i probówek 2-12 225 ml pożywki płuczącej i 25 ml komórek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najpierw określono ilościowo wpływ chłodzonego procesora komórkowego na pomieszczenie czyste GMP. W znormalizowanych metodach zastosowano licznik cząstek mierzący zanieczyszczenie powietrzem cząstek w środowisku pomieszczeń czystych klasy C i B GMP w krytycznych punktach w pobliżu procesora komórkowego i systemu chłodzenia powietrzem pod ciśnieniem. Wyniki wykazały, że wokół sprzętu nie wystąpiły żadne turbulencje. Zarejestrowane dane wykazały, że nie stwierdzono nadmiaru 0,5 μm i 5 μm cząstek unoszących się w powietrzu ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakłady izolacji wysepek na całym świecie od dziesięcioleci stosują oczyszczanie ludzkich wysp trzustkowych w procesorze komórkowym o zmienionym przeznaczeniu. Chociaż niektóre zakłady produkujące wysepki nadal przetwarzają wysepki w niechłodzonym procesorze komórkowym, większość ośrodków korzysta z chłodzonej wersji procesora komórkowego 10,11,15. Centra albo umieszczają procesor komórkowy w zimnym pomieszczeniu, którego główną...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować europejskiemu instytutowi genomicznemu dla diabetologicznego (ANR-10- LABEX-0046 do FP) oraz katarskiemu instytutowi metabolicznemu - Hamad medical corporation, Katar. Autorzy dziękują również Centrum Badań Medycznych w Hamad Medical Corporation za wsparcie w opłatach za przetwarzanie artykułów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Air - licznik cząstek LasairIII 
AirJet XR40 SP ScientificFTS system XR40
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoThermo ScientificEQ-1301
Cyrkulacyjny agregat chłodniczyJulaboCF30
COBE 2991 Terumo BCT
BiorepCCT-01
Ekspres gradientowy z podwójnym płaszczem dostosowany w domu
Termometr termoparowy KJTHanna InstrumentsHI93551NDo pomiaru temperatury cieczy
Mieszadło magnetyczne Thermo Scientific88880014
Pompa perystaltyczna MasterFlexMK-77921-79
 Extech InstrumentsRMS 430Do temperatury COBE
Bezwodna kąpiel perełkowaCole-Parmer10122-00
Materiały i odczynniki
BD zestaw do oznaczania liczby komórek macierzystychBD Biosciences 
Zestaw wężyków COBE 2911Terumo BCT90819
Rurki stożkowe 250mlCorning430776
Gęstość gradientu 1,1Biochrom L6155
Butelki jednorazowe z podziałkąThermo fisher382019-1000
Albumina ludzka 20% Kedrion Biopharma 8091600
M199 roztwór myjący Corning 99-784-CM 
Rurki MasterflexMasterflex96400-6
Medyczne suche powietrzeLinde HealthcareMedi On 22
Pencillin-streptomycyna Gibco 
ThermoprobeBiorepTC-02Thermosensor
Trypan niebieski Sigma Aldrich15250061
Uniwersytet Wisconsin Belzer (UW) Most Życia RM/N 4055Podłoże konserwujące
Stożkowa taca chłodząca Termometr 34456315140122

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  2. Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates. Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).
  3. Lake, S. P., et al. Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator. Diabetes. 38, 143-145 (1989).
  4. Ricordi, C., et al. Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases. Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).
  5. Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. Human islet separation utilizing a closed automated purification system. Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).
  6. Bampton, T. J., et al. Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis. ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).
  7. Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique. Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).
  8. Shimoda, M., et al. Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas. Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).
  9. Noguchi, H. Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles. Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).
  10. Shapiro, A. M., et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).
  11. Ricordi, C. National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities. Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).
  12. Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. Comparison of cooling systems during islet purification. Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).
  13. Rilo, H. L. R., et al. Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator. Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).
  14. Chadwick, D. R., et al. Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality. Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).
  15. Nano, R., et al. Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study. Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).
  16. Chadwick, D. R., et al. Storage of pancreatic digest before islet purification. Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).
  17. Amrani, M., et al. Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C. Circulation. 86, 280-288 (1992).
  18. Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).
  19. Adewola, A., et al. Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans. Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).
  20. Keymeulen, B., et al. Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft. Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).
  21. de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. Islet transplantation in type 1 diabetes. BMJ. 342, (2011).
  22. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).
  23. Lemarie, C., et al. A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells. Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Islet Cell IsolationCooled Cell ProcessorDensity Gradient PurificationHuman Islet ViabilityCell Therapy EquipmentCleanroom GMP StandardsMononuclear Cell FractionCentrifugation StepAirborne Particle AssessmentCell Viability Measurement

Related Articles