Artykuł metodologiczny

Jednoczesne wykrywanie różnych klas przeciwciał w multipleksowanym teście serologicznym

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65323

⸱

14 lipca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen, 2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch, 3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research, 4German Centre for Infection Research (DZIF)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Trzykanałowy system analizy przepływu fluorescencji z podwójnym reporterem został wykorzystany do opracowania multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie ocenia próbki surowicy pod kątem IgG i IgM wywołanych przez wiele antygenów różnych gatunków Borrelia, które powodują boreliozę z Lyme w Europie i Ameryce Północnej.

Streszczenie

Aby monitorować postęp chorób zakaźnych, warto ocenić immunoreaktywność przeciwko różnym determinantom antygenowym i zmierzyć różne izotypy przeciwciał, ponieważ pojawiają się one na różnych etapach odpowiedzi immunologicznej gospodarza. W przypadku boreliozy z Lyme czynnik chorobotwórczy może być jednym z wielu członków gatunku Borrelia. Dlatego prawidłowa klasyfikacja próbki wymaga oceny immunoreaktywności wobec różnych antygenów różnych gatunków Borrelia. Ponadto odpowiedzi przeciwpatogenne IgG i IgM mogą mieć różny przebieg czasu wywołania podczas progresji choroby. Tutaj pokazujemy rozwój dwureporterowego multipleksowego testu immunologicznego, który ma zastosowanie w identyfikacji odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla Borrelia w próbkach ludzkiej surowicy poprzez jednoczesną ocenę immunoreaktywności zarówno IgG, jak i IgM przeciwko różnym antygenom bakteryjnym w tej samej reakcji. To podejście oparte na podwójnym reporterze pozwala zachować wydajność analityczną metod z jednym reporterem, jednocześnie oszczędzając czas i zasoby oraz zmniejszając wymagania dotyczące wielkości próby. Test ten pozwala zasadniczo podwoić ilość informacji serologicznych generowanych z próbki krwi w czasie o połowę krótszym.

Wprowadzenie

Borelioza z Lyme jest najczęstszą chorobą zakaźną przenoszoną przez kleszcze w umiarkowanym klimacie półkuli północnej1. Jest wywoływana przez bakterie krętkowe z rodzaju Borrelia, z pięcioma znanymi ludzkimi patogenami, które różnią się rozmieszczeniem geograficznym2. Głównymi chorobotwórczymi gatunkami Borrelia w Europie są B. afzelii i B. garinii, przy czym B. burgdorferi s.s., B. spielmanii i B. bavariensis są rzadziej atakowane. W Ameryce Północnej B. burgdorferi s.s. jest jedynym czynnikiem wywołującym boreliozę z Lyme2,3. Patogeny Borrelia są przenoszone przez przedstawicieli rodzaju kleszczy Ixodes, a ich przeniesienie może nastąpić w ciągu 24 godzin od ukąszenia kleszcza4.

Diagnoza boreliozy z Lyme jest zazwyczaj stawiana na podstawie objawów klinicznych, a następnie potwierdzana przez serologię. Zarówno w Europie, jak i Ameryce Północnej wytyczne diagnostyczne zalecają dwuetapową serię testów składającą się z testu immunoenzymatycznego (ELISA) z odruchowym immunoblotem w celu oceny odpowiedzi przeciwciał przeciwko antygenom specyficznym dla Borrelia1,5,6,7,8,9. Jednak podejście to nie jest czułe i jest nieoptymalne, szczególnie we wczesnej fazie infekcji, kiedy serokonwersja może być niepełna, a miana przeciwciał anty-Borrelia IgG i IgM są zbyt niskie6.

Multipleksowe testy immunologiczne są lepsze od tradycyjnych testów immunologicznych, które mierzą tylko jeden cel na raz i mogą jednocześnie oceniać wiele odpowiedzi izotypów przeciwciał przeciwko jednemu lub więcej antygenom10,11,12. Testy, takie jak ELISA, ograniczają się do identyfikacji i ilościowego określenia pojedynczego analitu na reakcję, w obecnym przypadku krążącej IgG lub IgM indukowanej przeciwko pojedynczemu antygenowi bakteryjnemu po zakażeniu Borrelią. Niniejszy raport ilustruje wykorzystanie technologii profilowania analitów na bazie kulek do opracowania multipleksowego testu immunologicznego, który jednocześnie wykrywa zarówno przeciwciała IgG, jak i IgM przeciwko dowolnemu z wybranych antygenów Borrelia w próbkach surowicy ludzkiej. Wybraliśmy cztery antygeny, które razem obejmują najpowszechniejszy patogenny gatunek Borrelia występujący w Europie (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) i Ameryka Północna (B. burgdorferi s.s.) (Tabela 1)2,3. Pozwala to na zdecydowaną identyfikację patogenu i możliwość rozpoznania wczesnej immunoreaktywności IgM i późniejszej, trwalszej immunoreaktywności IgG w próbkach pobranych od pacjentów.

powiedział:
Docelowy izotypKanał reporterskiantygenGatunki BorrelianaprężaćStężenie sprzężenia antygenu
IgmPeProtokół OspCB. garinii (B. garinii)Rok 200475,0 μg/106 koralików
IgG (IgG)Zobacz materiał BV421VlsEB. burgdorferi s.sZobacz materiał B311,25 μg/106 koralików
IgG (IgG)Zobacz materiał BV421Baza danych DbpAB. burgdorferi s.s.ZS710,0 μg/106 koralików
IgG (IgG)Zobacz materiał BV421Baza danych DbpAB. afzelii (B. afzelii)PKo5,0 μg/106 koralików

Tabela 1: Reprezentatywne antygeny Borrelia używane do opracowywania testów multipleksowych.

