Artykuł metodologiczny

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65326

⸱

26 maja 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University, 2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3CytoCypher BV, 4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Streszczenie

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią potężne narzędzie do badania zmian w funkcjonowaniu kardiomiocytów za pośrednictwem mutacji i definiowania skutków stresorów i interwencji lekowych. W tym badaniu wykazano, że ten system oparty na optyce jest potężnym narzędziem do oceny parametrów funkcjonalnych hiPSC-CM w 2D. Korzystając z tej platformy, możliwe jest wykonywanie sparowanych pomiarów w dobrze zachowanym środowisku temperaturowym na różnych układach płyt. Co więcej, system ten zapewnia badaczom natychmiastową analizę danych.

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru kurczliwości niezmodyfikowanych hiPSC-CMs. Kinetykę skurczu mierzy się w temperaturze 37 °C na podstawie zmian korelacji pikseli względem układu odniesienia przyjętego w momencie relaksacji przy częstotliwości próbkowania 250 Hz. Dodatkowo, jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia można uzyskać, ładując komórkę wrażliwym na wapń fluoroforem, takim jak Fura-2. Za pomocą hiperprzełącznika można wykonać ratiometryczne pomiary wapnia na plamce oświetleniowej o średnicy 50 μm, odpowiadającej obszarowi pomiarów kurczliwości.

Wprowadzenie

Niewydolność serca jest główną przyczyną zgonów na całym świecie. W 2019 r. choroby układu krążenia spowodowały 18,6 miliona zgonów na całym świecie, co odzwierciedla wzrost o 17,1% w ciągu ostatniej dekady1. Pomimo wysiłków naukowców zmierzających do zidentyfikowania celów leków zapobiegających i leczących niewydolność serca, wyniki leczenia pacjentów są nadal słabe2. Różnica w patofizjologii modeli zwierzęcych w stosunku do ludzi może być jednym z czynników leżących u podstaw ograniczonego sukcesu optymalizacji terapii niewydolności serca3. Dodatkowe modele podobne do ludzkich są uzasadnione do modelowania choroby oraz testowania toksyczności i skuteczności nowych związków leczniczych.

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią potężne narzędzie do definiowania komórkowych patomechanizmów indukowanych przez stresory, niedokrwienie, zmieniony metabolizm lub patogenne warianty genów, a także skuteczność i toksyczność interwencji lekowych4. Aby określić wpływ na właściwości funkcjonalne hiPSC-CM, uzasadniony jest szybki system, który mierzy skurczowe i rozkurczowe właściwości skurczów komórkowych w sposób bezstronny i powtarzalny. Ogólnym celem obecnego badania jest wykazanie, że system oparty na optyce jest potężnym narzędziem do przeprowadzania analiz parametrów funkcjonalnych hiPSC-CM w czasie rzeczywistym.

Obecnie istnieje wiele platform do oceny kurczliwości hiPSC-CMs. Jednak obecne systemy albo oferują powolny odczyt, albo wymagana liczba komórek może być wyzwaniem. Systemy pomiaru wideo bez etykiet5,6 opierają się na analizie post-hoc filmów, co wymaga dużej ilości pamięci i nie zapewnia bezpośredniego sprzężenia zwrotnego podczas pozyskiwania wideo. Ponadto trudno jest osiągnąć wystarczającą rozdzielczość czasową i przestrzenną, co może prowadzić do niedostatecznego próbkowania. Inne metody określania właściwości kardiomiocytów, takie jak zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/edytowane przez Cas9 hiPSC-CMs7 z fluorescencyjnymi reporterami, mogą zakłócać stabilność genów komórek i wymagać specjalistycznej wiedzy laboratoryjnej.

Aby przezwyciężyć powyższe ograniczenia, opracowano i wprowadzono unikalny system pomiarowy oparty na optyce. Platforma ta umożliwia pomiary kurczliwości na niezmodyfikowanych hiPSC-CM poprzez proste ponowne powlekanie ich na dowolnym wymaganym formacie płyty, bez żadnych ograniczeń co do rozmiaru płytki. Co więcej, pomiary w czasie rzeczywistym umożliwiają bezpośrednią obserwację i analizę parametrów funkcjonalnych hiPSC-CM, a tym samym zapewniają warunki eksperymentalne do natychmiastowego dostosowania i optymalizacji protokołów. Co więcej, lokalizacja każdego pomiaru jest przechowywana, co umożliwia sparowane pomiary na tej samej próbce, zwiększając w ten sposób moc eksperymentów.

