Artykuł metodologiczny

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

DOI:

10.3791/65326

⸱

26 maja 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University, 2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3CytoCypher BV, 4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią potężne narzędzie do badania zmian w funkcjonowaniu kardiomiocytów za pośrednictwem mutacji i definiowania skutków stresorów i interwencji lekowych. W tym badaniu wykazano, że ten system oparty na optyce jest potężnym narzędziem do oceny parametrów funkcjonalnych hiPSC-CM w 2D. Korzystając z tej platformy, możliwe jest wykonywanie sparowanych pomiarów w dobrze zachowanym środowisku temperaturowym na różnych układach płyt. Co więcej, system ten zapewnia badaczom natychmiastową analizę danych.

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru kurczliwości niezmodyfikowanych hiPSC-CMs. Kinetykę skurczu mierzy się w temperaturze 37 °C na podstawie zmian korelacji pikseli względem układu odniesienia przyjętego w momencie relaksacji przy częstotliwości próbkowania 250 Hz. Dodatkowo, jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia można uzyskać, ładując komórkę wrażliwym na wapń fluoroforem, takim jak Fura-2. Za pomocą hiperprzełącznika można wykonać ratiometryczne pomiary wapnia na plamce oświetleniowej o średnicy 50 μm, odpowiadającej obszarowi pomiarów kurczliwości.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niewydolność serca jest główną przyczyną zgonów na całym świecie. W 2019 r. choroby układu krążenia spowodowały 18,6 miliona zgonów na całym świecie, co odzwierciedla wzrost o 17,1% w ciągu ostatniej dekady1. Pomimo wysiłków naukowców zmierzających do zidentyfikowania celów leków zapobiegających i leczących niewydolność serca, wyniki leczenia pacjentów są nadal słabe2. Różnica w patofizjologii modeli zwierzęcych w stosunku do ludzi może być jednym z czynników leżących u podstaw ograniczonego sukcesu optymalizacji terapii niewydolności serca3. Dodatkowe modele podobne do ludzkich są uzasadnione do modelowania choroby oraz testowania toksyczności i skuteczności nowych związków leczniczych.

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią potężne narzędzie do definiowania komórkowych patomechanizmów indukowanych przez stresory, niedokrwienie, zmieniony metabolizm lub patogenne warianty genów, a także skuteczność i toksyczność interwencji lekowych4. Aby określić wpływ na właściwości funkcjonalne hiPSC-CM, uzasadniony jest szybki system, który mierzy skurczowe i rozkurczowe właściwości skurczów komórkowych w sposób bezstronny i powtarzalny. Ogólnym celem obecnego badania jest wykazanie, że system oparty na optyce jest potężnym narzędziem do przeprowadzania analiz parametrów funkcjonalnych hiPSC-CM w czasie rzeczywistym.

Obecnie istnieje wiele platform do oceny kurczliwości hiPSC-CMs. Jednak obecne systemy albo oferują powolny odczyt, albo wymagana liczba komórek może być wyzwaniem. Systemy pomiaru wideo bez etykiet5,6 opierają się na analizie post-hoc filmów, co wymaga dużej ilości pamięci i nie zapewnia bezpośredniego sprzężenia zwrotnego podczas pozyskiwania wideo. Ponadto trudno jest osiągnąć wystarczającą rozdzielczość czasową i przestrzenną, co może prowadzić do niedostatecznego próbkowania. Inne metody określania właściwości kardiomiocytów, takie jak zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/edytowane przez Cas9 hiPSC-CMs7 z fluorescencyjnymi reporterami, mogą zakłócać stabilność genów komórek i wymagać specjalistycznej wiedzy laboratoryjnej.

Aby przezwyciężyć powyższe ograniczenia, opracowano i wprowadzono unikalny system pomiarowy oparty na optyce. Platforma ta umożliwia pomiary kurczliwości na niezmodyfikowanych hiPSC-CM poprzez proste ponowne powlekanie ich na dowolnym wymaganym formacie płyty, bez żadnych ograniczeń co do rozmiaru płytki. Co więcej, pomiary w czasie rzeczywistym umożliwiają bezpośrednią obserwację i analizę parametrów funkcjonalnych hiPSC-CM, a tym samym zapewniają warunki eksperymentalne do natychmiastowego dostosowania i optymalizacji protokołów. Co więcej, lokalizacja każdego pomiaru jest przechowywana, co umożliwia sparowane pomiary na tej samej próbce, zwiększając w ten sposób moc eksperymentów.