Początkowo opracowaliśmy test immunologiczny z pojedynczym reporterem, który wykrywał przeciwciała anty-anty-Borrelia IgG lub IgM w dwóch oddzielnych reakcjach, a następnie połączyliśmy te testy w dwutorowy test multipleksowy, który mierzy oba izotypy przeciwciał w tej samej mieszaninie reakcyjnej. Kulki magnetyczne są sprzężone z docelowym antygenem patogenu, a następnie inkubowane z próbkami surowicy pacjenta. Antygen sprzężony z kulkami zostaje rozpoznany i wychwytuje zarówno krążące IgG, jak i IgM w surowicy, która jest generowana w odpowiedzi immunologicznej przeciwko temu antygenowi patogenu. Swoistość testu IgG w stosunku do IgM określa się przez wybór przeciwciała drugorzędowego, które wiąże się z IgG lub IgM, z których każde ma odrębny sygnał fluoroforowy związany z dwoma przeciwciałami drugorzędowymi. Każdy sygnał fluorescencyjny jest wykrywany w jednym z dwóch kanałów reporterowych instrumentu (tj. podwójnym reporterze), który ma inny laser wzbudzający i wychwyt emisji specyficzny dla pojedynczego fluoroforu używanego do wykrywania IgG lub IgM (tutaj odpowiednio fiolet brylantowy 421 lub fikoerytryna). Kanał klasyfikacyjny instrumentu identyfikuje barwnik oznaczony kolorem, który jest nieodłącznie związany z różnymi zestawami koralików. W ten sposób wiele docelowych antygenów można sprzęgnąć z różnie barwionymi kulkami, a zestawy kulek wymieszać ze sobą i wykorzystać do kompleksowej oceny różnorodnej immunoreaktywności przeciwpatogennej w próbkach surowicy. Kanał klasyfikacyjny identyfikuje każdy pojedynczy zestaw kulek (tj. specyficzny antygen) i mierzy fluorescencję związaną z IgG lub IgM w stosunku do tego antygenu. Wynikowy test multipleksowy oszczędza czas i zasoby w porównaniu z mniej kompleksowymi klasycznymi testami i dokładnie kataloguje immunoreaktywność boreliozy w ograniczonych objętościach próbek. Podczas gdy podobne podejście z podwójnym reporterem było wcześniej stosowane do kategoryzacji odpowiedzi immunologicznych w innych patologiach, takich jak zakażenie SARS-CoV-213, niniejszy raport szczegółowo opisuje zastosowanie technologii multipleksowego testu fluorescencyjnego do charakteryzowania immunoreaktywności w boreliozie z Lyme.

Protokół

Otrzymano odpowiednią zgodę Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej/Komisji Etyki na użycie próbek ludzkiej surowicy w tej serii eksperymentalnej. Próbki były anonimowymi materiałami pozostałościowymi z niemieckiego krajowego badania seroprewalencji SARS-CoV-214. Zezwolenie na wykorzystanie próbek ludzkich zostało wydane przez Komisję Etyki Wyższej Szkoły Medycznej w Hanowerze w Niemczech (9086_BO_S_2020). W obecnym badaniu wykorzystano łącznie 21 próbek surowicy ludzkiej.

1. Etyczna aprobata dla korzystania z próbek ludzkich

  1. Uzyskanie odpowiednich zgód etycznych dotyczących wykorzystywania próbek pobranych od ludzi.

2. Odczynniki i sprzęt

  1. Próbki surowicy ludzkiej: Przeprowadź walidację testu technicznego i kontrolę jakości, używając próbek surowicy od osób, u których wcześniej zdiagnozowano boreliozę z Lyme lub od osób, u których stwierdzono boreliozę-ujemny status immunologiczny Borrelia12,14.
  2. Oprzyrządowanie z pojedynczym reporterem. Użyj dwukanałowego jednokanałowego przyrządu reporterowego (Tabela materiałów) do wstępnego opracowania testu i walidacji technicznej.
    UWAGA: System z pojedynczym reporterem ma dwa lasery: 1) identyfikuje i określa ilościowo fluorescencję specyficzną dla zestawu kulek w celu rozróżnienia różnych zestawów kulek, jeśli jest używany (kanał klasyfikacyjny), oraz 2) wykrywa i określa ilościowo fluorescencję fikoerytryny (PE) specyficzną dla celu (kanał reporterowy; wzbudzenie 532 nm, emisja "pomarańczowa" 565-585 nm). W związku z tym tylko jedna klasa izotypów przeciwciał (np. IgG lub IgM) może być analizowana jednocześnie przy użyciu pojedynczego kanału reporterowego.
    1. Wykonaj wstępne badania walidacyjne w celu oceny przeciwciał anty-Borrelia IgG i IgM oddzielnie, w formacie 96-dołkowym z pojedynczym reporterem, który wykorzystuje odczynniki wykrywające znakowane PE dla obu klas przeciwciał.
      UWAGA: Obecny test ocenia krążące IgG specyficzne dla antygenu Borrelia VlsE i dwóch wariantów DbpA oraz krążące IgM specyficzne dla antygenu OspC, jako reprezentatywne przykłady. Test można rozszerzyć w celu oceny immunoreaktywności surowicy w stosunku do innych antygenów anty-Borrelia, zgodnie z potrzebami12.
  3. Oprzyrządowanie z podwójnym reporterem. Użyj trzykanałowego dwukanałowego instrumentu reporterowego (tabela materiałów), który umożliwia jednoczesną analizę IgG/IgM w tej samej reakcji, w celu opracowania i walidacji technicznej podwójnego testu IgM/IgG (szczegółowo opisanego poniżej). Ten instrument ma 3 kanały wykrywające fluorescencję, z których 2 to kanały reporterowe, które oceniają docelowe sygnały związane z Ig.
    UWAGA: System dual-reporter składa się z trzech laserów: 1) identyfikuje i określa ilościowo fluorescencję specyficzną dla zestawu kulek (kanał klasyfikacyjny); 2) wykrywa i określa ilościowo specyficzną dla celu fluorescencję fikoerytryny (PE) (kanał reporterowy 1; wzbudzenie 532 nm, emisja "pomarańczowa" 565-585 nm), oraz 3) ocenia specyficzną dla celu fluorescencję fioletu brylantowego 421 (BV421) analitu drugiego celu (kanał reporterowy 2; wzbudzenie 405 nm, emisja "niebieska" 421-441 nm). System podwójnego reportera jest kompatybilny zarówno z 96-dołkowymi, jak i 384-dołkowymi formatami testów na płytkach mikromiareczkowych (obsługa półautomatyczna). Ogólny schemat testu jest pokazany w Rysunek 1. Kroki protokołu są szczegółowo opisane poniżej.

3. Sprzężenie antygenowe

  1. Spraż antygeny Borrelia z magnetycznymi, karboksylowanymi i fluorescencyjnymi mikrosferami o grubości 6,5 μm (kulkami; Tabela materiałów) przy użyciu chemii 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC)/sulfo-N-hydroksysukcynimidu (sNHS).
    UWAGA: Szczegółowy opis można znaleźć w reference11i reference12. Znajdź stężenie sprzężenia każdego antygenu w tabeli 1. Sprzężone koraliki należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Wszystkie stosowane w reakcjach sprzęgania i detekcji są szczegółowo opisane w materiałach uzupełniających.

