Artykuł metodologiczny

Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

DOI:

10.3791/65329

⸱

9 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zawiera zestaw testów funkcjonalnych neutrofili, które mają być używane jako metoda przesiewowa w celu pokrycia funkcji z różnych ścieżek sygnałowych. Protokół zawiera wstępną i prostą ocenę żywotności komórek, czystości, produkcji reaktywnych form tlenu, migracji w czasie rzeczywistym, fagocytozy oraz wstępną sugestię pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile są znane jako jedna z pierwszych linii obrony we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i mogą wykonywać wiele szczególnych funkcji komórkowych, takich jak chemotaksja, migracja wsteczna, fagocytoza, degranulacja cytotoksycznych enzymów i metabolitów oraz uwalnianie DNA jako zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NET). Neutrofile nie tylko mają ściśle uregulowaną sygnalizację, ale także uczestniczą w regulacji innych składników układu odpornościowego. Ponieważ świeże neutrofile są terminalnie zróżnicowane, krótkotrwałe i bardzo zmienne wśród osobników, ważne jest, aby jak najlepiej wykorzystać pobrane próbki. Badacze często muszą przeprowadzać testy przesiewowe, aby ocenić przegląd wielu funkcji neutrofili, na które mogą mieć wpływ określone warunki podlegające ocenie. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano zestaw testów przeprowadzających pojedynczy proces izolacji neutrofili o normalnej gęstości, poszukując równowagi między szybkością, kompleksowością, kosztami i dokładnością. Wyniki mogą być wykorzystane do uzasadnienia i ukierunkowania dogłębnych badań uzupełniających. Procedura ta może być przeprowadzona w średnim czasie 4 godzin i obejmuje ocenę żywotności komórek, produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), migracji w czasie rzeczywistym i fagocytozy drożdży na szkiełkach szkiełkowych, pozostawiając wystarczającą ilość komórek do bardziej szczegółowych podejść, takich jak badania omiczne. Co więcej, procedura obejmuje sposób na łatwą obserwację wstępnej sugestii NET po szybkim barwieniu panoptycznym zaobserwowanym za pomocą mikroskopii świetlnej, przy braku specyficznych markerów, aczkolwiek wystarczających, aby wskazać, czy dalsze wysiłki w tym kierunku byłyby warte zachodu. Różnorodność testowanych funkcji łączy punkty wspólne dla testów, skracając czas analizy i zmniejszając koszty. Procedura została nazwana NeutroFun Screen i choć ma ograniczenia, równoważy wyżej wymienione czynniki. Co więcej, celem tej pracy nie jest konkretny zestaw testów, ale raczej wytyczna, którą można łatwo dostosować do zasobów i wymagań każdego laboratorium.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile są najliczniejszymi wrodzonymi komórkami odpornościowymi w ludzkiej krwi i są znane z tego, że odgrywają główną rolę w infekcjach i stanach zapalnych, będąc pierwszymi ratownikami, którzy docierają do miejsca uszkodzenia tkanki1. W ostatnich latach coraz częściej dostrzega się kluczową rolę, jaką neutrofile odgrywają w różnych chorobach oraz we wspieraniu homeostazy2. Neutrofile nie tylko mają ściśle regulowaną sygnalizację, ale także uczestniczą w regulacji innych składników układu odpornościowego3,4,5. Dlatego badanie neutrofili i ich wielu nietypowych funkcji komórkowych, takich jak chemotaksja, migracja odwrotna6, fagocytoza7, breathing burst8 oraz uwalnianie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NETs)7, jest niezbędne w wielu kontekstach badawczych, w których konieczna jest ocena potencjalnych zmian funkcjonalnych, morfologicznych lub molekularnych neutrofili wywołanych przez określone warunki w warunkach analiza.

Świeżo wyizolowane neutrofile są nieuleczalnie zróżnicowane, krótkotrwałe, bardzo dynamiczne i łatwo aktywowane9. Jednak nie osiągnięto jeszcze skutecznej metody przechowywania, która nie wpływa na odpowiedzi neutrofili, co utrudnia wykonywanie wielu testów, które muszą być nieprzerwane. Co więcej, wcześniej opisane analizy funkcjonalne 10,11, oparte na testach wymagających cytometrii i/lub barwienia fluorescencyjnego, mogą nie być realnym wyborem, gdy potrzebna jest szeroka i wstępna ocena neutrofili.

Aby rozwiązać te problemy, ten protokół opisuje zestaw testów, które mogą być przeprowadzone po pojedynczym procesie izolacji, w tym ocena żywotności komórek, produkcja reaktywnych form tlenu (ROS), migracja w czasie rzeczywistym i fagocytoza Saccharomyces cerevisiae, których wyniki mogą być wykorzystane do przeprowadzenia szczegółowych badań uzupełniających. Procedura ta, nazwana NeutroFun Screen, została zaprojektowana tak, aby obejmowała wiodące czynności efektorowe, z wyjątkiem degranulacji, i może być wykonana w średnim czasie 4 godzin, w tym 1 godzinę aktywacji. Ponadto pozostałe komórki można wykorzystać do bardziej szczegółowych podejść, takich jak badania omiczne. Zaletą tej metody jest równowaga między szybkością, kompleksowością, kosztem i dokładnością.

Ponadto, istnieje sposób na łatwe zaobserwowanie wstępnej sugestii NETs, bez konkretnych znaczników, ale wystarczających, aby wskazać, czy dalsze wysiłki w tym kierunku byłyby warte zachodu. Różnorodność testowanych funkcji ma na celu połączenie punktów wspólnych między testami, skrócenie czasu i kosztów analizy. Głównym celem tej metody jest zapewnienie zrównoważonej, funkcjonalnej analizy dotyczącej szybkości, kompleksowości, kosztów i dokładności, która pozwala na przegląd odpowiedzi neutrofili, co czyni ją użytecznym początkowym krokiem w badaniu wpływu nowych bodźców na neutrofile o normalnej gęstości.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty ściśle przestrzegały wytycznych etycznych ustalonych przez instytucjonalną komisję rewizyjną Uniwersytetu w Brasilii (proces 13364819.0.0000.5558), a próbki były identyfikowane za pomocą kodów, aby zapewnić anonimowość dawcy. Komórki uzyskano od normalnych, zdrowych dawców płci męskiej w wieku 18-35 lat, którzy podpisali świadomą zgodę i spełnili następujące kryteria kwalifikacyjne: osoby niepalące/vapery, brak przewlekłych schorzeń i brak historii stanów zapalnych w ciągu ostatnich 14 dni.