Aby zademonstrować system oparty na optyce, przeprowadzono pomiary kurczliwości na linii kontrolnej hiPSC-CM. Ta kontrolna linia hiPSC została wygenerowana z fibroblastów skórnych zdrowego dawcy płci męskiej z prawidłowym kariotypem8. Kinetykę skurczu zmierzono w temperaturze 37 °C, w oparciu o zmiany korelacji pikseli w stosunku do układu odniesienia wykonanego podczas relaksacji przy częstotliwości próbkowania 250 Hz. Ponieważ dokładny początek skurczu nie zawsze może być jednoznacznie określony, punkt czasowy, w którym osiągnięto 20% wysokości piku (czas do szczytu 20%) został przyjęty jako punkt wyjścia dla pomiarów czasu do szczytu. W ten sposób stwierdzono mniejszą zmienność dla tego parametru w obrębie jednej próby. Podobnie, ponieważ dokładny moment, w którym sygnał powraca do linii bazowej, jest trudny do oszacowania, czas potrzebny do osiągnięcia 80% powrotu do linii podstawowej od wartości szczytowej (czas do linii bazowej 80%) został wykorzystany do opisania czasu relaksacji.

Ogólne pomiary kurczliwości obejmowały spoczynkowe częstotliwości dudnienia, czas od 20% szczytu do szczytowego skurczu (TP. Con) oraz czas od szczytowego skurczu do 80% wartości wyjściowej (TB. Con80) (Rysunek 1B). Aby przetestować działanie stresora, komórki inkubowano z izoprenaliną (ISO). Ponadto, równolegle z pomiarami kurczliwości, stany nieustalone Ca2+ mierzono poprzez obciążenie komórek estrem fura-2-acetoksymetylowym (Fura-2 AM) przy częstotliwości próbkowania 250 Hz. Pomiary ratiometryczne Ca2+ 9 za pomocą hiperprzełącznika przeprowadzono na obszarze oświetlenia o średnicy 50 μm, odpowiadającym obszarowi pomiarów kurczliwości. Dane pomiarowe Ca2+ są przedstawione jako czas od 20% piku do szczytu w stanie nieustalonym Ca2+ (TP.Ca) oraz czas od szczytu do 80% linii bazowej (TB.Ca80) (Rysunek 1C). Wykorzystano szybkie, automatyczne narzędzie do analizy danych, aby uzyskać średnie parametry kinetyczne kurczliwości i wapnia dla każdego obszaru.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywek do hodowli komórkowych i odczynników

  1. Przygotuj pożywkę hiPSC-CM, dodając 1 ml suplementu B27 (50x) do 49 ml RPMI1640.
  2. Przygotować pożywkę do powlekania, dodając najpierw 5 ml substytucji surowicy nokautującej do 45 ml pożywki hiPSC-CM. Następnie dodać 22,5 μl inhibitora Y-27632 ROCK (rozcieńczenie 1:2 000; stężenie podstawowe: 10 mM) i dokładnie wymieszać.
  3. Przygotuj płyty pokryte membraną podstawową, jak opisano poniżej:
    1. Rozmrozić fiolkę z membraną podstawną przez noc w lodówce lub na pojemniku na lód.
    2. Rozcieńczyć błonę podstawną odpowiednią ilością zmodyfikowanego podłoża Eagle's Dulbecco/Ham's F12 (DMEM/F12). Ponieważ każda partia błony podstawnej ma inne stężenie, należy obliczyć ilość DMEM/F12 potrzebną do osiągnięcia rozcieńczenia 1 mg/1 ml. Przygotować 0,5 lub 1 ml porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Krok 1.3.2 należy wykonać na lodzie wewnątrz okapu przepływowego.
    3. Rozmrozić 0,5 ml podwielokrotności błony podstawnej i rozcieńczyć ją 6 ml DMEM/F12. Dokładnie wymieszaj.
    4. Pokryć płytkę, pipetując 250 μl rozcieńczonej membrany/studzienki podstawowej na płytce 24-dołkowej. Obliczenia na podstawie pola powierzchni każdego dołka dla różnych formatów płytek, na przykład 1 ml / dołek w płytce 6-dołkowej.
    5. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  4. Przygotować podwielokrotności Fura-2 AM przez rozpuszczenie Fura-2 AM w dimetylosulfotlenku (DMSO), zgodnie z instrukcją producenta dotyczącą przygotowania podwielokrotności 1 mM. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.

