Artykuł metodologiczny

Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65329

⸱

9 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zawiera zestaw testów funkcjonalnych neutrofili, które mają być używane jako metoda przesiewowa w celu pokrycia funkcji z różnych ścieżek sygnałowych. Protokół zawiera wstępną i prostą ocenę żywotności komórek, czystości, produkcji reaktywnych form tlenu, migracji w czasie rzeczywistym, fagocytozy oraz wstępną sugestię pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Streszczenie

Neutrofile są znane jako jedna z pierwszych linii obrony we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i mogą wykonywać wiele szczególnych funkcji komórkowych, takich jak chemotaksja, migracja wsteczna, fagocytoza, degranulacja cytotoksycznych enzymów i metabolitów oraz uwalnianie DNA jako zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NET). Neutrofile nie tylko mają ściśle uregulowaną sygnalizację, ale także uczestniczą w regulacji innych składników układu odpornościowego. Ponieważ świeże neutrofile są terminalnie zróżnicowane, krótkotrwałe i bardzo zmienne wśród osobników, ważne jest, aby jak najlepiej wykorzystać pobrane próbki. Badacze często muszą przeprowadzać testy przesiewowe, aby ocenić przegląd wielu funkcji neutrofili, na które mogą mieć wpływ określone warunki podlegające ocenie. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano zestaw testów przeprowadzających pojedynczy proces izolacji neutrofili o normalnej gęstości, poszukując równowagi między szybkością, kompleksowością, kosztami i dokładnością. Wyniki mogą być wykorzystane do uzasadnienia i ukierunkowania dogłębnych badań uzupełniających. Procedura ta może być przeprowadzona w średnim czasie 4 godzin i obejmuje ocenę żywotności komórek, produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), migracji w czasie rzeczywistym i fagocytozy drożdży na szkiełkach szkiełkowych, pozostawiając wystarczającą ilość komórek do bardziej szczegółowych podejść, takich jak badania omiczne. Co więcej, procedura obejmuje sposób na łatwą obserwację wstępnej sugestii NET po szybkim barwieniu panoptycznym zaobserwowanym za pomocą mikroskopii świetlnej, przy braku specyficznych markerów, aczkolwiek wystarczających, aby wskazać, czy dalsze wysiłki w tym kierunku byłyby warte zachodu. Różnorodność testowanych funkcji łączy punkty wspólne dla testów, skracając czas analizy i zmniejszając koszty. Procedura została nazwana NeutroFun Screen i choć ma ograniczenia, równoważy wyżej wymienione czynniki. Co więcej, celem tej pracy nie jest konkretny zestaw testów, ale raczej wytyczna, którą można łatwo dostosować do zasobów i wymagań każdego laboratorium.

Wprowadzenie

Neutrofile są najliczniejszymi wrodzonymi komórkami odpornościowymi w ludzkiej krwi i są znane z tego, że odgrywają główną rolę w infekcjach i stanach zapalnych, będąc pierwszymi ratownikami, którzy docierają do miejsca uszkodzenia tkanki1. W ostatnich latach coraz częściej dostrzega się kluczową rolę, jaką neutrofile odgrywają w różnych chorobach oraz we wspieraniu homeostazy2. Neutrofile nie tylko mają ściśle regulowaną sygnalizację, ale także uczestniczą w regulacji innych składników układu odpornościowego3,4,5. Dlatego badanie neutrofili i ich wielu nietypowych funkcji komórkowych, takich jak chemotaksja, migracja odwrotna6, fagocytoza7, breathing burst8 oraz uwalnianie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NETs)7, jest niezbędne w wielu kontekstach badawczych, w których konieczna jest ocena potencjalnych zmian funkcjonalnych, morfologicznych lub molekularnych neutrofili wywołanych przez określone warunki w warunkach analiza.

Świeżo wyizolowane neutrofile są nieuleczalnie zróżnicowane, krótkotrwałe, bardzo dynamiczne i łatwo aktywowane9. Jednak nie osiągnięto jeszcze skutecznej metody przechowywania, która nie wpływa na odpowiedzi neutrofili, co utrudnia wykonywanie wielu testów, które muszą być nieprzerwane. Co więcej, wcześniej opisane analizy funkcjonalne 10,11, oparte na testach wymagających cytometrii i/lub barwienia fluorescencyjnego, mogą nie być realnym wyborem, gdy potrzebna jest szeroka i wstępna ocena neutrofili.