1. Pobieranie krwi

  1. Umieścić w aseptyki 0,3 ml 5 000 j.m./ml heparyny (patrz tabela materiałów) w sterylnej strzykawce o pojemności 20 ml w celu jej heparynizacji.
  2. Założyć żylną opaskę uciskową około 4 cali powyżej miejsca nakłucia i zidentyfikować środkową żyłę łokciową lub głowową do nakłucia żyły.
    UWAGA: Upewnij się, że całkowity czas założenia opaski uciskowej nie przekracza 1 minuty.
  3. Oczyścić miejsce nakłucia 70% alkoholem i wykonać nakłucie dożylne.
  4. Delikatnie odwrócić strzykawkę trzy lub cztery razy po pobraniu krwi, aby prawidłowo wymieszać krew i heparynę.

2. Izolacja neutrofili

UWAGA: Leukocyty wielojądrzaste (PMN) są izolowane poprzez wirowanie w gradiacji gęstości, po której następuje hipotoniczna liza pozostałych czerwonych krwinek (RBC), jak opisano wcześniej11 z pewnymi zmianami. Metoda ta nie jest obowiązkowa do przeprowadzania testów przesiewowych i może być zastąpiona, o ile wybrana metoda skutkuje żywotnością na poziomie >97%, pobudzaniem lub aktywacją <3% PMN i daje wystarczającą liczbę komórek dla wszystkich testów, powtórzeń i warunków. Wykonywanie tych czynności w warunkach aseptycznych i stosowanie roztworów wolnych od endotoksyn jest obowiązkowe, aby uniknąć aktywacji komórek.

  1. Roztwory 60% i 70% (dostępne w handlu; patrz tabela materiałów) rozcieńczyć 12 ml w probówkach stożkowych o pojemności 50 ml.
  2. Przygotować gradient od dołu do góry, dodając 4 ml na raz 60% rozcieńczenia do 70% rozcieńczenia, używając pipety 5 ml. Zrób to delikatnie, aby zapobiec mieszaniu interfejsu.
  3. Ostrożnie ułóż 12 ml heparynizowanej krwi na wierzchu gradientu gęstości. Wirować przy 200 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Od tego etapu, aż do aktywacji PMN, wszystkie używane odczynniki i probówki muszą być przechowywane w lodówce wypełnionej lodem.
  4. Odrzuć warstwę osocza/komórek jednojądrzastych, a następnie delikatnie przenieś warstwę nad osadem erytrocytów do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml z około 7,5 ml w każdej. Uzupełnić objętość probówki zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS; patrz tabela materiałów).
  5. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 19 °C.
  6. Umyj osad komórkowy za pomocą HBSS.
    1. Wyrzucić supernatant przez zalanie probówki i delikatnie zawiesić osad w 7 ml HBSS.
    2. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 19 °C w celu usunięcia wszystkich pożywek separacyjnych.
  7. Przeprowadzić hipotoniczną lizę pozostałych krwinek czerwonych.
    1. Odrzucić supernatant i połączyć granulki w jednej probówce.
    2. Zawiesić osad RBC/PMN w 3 ml sterylnegoH2Oi dodać 3 ml HBSS (2x) w ciągu 25 sekund, aby przywrócić osmolarność. Następnie odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 19 °C.
    3. Powtórzyć kroki 2.8.1 i 2.8.2 dla białej, wolnej od erytrocytów osadki.
      UWAGA: Supernatant musi zostać usunięty tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować kontakt neutrofili z produktami rozpadu erytrocytów. Alternatywnie, drugą hipotoniczną lizę można zastąpić poprzez delikatne ponowne zawieszenie pozostałej warstwy RBC i usunięcie całego supernatantu, ponieważ pozostałe RBC będą osadzać się nad osadem PMN.
  8. Wyrzucić supernatant przez nalewanie probówki, delikatnie zawiesić PMN w pozostałym buforze i przenieść je do lodowato zimnej mikroprobówki.
    UWAGA: Upewnij się, że adnotacja dotycząca objętości została oznaczona podczas przenoszenia ponownie zawieszonych komórek za pomocą mikropipety.
  9. Przenieś 3 x 1 μl zawiesiny komórek do czystego szkiełka (trzy studzienki po 1 μl każda) i wybarwić szybkim panoptykiem (patrz Tabela materiałów) w celu oceny morfologii i czystości12.
    1. Aby zabarwić szkiełko za pomocą szybkiego utrwalacza panoptycznego, zanurz szkiełko pięć razy w utrwalaczu panoptycznym nr 1, sześć razy w eozynie nr 2 i dwa razy w hematoksylinie nr 3, przy czym każde zanurzenie trwa 1 s.
    2. Delikatnie umyj szkiełko szkiełkowe wodą destylowaną.
    3. Pozostawić do odsączenia i wysuszyć na powietrzu.
  10. Obserwuj pod mikroskopem i policz 300 losowych komórek w każdym dołku, różnicując w ten sposób neutrofile od innych granulocytów.
  11. Przenieś 1 μl zawiesiny komórkowej do 49 μl 0,2% barwnika błękitu trypanowego13 i policz komórki za pomocą komory Neubauera, rozróżniając komórki martwe i żywotne.
  12. Dostosuj stężenie komórek do 6,667 komórek/μl za pomocą roztworu 50% osocza autologicznego i 50% HBSS uzupełnionego wapniem i magnezem. Podzielić 6,667 komórek/μl zawiesiny równomiernie między mikroprobówki odpowiadające warunkom, które mają być badane, w tym kontroli ujemnej.
    UWAGA: Można użyć dowolnego stężenia komórek podobnego do stężenia krążących neutrofili w organizmie modelowym, ale ważne jest, aby używać tego samego stężenia komórek we wszystkich eksperymentach w celu zapewnienia odtwarzalności.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Protokół izolacji neutrofili. Dwa stężenia pożywki separacyjnej (percoll) (A) są ułożone w stos (B), a następnie krew jest nakładana warstwami na gradient separacji (C). Po odwirowaniu PMN znajduje się w warstwie środkowej (D), która jest podzielona na dwie probówki o pojemności 15 ml (E). Zawiesinę komórek przemywa się dwukrotnie w HBSS i odwirowuje (G-I) w celu usunięcia pożywki, następnie komórki są ponownie zawieszane, a pozostałe erytrocyty są poddawane dwóm rundom lizy hipotonicznej (J-M). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie do aktywacji neutrofili