4. Procedura testu: Test serologiczny IgG lub IgM z pojedynczym reporterem: format 96-dołkowy

  1. Rozcieńczyć próbkę w 2 etapach (2 etapy, oba na płytkach 96-dołkowych; 200-krotne rozcieńczenie próbki surowicy w buforze do oznaczania).
    UWAGA: Skład buforu testowego to mieszanina 1:4 Low Cross Buffer: PBS zawierająca 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej. Tween-20 dodaje się do mieszaniny do końcowego stężenia 0,05 % (v/v).
    1. Etap 1 rozcieńczania próbki: Zmieszać 5 μl próbki surowicy ze 120 μl buforu do oznaczania (rozcieńczenie 25-krotne).
    2. Etap 2 rozcieńczania próbki: Rozcieńczyć 25-krotnie próbkę dodatkowo 8-krotnie, mieszając 10 μl rozcieńczenia z 70 μl buforu do oznaczania, aby uzyskać 200-krotne rozcieńczenie próbki końcowej.
  2. Rozcieńczenie mieszanki kulek magnetycznych
    1. Przygotować mieszankę kulek zawierającą od 1,0 × 10do 6 kulek/ml na populację kulek (tj. na unikalny antygen docelowy).
    2. Rozcieńczyć przygotowaną mieszaninę kulek 25-krotnie w buforze testowym, aby uzyskać końcowe stężenie kulek w tej rozcieńczonej zawiesinie wynosi teraz 4 × 104 kulek/ml na populację kulek (tj. na unikalny antygen docelowy).
  3. Inkubacja próbki surowicy z kulkami
    1. Odpipetować 25 μl rozcieńczonej sprzężonej zawiesiny kulek multipleksowych (zawierającej 4,0 ×10 4 kulek/zestaw/ml) do przypisanych dołków 96-dołkowej półpowierzchniowej płytki mikromiareczkowej (tabela materiałów).
    2. Dodać 25 μl 200-krotnie rozcieńczonej próbki surowicy (z kroku 4.1 powyżej) do odpowiednich studzienek zawierających 25 μl sprzężonej zawiesiny kulek.
      UWAGA: Powoduje to dodatkowe 2-krotne rozcieńczenie, więc końcowe rozcieńczenie próbki surowicy w studzience jest 400-krotne, a końcowa liczba kulek wynosi 1000 kulek / zestaw kulek / 50 μl reakcji.
    3. Przykryć 96-dołkową płytkę reakcyjną uszczelką z mikropłytką (folia samoprzylepna lub osłony płytek z tworzywa sztucznego).
    4. Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze 20 °C, przy 750 obr./min na wytrząsarce płytkowej.
  4. Mycie koralików
    1. Wyjąć 96-dołkową płytkę reakcyjną z wytrząsarki płytek i ostrożnie usunąć samoprzylepną uszczelkę płyty.
    2. Umieść 96-dołkową płytkę reakcyjną w myjce do płytek.
    3. Umyj koraliki trzykrotnie za pomocą 100 μl buforu do płukania (1× PBS + 0,05% v/v Tween 20) za pomocą automatycznej magnetycznej podkładki do płyt.
  5. Umyte kulki zawiesić ponownie w 100 μl buforu do płukania, przykryć płytkę folią samoprzylepną lub plastikową osłoną talerza i wstrząsnąć płytką na wytrząsarce płytek przez 1 minutę w temperaturze 20 °C przy 1000 obr./min.
  6. Podziel umyte koraliki
    1. Wyjąć 96-dołkową płytkę reakcyjną z wytrząsarki płytek i ostrożnie usunąć samoprzylepną uszczelkę płyty.
    2. Wymieszać reakcje, pipetując pięć razy w górę i w dół, a następnie przenieść 50 μl każdej objętości reakcyjnej 100 μl na każdą z dwóch nowych 96-dołkowych płytek reakcyjnych, jedną płytkę do wykrywania IgG i jedną do wykrywania IgM.
  7. Inkubacja przeciwciała/odczynnika detekcji
    UWAGA: W tym momencie kulki sprzężone z docelowym antygenem inkubowano z próbkami surowicy w celu ekstrakcji krążących przeciwciał w surowicy (jeśli są obecne), które reagują z antygenem (antygenami). Przereagowane kulki ze związaną immunoglobuliną podzielono na dwie płytki, a IgG i IgM są teraz wykrywane i oznaczane ilościowo na ich oddzielnych płytkach przy użyciu przeciwciał drugorzędowych specyficznych dla izotypu ze znacznikiem PE. Przesuwanie czynności związanych z płytami o 20 min.
    1. Odessać supernatant ze studzienek zawierających kulki magnetyczne za pomocą magnetycznej podkładki płytowej.
    2. Dla każdej płytki należy przygotować odpowiednią mieszaninę odczynników do wykrywania Ig (anty-IgG lub anty-IgM), zawierającą anty-ludzką IgG (3 μg/ml) lub anty-ludzką IgM (5 μg/ml) sprzężoną z PE kozłą (5 μg/ml) w buforze testowym. Do każdej studzienki zawierającej kulki stosuje się 30 μl odczynnika detekcyjnego. Przygotować wystarczającą ilość odczynników do wykrywania IgG i IgM do studzienek reakcyjnych, z wystarczającą ilością nadwyżek, aby pokryć straty po pipetowaniu.
    3. Odpipetować 30 μl odczynnika do wykrywania IgG do każdego dołka zawierającego przereagowane kulki na płytce IgG i przykryć 96-dołkową płytkę reakcyjną uszczelką z mikropłytki.
    4. Odpipetować 30 μl odczynnika do wykrywania IgM do każdego dołka zawierającego przereagowane kulki na płytce IgM i przykryć 96-dołkową płytkę reakcyjną uszczelką z mikropłytki.
    5. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 20 °C, wytrząsając z prędkością 750 obr./min na wytrząsarce płytkowej.
  8. Mycie koralików
    1. Wyjąć 96-dołkową płytkę reakcyjną z wytrząsarki płytek i ostrożnie usunąć samoprzylepną uszczelkę płyty.
    2. Umieść 96-dołkową płytkę reakcyjną w magnetycznej podkładce do płytek.
    3. Umyj koraliki trzykrotnie buforem myjącym o pojemności 100 μl za pomocą magnetycznej podkładki do płyt
      4. .
  9. Ponownie zawiesić kulki w 100 μl bufora do płukania.
  10. Przeanalizuj wyniki na pojedynczym instrumencie reporterowym.
    1. Przykryj 96-dołkową płytkę reakcyjną uszczelką z mikropłytką.
    2. Potrząsać 96-dołkową płytką reakcyjną przez 3 minuty w temperaturze 20 °C, przy 1000 obr./min na wytrząsarce płytkowej.
    3. Przenieść 96-dołkową płytkę reakcyjną z wytrząsarki płytkowej i umieścić w jednopunktowym analizatorze przepływu (tabela materiałów).
    4. Dla każdej próbki przeanalizuj medianę intensywności fluorescencji (MFI) przy użyciu następujących ustawień urządzenia: objętość wychwytu = 80 μl, liczba = 50/populacja kulek, limit czasu = 60 s, bramkowanie = 7 500-15 000)12,13.