2. Hodowla hiPSC-CM

  1. Rozmrozić fiolkę z hiPSC-CM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść rozmrożoną zawartość fiolki do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 10 ml pożywki do powlekania kroplami do komórek.
  2. Odwirowywać komórki przez 5 minut w temperaturze 100 × g.
  3. Usunąć supernatant i dodać 1 ml pożywki do powlekania. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad i usunąć wszelkie grudki komórek.
  4. Użyj hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, aby policzyć liczbę komórek.
  5. Usunąć błonę podstawną z inkubowanej płytki i zastąpić ją podłożem do ponownego powlekania.
  6. Umieść komórki o odpowiedniej gęstości komórek na płytce 6/12/24/48/96-dołkowej pokrytej błoną podstawną (np. 250 000 komórek/studzienkę na płytce 24-dołkowej).
    UWAGA: W przypadku eksperymentów przejściowych Ca2+ umieść komórki na płytkach ze szklanym dnem.
  7. Następnego dnia zastąp pożywkę pożywką hodowlaną hiPSC-CM, a następnie odświeżaj pożywkę co drugi dzień, używając 0,5 ml/dołek w 24-dołkowej płytce.
  8. Pomiary kurczliwości należy wykonać, gdy hiPSC-CM odzyskają sprawność po rozmrożeniu i ponownym poszyciu (3-5 dni po ponownym poszyciu w tym protokole).
    UWAGA: W przypadku nierównomiernego ponownego posiewu komórek możliwe jest, że grupa komórek nie styka się z resztą ponownie posianych komórek i może wykazywać nieregularny lub niezsynchronizowany wzór bicia. Aby uniknąć asynchroniczności, zaleca się równomierny rozkład komórek i zsynchronizowaną, dobrze połączoną monowarstwę hiPSC-CM w każdym dołku.