Aby zademonstrować system oparty na optyce, przeprowadzono pomiary kurczliwości na linii kontrolnej hiPSC-CM. Ta kontrolna linia hiPSC została wygenerowana z fibroblastów skórnych zdrowego dawcy płci męskiej z prawidłowym kariotypem8. Kinetykę skurczu zmierzono w temperaturze 37 °C, w oparciu o zmiany korelacji pikseli w stosunku do układu odniesienia wykonanego podczas relaksacji przy częstotliwości próbkowania 250 Hz. Ponieważ dokładny początek skurczu nie zawsze może być jednoznacznie określony, punkt czasowy, w którym osiągnięto 20% wysokości piku (czas do szczytu 20%) został przyjęty jako punkt wyjścia dla pomiarów czasu do szczytu. W ten sposób stwierdzono mniejszą zmienność dla tego parametru w obrębie jednej próby. Podobnie, ponieważ dokładny moment, w którym sygnał powraca do linii bazowej, jest trudny do oszacowania, czas potrzebny do osiągnięcia 80% powrotu do linii podstawowej od wartości szczytowej (czas do linii bazowej 80%) został wykorzystany do opisania czasu relaksacji.

Ogólne pomiary kurczliwości obejmowały spoczynkowe częstotliwości dudnienia, czas od 20% szczytu do szczytowego skurczu (TP. Con) oraz czas od szczytowego skurczu do 80% wartości wyjściowej (TB. Con80) (Rysunek 1B). Aby przetestować działanie stresora, komórki inkubowano z izoprenaliną (ISO). Ponadto, równolegle z pomiarami kurczliwości, stany nieustalone Ca2+ mierzono poprzez obciążenie komórek estrem fura-2-acetoksymetylowym (Fura-2 AM) przy częstotliwości próbkowania 250 Hz. Pomiary ratiometryczne Ca2+ 9 za pomocą hiperprzełącznika przeprowadzono na obszarze oświetlenia o średnicy 50 μm, odpowiadającym obszarowi pomiarów kurczliwości. Dane pomiarowe Ca2+ są przedstawione jako czas od 20% piku do szczytu w stanie nieustalonym Ca2+ (TP.Ca) oraz czas od szczytu do 80% linii bazowej (TB.Ca80) (Rysunek 1C). Wykorzystano szybkie, automatyczne narzędzie do analizy danych, aby uzyskać średnie parametry kinetyczne kurczliwości i wapnia dla każdego obszaru.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek do hodowli komórkowych i odczynników

  1. Przygotuj pożywkę hiPSC-CM, dodając 1 ml suplementu B27 (50x) do 49 ml RPMI1640.
  2. Przygotować pożywkę do powlekania, dodając najpierw 5 ml substytucji surowicy nokautującej do 45 ml pożywki hiPSC-CM. Następnie dodać 22,5 μl inhibitora Y-27632 ROCK (rozcieńczenie 1:2 000; stężenie podstawowe: 10 mM) i dokładnie wymieszać.
  3. Przygotuj płyty pokryte membraną podstawową, jak opisano poniżej:
    1. Rozmrozić fiolkę z membraną podstawną przez noc w lodówce lub na pojemniku na lód.
    2. Rozcieńczyć błonę podstawną odpowiednią ilością zmodyfikowanego podłoża Eagle's Dulbecco/Ham's F12 (DMEM/F12). Ponieważ każda partia błony podstawnej ma inne stężenie, należy obliczyć ilość DMEM/F12 potrzebną do osiągnięcia rozcieńczenia 1 mg/1 ml. Przygotować 0,5 lub 1 ml porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Krok 1.3.2 należy wykonać na lodzie wewnątrz okapu przepływowego.
    3. Rozmrozić 0,5 ml podwielokrotności błony podstawnej i rozcieńczyć ją 6 ml DMEM/F12. Dokładnie wymieszaj.
    4. Pokryć płytkę, pipetując 250 μl rozcieńczonej membrany/studzienki podstawowej na płytce 24-dołkowej. Obliczenia na podstawie pola powierzchni każdego dołka dla różnych formatów płytek, na przykład 1 ml / dołek w płytce 6-dołkowej.
    5. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  4. Przygotować podwielokrotności Fura-2 AM przez rozpuszczenie Fura-2 AM w dimetylosulfotlenku (DMSO), zgodnie z instrukcją producenta dotyczącą przygotowania podwielokrotności 1 mM. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.