  1. W mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml przygotuj system aktywacji dla każdego stanu, tak aby końcowe stężenie komórek wynosiło 6 600 komórek/μl. Na przykład, aby przetestować działanie 100 nM fMLP (N-formylo-metionylo-leucylo-fenyloalaniny; patrz tabela materiałów), dodaj 5 μl 10 μM fMLP do 495 μL zawiesiny o stężeniu 6,667 komórek/μl. Do kontroli ujemnej (niestymulowanej) dodać HBSS zawierającą Ca2+ i Mg2+,
    UWAGA: Aby zademonstrować tę metodologię, użyto następujących końcowych stężeń bodźców: 100 nM fMLP, 16 μM fallaxin, naturalnie występującego peptydu przeciwdrobnoustrojowego 14 i 100 nM PMA (12-mirystynian 13-octanu forbolu) (patrz Tabela materiałów).
  2. Inkubować w temperaturze 37 °C bez rotacji.
    UWAGA: Wszystkie podwielokrotności do testów funkcjonalnych są pobierane z tej zawiesiny komórek, zwanej dalej systemem aktywacji.

4. Test niebieskiego chlorku nitrotetrazolium (NBT) do oceny produkcji ROS

  1. Przygotowanie roztworu roboczego NBT: Dla każdego warunku doświadczalnego należy przygotować roztwór roboczy NBT (patrz Tabela Materiałów) o stężeniu 6 mM, wykonując następujące czynności:
    1. Rozpuścić 0,0005 g NBT w 10 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) i wirować przez co najmniej 15 minut.
    2. Dodać 90 μl HBSS Ca2 + Mg2+ i wirować do 2 min.
      UWAGA: Wszystkie czynności związane z NBT muszą być wykonywane w ciemności.
  2. Wykonaj test slajdów NBT.
    1. Po 20 minutach od aktywacji komórek delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek i ostrożnie przenieś 2 μl PMN na czyste szkiełko podstawowe. Inkubować przez 20 minut w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Nie rozprowadzaj zawiesiny komórek zbyt mocno na szkiełku; w przeciwnym razie może wyschnąć przed inkubacją.
    2. Dodać 1 μl roztworu roboczego NBT na komórki i dalej inkubować przez 20 minut, chroniąc przed światłem.
    3. Osuszyć szkiełko gorącym powietrzem i utrwalić je kroplą metanolu w każdym dołku na 1 minutę. Zabarwić 0,03% safraniną (patrz tabela materiałów) przez 1 minutę.
    4. Delikatnie umyj szkiełko szkiełkowe wodą destylowaną.
    5. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu i obserwuj pod mikroskopem.
    6. Policz 100 losowych komórek w każdym dołku, różnicując neutrofile ze złogami formazanu i bez nich.
  3. Wykonać test spektrofotometryczny NBT.
    1. Po 40 minutach od aktywacji komórek delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek i przenieś 90 μl PMN z systemu aktywacji do czystej mikroprobówki. Następnie ostrożnie dodać 20 μl 6 mM roztworu NBT. Inkubować w ciemności przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 100 μl 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS; patrz tabela materiałów) i odwirować.
    3. Sonikacja za pomocą końcówki-sonikatora o amplitudzie 60%, pięć cykli po 15 s każdy w odstępach 15 s. Wirować przy 12 000 x g przez 5 min.
    4. Przenieść 60 μl supernatantu na 96-dołkową płytkę z przezroczystym dnem i zmierzyć absorbancję produktu formazanu przy długości fali 570 nm.

5. Test fagocytozy

  1. Przygotuj zawiesinę 33 000 drożdży/μl dla każdego stanu, jak opisano poniżej:
    1. Dodać około 0,75 mg suchych drożdży (Saccharomyces cerevisiae; patrz tabela materiałów) do 200 μl HBSS Ca2 + Mg2+ i inkubować w termomikserze w temperaturze 100 °C przy prędkości 500 obr./min przez co najmniej 15 minut.
    2. Homogenizować mieszaninę przez wirowanie i przenieść 5 μl zawiesiny drożdży do 45 μl 0,2% barwnika błękitu trypanowego. Policz drożdże za pomocą komory Neubauera.
    3. Dostosuj stężenie zawiesiny początkowej do 33 000 komórek drożdży/μl za pomocą HBSS Ca2 + Mg2 +. Zawiesinę należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
  2. Po 20 minutach od aktywacji komórek delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek i przenieś 5 μl systemu aktywacji do 5 μl zawiesiny 33 000 drożdży/μl Saccharomyces cerevisiae w nowej sterylnej mikroprobówce.
    UWAGA: Stosunek neutrofili do drożdży wynosi 1:5 (PMN:drożdże).
  3. Natychmiast przenieść 6 μl zawiesiny PMN/drożdży do trzech dołków czystego szkiełka podstawowego (po 2 μl każda) i inkubować szkiełko w wilgotnej komorze przez 40 min.
    UWAGA: Nie rozprowadzaj zawiesiny komórek zbyt mocno na szkiełku; W przeciwnym razie może wyschnąć przed inkubacją.
  4. Wysuszyć szkiełko pod gorącym powietrzem i zabarwić je szybkozłączką panoptyczną, zgodnie z opisem w kroku 2.9 powyżej.
    UWAGA: Trzeci etap szybkiego barwienia panoptycznego ma kluczowe znaczenie dla analizy mikroskopowej szkiełka. Barwienie szkiełka przez ≥3 s na tym etapie może spowodować, że nie będzie ono nadawało się do analizy, ponieważ trudno będzie odróżnić płaty jądrowe drożdży od neutrofili
    5. .
  5. Obserwuj szkiełka pod mikroskopem, licząc 100 losowych neutrofili z każdej studzienki i rozróżniając dodatnie i ujemne PMN dla fagocytozy.
    UWAGA: Co najmniej jedna cząsteczka drożdży w błonie komórkowej PMN lub w bezpośrednim kontakcie z nią wskazuje na obecność PMN pod względem fagocytozy. Jeśli interesuje Cię stosunek drożdży do neutrofili, policz również liczbę pochłoniętych cząstek drożdży.