3. Pomiary kurczliwości

  1. Włącz optyczny system pomiarowy, mikroskopowe źródło światła z diodą elektroluminescencyjną (LED) i komputer (patrz tabela materiałów).
  2. Otwórz program i otwórz nowy plik. W obszarze Plik w lewym górnym rogu ekranu kliknij przycisk Nowy.
  3. Kliknij Zbierz, wybierz Eksperymenty, a następnie wybierz "iPSC + Wapń".
  4. Włącz urządzenie sterujące klimatyzacją. Ustaw temperaturę na 37 °C, a poziom CO2 na 5%.
  5. Zastąp pożywkę hodowlaną hiPSC-CM roztworem Tyrode (0,5 ml/basenik w płytce 24-dołkowej). Zamień pokrywę płytki na pokrywę klimatyzacji.
    UWAGA: Jeśli konieczne jest wykonanie pomiarów stanów nieustalonych wapnia, załaduj ogniwa Fura-2 AM, jak opisano w sekcji 4.
  6. Umieść tabliczkę w optycznym układzie pomiarowym, gdy urządzenie sterujące klimatyzacją pokaże, że temperatura wynosi 37 °C.
    UWAGA: Skurcz jest mierzony w warunkach jasnego pola.
  7. Kliknij Otwórz wyszukiwarkę komórek pod paskiem narzędzi i poczekaj, aż pojawi się nowy ekran. W prawym górnym rogu ekranu wybierz format płyty i studzienkę.
  8. Wybierz jedną studzienkę, wybierz obszar w studni, aby obserwować zsynchronizowany skurcz i rozluźnienie, naciśnij start, kliknij Dodaj pomiar. Wybierz czas trwania pomiarów w ustawieniach (10 s na obszar). Natychmiast odrzuć asynchroniczne pomiary skurczu i wybierz nowy obszar.
    UWAGA: Na monitorze można zobaczyć stany przejściowe kurczliwości w czasie rzeczywistym. W przypadku zsynchronizowanych skurczów obserwuje się płynny ciągły stan przejściowy, podczas gdy w przypadku skurczów asynchronicznych obserwuje się małe dodatkowe szczyty.
  9. Zmierz wiele obszarów w studni w zależności od wielkości studni. Na przykład, aby postępować zgodnie z tym badaniem, zmierz 10 obszarów na studzienkę w 24-dołkowej płytce. W przypadku, gdy potrzebne są tylko pomiary podstawowe i nie ma planu badania jakiegokolwiek związku, kontynuuj od kroku 3.13.
  10. Po zmierzeniu obszarów w studni naciśnij przycisk Complete i otwórz przyrząd pomiarowy oparty na optyce, aby dodać stresor/związek do studni (np. 500 nM ISO, rozpuszczony w Tyrode).
  11. Wybierz czas inkubacji w zależności od interesującego nas związku (2 minuty z ISO w tym protokole).
  12. Kliknij pomiar automatyczny, aby umożliwić przyrządowi pomiarowemu opartemu na optyce wykonywanie pomiarów w tych samych obszarach, w których wykonano pomiary podstawowe, co skutkuje sparowanymi pomiarami w odwiercie.
  13. Naciśnij przycisk Zakończ, gdy wszystkie pomiary w studni zostaną wykonane.
  14. Wybierz następną studnię w prawym górnym rogu ekranu.
  15. Kontynuuj pomiary dla wszystkich wymaganych studzienek.
  16. Kliknij przycisk stop po zmierzeniu wszystkich wymaganych studzienek i zapisz plik.
    UWAGA: Klimatyzacja służy do utrzymania stabilnego poziomu emisji CO2 . Pozwala to na szybki pomiar wpływu związków/stresorów na hiPSC-CM.

4. Pomiary stanów przejściowych wapnia

  1. Przygotować roztwór tyrozu o temperaturze 37 °C.
  2. Rozpuścić podwielokrotności Fura-2 AM w roztworze Tyrode, tak aby końcowe stężenie 1 μM Fura-2 AM zostało dodane do komórek.
    UWAGA: Podczas korzystania z Fura-2 AM upewnij się, że światła w okapie przepływowym są wyłączone, aby zminimalizować ekspozycję na światło.
  3. Odessać pożywkę i zastąpić ją roztworem Tyrode zawierającym Fura-2 AM.
  4. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze lub w optycznym systemie pomiarowym.
  5. Usunąć roztwór Tyrode zawierający Fura-2 AM, a następnie przemyć 2x świeżym roztworem Tyrode. Na koniec inkubować komórki w roztworze Tyrode przez kolejne 5 minut w temperaturze 37 °C, aby umożliwić deestryfikację Fura-2 AM.
  6. Umieść płytkę w optycznym układzie pomiarowym i rozpocznij pomiary, jak opisano w rozdziale 3.
    UWAGA: W kroku 4.6. Rozpoczynając pomiary równocześnie z pomiarami skurczu, rejestruje się ratiometryczny stan przejściowy wapnia: wzbudzenie przy 340 nm i 385 nm w plamce 100 μm; emisja zebrana przy długości fali 510 ± 40 nm. Oprócz śladów kurczliwości na ekranie pojawią się ratiometryczne stany przejściowe wapnia w czasie rzeczywistym.