2. Hodowla hiPSC-CM

  1. Rozmrozić fiolkę z hiPSC-CM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść rozmrożoną zawartość fiolki do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 10 ml pożywki do powlekania kroplami do komórek.
  2. Odwirowywać komórki przez 5 minut w temperaturze 100 × g.
  3. Usunąć supernatant i dodać 1 ml pożywki do powlekania. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad i usunąć wszelkie grudki komórek.
  4. Użyj hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, aby policzyć liczbę komórek.
  5. Usunąć błonę podstawną z inkubowanej płytki i zastąpić ją podłożem do ponownego powlekania.
  6. Umieść komórki o odpowiedniej gęstości komórek na płytce 6/12/24/48/96-dołkowej pokrytej błoną podstawną (np. 250 000 komórek/studzienkę na płytce 24-dołkowej).
    UWAGA: W przypadku eksperymentów przejściowych Ca2+ umieść komórki na płytkach ze szklanym dnem.
  7. Następnego dnia zastąp pożywkę pożywką hodowlaną hiPSC-CM, a następnie odświeżaj pożywkę co drugi dzień, używając 0,5 ml/dołek w 24-dołkowej płytce.
  8. Pomiary kurczliwości należy wykonać, gdy hiPSC-CM odzyskają sprawność po rozmrożeniu i ponownym poszyciu (3-5 dni po ponownym poszyciu w tym protokole).
    UWAGA: W przypadku nierównomiernego ponownego posiewu komórek możliwe jest, że grupa komórek nie styka się z resztą ponownie posianych komórek i może wykazywać nieregularny lub niezsynchronizowany wzór bicia. Aby uniknąć asynchroniczności, zaleca się równomierny rozkład komórek i zsynchronizowaną, dobrze połączoną monowarstwę hiPSC-CM w każdym dołku.

3. Pomiary kurczliwości

  1. Włącz optyczny system pomiarowy, mikroskopowe źródło światła z diodą elektroluminescencyjną (LED) i komputer (patrz tabela materiałów).
  2. Otwórz program i otwórz nowy plik. W obszarze Plik w lewym górnym rogu ekranu kliknij przycisk Nowy.
  3. Kliknij Zbierz, wybierz Eksperymenty, a następnie wybierz "iPSC + Wapń".
  4. Włącz urządzenie sterujące klimatyzacją. Ustaw temperaturę na 37 °C, a poziom CO2 na 5%.
  5. Zastąp pożywkę hodowlaną hiPSC-CM roztworem Tyrode (0,5 ml/basenik w płytce 24-dołkowej). Zamień pokrywę płytki na pokrywę klimatyzacji.
    UWAGA: Jeśli konieczne jest wykonanie pomiarów stanów nieustalonych wapnia, załaduj ogniwa Fura-2 AM, jak opisano w sekcji 4.
  6. Umieść tabliczkę w optycznym układzie pomiarowym, gdy urządzenie sterujące klimatyzacją pokaże, że temperatura wynosi 37 °C.
    UWAGA: Skurcz jest mierzony w warunkach jasnego pola.
  7. Kliknij Otwórz wyszukiwarkę komórek pod paskiem narzędzi i poczekaj, aż pojawi się nowy ekran. W prawym górnym rogu ekranu wybierz format płyty i studzienkę.
  8. Wybierz jedną studzienkę, wybierz obszar w studni, aby obserwować zsynchronizowany skurcz i rozluźnienie, naciśnij start, kliknij Dodaj pomiar. Wybierz czas trwania pomiarów w ustawieniach (10 s na obszar). Natychmiast odrzuć asynchroniczne pomiary skurczu i wybierz nowy obszar.
    UWAGA: Na monitorze można zobaczyć stany przejściowe kurczliwości w czasie rzeczywistym. W przypadku zsynchronizowanych skurczów obserwuje się płynny ciągły stan przejściowy, podczas gdy w przypadku skurczów asynchronicznych obserwuje się małe dodatkowe szczyty.
  9. Zmierz wiele obszarów w studni w zależności od wielkości studni. Na przykład, aby postępować zgodnie z tym badaniem, zmierz 10 obszarów na studzienkę w 24-dołkowej płytce. W przypadku, gdy potrzebne są tylko pomiary podstawowe i nie ma planu badania jakiegokolwiek związku, kontynuuj od kroku 3.13.
  10. Po zmierzeniu obszarów w studni naciśnij przycisk Complete i otwórz przyrząd pomiarowy oparty na optyce, aby dodać stresor/związek do studni (np. 500 nM ISO, rozpuszczony w Tyrode).
  11. Wybierz czas inkubacji w zależności od interesującego nas związku (2 minuty z ISO w tym protokole).
  12. Kliknij pomiar automatyczny, aby umożliwić przyrządowi pomiarowemu opartemu na optyce wykonywanie pomiarów w tych samych obszarach, w których wykonano pomiary podstawowe, co skutkuje sparowanymi pomiarami w odwiercie.
  13. Naciśnij przycisk Zakończ, gdy wszystkie pomiary w studni zostaną wykonane.
  14. Wybierz następną studnię w prawym górnym rogu ekranu.
  15. Kontynuuj pomiary dla wszystkich wymaganych studzienek.
  16. Kliknij przycisk stop po zmierzeniu wszystkich wymaganych studzienek i zapisz plik.
    UWAGA: Klimatyzacja służy do utrzymania stabilnego poziomu emisji CO2 . Pozwala to na szybki pomiar wpływu związków/stresorów na hiPSC-CM.