5. Procedura testu: Test serologiczny IgG i IgM z podwójnym reporterem: format 96-dołkowy

  1. Rozcieńczanie próbki (2 etapy, oba na płytkach 96-dołkowych; 200-krotne rozcieńczenie próbki surowicy w buforze do oznaczania)
    1. Etap rozcieńczania próbki 1: Zmieszać 5 μl próbki surowicy ze 120 μl buforu do oznaczania (rozcieńczenie 25-krotne).
    2. Etap 2 rozcieńczania próbki: Rozcieńczyć 25-krotnie próbkę dodatkowo 8-krotnie, mieszając 10 μl pierwszego rozcieńczenia (25-krotnie rozcieńczonej próbki z sekcji 5.1.1) z 70 μl buforu do oznaczania (rozcieńczenie 8-krotne), aby uzyskać końcowe rozcieńczenie próbki do 200 razy.
  2. Rozcieńczenie mieszanki kulek magnetycznych
    1. Przygotować mieszankę kulek zawierającą 1,0 × 106 kulek sprzężonych z docelowym antygenem/ml na populację kulek (tj. na unikalny antygen docelowy).
      UWAGA: W tej serii eksperymentalnej oceniliśmy zarówno immunoreaktywność IgG, jak i IgM wobec czterech unikalnych antygenów Borrelia w każdej reakcji.
    2. Rozcieńczyć przygotowaną mieszankę kulek 50-krotnie w buforze do oznaczania. Stężenie kulek w tej rozcieńczonej zawiesinie wynosi teraz 2,0 × 104 kulek/ml na populację kulek.
      UWAGA: Liczba kulek w reakcji dupleksu jest zmniejszona o połowę w stosunku do liczby zastosowanej w reakcji pojedynczego reportera, aby umożliwić bezpośrednią porównywalność między tymi dwoma testami i oszczędzać zasoby, po tym jak wstępne badania potwierdziły, że sygnał fluorescencji został utrzymany w liniowym zakresie kwantyfikacji przy użyciu połowy liczby kulek.
  3. Inkubacja próbki surowicy z kulkami
    1. Odpipetować 25 μl rozcieńczonej zawiesiny kulek sprzężonej z docelowym antygenem (zawierającej 2,0 ×10 4 kulek/zestaw/ml) do wstępnie przypisanych dołków 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej o połowie powierzchni. Dokładna liczba dołków reakcyjnych i ich rozmieszczenie na płytce zależy od ustalonej przez operatora całkowitej liczby badanych próbek oraz od tego, czy na próbkę będą prowadzone studzienki pojedyncze, czy powtórzone.
      UWAGA: Docelowe kulki magnetyczne sprzężone z antygenem będą reagować z próbkami ludzkiej surowicy. Zarówno immunoreaktywne IgG, jak i IgM anty-Borrelia, jeśli są obecne w próbkach, zwiążą się i zostaną unieruchomione na tych samych kulkach sprzężonych z antygenem. Drugorzędowa kwantyfikacja przeciwciał związanych IgG i IgM zostanie następnie przeprowadzona na tych samych kulkach w tych samych reakcjach, przy użyciu różnych fluoroforów do identyfikacji IgG i IgM, co umożliwia ich różnicowanie.
    2. Dodać 25 μl 200-krotnie rozcieńczonej surowicy (z kroku 5.1 powyżej) do każdej studzienki zawierającej 25 μl mieszanej zawiesiny kulek sprzężonej z docelowym antygenem (krok 5.2).
      UWAGA: Daje to dodatkowe 2-krotne rozcieńczenie, więc końcowe rozcieńczenie próbki surowicy w studzience jest 400-krotne, a końcowa liczba kulek wynosi 500 kulek / zestaw kulek / 50 μl reakcji.
    3. Przykryj 96-dołkową płytkę reakcyjną uszczelką z mikropłytką (folia samoprzylepna lub plastikowa osłona płytki).
    4. Inkubować płytkę z kulkami przez 2 godziny w temperaturze 20 °C, przy 750 obr./min na wytrząsarce do płytek.
  4. Mycie perełek (w celu usunięcia nadmiaru próbki surowicy)
    1. Wyjąć 96-dołkową płytkę reakcyjną z wytrząsarki płytek i usunąć samoprzylepną uszczelkę płytki.
    2. Umieść 96-dołkową płytkę reakcyjną w magnetycznej podkładce do płytek.
    3. Umyj koraliki trzykrotnie buforem myjącym o pojemności 100 μl za pomocą magnetycznej podkładki do płyt
      4. .
  5. Odessać końcową objętość prania ze kulek po ostatnim etapie prania.
  6. Przeciwciało wykrywające (Inkubacja - Część I)
    1. Przygotować świeży odczynnik do podwójnej detekcji IgG i IgM zawierający biotynylowane kozie przeciwciała anty-ludzkie IgG (1 μg / ml) wraz z anty-ludzkimi IgM osła sprzężonymi z PE (5 μg / ml) w buforze testowym. Do każdej studzienki zawierającej kulki stosuje się 30 μl odczynnika do podwójnej detekcji. Przygotować wystarczającą ilość odczynników do podwójnej detekcji IgG i IgM do dołków reakcyjnych, z wystarczającą ilością nadwyżek, aby zniwelować straty związane z pipetowaniem.
    2. Odpipetować 30 μl odczynnika do podwójnej detekcji IgG i IgM do każdego przypisanego dołka i przykryć 96-dołkową płytkę reakcyjną uszczelką mikropłytkową.
    3. Inkubować płytkę przez 45 minut w temperaturze 20 °C, wytrząsając z prędkością 750 obr./min na wytrząsarce do płytek.
  7. Mycie kulek (w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał wykrywających)
    1. Wyjąć 96-dołkową płytkę reakcyjną z wytrząsarki płytek i ostrożnie usunąć samoprzylepną uszczelkę płyty.
    2. Umieść 96-dołkową płytkę reakcyjną w automatycznej magnetycznej myjce płytowej.
    3. Umyj koraliki trzykrotnie buforem myjącym o pojemności 100 μl za pomocą automatycznej magnetycznej myjki do płyt
      4. .
  8. Odessać końcową objętość prania ze kulek po ostatnim etapie prania.
  9. Reporter sprzężony ze streptawidyną (Inkubacja - Część II)
    1. Rozcieńczyć świeżą streptawidynę znakowaną BV421 w buforze testowym do stężenia 0,2 μg/ml. Do każdej studzienki zawierającej kulki stosuje się 30 μl streptawidyny znakowanej BV421. Przygotować wystarczającą objętość streptawidyny znakowaną znakiem BV421 do studzienek reakcyjnych, z wystarczającą ilością dodatkowej ilości, aby zniwelować straty po pipetowaniu.
    2. Pobrać pipetą 30 μl rozcieńczonej BV421-streptawidyny do każdej studzienki reakcyjnej i przykryć 96-dołkową płytkę reakcyjną uszczelką z mikropłytki.
    3. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 20 °C, wstrząsając z prędkością 750 obr./min na wytrząsarce do płytek.
  10. Koraliki do mycia (w celu usunięcia nadmiaru BV421-Streptawidyny)
    1. Wyjąć 96-dołkową płytkę reakcyjną z wytrząsarki płytek i ostrożnie usunąć samoprzylepną uszczelkę płyty.
    2. Umieść 96-dołkową płytkę reakcyjną w magnetycznej podkładce płytowej.
    3. Umyj koraliki trzykrotnie buforem myjącym o pojemności 100 μl za pomocą automatycznej magnetycznej myjki do płyt
      4. .
  11. Zawiesić kulki w studzienkach do końcowej objętości 100 μl w buforze do płukania.
  12. Analizuj wyniki na instrumencie z podwójnym raportem
    1. Przykryj 96-dołkową płytkę reakcyjną uszczelką z mikropłytką.
    2. Inkubować 96-dołkową płytkę reakcyjną przez 3 minuty w temperaturze 20 °C, przy 1000 obr./min na wytrząsarce płytkowej.
    3. Przenieść 96-dołkową płytkę reakcyjną z wytrząsarki płytkowej do przyrządu z podwójnym reporterowym analizatorem przepływu (tabela materiałów).
    4. Oceń medianę intensywności fluorescencji próbki (MFI) zgodnie z instrukcjami producenta (Ustawienia urządzenia: tryb Dual-Reporter, objętość absorpcji = 80 μl, liczba = 50 / populacja kulek, limit czasu = 60 s, bramkowanie = 7 500-15 000).