5. Analiza danych

  1. Aby przeanalizować dane, kliknij CytoSolver na pulpicie.
  2. Kliknij import i wybierz plik(i) do analizy.
  3. Po wykonaniu analizy przez program obserwuj akceptowane (niebieskie) i odrzucone (czerwone) stany nieustalone pojawiające się na ekranie (Rysunek 1A).
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano następujące domyślne kryteria tłumienia, zdefiniowane przez stosunek sygnału do szumu (SNR) i dobroć dopasowania (R2): R2 > 0,9 i SNR > 4 dla stanów przejściowych skurczu oraz R2 > 0,5 i SNR > 3 dla stanów przejściowych wapnia. Te kryteria odrzucenia mogą być dostosowywane przez użytkownika w zależności od jakości pomiarów, jakości komórek i pierwotnego wyniku dla badacza. Na przykład, jeśli zainteresowania badacza dotyczą głównie kinetyki relaksacji, kryteria dotyczące zmiennych czasu do osiągnięcia szczytu mogą zostać obniżone. W przypadku uzyskania bardzo silnych stanów przejściowych wapnia może być konieczne zwiększenie SNR, aby wykluczyć dane, które są bardziej hałaśliwe.
  4. Kliknij eksport i zaznacz średnie, przejściowe dane. Sprawdź przeanalizowane dane przedstawione w arkuszu kalkulacyjnym.
  5. Wyłącz komputer i wszystkie inne instrumenty.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z tym protokołem, przeprowadzono pomiary kurczliwości, stanów przejściowych Ca2+ i odpowiedzi na związek w hiPSC-CMs. Dzięki zastosowaniu tego systemu pomiarowego opartego na optyce, hiPSC-CM można było po prostu ponownie pokryć na wymaganych płytkach i przeprowadzić pomiary kurczliwości. Kurczliwość mierzy się w obszarze zainteresowania (ROI) o wymiarach 100 μm x 100 μm przy 250 klatkach na sekundę poprzez obliczenie korelacji pikseli względem klatki odniesienia. Układ odniesienia jest automatycznie wykrywany przez system przy końcu rozkurczu. Równocześnie z pomiarami skurczu rejestrowany jest ratiometryczny stan przejściowy wapnia.

W tym badaniu, trzy różne rundy różnicowania zostały użyte jako trzy biologiczne powtórzenia. Dla każdej partii różnicowania zmierzono trzy studzienki jako kontrpróby techniczne. Badanie to przeprowadzono przy użyciu 24-dołkowych płytek i zmierzono 10 obszarów w każdym dołku. Po pomiarach wykorzystano program CytoSolver do natychmiastowej analizy danych. Podano następujące parametry: spoczynkową częstotliwość dudnienia, TP. Wada i gruźlica. Con80 kontrolnych hiPSC-CM (Rysunek 2A-C). Aby zobrazować zmienność danych dla każdego z wymienionych parametrów, pomiary w każdym dołku oraz średnie wartości z trzech dołków dla każdej rundy różnicowania są prezentowane jako superwykresy10. Aby lepiej ocenić zmienność danych dla każdej rundy różnicowania i między trzema rundami, obliczono współczynnik wariancji (Rysunek 2D) dla każdego parametru. Jak pokazano na rysunku Rysunek 2D, wartości kontrprób technicznych odpowiadających jednej kontrpróbie biologicznej mieszczą się w bardzo bliskim zakresie (tj. niski współczynnik wariancji), co ilustruje solidność tej metody.

Ta aplikacja jest bardzo dobrze przystosowana do testowania efektów leku. Zbadano wpływ ISO 500 nM, nieselektywnego agonisty receptora β-adrenergicznego, na kurczliwość kontrolnych hiPSC-CM. Związek ten jest znany z tego, że zwiększa częstość akcji serca i wywiera pozytywny efekt lusytropowy. Jak pokazano w Rysunek 3A, ISO znacznie zwiększyło częstotliwość dudnienia we wszystkich studzienkach. ISO zwiększyło również kinetykę, co jest widoczne w spadku TP. Wada i gruźlica. Con80 (Rysunek 3B,C). Ogólnie rzecz biorąc, po inkubacji z ISO, częstotliwość dudnienia została znacznie zwiększona we wszystkich studzienkach, wraz ze skróceniem czasu skurczu i relaksacji, co wskazuje, że oczekiwana reakcja na ten związek została zarejestrowana przez tę platformę.