4. Pomiary stanów przejściowych wapnia

  1. Przygotować roztwór tyrozu o temperaturze 37 °C.
  2. Rozpuścić podwielokrotności Fura-2 AM w roztworze Tyrode, tak aby końcowe stężenie 1 μM Fura-2 AM zostało dodane do komórek.
    UWAGA: Podczas korzystania z Fura-2 AM upewnij się, że światła w okapie przepływowym są wyłączone, aby zminimalizować ekspozycję na światło.
  3. Odessać pożywkę i zastąpić ją roztworem Tyrode zawierającym Fura-2 AM.
  4. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze lub w optycznym systemie pomiarowym.
  5. Usunąć roztwór Tyrode zawierający Fura-2 AM, a następnie przemyć 2x świeżym roztworem Tyrode. Na koniec inkubować komórki w roztworze Tyrode przez kolejne 5 minut w temperaturze 37 °C, aby umożliwić deestryfikację Fura-2 AM.
  6. Umieść płytkę w optycznym układzie pomiarowym i rozpocznij pomiary, jak opisano w rozdziale 3.
    UWAGA: W kroku 4.6. Rozpoczynając pomiary równocześnie z pomiarami skurczu, rejestruje się ratiometryczny stan przejściowy wapnia: wzbudzenie przy 340 nm i 385 nm w plamce 100 μm; emisja zebrana przy długości fali 510 ± 40 nm. Oprócz śladów kurczliwości na ekranie pojawią się ratiometryczne stany przejściowe wapnia w czasie rzeczywistym.

5. Analiza danych

  1. Aby przeanalizować dane, kliknij CytoSolver na pulpicie.
  2. Kliknij import i wybierz plik(i) do analizy.
  3. Po wykonaniu analizy przez program obserwuj akceptowane (niebieskie) i odrzucone (czerwone) stany nieustalone pojawiające się na ekranie (Rysunek 1A).
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano następujące domyślne kryteria tłumienia, zdefiniowane przez stosunek sygnału do szumu (SNR) i dobroć dopasowania (R2): R2 > 0,9 i SNR > 4 dla stanów przejściowych skurczu oraz R2 > 0,5 i SNR > 3 dla stanów przejściowych wapnia. Te kryteria odrzucenia mogą być dostosowywane przez użytkownika w zależności od jakości pomiarów, jakości komórek i pierwotnego wyniku dla badacza. Na przykład, jeśli zainteresowania badacza dotyczą głównie kinetyki relaksacji, kryteria dotyczące zmiennych czasu do osiągnięcia szczytu mogą zostać obniżone. W przypadku uzyskania bardzo silnych stanów przejściowych wapnia może być konieczne zwiększenie SNR, aby wykluczyć dane, które są bardziej hałaśliwe.
  4. Kliknij eksport i zaznacz średnie, przejściowe dane. Sprawdź przeanalizowane dane przedstawione w arkuszu kalkulacyjnym.
  5. Wyłącz komputer i wszystkie inne instrumenty.