6. Test serologiczny IgG i IgM z podwójnym reporterem: półautomatyczny format 384-dołkowy

  1. Przeprowadzić test z podwójnym reporterem w formacie płytki 384-dołkowej, wykonując etapy oznaczania opisane w sekcji 5, ale próbki należy przetwarzać za pomocą robota pipetującego i automatycznej magnetycznej myjki do płytek (tabela materiałów). W formacie 384-dołkowym wstrząsnąć płytkami podczas inkubacji i płukania z prędkością 1450 obr./min, a przed pomiarem fluorescencji wstrząsnąć płytką przez 5 minut w temperaturze 21 °C i 1800 obr./min.

Wyniki

Przegląd eksperymentu
Ogólne schematy testów opartych na koralikach z jednym i dwoma reporterami w kierunku Borrelia przedstawiono na Rysunku 1. W przypadku pojedynczych celów przeciwciał (t.j. IgG lub IgM) generowanych przeciwko konkretnemu antygenowi Borrelia, obie klasy przeciwciał oceniano niezależnie w próbkach surowicy ludzkiej, wykorzystując przeciwciało anty-izotypowe koniugowane z PE jako reporter. W teście z dwoma reporterami, służącym do jednoczesnej analizy immunoreaktywności IgG i IgM, do wykrywania IgG specyficznych dla antygenu Borrelia zastosowano system reporterowy oparty na biotynilowanym anty-ludzkim IgG + streptawidynie znakowanej BV421 (fluorescencja niebieska), zachowując reporter koniugowany z PE (fluorescencja pomarańczowa) do wykrywania IgM. Przebieg testu z dwoma reporterami jest podobny do testu z jednym reporterem, z wyjątkiem dodatkowej 30-minutowej inkubacji układu detekcyjnego z odczynnikiem do wykrywania fluorescencji w drugim kanale, BV421-Streptavidin.

Porównanie detekcji IgG/IgM z użyciem pojedynczego i podwójnego reportera przy zastosowaniu kulek MagPlex na schemacie immunoanalizy.
Rycina 1: Schemat testów na Borrelia opartych na kuleczkach z pojedynczym i podwójnym reporterem. (A) Instrument z pojedynczym reporterem został wykorzystany do opracowania i wstępnej walidacji testu opartego na kuleczkach, który charakteryzował osobno przeciwciała anty-Borrelia IgG lub IgM, w obu przypadkach z wykorzystaniem fluorescencyjnego znacznika reporterowego fikoerytryny (PE), który emituje sygnał w spektrum „pomarańczowym”. Dowolny wybrany antygen Borrelia może zostać sprzężony z kuleczkami i wykorzystany do wychwytywania oraz oznaczania ilościowego IgG lub IgM obecnych w próbkach surowicy. Do oceny reaktywności zarówno IgG, jak i IgM przeciwko danemu antygenowi potrzebne są dwie oddzielne immunoanalizy. (B) System z podwójnym reporterem umożliwił jednoczesną analizę próbek surowicy pod kątem przeciwciał IgG i IgM przeciwko dowolnemu pojedynczemu antygenowi Borrelia w tej samej dołku. Podejście to wykorzystuje to samo przeciwciało detekcyjne sprzężone z PE do celowania w anty-Borrelia IgM, ale zastępuje detekcję IgG z systemu opartego na PE zastosowaniem biotynilowanego pierwotnego przeciwciała detekcyjnego oraz streptawidyny znakowanej BV421 (emitera „niebieskiego”), co wymaga dodatkowego 30-minutowego etapu inkubacji układu detekcyjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Precyzja wewnątrzanalizy
Analiza korelacji Spearmana dla trzech reprezentatywnych antygenów Borrelia (Rysunek 2) wykazała jednorodną powtarzalność wartości MFI podczas wykrywania przeciwciał przeciwko Borrelia obecnych w ludzkiej surowicy.