6. Test chemotaksji PMN w czasie rzeczywistym

UWAGA: Test migracji jest wykonywany podobnie do opisanego wcześniej protokołu 15, z następującymi adaptacjami:

  1. Przygotować gradient chemotaktologiczny, dodając 160 μl chemoatraktantu (np. fMLP, IL-8, C5 lub LTB4; patrz Tabela materiałów) do dolnej komory płytki analizatora komórek czasu rzeczywistego (RTCA) opartego na impedancji. W przypadku kontroli ujemnych i ślepej próby dodać 160 μl HBSS Ca2 + Mg2+.
  2. Podłącz górną komorę i dodaj 25 μL HBSS Ca2 + Mg2+. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę w celu wytworzenia gradientu chemotaktycznego.
  3. Po 60 minutach od aktywacji komórek delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek i umieść 60 μl zawiesiny komórek w górnej komorze. Dodać 60 μl HBSS Ca2 + Mg2+ do ślepej próby ślepej.
  4. Umieść płytkę RTCA i zaprogramuj oprogramowanie RTCA do pomiaru indeksu komórki (CI) co 60 s przez 2 godziny
    UWAGA: Płyty RTCA można umyć w celu ponownego użycia, jak opisano wcześniej16. Podsumowując, umyj komory i elektrody RTCA trzykrotnie solą fizjologiczną z dodatkiem fosforanów (PBS), a następnie dwukrotnie wodą ultraczystą typu I. Inkubować dolną i górną komorę z 0,25% trypsyną 0,53 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przez 40 minut. Umyj trzykrotnie ultraczystą wodą.

7. Test sugestywny NET

  1. Po 10 minutach od aktywacji komórek delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek i przenieś 4 μl PMN z każdego ocenianego systemu aktywacji, podzielone na dwie studzienki z czystym szkiełkiem podstawowym. Inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  2. Dodać 1 μl DNAzy I do jednego z dołków i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C (w mokrej komorze).
  3. Osuszyć szkiełko i zabarwić go szybkim środkiem panoptycznym, jak opisano wcześniej w kroku 2.9 rozdziału "Izolacja neutrofili".
  4. Oceń szkiełka pod mikroskopem.
    UWAGA: Szukaj jakichkolwiek oznak wydania NET, charakteryzującego się obecnością struktur podobnych do stron internetowych. Po zidentyfikowaniu sprawdź, czy leczenie DNAzą I było w stanie usunąć takie struktury. Ten test sugeruje tworzenie się NET, ponieważ wymagane są dodatkowe testy, aby potwierdzić ich obecność.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda izolacji oparta na gęstości zastosowana w tym badaniu (Rysunek 1) spełniała kryteria proponowanych eksperymentów. Parametry neutrofili uzyskane tą metodą obejmowały żywotność ≥98%, czystość ≥94% oraz wydajność komórek ≥1,5 x 107, przy czym testy przesiewowe nie wykrywały aktywacji. Dwa istotne etapy izolacji PMN to antykoagulacja i usuwanie RBC. Utrzymywanie antyzakrzepowej probówki lub strzykawki w stanie delikatnego kołysania przed nałożeniem warstwy na gradient gęstości i wyborem metody usuwania RBC, aby zapobiec zarówno aktywacji, jak i zanieczyszczeniu, może wpłynąć na wydajność i odtwarzalność eksperymentu.

Aby ocenić funkcjonalny przegląd funkcji neutrofili, opracowano procedurę, która pozwoliła na przeprowadzenie proponowanych testów przesiewowych z co najmniej dwoma badaczami w średnim czasie 4 godzin, z 1 godziną aktywacji i 2 godzinami monitorowania migracji w czasie rzeczywistym, jak pokazano na Rysunek 2.