Wyniki

Zgodnie z niniejszym protokołem przeprowadzono pomiary kurczliwości, przejściowych zmian poziomu Ca2+ oraz odpowiedzi na związek w kardiomiocytach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CMs). Dzięki zastosowaniu tego systemu pomiarowego opartego na optyce, komórki hiPSC-CMs można było po prostu ponownie wysiać na odpowiednie płytki i przeprowadzić pomiary kurczliwości. Kurczliwość mierzono w obszarze zainteresowania (ROI) o wymiarach 100 µm x 100 µm przy 250 klatkach na sekundę, obliczając korelację pikseli względem klatki referencyjnej. Klatka referencyjna jest automatycznie wykrywana przez system w końcowej fazie rozkurczu. Równocześnie z pomiarami skurczu rejestrowano ratiometryczny pomiar przejściowego stężenia wapnia.

W niniejszym badaniu trzy różne serie różnicowania zostały wykorzystane jako trzy powtórzenia biologiczne. Dla każdej serii różnicowania zmierzono trzy studzienki jako powtórzenia techniczne. Badanie przeprowadzono przy użyciu płytek 24-dołkowych, mierząc 10 obszarów w każdej studzience. Po wykonaniu pomiarów dane poddano natychmiastowej analizie za pomocą programu CytoSolver. Przedstawiono następujące parametry: spoczynkową częstotliwość skurczów, TP.Con oraz TB.Con80 dla kontrolnych hiPSC-CMs (Rycina 2A-C). Aby zwizualizować zmienność danych dla każdego wymienionego parametru, pomiary w obrębie każdej studzienki oraz wartości średnie z trzech studzienek dla każdej serii różnicowania przedstawiono w formie superplotów10. W celu lepszej oceny zmienności danych dla każdej serii różnicowania oraz pomiędzy trzema seriami obliczono współczynnik zmienności (Rycina 2D) dla każdego parametru. Jak pokazano na Rycynie 2D, wartości powtórzeń technicznych odpowiadających jednemu powtórzeniu biologicznemu mieszczą się w bardzo zbliżonym zakresie (tj. niski współczynnik zmienności), co ilustruje powtarzalność tej metody.

Ta aplikacja jest bardzo dobrze dostosowana do testowania działania leków. W tym przypadku przetestowano wpływ 500 nM ISO, nieselektywnego agonisty receptorów β-adrenergicznych, na kurczliwość kontrolnych hiPSC-CMs. Znane jest, że związek ten zwiększa częstotliwość pracy serca i wywiera pozytywny efekt lusitropowy. Jak przedstawiono na Rysunku 3A, ISO znacząco zwiększyło częstotliwość bicia we wszystkich studzienkach. ISO zwiększyło również kinetykę, co objawiło się spadkiem TP.Con oraz TB.Con80 (Rysunek 3B,C). Podsumowując, po inkubacji z ISO częstotliwość bicia uległa znacznemu zwiększeniu we wszystkich studzienkach, przy jednoczesnym skróceniu czasu skurczu i rozkurczu, co wskazuje, że platforma ta zarejestrowała oczekiwaną odpowiedź na ten związek.

Równolegle do pomiarów kurczliwości przeprowadzono również pomiary poziomu wapnia. W ten sam sposób, jak w przypadku danych dotyczących kurczliwości (Rysunek 2), dane z pomiarów wapnia w hiPSC-CMs przedstawiono na Rysunku 4. Wskaźnik TB.Ca80 jest znacznie wolniejszy niż w izolowanych kardiomiocytach szczura lub myszy, co częściowo wynika z różnic międzygatunkowych i różnic w częstości akcji serca11, a także z niedojrzałości mechanizmów gospodarki wapniowej w hiPSC-CMs ze względu na niższą dynamikę wapnia wewnątrz siateczki sarkoplazmatycznej i niższą ekspresję białek odpowiedzialnych za gospodarkę wapniową w porównaniu z komórkami pierwotnymi12. Podobnie jak dla danych dotyczących kurczliwości, obliczono współczynnik zmienności dla pomiarów wapnia, który wskazuje na niską zmienność pomiędzy powtórzeniami technicznymi i biologicznymi (Rysunek 4C).