Wykresy kropkowe porównujące poziom IgG/IgM w próbkach surowicy, wykazujące wysoką korelację w danych z cytometrii przepływowej.
Rysunek 2: Precyzja wewnątrzanalizy testu opartego na koralikach z podwójnym reporterem na obecność Borrelia. Analiza korelacji Spearmana wykazała wysoką precyzję wewnątrzanalizy testu z podwójnym reporterem, gdy do wykrywania swoistych dla Borrelia przeciwciał IgM zastosowano system detekcji PE (A), a do wykrywania swoistych dla Borrelia przeciwciał IgG zastosowano system detekcji BV421 (B, C). Łącznie 21 próbek surowicy przeanalizowano w duplikatach przy użyciu procedury półautomatycznej. Na każdym wykresie sygnały MFI naniesiono względem siebie i przeanalizowano za pomocą regresji liniowej. Krzywa liniowa (x=y) przedstawiona jako czerwona przerywana linia wskazuje identyczne sygnały MFI dla systemów detekcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Precyzja międzyanaliza
W przypadku testu z podwójnym reporterem zaobserwowano dobrą powtarzalność międzyanalizami. Wykresy Levey-Jenningsa (Rysunek 3) z wartościami MFI próbki kontrolnej mierzonej w siedmiu niezależnych seriach wykazały wysoką precyzję międzyanaliza dla wszystkich reprezentatywnych antygenów. Średni procentowy współczynnik zmienności (CV% = odchylenie standardowe/średnia × 100) dla czterech reprezentatywnych antygenów Borrelia wyniósł 5,3%.

Liniowość rozcieńczeń
Ponieważ oryginalny test z jednym reporterem oraz nowy test z dwoma reporterami wykorzystują różne platformy cytometrii przepływowej, porównaliśmy mediany sygnałów fluorescencji dla tego samego immunoanalizy antygenu pomiędzy dwoma urządzeniami do cytometrii przepływowej (Rysunek 4). Serie rozcieńczeń próbek wykazały liniowe krzywe rozcieńczeń zarówno dla oceny IgM, jak i IgG, z dobrą równoległością zależności dawka-odpowiedź pomiędzy instrumentami w całym badanym zakresie rozcieńczeń (1:100-1:12 800).

Wykresy wykrywania przeciwciał przeciwko Borrelia; dane MFI względem serii; poziomy IgM/IgG; reportery PE/BV; analiza statystyczna.
Rysunek 3: Precyzja międzyassayna testu opartego na kuleczkach z podwójnym reporterem na obecność Borrelia. W celu oceny precyzji międzyassaynej przeanalizowano odpowiedź przeciwciał IgM (A) i IgG (B-D) specyficznych dla Borrelia w próbce kontrolnej jakości w siedmiu niezależnych seriach, za każdym razem w dwóch powtórzeniach. Testy przeprowadzono ręcznie. Wartości MFI przedstawiono na wykresie Leveya-Jenningsa. Zielona linia oznacza średnią wszystkich wartości. Dwie czerwone przerywane linie wskazują zakres tolerancji precyzji międzyassaynej. Został on obliczony jako wartość średnia ± 2,5 razy odchylenie standardowe (2,5 S.D.). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Krzywe rozcieńczeń w cytometrii przepływowej; IgM przeciwko OspC, IgG przeciwko DbpA, pojedynczy vs podwójny reporter, wyniki MFI.
Rycina 4: Liniowość rozcieńczeń w opartym na kuleczkach teście z podwójnym reporterem na obecność Borrelia. Przy rozcieńczeniach próbek od 100-krotnego do 12 800-krotnego krzywe rozcieńczeń zarówno dla detekcji IgM (A), jak i IgG (B) były podobne podczas pomiarów wykonanych ręcznie przy użyciu instrumentu z pojedynczym reporterem oraz instrumentu z podwójnym reporterem. Przy wszystkich testowanych rozcieńczeniach wartości MFI były nieco wyższe przy użyciu instrumentu z pojedynczym reporterem (symbole czerwone) niż przy użyciu instrumentu z podwójnym reporterem (symbole niebieskie). Przedstawiono krzywe rozcieńczeń dla 2 reprezentatywnych antygenów, gdzie każdy punkt rozcieńczenia reprezentuje średnią z pomiarów w trzech powtórzeniach, a odchylenie standardowe (SD *) jest zaznaczone słupkami błędów. Uwaga: Małe wartości SD nie są widoczne w tej skali. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Materiały uzupełniające. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W niniejszym raporcie zwrócono uwagę na opracowanie dwureporterowego testu immunologicznego Borrelia opartego na kulkach, który w sposób powtarzalny i czuły określa immunoreaktywność anty-Borrelia w próbkach surowicy12. Różne chorobotwórcze gatunki Borrelia, które powodują boreliozę z Lyme, można różnicować na podstawie specyficznej dla wariantu heterogenów 6,7,8,9. Test multipleksowy jednocześnie ocenia immunoreaktywność anty-Borrelia za pośrednictwem IgG i IgM w obrębie tej samej reakcji, oszczędzając w ten sposób odczynniki, pracę i materiał próbki, które w przeciwnym razie byłyby potrzebne do wykonania dwóch testów singleplex osobno. Porównanie odpowiedzi IgM i IgG w czasie może umożliwić lepsze śledzenie postępu choroby, ponieważ serokonwersja IgM do IgG następuje po zakażeniu6.

System dual-reporter wykorzystuje dwa różne systemy wykrywania przeciwciał13,15. Powiązane eksperymenty nie wykazały istotnej wykrywalnej reaktywności krzyżowej między systemami wykrywania anty-IgM i anty-IgG Borrelia, gdy obie klasy przeciwciał analizowano razem w tym samym dołku reakcyjnym12. Biorąc pod uwagę niższe powinowactwo wiązania przeciwciał IgM w stosunku do IgG16,17, wybraliśmy przeciwciało detekcyjne sprzężone z PE do wykrywania IgM (pierwszy kanał reporterowy instrumentu z podwójnym reporterem), ponieważ PE jest jednym z silniej emitujących fluoroforów rutynowo stosowanych w testach immunologicznych18. Do oceny IgG użyliśmy biotynylowanego przeciwciała wykrywającego, które następnie zostało oświetlone streptawidyną sprzężoną z BV421 (drugi kanał reporterowy instrumentu)19. Pomimo dodatkowego 30-minutowego kroku inkubacji w porównaniu z systemem z pojedynczym reporterem, system z podwójnym reporterem dostarcza dwa razy więcej informacji na reakcję. Ogólnie rzecz biorąc, test multipleksowany z podwójnym reporterem wymaga mniej skumulowanego czasu i nakładów materiałowych niż przeprowadzenie dwóch testów z jednym reporterem.