figure-results-1
Rysunek 2: Przepływ pracy NeutroFun Screen. Aby ocenić panel reakcji funkcjonalnych wywołanych przez określone warunki podlegające ocenie, przepływ pracy NeutroFun Screen obejmuje udział co najmniej dwóch badaczy. Badacz 1 (R1) rozpoczyna proces izolacji PMN, po którym następuje regulacja stężenia komórek i inkubacja systemu aktywacji, podczas gdy równolegle badacz 2 (R2) przygotowuje materiały do przeprowadzenia kolejnych testów, które są dzielone między dwa: R1 wykonuje testy fagocytozy, NET i spektrofotometryczne NBT; R2 przeprowadza migrację w czasie rzeczywistym i testy slajdów NBT. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Klasyczny test NBT17 został zoptymalizowany zarówno pod kątem szkiełkowej, jak i spektrofotometrycznej oceny powstawania formazanu w wyniku reakcji NBT z ROS generowanym przez PMNs. Test spektrofotometryczny pozwolił na względną kwantyfikację między warunkami, podczas gdy test mikroskopowy był przydatny do analizy opisowej i półilościowej, oceniającej regularność rozmieszczenia kryształów, morfologii i liczby komórek zawierających formazan. Wyniki testu spektrofotometrycznego są pokazane w Rysunek 3A, wskazując, że 100 nM PMA indukowało podwyższoną produkcję ROS (w średnim stosunku 3:2:1) w porównaniu z fMLP i grupami kontrolnymi. Wyniki testu slajdów NBT (Rysunek 3B) potwierdziły wyniki spektrofotometryczne, pokazując również PMA jako najbardziej intensywny bodziec indukujący produkcję ROS w porównaniu z fMLP (Rysunek 3C), jak wcześniej wykazano przez bezpośredni pomiar ROS za pomocą cytometrii18. Jeśli chodzi o zliczanie komórek, liczba neutrofili zawierających kryształy formazanu wykazała stosunek 7:4:1 w warunkach kontrolnych PMA:fMLP:, ujawniając również różne wzorce dystrybucji formazanu między PMN aktywowanymi przez fMLP i PMA; Leczenie fMLP skutkowało intensywną aktywacją pojedynczych komórek, podczas gdy PMA indukowało powstawanie kryształów formazanu rozsianych po cytoplazmie w większości PMN. Ponadto zaobserwowano kilka cech morfologicznych, które różnicowały te warunki, takich jak ekspresyjna agregacja komórek po leczeniu PMA. Brak takich typowych cech aktywacji i niski poziom formazanu w grupie kontrolnej wskazywały, że stan spoczynku nie był istotnie zaburzony. Dlatego test NBT okazał się prostym, niedrogim i wiarygodnym testem do produkcji ROS neutrofili, który można wykorzystać do przeglądu zdolności i intensywności danego bodźca do indukowania produkcji ROS.

figure-results-2
Rysunek 3: Test NBT. (A) Spektrofotometryczna ocena wybuchu oddechowego neutrofili do różnych warunków (kontrola negatywna: 100 nM fMLP i 100 nM PMA) przez absorbancję formazanu (490-630 nm). Dane od czterech dawców są przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). * = wszystkie grupy różnią się od siebie (p≤ 0,05); £ = Porównania CTRL i PMA oraz fMLP i PMA pokazują istotne różnice (p≤ 0,05). (B) Test szkiełkowy można analizować jakościowo, charakteryzując intensywność osadów formazanu, jego lokalizację w komórce i agregację komórek. Czarne strzałki wskazują na kryształy formazanu. Podziałka skali: 20 μm. (C) Liczba PMN zawierających formazan, obliczona za pomocą mikroskopii optycznej. Dane od ośmiu dawców przedstawione jako średnia ± SD. *** p < 0,0001, test t-Studenta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Preparaty fagocytozy zostały użyte do określenia wskaźnika fagocytozy jako procentu neutrofili wykonujących fagocytozę, jak pokazano w Rysunek 4. Chociaż zarówno peptyd przeciwdrobnoustrojowy 100 nM fMLP, jak i peptyd przeciwdrobnoustrojowy 16 μM indukowały pozornie zwiększone pochłanianie drożdży, różnica nie była statystycznie istotna aż do podwójnej stymulacji, która znacznie zwiększyła fagocytozę w porównaniu z grupą kontrolną i może sugerować odpowiedź na podwójną stymulację.

figure-results-3
Rysunek 4: Test na fagocytozę. Neutrofile oceniano na podstawie ich zdolności do fagocytozy (liczenie neutrofili zawierających drożdże). Chociaż ekspozycja na 100 nM fMLP lub peptyd przeciwdrobnoustrojowy 16 μM przed inkubacją drożdży zwiększała fagocytozę w porównaniu z grupą kontrolną, (A) wzrost nie był statystycznie istotny. Co ciekawe, początkowa inkubacja z fMLP, a następnie dodanie peptydu przeciwdrobnoustrojowego, spowodowała znacznie zwiększoną fagocytozę u ludzkich neutrofili (gwiazdka między CTRL a peptydem przeciwdrobnoustrojowym fMLP+). (B) Czarne strzałki pokazują komórki drożdży, zielone strzałki pokazują same neutrofile, a czerwone strzałki wskazują na fagocytozy neutrofili. Dane od pięciu dawców przedstawione jako średnia ± SD. Podziałka skali: 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przykład wyników migracji komórek w czasie rzeczywistym jest pokazany w Rysunek 5, pokazujący dobrze znany chemotaktyczny wpływ 100 nM fMLP na neutrofile. Kinetykę migracji komórek dostosowano do modelu Gompertza, umożliwiając porównanie jej parametrów.

figure-results-4
Rysunek 5: Migracja komórek w czasie rzeczywistym. Indeks ogniw odzwierciedla impedancję elektryczną wynikającą z migracji komórek. W tym teście fMLP zastosowano jako pozytywną kontrolę migracji neutrofili poprzez dodanie 100 nM fMLP do dolnej komory. Kontrola ujemna (CTRL) zawierała tylko HBSS w dolnej komorze. Nałożone na siebie krzywe reprezentują krzywą dopasowaną do modelu Gompertza, zmodyfikowaną tak, aby jak najlepiej pasowała do wznoszących się i opadających nachyleń. Dane od trzech dawców, przedstawione jako średnia ± SD.* p < 0,05, test t-Studenta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Na koniec, przedstawiono prosty test mikroskopii optycznej sugerujący obecność NET, w którym PMN są barwione szybkim panoptykiem. Można zaobserwować, że w przypadku niektórych specyficznych bodźców indukujących NET, takich jak PMA lub niektóre peptydy przeciwdrobnoustrojowe, nawet po krótkim czasie aktywacji (1 h) można zaobserwować nitkowate struktury przypominające sieć w pobliżu komórek, podczas gdy nie jest to możliwe w innych warunkach, takich jak kontrola negatywna i fMLP (Rysunek 6). Aby lepiej poprzeć to twierdzenie, DNaza I została dodana po 40 minutach aktywacji komórek za pomocą PMA 100 nm lub peptydu przeciwdrobnoustrojowego, usuwając struktury podobne do NET (Ryc. 6). Chociaż metoda ta nie nadaje się do charakterystyki NET i mogą na nią wpływać artefakty, jest tanim, prostym i interesującym punktem wyjścia uzasadniającym dalsze inwestycje w analizę NET, szczególnie w kontekstach, w których efekty bodźców są nieznane lub słabo opisane.