Analiza widm absorpcji przejściowej; wykres pomiaru wzbudzenia optycznego; wyniki dopasowania danych.
Rysunek 1: Natychmiastowe użycie narzędzia do analizy przejściowej CytoSolver po eksperymencie w celu analizy danych. (A) Przykład zaakceptowanych przejściowych sygnałów (wszystkie na niebiesko) z jednego obszaru mierzonego wewnątrz studni. Panel A1 przedstawia sygnały skurczowe. Panel A2 przedstawia sygnały wapniowe. (B) Średni sygnał przejściowy kurczliwości uzyskany z pomiarów w trzech studniach z jednej serii różnicowania. Z każdego pojedynczego lub średniego sygnału można było wyodrębnić dane z różnych punktów czasowych czasu do szczytu (TP.Con) i czasu do linii bazowej (TB.Con) sygnału kurczliwości. Ponieważ dokładnego początku skurczu nie zawsze można jednoznacznie określić, za punkt wyjścia dla pomiarów czasu do szczytu przyjmuje się czas do 20% szczytu. Podobnie trudno jest ocenić dokładny moment, w którym sygnał powraca do linii bazowej. Dlatego czas do 80% linii bazowej jest używany do opisu czasu relaksacji. Tutaj zastosowano TP.Con (czas do szczytu - czas do 20% szczytu) oraz TB.Con80 (czas do 80% linii bazowej - czas do szczytu). (C) Średnie dane sygnału przejściowego wapnia uzyskane z pomiarów w trzech studniach z jednej serii różnicowania. Z każdego pojedynczego lub średniego sygnału wapniowego można było wyodrębnić dane z różnych punktów czasowych czasu do szczytu (TP.Ca) i czasu do linii bazowej (TB.Ca) sygnałów wapniowych. Dla pomiarów czasu do szczytu punktem wyjścia jest czas do 20% szczytu, a dla czasu do linii bazowej punktem końcowym jest czas do 80% linii bazowej. W niniejszym badaniu zastosowano TP.Ca(czas do szczytu - czas do 20% szczytu) oraz TB.Ca80 (czas do 80% linii bazowej - czas do szczytu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza częstotliwości skurczów i współczynnika zmienności; wykresy rozrzutu i wizualizacja danych.
Rycina 2: Pomiary podstawowej kurczliwości wykonane w trzech różnych cyklach różnicowania. Trzy powtórzenia biologiczne i trzy dołki dla każdego cyklu różnicowania (tj. trzy powtórzenia techniczne). Trzy główne symbole dla każdego cyklu różnicowania reprezentują średnią wartość zmierzonych obszarów (symbole w tle w wyblakłych kolorach) w obrębie każdego dołka. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Dane dotyczące spoczynkowej częstotliwości skurczów przedstawiono w hercach, a dla TP.Con i TB.Con80 dane podano w sekundach. (A) Spoczynkowa częstotliwość skurczów. (B) Czas do szczytu (TP.Con). (C) Czas do powrotu do poziomu bazowego 80% (TB.Con80). (D) Aby ocenić zmienność między danymi uzyskanymi w każdym cyklu oraz pomiędzy wszystkimi trzema cyklami różnicowania, obliczono procentowy współczynnik zmienności, korzystając ze średnich wartości dla każdego dołka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Częstotliwość bicia, TP.Con, analiza TB.Con80 z ISO, statystyczny wykres słupkowy przedstawiający porównanie danych.