Wysoka wydajność i stabilność multipleksowanego testu Borrelia została zilustrowana wysoką odtwarzalnością w badaniach precyzji wewnątrz i między testami oraz wykazaniem liniowości rozcieńczeń i równoległości rozcieńczeń w szerokim zakresie stężeń próbek zarówno do oceny IgG, jak i IgM. Zaobserwowaliśmy wyższe bezwzględne poziomy emisji fluorescencji dla tych samych fluoroforów przy użyciu przyrządu jednokanałowego w porównaniu z systemem dwukanałowym (≈1,7× wyższe w przypadku PE), co można przypisać różnicom w optyce i ustawieniach kalibracji między dwoma instrumentami (Rysunek 4). Niemniej jednak krzywe emisji fluorescencji z obydwoma fluoroforami pozostawały w zakresie liniowym obu przyrządów przy ekstremalnych wysokich i niskich rozcieńczeniach próbki, a jakakolwiek rozbieżność w zmierzonej fluorescencji bezwzględnej nie miała wpływu na klasyfikację statusu ekspozycji na Borrelia . 12

Główną zaletą tego wielopoziomowego testu Borrelia opartego na koralikach jest łatwość, z jaką test może być modyfikowany lub rozszerzany w celu oceny różnych lub dodatkowych analitów, np. w celu wykrycia przeciwciał przeciwko antygenom innych gatunków Borrelia . Zestawy kulek magnetycznych xMAP zawierają różne kombinacje barwników, które można rozróżnić w kanale klasyfikacyjnym urządzenia i teoretycznie można je wdrożyć do testów multipleksowych, które mogą jednocześnie oceniać do 500 unikalnych analitów w tej samej próbce. Podczas gdy obecne badanie skupia się na czterech reprezentatywnych antygenach Borrelia w celu wykazania funkcjonalności i stabilności testu oraz porównania systemu pojedynczego i podwójnego reportera, końcowy test bada osiem antygenów, które razem mogą zidentyfikować wszystkie pięć klinicznie istotnych patogenów Borrelia krążących w Europie i Ameryce Północnej12.

Wysoka przepustowość jest możliwa przy użyciu standardowych 384-dołkowych płytek do mikromiareczkowania w półautomatycznym formacie testu. Kompatybilność testów i instrumentów zarówno z płytkami 96-, jak i 384-dołkowymi pozwala na wykorzystanie testu multipleksowego Borrelia jako wydajnego narzędzia przesiewowego do szybkiej analizy dużych zestawów próbek, takich jak badania krajowe20. Ręczne wykonanie testu pozostaje możliwe w przypadku mniejszych zestawów próbek przy użyciu mniejszych płytek 96-dołkowych.

Ograniczenia badania obejmują ocenę porównawczą tylko kilku docelowych parametrów immunoreaktywności Borrelia w niewielkiej liczbie próbek surowicy ludzkiej. Jednak pierwotne badanie potwierdziło, że wydajność testu zarówno dla IgG, jak i IgM została utrzymana podczas analizy ośmiu antygenów ze wszystkich pięciu znanych gatunków Borrelia w większym zestawie próbek12. Ponadto instrument z podwójnym reporterem może oceniać tylko dwa izotypy przeciwciał jednocześnie w ramach każdej reakcji, więc pełne profilowanie izotypu wymagałoby wykonania dodatkowych reakcji testowych13.

Podsumowując, raport ten szczegółowo opisuje udane połączenie i konwersję testów immunologicznych opartych na pojedynczym reporterze na testy z podwójnym reporterem, które mogą jednocześnie oceniać patogenne przeciwciała IgG i IgM specyficzne dla Borrelii w próbkach surowicy ludzkiej. To połączone podejście pozwala zaoszczędzić całkowity czas, materiały i nakłady pracy, aby wygenerować taką samą ilość danych, jak w przypadku dwóch niezależnych testów z pojedynczym reporterem. Test multipleksowy może być skalowany z 96-dołkowej do 384-dołkowej płytki mikromiareczkowej i może być częściowo zautomatyzowany dzięki zastosowaniu zrobotyzowanego oprzyrządowania do obsługi płytek i cieczy, dzięki czemu nadaje się do zastosowań o wysokiej przepustowości, takich jak badania dużych populacji. Systemy testów z podwójnym reporterem oparte na kulkach wykazały wcześniej przydatność w ocenie na przykład odpowiedzi immunologicznej na inne patogeny wirusowe i bakteryjne13,21, ocenie odpowiedzi przeciwciał allogenicznych przeciwko epitopom HLA w transplantacji narządów22 oraz badaniu mechanizmów choroby autoimmunologicznej23. Bieżący raport szczegółowo opisuje wykorzystanie technologii multipleksowej do identyfikacji narażenia na patogeny Borrelia, które powodują boreliozę, jako przykład tego, jak laboratoria mogą dostosować to podejście do badania złożonych mechanizmów immunologicznych w różnych patologiach.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten raport został sfinansowany przez Luminex (Austin, TX). Autorzy dziękują dr Matthew Silvermanowi (Biomedical Publishing Solutions, Panama City, Floryda; mattsilver@yahoo.com) za pomoc w redakcji analitycznej i naukowej. Autorzy dziękują również Haraldowi Kleinowi i Christophowi von Eichel-Streiberowi z tgcBIOMICS GmbH (Bingen, Niemcy) za dostarczenie antygenów Borrelia wykorzystanych w badaniu. Próbki surowicy ludzkiej do walidacji testu technicznego i kontroli jakości uzyskano z: 1) Wielolokalnego i seryjnego badania rozpowszechnienia przeciwciał przeciwko SARS-CoV-2 w Niemczech za pośrednictwem Wydziału Epidemiologii, Centrum Badań nad Infekcjami im. Helmholtza, Brunszwik, Niemcy; oraz 2) Oddział Neurologii, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, Niemcy). Zezwolenie na wykorzystanie próbek ludzkich zostało wydane przez Komisję Etyczną Wyższej Szkoły Medycznej w Hanowerze w Niemczech (9086_BO_S_2020).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała i odczynniki wykrywająceŹródłokatalogowy
Biotynylowane kozy anty-ludzkie IgGJackson ImmunoResearch (Dianova)109-066-098 
Fioletowy brylantowy 421-StreptawidynaBD Biosciences563259
Osioł Anty-Human IgM Jackson ImmunoResearch (Dianova)709-116-073
Borrelia AntigenstgcBIOMICS (Bingen, Niemcy)
Coupling Reling
1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]chlorowodorek karbodimidu (EDC)Thermo Scientific Pierce77149 ProteoChem (100 mg)
10x PBSFisher ScientificBP399-4
BSACarl RothT844.3
MES (kwas 2-etanosulfonowy; bufor obojczojonowy)Carl Roth4256.2
Na2HPO4Carl Roth4984.1
ProClin300Sigma48914-U
Sulfo-NHS (N-hydroksysulfosuccinimid)Thermo Scientific Pierce24510 (500 mg)
Triton X-100Thermo Scientific85111
Instrumentation and Ancillary Lab SuppliesSource
384-well plateCorning, Cat# 3570
96-dołkowe płytki głębinoweThermoFisher Scientific, Cat# 95040450
96-dołkowe płytki półpowierzchniowe Corning, Cat# 3690
BioTek 405 TS Myjka do płytBioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
Myjka do płyt BioTek MultiFlo FXBioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
Magnes wirujący DynaMag (do izolowania kulek w probówkach do mikrowirówek)ThermoFisher, Cat# 12320D
Flexmap 3D (dwukanałowy, jednoreporterowy instrument)Luminex Corp., Austin, TX
Magnetyczny procesor cząstek KingFisher (do izolowania kulek w płytkach 96-dołkowych) ThermoFisher, Cat# A31508
MagPlex Mikrosfery (magnetyczne, fluorescencyjne, 6,5 i mikro; Koraliki o średnicy m)Luminex Corp., Austin, TX
Płyty SmartBlockEppendorf, Cat# 5363000039
ThermoMixer CEppendorf, Cat# 5382000015
ThermoTopEppendorf, Cat# 5308000003
xMAP Intelliflex (trzykanałowy, dwureporterowy instrument)Luminex Corp., Austin, TX
: Numer :