figure-results-5
Rysunek 6: Test sugestywny tworzenia NET. Analiza jakościowa neutrofili wybarwionych panoptycznie po 1 godzinie od aktywacji na szkiełku podstawowym może wskazać na uwolnienie NET. Grupy CTRL (A,B) i fMLP (C,D) nie wykazywały żadnych oznak uwalniania NET, podczas gdy aktywacja za pomocą PMA (E-H) indukowała tworzenie struktur podobnych do NET, które zostały zdegradowane przez traktowanie DNazą I (I-L). Badanie wpływu peptydu przeciwdrobnoustrojowego na neutrofile wykazało, że taki bodziec może być w stanie wywołać uwolnienie NET, ponieważ slajdy przedstawiały struktury podobne do NET (M-P), które zostały zdegradowane przez DNazę I (Q-T). Czerwone strzałki wskazują na struktury podobne do NET. Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile są bardzo dynamicznymi i wrażliwymi komórkami, które żyją krótko i nie mogą być jeszcze kriokonserwowane19, co sprawia, że badania nad ich biologią są trudne. Dlatego ważne jest, aby postępować ostrożnie w celu uzyskania żywotnych, wzbogaconych i spoczynkowych neutrofili 11,20. W badaniu tym zastosowano technikę izolacji opartą na gęstości, która kładzie nacisk na delikatną i minimalną manipulację, a także stosowanie niskich temperatur aż do etapu aktywacji. Dodatkowo przetwarzanie krwi musi nastąpić w ciągu 30 minut po wkłuciu żyły i być przechowywane w temperaturze pokojowej. Niniejsza praca przedstawia możliwość zmniejszenia stresu manipulacyjnego i czasu eksperymentu. Aby jeszcze bardziej uprościć ten proces, wprowadziliśmy nowy krok (jako opcję) w protokole, który polega na usunięciu erytrocytów poprzez delikatne ponowne zawieszenie i aspirację warstwy erytrocytów po pojedynczej procedurze hemolizy. Ten etap zmniejsza stres manipulacyjny i czas eksperymentu, ponieważ usuwa większość erytrocytów za pomocą tylko jednego etapu hemolizy hipotonicznej. Należy jednak zauważyć, że umiejętności operatora mają duży wpływ na skuteczność tego kroku i nie zawsze może on całkowicie usunąć erytrocyty. Co więcej, aspiracja erytrocytów może prowadzić do utraty neutrofili, ale nie wpływa to na plon, ponieważ więcej neutrofili zostało początkowo odzyskanych z gradientu, gdy zbierano je bliżej warstwy erytrocytów. W związku z tym aspiracja RBC jest zalecana, jeśli testy nie wymagają najwyższej możliwej czystości lub jeśli operator ma niezmiennie dobre wyniki. W przypadku przedstawionych tutaj badań przesiewowych niewielka ilość zanieczyszczeń krwinkami czerwonymi (<3%) nie zakłóciłaby wyników.

Aby upewnić się, że wszystkie procedury są wykonywane w odpowiednim czasie, w tym przygotowanie odczynników, przedstawiono przepływ pracy (rysunek 2), który szczegółowo określa harmonogram i podział zadań między dwoma badaczami. Po zakończeniu wszystkich testów funkcjonalnych pozostałe komórki można przygotować do dalszych badań molekularnych, takich jak badania omiczne poprzez lizę komórek z odpowiednim buforem do lizy i przechowywaniem.

Produkcja ROS
Wybuch oddechowy jest cechą charakterystyczną pobudzania i aktywacji neutrofili18,21, a ocena produkcji ROS jest powszechną metodą stosowaną do szacowania stanu aktywacji neutrofili. W badaniu tym oceniano produkcję ROS przy użyciu dwóch podejść: mikroskopii optycznej i spektrofotometrii.

Test NBT jest dobrze znanym podejściem do oceny wybuchu oddechowego u neutrofili22,23. Dwie powszechnie stosowane metody to testy oparte na mikroskopii optycznej (lub teście szkiełkowym) i spektrofotometrii 24,25,26. Chociaż mikroskopia optyczna pozwala na wizualizację szczegółów na poziomie komórki, jest podatna na stronniczość użytkownika. W związku z tym test szkiełkowy NBT służy jako jakościowe uzupełnienie testu spektrofotometrycznego dotyczącego cech fenotypowych, takich jak wzorce tworzenia formazanu, intensywność i agregacja komórek.

Krytycznymi etapami zarówno dla szkiełka NBT, jak i testów spektrofotometrycznych są całkowita rozpuszczalność NBT i formazanu. Wbrew zaleceniom producenta, NBT nie rozpuszcza się dobrze w wodzie. Jednak homogenizacja NBT w DMSO przez co najmniej 15 minut, a następnie dodanie wody/HBSS i wirowanie przez 2 minuty zapewnia całkowitą rozpuszczalność. Ponadto, aby przeanalizować absorbancję formazanu, należy osiągnąć dwa krytyczne etapy: (1) uwolnienie kryształów formazanu z komórek przez lizę PMN oraz (2) całkowite rozpuszczenie kryształów formazanu. Oba etapy osiągnięto poprzez potraktowanie osadu komórkowego 10% SDS, jak ostatnio sugerowano27, a następnie analizę sonikacji i absorbancji supernatantu przy 570 nm.

Ponadto wyniki NBT w ujemnych i pozytywnych grupach kontrolnych są pierwszym etapem badań przesiewowych, które należy ocenić. Ten krok musi wykazać niezwykłą różnicę, ponieważ ocena produkcji ROS za pomocą formazanu wskazuje, czy proces izolacji mógł być odpowiedzialny za niepożądane zmiany w stanie spoczynku komórek, czy to poprzez stymulację, czy hamowanie.