Rysunek 3: Pomiary kurczliwości w stanie spoczynku (-) oraz po inkubacji z ISO (+) w trzech studniach z trzech serii różnicowania. (A) Częstotliwość bicia w spoczynku (-) oraz częstotliwość bicia po inkubacji z 500 nM ISO (+). (B) Pomiary czasu do szczytu (TP.Con) w stanie spoczynku i po inkubacji z ISO. (C) Pomiary czasu do 80% linii bazowej (TB.Con80) w stanie spoczynku i po inkubacji z ISO. Aby ocenić wpływ ISO na parametry kurczliwości, przeprowadzono dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z korektą Bonferroniego. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Dane dotyczące częstotliwości bicia w spoczynku podano w hercach, a dla TP.Con i TB.Con80 dane podano w sekundach. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Wykres analizy porównawczej; dane TP.Ca, TB.Ca₈₀; współczynniki wariancji, trendy statystyczne.
Rysunek 4: Pomiary bazowe przejściowych stężeń wapnia wykonane w trzech studzienkach z trzech serii różnicowania. (A) Czas do szczytu (TP.Ca) oraz (B) czas do powrotu do 80% poziomu bazowego (TB.Ca80) przejściowych stężeń wapnia. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Dane TP.Ca i TB.Ca80 podano w sekundach. (C) Aby ocenić zmienność między danymi uzyskanymi w każdej serii a wszystkimi trzema seriami różnicowania, obliczono procentowy współczynnik wariancji, korzystając z wartości średniej dla każdej studzienki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym badaniu opisano metodę wykonywania pomiarów kurczliwości i przejściowych stanów wapnia na hiPSC-CM oraz badania wpływu stresorów/leków na te komórki. Pomiary kurczliwości, ratiometryczne pomiary wapnia i odpowiedź na ISO przeprowadzono w trzech różnych rundach różnicowania jako kontrpróby biologiczne. Dla każdej kontrpróby biologicznej przeprowadzono pomiary na trzech odwiertach jako kontrpróbach technicznych. Powodem przeprowadzenia pomiarów w ten sposób było zapewnienie możliwości oceny zmienności biologicznej i technicznej próbki i platformy. Oprócz uwzględnienia odpowiedniej liczby kontrprób biologicznych i technicznych, warunek hodowli hiPSC-CM może odegrać ważną rolę w osiąganiu stałych i wiarygodnych wyników. Ważne jest, aby zachować spójność z kryteriami, takimi jak wiek hiPSC-CM, skład pożywki, warunki ponownego powlekania i czas inkubacji związku podczas pomiarów. W tym badaniu pomiar 11 obszarów dwa razy przez 10 s w jednej studzience trwał średnio od 568 ± 24 s. Obejmuje to czas inkubacji ISO wynoszący 79 ± 11 s. Sprowadza się to do około 10 minut na dołek, co powinno umożliwić naukowcom zmierzenie pełnej 24-dołkowej płytki w ciągu ~4 godzin. Klimatyzacja służy do utrzymania stabilnego poziomu emisjiCO2. Pozwala to na szybki pomiar wpływu związków/stresorów na hiPSC-CM.