Równolegle do pomiarów kurczliwości, przeprowadzono również pomiary wapnia. W taki sam sposób, jak dane dotyczące kurczliwości (Rysunek 2), dane pomiarowe wapnia hiPSC-CMs są przedstawione w Rysunek 4. TB.Ca80 jest znacznie wolniejszy niż w izolowanych kardiomiocytach szczurów lub myszy, co częściowo tłumaczy różnice w gatunkach i częstości akcji serca11, a także niedojrzałe obchodzenie się z wapniem w hiPSC-CM z powodu niższej dynamiki wapnia w retikulum sarkoplazmatycznym i niższej ekspresji białek przetwarzających wapń w porównaniu z komórkami pierwotnymi12. Podobnie jak w przypadku danych dotyczących kurczliwości, obliczono współczynnik wariancji dla pomiarów wapnia, który wykazuje niską zmienność w obrębie kontrprób technicznych i biologicznych (Rysunek 4C).

figure-results-1
Rysunek 1: Natychmiastowe użycie narzędzia do analizy stanów nieustalonych CytoSolver po eksperymencie w celu analizy danych. (A) Przykład akceptowalnych stanów nieustalonych (wszystkie na niebiesko) dla jednego obszaru mierzonego w studni. Panel A1 przedstawia stany przejściowe kurczliwości. Panel A2 przedstawia stany nieustalone wapnia. (B) Średnia przejściowa kurczliwość uzyskana z pomiarów w trzech dołkach jednej rundy różnicowania. Z każdego pojedynczego lub średniego stanu nieustalonego dane z różnych punktów czasowych do wartości szczytowej (TP. Con) i czas do punktu odniesienia (TB. Con) kurczliwości przejściowej można wyodrębnić. Ponieważ nie zawsze można jednoznacznie określić dokładny początek skurczu, czas do osiągnięcia szczytu 20% przyjmuje się jako punkt wyjścia dla pomiarów czasu do szczytu. Podobnie trudny do oszacowania jest dokładny moment, w którym sygnał powraca do linii bazowej. Dlatego czas do linii bazowej 80% jest używany do opisania czasu relaksu. W tym przypadku TP. Con (czas do szczytu - czas do szczytu 20%) i TB. Stosuje się Con80 (czas do linii bazowej 80% - czas do szczytu). (C) Średnie dane dotyczące stanu przejściowego wapnia uzyskane z pomiarów w trzech studzienkach jednej rundy różnicowania. Z każdego pojedynczego lub średniego stanu przejściowego wapnia można uzyskać dane z różnych punktów czasowych czasu do osiągnięcia wartości szczytowej (TP.Ca) i czasu do wartości początkowej (TB.Ca) stanów przejściowych wapnia. W przypadku pomiarów czasu do wartości szczytowej punktem początkowym jest czas do osiągnięcia wartości szczytowej 20%, a punktem końcowym do linii bazowej 80%. W tym badaniu zastosowano TP.Ca (czas do szczytu - czas do szczytu 20%) i TB.Ca80 (czas do punktu odniesienia 80% - czas do szczytu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Podstawowe pomiary kurczliwości wykonane w trzech różnych rundach różnicowania. Trzy kontrpróby biologiczne i trzy dołki dla każdej rundy różnicowania (tj. trzy kontrpróby techniczne). Trzy główne symbole dla każdej rundy różnicowania reprezentują średnią wartość mierzonych obszarów (symbole tła w wyblakłych kolorach) w każdym dołku. Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM. Dane dotyczące spoczynkowej częstotliwości dudnień są reprezentowane w hercach, a dla TP. Wada i gruźlica. Con80, dane są w kilka sekund. (A) Spoczynkowa częstotliwość dudnienia. (B) Czas do osiągnięcia szczytu (TP. Przeciw). (C) Czas do osiągnięcia punktu bazowego 80% (TB. Przeciw80). (D) Aby ocenić zmienność między danymi uzyskanymi w każdej rundzie i między wszystkimi trzema rundami różnicowania, procentowy współczynnik wariancji obliczono przy użyciu średnich wartości każdego dołka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Pomiary kurczliwości na linii bazowej (-) i po inkubacji z ISO (+) na trzech dołkach z trzech rund różnicowania. (A) Spoczynkowa częstotliwość dudnienia (-) i częstotliwość dudnienia po inkubacji z 500 nM ISO (+). (B) Czas do osiągnięcia szczytu (TP. Con) pomiary na linii podstawowej i po inkubacji z ISO. (C) Czas do osiągnięcia punktu bazowego 80% (TB. Con80) pomiary na linii podstawowej i po inkubacji z ISO. W celu oceny wpływu ISO na parametry kurczliwości wykonano dwukierunkową korektę Anova z poprawką Bonferroniego. Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM. Dane dotyczące spoczynkowej częstotliwości dudnienia są reprezentowane w hercach i dla TP. Wada i gruźlica. Con80, dane są reprezentowane w ciągu kilku sekund. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Podstawowe pomiary przejściowe wapnia wykonane na trzech dołkach z trzech rund różnicowania. (A) Czas do osiągnięcia szczytu (TP.Ca) i (B) czas do osiągnięcia wartości wyjściowej 80% (TB.Ca80) stanów przejściowych wapnia. Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM. TP.Ca i TB.Ca80 danych są reprezentowane w sekundach. (C) Aby ocenić zmienność między danymi uzyskanymi w każdej rundzie i między wszystkimi trzema rundami różnicowania, współczynnik wariancji procentowej obliczono przy użyciu średniej wartości każdego odwiertu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu opisano metodę wykonywania pomiarów kurczliwości i przejściowych stanów wapnia na hiPSC-CM oraz badania wpływu stresorów/leków na te komórki. Pomiary kurczliwości, ratiometryczne pomiary wapnia i odpowiedź na ISO przeprowadzono w trzech różnych rundach różnicowania jako kontrpróby biologiczne. Dla każdej kontrpróby biologicznej przeprowadzono pomiary na trzech odwiertach jako kontrpróbach technicznych. Powodem przeprowadzenia pomiarów w ten sposób było zapewnienie możliwości oceny zmienności biologicznej i technicznej próbki i platformy. Oprócz uwzględnienia odpowiedniej liczby kontrprób biologicznych i technicznych, warunek hodowli hiPSC-CM może odegrać ważną rolę w osiąganiu stałych i wiarygodnych wyników. Ważne jest, aby zachować spójność z kryteriami, takimi jak wiek hiPSC-CM, skład pożywki, warunki ponownego powlekania i czas inkubacji związku podczas pomiarów. W tym badaniu pomiar 11 obszarów dwa razy przez 10 s w jednej studzience trwał średnio od 568 ± 24 s. Obejmuje to czas inkubacji ISO wynoszący 79 ± 11 s. Sprowadza się to do około 10 minut na dołek, co powinno umożliwić naukowcom zmierzenie pełnej 24-dołkowej płytki w ciągu ~4 godzin. Klimatyzacja służy do utrzymania stabilnego poziomu emisjiCO2. Pozwala to na szybki pomiar wpływu związków/stresorów na hiPSC-CM.