Aby rozwiązać te problemy, ten protokół opisuje zestaw testów, które mogą być przeprowadzone po pojedynczym procesie izolacji, w tym ocena żywotności komórek, produkcja reaktywnych form tlenu (ROS), migracja w czasie rzeczywistym i fagocytoza Saccharomyces cerevisiae, których wyniki mogą być wykorzystane do przeprowadzenia szczegółowych badań uzupełniających. Procedura ta, nazwana NeutroFun Screen, została zaprojektowana tak, aby obejmowała wiodące czynności efektorowe, z wyjątkiem degranulacji, i może być wykonana w średnim czasie 4 godzin, w tym 1 godzinę aktywacji. Ponadto pozostałe komórki można wykorzystać do bardziej szczegółowych podejść, takich jak badania omiczne. Zaletą tej metody jest równowaga między szybkością, kompleksowością, kosztem i dokładnością.

Ponadto, istnieje sposób na łatwe zaobserwowanie wstępnej sugestii NETs, bez konkretnych znaczników, ale wystarczających, aby wskazać, czy dalsze wysiłki w tym kierunku byłyby warte zachodu. Różnorodność testowanych funkcji ma na celu połączenie punktów wspólnych między testami, skrócenie czasu i kosztów analizy. Głównym celem tej metody jest zapewnienie zrównoważonej, funkcjonalnej analizy dotyczącej szybkości, kompleksowości, kosztów i dokładności, która pozwala na przegląd odpowiedzi neutrofili, co czyni ją użytecznym początkowym krokiem w badaniu wpływu nowych bodźców na neutrofile o normalnej gęstości.

Protokół

Wszystkie eksperymenty były prowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi etycznymi określonymi przez komisję rewizyjną Uniwersytetu w Brasilii (proces 13364819.0.0000.5558), a próbki oznaczono kodami, aby zapewnić anonimowość dawców. Komórki pozyskano od zdrowych mężczyzn w wieku 18–35 lat, którzy podpisali świadomą zgodę i spełniali następujące kryteria kwalifikacji: niepalenie tytoniu ani papierosów elektronicznych, brak przewlekłych schorzeń oraz brak stanów zapalnych w ciągu ostatnich 14 dni.

1. Pobieranie krwi

  1. Aseptycznie nanieś 0,3 ml heparyny o stężeniu 5 000 IU/ml (patrz Tabela materiałów) w sterylnej strzykawce o pojemności 20 ml w celu jej heparynizacji.
  2. Założyć stazę żylną około 10 cm powyżej miejsca nakłucia i zidentyfikować żyłę łokciową środkową lub żyłę cephaliczną w celu wykonania wenipunkcji.
    UWAGA: Należy upewnić się, że całkowity czas założenia stazy nie przekracza 1 min.
  3. Oczyścić miejsce nakłucia 70% alkoholem i przeprowadzić wenipunkcję.
  4. Po pobraniu krwi należy delikatnie odwrócić strzykawkę trzy lub cztery razy, aby prawidłowo wymieszać krew z heparyną.

2. Izolacja neutrofili

UWAGA: Leukocyty polimorfonuklearne (PMNs) są izolowane poprzez wirowanie w gradiencie gęstości, a następnie hipotoniczną lizę pozostałych erytrocytów (RBC), zgodnie z wcześniejszym opisem11 z pewnymi zmianami. Metoda ta nie jest obowiązkowa do przeprowadzenia testów przesiewowych i może zostać zastąpiona, o ile wybrana metoda zapewni żywotność >97%, priming lub aktywację <3% PMNs oraz dostarczy wystarczającą liczbę komórek do wszystkich testów, powtórzeń i warunków. Przeprowadzanie tych etapów w warunkach aseptycznych i stosowanie roztworów wolnych od endotoksyn jest obowiązkowe, aby uniknąć aktywacji komórek.