Aby zmierzyć funkcję skurczową iPSC-CM, istnieje kilka systemów opierających się na optogenetyce13 lub mikroskopii wideo bez znaczników 5,6. Systemy optogenetyczne są dość złożone i wymagają specjalnych technik w celu uzyskania danych elektrofizycznych i/lub kurczliwości. Inne systemy opierają się na analizie post-hoc filmów, która wymaga dużej ilości pamięci i brakuje bezpośredniej informacji zwrotnej podczas pozyskiwania wideo. Ponadto trudno jest osiągnąć wystarczającą rozdzielczość czasową i przestrzenną, co może skutkować niedostatecznym próbkowaniem. Podobnie, edytowane przez CRISPR/CAS-9 hiPSC-CM z fluorescencyjnymi reporterami7 mogą wprowadzać niepożądane skutki w zachowaniu kardiomiocytów. Stosowanie barwników fluorescencyjnych do pomiarów skurczu i relaksacji jest również eleganckim podejściem, ale ogranicza przeprowadzanie eksperymentów na tej samej próbce przez dłuższy okres czasu14.

Ta oparta na optyce platforma pomiarowa może być jednak wykorzystana do pomiaru czasów skurczu i relaksacji bez użycia barwnika fluorescencyjnego lub metod inwazyjnych. Ponieważ jednak korelacja pikseli nie dostarcza informacji przestrzennych, metoda ta nie może być stosowana do pomiaru siły skurczu, a jedynie może niezawodnie wykrywać zmiany prędkości skurczu i relaksacji. Wprowadzony system pomiarowy jest sterowany temperaturą i może pozyskiwać dane o wapniu i kurczliwości w czasie rzeczywistym z rozdzielczością >200 klatek na sekundę. Dodatkowo przechowywana jest lokalizacja każdego pomiaru, co umożliwia sparowanie pomiarów, zwiększając w ten sposób moc eksperymentów. Co więcej, platforma ta zapewnia badaczom możliwość przechowywania danych i analizowania ich natychmiast po eksperymencie. Ogólnie rzecz biorąc, ten oparty na optyce system pomiarowy okazuje się być obiecującą metodą badania patomechanizmów komórkowych, może oceniać wpływ związków na funkcjonalność hiPSC-CM i może być pomocny w procesie przedklinicznym badań przesiewowych leków.

Oświadczenia

EM jest pracownikiem firmy CytoCypher BV. MH jest dyrektorem generalnym CytoCypher BV. Pozostali autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Eurostars grant Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) oraz NWO-VICI grant 91818602 (JV).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mmibidi82421
B-27 Suplement (50x)Thermo Fisher17504044
CytoSolver narzędzie do analizy stanów nieustalonychCytoCypherSzybkie narzędzie do automatycznej analizy danych
DMEM/F-12Thermo Fisher11320033
Fura-2, AMThermo FisherF1221
Chlorowodorek izoprenalinyMerck15627
KnockOut™ Zamiennik surowicyThermo Fisher10828010
MatrigelMerckCLS3542CMembrana podstawna
MultiCell CytoCypher z obiektywem Nikon 20x Super Fluor i źródłem światła LED 730 nm oraz oprogramowaniem IonwizardSystempomiarowy oparty na optyce
ROCK inhibitor Y-27632Tocris1254
RPMI 1640Thermo Fisher
TyrodeSamodzielnie przygotowany roztwór o końcowym stężeniu następujących składników: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1,2 mM, NaH2PO4 H2O 1,2 mM, Glukoza 11 mM, Pirowanian sodu 5 mM, 1 mM CaCl2
11875119

Bibliografia

  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153(2022).
  2. Ghionzoli, N., et al. Current and emerging drug targets in heart failure treatment. Heart Failure Reviews. 27 (4), 1119-1136 (2022).
  3. Criscione, J., et al. Heart-on-a-chip platforms and biosensor integration for disease modeling and phenotypic drug screening. Biosensors and Bioelectronics. 220, 114840(2023).
  4. vander Velden, J., et al. Animal models and animal-free innovations for cardiovascular research: current status and routes to be explored. Consensus document of the ESC Working Group on Myocardial Function and the ESC Working Group on Cellular Biology of the Heart. Cardiovascular Research. 118 (15), 3016-3051 (2022).
  5. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Reports. 4 (4), 621-631 (2015).
  6. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
  7. Sharma, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated fluorescent tagging of endogenous proteins in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 96 (1), 1-20 (2018).
  8. Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
  9. Luo, X., et al. IP3R-mediated compensatory mechanism for calcium handling in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with cardiac ryanodine receptor deficiency. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 772(2020).
  10. Lord, S. J., Velle, K. B., Mullins, R. D., Fritz-Laylin, L. K. SuperPlots: communicating reproducibility and variability in cell biology. The Journal of Cellular Biology. 219 (6), e202001064(2020).
  11. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  12. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  13. Klimas, A., Ortiz, G., Boggess, S. C., Miller, E. W., Entcheva, E. Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 62-70 (2020).
  14. van Meer, B. J., et al. Simultaneous measurement of excitation-contraction coupling parameters identifies mechanisms underlying contractile responses of hiPSC-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 10 (1), 4325(2019).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
Posted by JoVE Editors on 12/13/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. The Authors section was updated from:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

to:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn C. Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

Tagi

Pomiary wapniaindukowane pluripotencjalne komórki macierzystefunkcja kardiomiocytówwewnątrzkomórkowe przejściowe stężenia wapniakinetyka kurczliwościratiometryczny pomiar wapniaprzedkliniczne przesiewy lekówkorelacja pikseli
Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.