Inne metody, takie jak redukcja cytochromu c28 lub analiza cytometrii przepływowej29, są często stosowane do wykrywania ROS; Biorąc jednak pod uwagę podejście przesiewowe, ich zastosowanie wymaga dłuższego czasu eksperymentu, użycia specjalnych markerów i drogich instrumentów. Chemiluminescencja luminolu/izoluminolu jest szybką i opłacalną metodą wykrywania ROS, a jednocześnie umożliwia różnicowanie wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych ROS. Jednak do tej metody wymagany jest luminometr30,31. Chociaż koszt instrumentu można obejść poprzez wykorzystanie urządzenia, nadal nie nadawałoby się ono do analizy przesiewowej wykonywanej jednocześnie z innymi testami.

Fagocytozy
Inkubacja PMN/drożdży zapewnia przegląd zdolności i skuteczności fagocytozy neutrofili poprzez zliczenie liczby neutrofili wykonujących fagocytozę oraz liczby drożdży pochłoniętych na neutrofil. Jednakże, ponieważ cząstka drożdży sama w sobie jest sygnałem aktywacji, porównanie grupy kontrolnej ze wstępnie potraktowanym PMN stanowi system podwójnej stymulacji, który może nie wykazywać znaczących zmian, jak pokazano w przypadku PMN traktowanego CTRL w porównaniu z fMLP (Figura 4). Niemniej jednak test ten jest przydatny do wskazania, czy potencjalny modulator miałby jakikolwiek wpływ na fagocytozę. Za pomocą tego testu przetestowano nowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy, a wyniki wskazują na interesującą potencjalną reakcję na tę kombinację bodźców, która została niedawno omówiona jako potrzebna do skutecznej aktywacji32.

Krytycznym etapem tego testu jest barwienie, ponieważ analiza staje się niewiarygodna, jeśli szkiełko jest trzymane na panoptyce nr 3 (hematoksylinie) przez ≥3 s. Dzieje się tak, ponieważ komórek drożdży i płatów jądrowych neutrofili nie można od siebie odróżnić. Co więcej, podejście to pozwala na analizę morfologii neutrofili po ekspozycji na modulatory. Cytometria przepływowa jest kolejną skuteczną techniką analizy fagocytozy33, chociaż ma ograniczenia wynikające z trudności w rozróżnieniu między cząstkami związanymi z błoną a pochłoniętymi przez błonę oraz innymi czynnikami związanymi z proponowanym zestawem przesiewowym, jak omówiono w poprzednim temacie. To samo ograniczenie obserwuje się w metodzie opisanej w niniejszym dokumencie, chociaż należy ją traktować jako wstępne badanie przesiewowe w celu ukierunkowania dalszych badań.

Migracja w czasie rzeczywistym
Protokół badań przesiewowych w czasie rzeczywistym został zoptymalizowany pod kątem oceny zdolności migracyjnej PMN. Chociaż poprzednie badanie sugerowało, że pokrycie spodu płytki RTCA było konieczne, aby test migracji wykazał różnicę między kontrolą ujemną a traktowaniem IL-815, badanie to wykazało wysokie wartości przedziału ufności (CI) dla komórek traktowanych fMLP bez dodatku środków powlekających. Wyniki wykazały wysoką powtarzalność przy znacznej migracji od 12 minut. Co więcej, analiza dopasowania krzywych uzyskanych danych migracyjnych może ujawnić parametry, takie jak maksymalny indeks komórek oraz wzrost i spadek nachylenia, które są przydatne do zrozumienia dynamiki migracji i mogą zależeć od stężenia lub różnić się w zależności od warunków. Najlepszym dopasowaniem do krzywych migracji neutrofili (ryc. 5) była skorygowana funkcja Gompertza34, pokazująca, że fMLP zwiększa maksymalny indeks komórek i zwiększa nachylenie.

Należy zwrócić szczególną uwagę, aby uniknąć pęcherzyków w systemie RTCA, ponieważ mogą one blokować ogniwa przechodzące przez elektrody, zagrażając eksperymentowi. Czynnikiem ograniczającym jest wysoki koszt płyt. Chociaż tańsze techniki analizują migrację komórek, brakuje im dobrej odtwarzalności lub są trudne i czasochłonne, jak w przypadku komory Boydena35. W związku z tym RTCA jest wiarygodną analizą migracji kompatybilną z innymi przedstawionymi tutaj testami przesiewowymi.

Sieci
Wreszcie, opracowano obiecujący, łatwy i tani test do wstępnej oceny powstawania NET przy użyciu mikroskopii optycznej. Uzyskano go na podstawie obserwacji szkiełek fagocytozy, w których PMA, specyficzny bodziec indukujący NET, badany pod kątem wpływu na zdolność fagocytozy, indukował również tworzenie struktury przypominającej pajęczynę w porównaniu z grupami CTRL i fMLP. W tej pracy postawiono hipotezę, że struktury te mogą wskazywać na wydanie NET. Hipotezę taką przetestowano, traktując próbki DNazą I po aktywacji, gdzie nie znaleziono żadnych nitkowatych struktur w neutrofilach aktywowanych PMA. Założenie, że takie struktury mogą być NET, opiera się na fakcie, że PMA jest cytowany jako dobrze znany induktor powstawania NET36,37, odkryciu podobnych struktur za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu specyficznych markerów dla NET38,39 oraz degradacji NET katalizowanej przez DNazę I40,41. Należy podkreślić, że nie jest to metoda potwierdzania powstawania NET, a jedynie wstępne badanie, które sugeruje obecność NET. Chociaż ten test ma ograniczenia, ponieważ NET można pomylić z artefaktami barwiącymi, służy on istotnemu celowi, sugerując tworzenie NET w szybkim i tanim badaniu przesiewowym, które można przeprowadzić razem z innymi testami funkcjonalnymi. Po wykryciu, że mogą być istotne dla badania przesiewowego, NET mogą być dalej oceniane za pomocą mikroskopii konfokalnej lub elektronowej42, jak omówiono później.