Aby zmierzyć funkcję skurczową iPSC-CM, istnieje kilka systemów opierających się na optogenetyce13 lub mikroskopii wideo bez znaczników 5,6. Systemy optogenetyczne są dość złożone i wymagają specjalnych technik w celu uzyskania danych elektrofizycznych i/lub kurczliwości. Inne systemy opierają się na analizie post-hoc filmów, która wymaga dużej ilości pamięci i brakuje bezpośredniej informacji zwrotnej podczas pozyskiwania wideo. Ponadto trudno jest osiągnąć wystarczającą rozdzielczość czasową i przestrzenną, co może skutkować niedostatecznym próbkowaniem. Podobnie, edytowane przez CRISPR/CAS-9 hiPSC-CM z fluorescencyjnymi reporterami7 mogą wprowadzać niepożądane skutki w zachowaniu kardiomiocytów. Stosowanie barwników fluorescencyjnych do pomiarów skurczu i relaksacji jest również eleganckim podejściem, ale ogranicza przeprowadzanie eksperymentów na tej samej próbce przez dłuższy okres czasu14.

Ta oparta na optyce platforma pomiarowa może być jednak wykorzystana do pomiaru czasów skurczu i relaksacji bez użycia barwnika fluorescencyjnego lub metod inwazyjnych. Ponieważ jednak korelacja pikseli nie dostarcza informacji przestrzennych, metoda ta nie może być stosowana do pomiaru siły skurczu, a jedynie może niezawodnie wykrywać zmiany prędkości skurczu i relaksacji. Wprowadzony system pomiarowy jest sterowany temperaturą i może pozyskiwać dane o wapniu i kurczliwości w czasie rzeczywistym z rozdzielczością >200 klatek na sekundę. Dodatkowo przechowywana jest lokalizacja każdego pomiaru, co umożliwia sparowanie pomiarów, zwiększając w ten sposób moc eksperymentów. Co więcej, platforma ta zapewnia badaczom możliwość przechowywania danych i analizowania ich natychmiast po eksperymencie. Ogólnie rzecz biorąc, ten oparty na optyce system pomiarowy okazuje się być obiecującą metodą badania patomechanizmów komórkowych, może oceniać wpływ związków na funkcjonalność hiPSC-CM i może być pomocny w procesie przedklinicznym badań przesiewowych leków.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EM jest pracownikiem firmy CytoCypher BV. MH jest dyrektorem generalnym CytoCypher BV. Pozostali autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Eurostars grant Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) oraz NWO-VICI grant 91818602 (JV).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mmibidi82421
B-27 Suplement (50x)Thermo Fisher17504044
CytoSolver narzędzie do analizy stanów nieustalonychCytoCypherSzybkie narzędzie do automatycznej analizy danych
DMEM/F-12Thermo Fisher11320033
Fura-2, AMThermo FisherF1221
Chlorowodorek izoprenalinyMerck15627
KnockOut™ Zamiennik surowicyThermo Fisher10828010
MatrigelMerckCLS3542CMembrana podstawna
MultiCell CytoCypher z obiektywem Nikon 20x Super Fluor i źródłem światła LED 730 nm oraz oprogramowaniem IonwizardSystempomiarowy oparty na optyce
ROCK inhibitor Y-27632Tocris1254
RPMI 1640Thermo Fisher
TyrodeSamodzielnie przygotowany roztwór o końcowym stężeniu następujących składników: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1,2 mM, NaH2PO4 H2O 1,2 mM, Glukoza 11 mM, Pirowanian sodu 5 mM, 1 mM CaCl2
11875119

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153(2022).
  2. Ghionzoli, N., et al. Current and emerging drug targets in heart failure treatment. Heart Failure Reviews. 27 (4), 1119-1136 (2022).
  3. Criscione, J., et al. Heart-on-a-chip platforms and biosensor integration for disease modeling and phenotypic drug screening. Biosensors and Bioelectronics. 220, 114840(2023).
  4. vander Velden, J., et al. Animal models and animal-free innovations for cardiovascular research: current status and routes to be explored. Consensus document of the ESC Working Group on Myocardial Function and the ESC Working Group on Cellular Biology of the Heart. Cardiovascular Research. 118 (15), 3016-3051 (2022).
  5. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Reports. 4 (4), 621-631 (2015).
  6. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
  7. Sharma, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated fluorescent tagging of endogenous proteins in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 96 (1), 1-20 (2018).
  8. Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
  9. Luo, X., et al. IP3R-mediated compensatory mechanism for calcium handling in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with cardiac ryanodine receptor deficiency. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 772(2020).
  10. Lord, S. J., Velle, K. B., Mullins, R. D., Fritz-Laylin, L. K. SuperPlots: communicating reproducibility and variability in cell biology. The Journal of Cellular Biology. 219 (6), e202001064(2020).
  11. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  12. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  13. Klimas, A., Ortiz, G., Boggess, S. C., Miller, E. W., Entcheva, E. Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 62-70 (2020).
  14. van Meer, B. J., et al. Simultaneous measurement of excitation-contraction coupling parameters identifies mechanisms underlying contractile responses of hiPSC-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 10 (1), 4325(2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
Posted by JoVE Editors on 12/13/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. The Authors section was updated from:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

to:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn C. Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

Tagi

Pomiary wapniaindukowane pluripotencjalne kom rki macierzystefunkcja kardiomiocyt wwewn trzkom rkowe przej ciowe st enia wapniakinetyka kurczliwo ciratiometryczny pomiar wapniaprzedkliniczne przesiewy lek wkorelacja pikseli

Powiązane artykuły