Bibliografia

  1. Stanek, G., Strle, F. Lyme borreliosis-from tick bite to diagnosis and treatment. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 233-258 (2018).
  2. Stanek, G., Wormser, G. P., Gray, J., Strle, F. Lyme borreliosis. The Lancet. 379 (9814), 461-473 (2012).
  3. Rizzoli, A., et al. Lyme borreliosis in Europe. Eurosurveillance. 16 (27), 19906(2011).
  4. Cook, M. J. Lyme borreliosis: a review of data on transmission time after tick attachment. International Journal of General Medicine. 8, 1-8 (2015).
  5. Strle, F., Stanek, G. Clinical Manifestations and Diagnosis of Lyme Borreliosis. Lyme Borreliosis: Biological and Clinical Aspects. Lipsker, D., Jaulhac, B. , Karger. 51-110 (2009).
  6. Wilske, B., Fingerle, V., Schulte-Spechtel, U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 49 (1), 13-21 (2007).
  7. Dessau, R. B., et al. To test or not to test? Laboratory support for the diagnosis of Lyme borreliosis: a position paper of ESGBOR, the ESCMID study group for Lyme borreliosis. Clinical Microbiology and Infection. 24 (2), 118-124 (2018).
  8. Eldin, C., et al. Review of European and American guidelines for the diagnosis of Lyme borreliosis. Médecine et Maladies Infectieuses. 49 (2), 121-132 (2019).
  9. Lantos, P. M., et al. Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America (IDSA), American Academy of Neurology (AAN), and American College of Rheumatology (ACR): 2020 Guidelines for the Prevention, Diagnosis and Treatment of Lyme Disease. Clinical Infectious Diseases. 72 (1), e1-e48 (2021).
  10. Gerritzen, A., Brandt, S. Serodiagnosis of Lyme borreliosis with bead based immunoassays using multiplex technology. Methods. 56 (4), 477-483 (2012).
  11. Embers, M. E., et al. Five-antigen fluorescent bead-based assay for diagnosis of Lyme disease. Clinical Vaccine Immunology. 23 (4), 294-303 (2016).
  12. Häring, J., et al. Borrelia multiplex: a bead-based multiplex assay for the simultaneous detection of Borrelia specific IgG/IgM class antibodies. BMC Infectious Diseases. 22 (1), 859(2022).
  13. Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
  14. Gornyk, D., et al. SARS-CoV-2 Seroprevalence in Germany. Deutsches Ärzteblatt International. 118 (48), 824-831 (2021).
  15. Luminex Corporation. xMAP Cookbook. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. , 5th ed, https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrer=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022).
  16. Racine, R., Winslow, G. M. IgM in microbial infections: Taken for granted. Immunology Letters. 125 (2), 79-85 (2009).
  17. Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature Reviews Immunology. 10 (11), 778-786 (2010).
  18. Kovaleski, G., et al. Extraction and purification of phycobiliproteins from algae and their applications. Frontiers in Chemistry. 10, 1065355(2022).
  19. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: A new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry Part A. 81 (6), 456-466 (2012).
  20. Coors, A., et al. Regional seropositivity for Borrelia burgdorferi and associated risk factors: findings from the Rhineland Study, Germany. Parasites & Vectors. 15 (1), 241(2022).
  21. Gürsoy, M., et al. Salivary IgA and IgG antibody responses against periodontitis-associated bacteria in Crohn's Disease. International Journal of Molecular Science. 24 (3), 2385(2023).
  22. Argani, H. Anti-HLA Antibody: The role of epitopes in organ transplantation. Experimental and Clinical Transplantation. 17 (Suppl 1), 38-42 (2019).
  23. Laman, J. D., Huizinga, R., Boons, G. J., Jacobs, B. C. Guillain-Barré syndrome: expanding the concept of molecular mimicry. Trends in Immunology. 43 (4), 296-308 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test
Posted by JoVE Editors on 8/16/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. The Authors section was updated to correct an Affiliation. It was updated from:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute, University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

to:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

Tagi

Multiplexowy immunoanalizatest z podw jnym reporteremdetekcja klas przeciwciadetekcja IgG i IgMgatunki Borreliaboreliozaocena immunoreaktywno ciludzkie pr bki surowicymonitorowanie chor b zaka nych
Jednoczesne wykrywanie różnych klas przeciwciał w multipleksowanym teście serologicznym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.