W naszym laboratorium nowe peptydy przeciwdrobnoustrojowe, które również mogą mieć działanie immunomodulujące, są często oceniane za pomocą tego zestawu testów przesiewowych, aby lepiej kierować dalszą analizą wpływu niektórych peptydów na ludzkie neutrofile, ponieważ niektóre wykazują interesujące właściwości ROS43, fagocytozy, migracji i / lub modulacji NET.

Podsumowując, NeutroFun Screen oferuje cenne narzędzie do identyfikacji potencjalnych modulatorów aktywności neutrofili o normalnej gęstości na podstawie dużej liczby nieprzebadanych związków. Należy jednak pamiętać, że ta metoda służy jedynie jako wstępne badanie przesiewowe. Po tym wstępnym badaniu przesiewowym droższe, bardziej zaawansowane i czasochłonne metodologie mogą zostać skierowane do określonych funkcji lub ścieżek sugerowanych przez te pierwsze wyniki w celu walidacji danych. W przypadku produkcji ROS, fagocytozy i tworzenia NET istnieją alternatywne metody walidacji danych i uzyskiwania dalszych wyników ilościowych. Wizualizację i kwantyfikację NET można przeprowadzić za pomocą analizy mikroskopii immunofluorescencyjnej, która określa obecność i nakładanie się zewnątrzkomórkowego DNA i białek ziarnistych, takich jak mieloperoksydaza i elastaza neutrofilowa, jak opisano szczegółowo niedawno42. ROS odgrywają różne kluczowe role w wielu procesach biologicznych, dlatego ich badanie jest bardzo rozpowszechnione i zróżnicowane. Do najbardziej uznanych metodologii należą te, które wykorzystują przeciwciała, takie jak test immunoenzymatyczny (ELISA) i immunoblotting luminescencji lub wykrywanie fluorescencji - takie jak cytometria przepływowa komórek pod różnymi znakami - za pomocą DCFDA, spektroskopii EPR i pomiarów aktywności enzymatycznej44. Podobnie, solidna ocena fagocytozy jest również przeprowadzana na kilka sposobów; Alternatywne metody obejmują samą cytometrię przepływową45,46 lub w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną47. Opisana migracja komórek w czasie rzeczywistym jest solidnym i wystarczającym testem, który nie wymaga dalszej walidacji i przedstawia parametry, których inne metodologie nie mogą uwzględnić. Inne kombinacje takich metod mogą lepiej pasować do konkretnych scenariuszy, ale podsumowując, jest to szybka i niedroga kombinacja, która obejmuje wiele aktywności neutrofili.

Podsumowując, badanie to ma na celu dostarczenie zestawu testów składających się z prostych, szybkich i tanich metodologii do oceny wielu odpowiedzi neutrofili na nowe cząsteczki i warunki, jako sposób na lepsze skierowanie wysiłków w kierunku zaawansowanych metodologii. Jako główne ograniczenia, wyniki testów ROS, NET i fagocytozy należy uznać za wstępne i wymagają dalszej walidacji za pomocą bardziej szczegółowych i wyszukanych testów, a te, które opierają się na niezautomatyzowanym zliczaniu komórek pod mikroskopem, są podatne na nieświadome uprzedzenia.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy uznają następujące agencje finansujące: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP i FINATEC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CIM-Plate 16Agilent 
Czytnik płytek CLARIOstar BMG LABTECHUS Numer patentu 9,733,124
Szczegóły Produktu: Oprogramowanie do analizy danych MARS
Dimetylosulfotlenek Dinâ mika1582
DNAza ISigma - AldrichDN 25
Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodnaSigma - AldrichE5134
Szybkie barwienie panoptyczneLaborclin620529
Szkiełko szkiełkoweExacta7102
Hank' s Zrównoważony roztwór soli z wapniem, z magnezem, bez czerwieni fenolowej.Sigma - Aldrich55037C
Hank' s Zrównoważony roztwór soli bez chlorku wapnia, siarczanu magnezu i wodorowęglanu sodu.Sigma - AldrichH4641
HeparinBlau 
Komora laminarnaVecoVLFS-12
Mikroskop Zeiss415501-0101-002Szczegóły Produktu:
Blok mieszającyBIOERMB-102
Neubauer ulepszony jasny NewOptik1110000
N-formylo-metionylo-leucylo-fenyloalaninaSigma - AldrichF3506
Nitroblue tetrazoliumNeonCAS 298-83-9
PercollCytiva17089101media separacyjne
Phorbol 12-mirystynian 13-octanSigma - AldrichP8139
Tabletka soli fizjologicznej buforowanej fosforanamiSigma - AldrichP4417
ROTOFIX 32 AHettich1206
Saccharomyces cerevisiaeFleischmann
SafraninSigma - Aldrich50240
Dodecylosiarczan soduCytiva17-1313-01
SonicatorQsonicaQ125
Roztwór błękitu trypanowegoVetecCI 23850
Vortex Genie 2Scientific Industries, Inc.0K-0500-902
xCELLigence Analiza komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) DP (podwójne zastosowanie)Agilent 380601050Szczegóły produktu: System RTCA składający się ze sprzętu detekcyjnego, płytek ogniw i oprogramowania
56658250017896014655229 Primostar 1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
  3. Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345(2017).
  4. Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
  5. Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147(2019).
  6. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  7. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  8. El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
  9. Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
  10. Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770(2021).
  11. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
  12. Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
  14. Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
  15. Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
  16. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
  17. Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
  18. Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
  19. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  20. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837(2021).
  21. Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991(2021).
  22. Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41(2019).
  23. Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316(2019).
  24. Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
  25. Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153(2019).
  26. Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
  27. Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637(2021).
  28. Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
  29. Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
  30. Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
  31. Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
  32. Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106(2021).
  33. Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27(2021).
  34. Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582(2020).
  35. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337(2017).
  36. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  37. de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
  38. Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
  39. Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
  40. Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
  41. Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
  42. Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
  43. Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790(2020).
  44. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  45. Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825(2021).
  46. Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
  47. Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neutrophil ScreeningCell ViabilityReactive Oxygen SpeciesPhagocytosis AssayReal Time MigrationNeutrophil Extracellular TrapsDensity Gradient IsolationNBT AssayChemotaxis Assay

Powiązane artykuły