  1. Przygotować 12 ml rozcieńczeń mediów separacyjnych o stężeniu 60% i 70% (dostępnych komercyjnie; patrz Tabela materiałów) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml.
  2. Przygotuj gradient od dołu do góry, dodając po 4 ml roztworu o stężeniu 60% nad roztwór o stężeniu 70%, używając pipety o pojemności 5 ml. Czynność tę wykonuj ostrożnie, aby zapobiec zmieszaniu warstw na granicy faz.
  3. Ostrożnie nanieś 12 ml heparynowanej krwi warstwą na gradient gęstości. Centryfuguj przy 200 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Od tego momentu, aż do aktywacji PMN, wszystkie używane odczynniki i probówki muszą być przechowywane w chłodni z lodem.
  4. Odrzuć warstwę osocza/komórek mononuklearnych, a następnie ostrożnie przenieś warstwę znajdującą się nad osadem erytrocytów do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml, rozdzielając ją po około 7,5 ml do każdej z nich. Uzupełnij objętość w probówkach zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS; patrz Tabela materiałów).
  5. Wirować przy 300 x g przez 5 min w temp. 19 °C.
  6. Przemyj osad komórkowy roztworem HBSS.
    1. Odlać supernatant z probówki, a następnie delikatnie resuspender osad w 7 ml HBSS.
    2. Wiruj przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 19 °C aby usunąć wszystkie media separacyjne.
  7. Przeprowadź lizę hipotoniczną pozostałych erytrocytów.
    1. Odrzucić supernatant i połączyć osady w jednej probówce.
    2. Resuspend pellet RBC/PMN w 3 ml sterylnego H2i dodaj 3 ml HBSS (2x) w ciągu 25 s w celu przywrócenia osmolarności. Następnie odwiruj przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 19 °C.
    3. Powtórz kroki 2.8.1 i 2.8.2, aż do uzyskania białego osadu pozbawionego erytrocytów.
      UWAGA: Nadpłyn należy usunąć jak najszybciej, aby zminimalizować kontakt neutrofili z produktami rozpadu erytrocytów. Alternatywnie drugą lizę hipotoniczną można zastąpić delikatnym resuspensowaniem pozostałej warstwy erytrocytów i usunięciem całego nadpłynu, ponieważ pozostałe erytrocyta osadzą się powyżej granulocytów wielniasymiarowych (PMN).
  8. Odlać supernatant, delikatnie resuspender PMN w pozostałym buforze, a następnie przenieść je do schłodzonej na lodzie mikroprobówki.
    UWAGA: Podczas przenoszenia resuspendowanych komórek za pomocą mikropipety należy odnotować ich objętość.
  9. Przenieś 3 x 1 µL zawiesiny komórkowej na czyste szkiełko przedmiotowe (trzy dołki z 1 µL po jednym) i zabarwić preparatem Fast Panoptic (patrz Tabela materiałów) do oceny morfologii i czystości12.
    1. Aby wykonać barwienie preparatem Fast Panoptic, należy pięciokrotnie zanurzyć szkiełko w fiksatorze Panoptic.° 1, sześć razy w eozynie n° 2, a następnie dwukrotnie w hematoksylinie n° 3, przy czym każde zanurzenie trwa 1 s.
    2. Ostrożnie opłucz szkiełko przedmiotowe wodą destylowaną.
    3. Pozostawić do odcieknięcia i wyschnięcia na powietrzu.
  10. Obserwować pod mikroskopem i policzyć 300 losowych komórek w każdej studzience, odróżniając w ten sposób neutrofile od pozostałych granulocytów.
  11. Transfer 1 µL zawiesiny komórkowej do 49 µL 0,2% roztworu błękitu trypanu13 następnie należy policzyć komórki przy użyciu komory Neubauera, rozróżniając komórki martwe od żywotnych.
  12. Dostosuj stężenie komórek do poziomu 6 667 komórek/µL przy użyciu roztworu składającego się z 50% autologicznej plazmy i 50% HBSS z dodatkiem wapnia i magnezu. Podziel 6 667 komórek/µL zawiesinę równomiernie pomiędzy mikroprobówki odpowiadające testowanym warunkom, w tym kontrolę negatywną.
    UWAGA: Można zastosować dowolne stężenie komórek zbliżone do stężenia neutrofili krążących w organizmie modelowym, jednak dla zapewnienia powtarzalności wyników ważne jest stosowanie tego samego stężenia komórek we wszystkich eksperymentach.

Gradient gęstości Percoll; schemat wirowania; lizy RBC; izolacja PMN; metoda separacji komórek.
Rysunek 1: Protokół izolacji neutrofili. Dwa stężenia medium separacyjnego (percoll) (A) są nakładane warstwowo (B), następnie krew zostaje naniesiona na górę gradientu separacyjnego (C). Po wirowaniu PMN znajduje się w warstwie środkowej (D), która zostaje podzielona do dwóch probówek o pojemności 15 mL (E). Zawiesinę komórkową płukano dwukrotnie w HBSS i wirowano (G-I) w celu usunięcia medium, następnie komórki resuspenderowano, a pozostałe RBC poddano dwóm cyklom lizy hipotonicznej (J-M). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie do aktywacji neutrofili

  1. W mikroprobówkach 1,5 mL przygotować system aktywacji dla każdego z warunków w taki sposób, aby końcowe stężenie komórek wynosiło 6 600 cells/µL. Na przykład, aby przetestować efekty 100 nM fMLP (N-formylo-metionylu-leucylo-fenyloalaniny; patrz Tabela materiałów), dodać 5 µL fMLP o stężeniu 10 µM do 495 µL zawiesiny o stężeniu 6 667 cells/µL. Jako kontrolę negatywną (niestymulowaną) dodać HBSS zawierający Ca2+ i Mg2+.
    UWAGA: W celu zademonstrowania tej metodologii zastosowano następujące końcowe stężenia stymulatorów: 100 nM fMLP, 16 µM fallaksyny, naturalnie występującego peptydu przeciwdrobnoustrojowego14, oraz 100 nM PMA (12-mirystynianu 13-octanu forbolu) (patrz Tabela materiałów).
  2. Inkubować w temperaturze 37 °C bez rotacji.
    ​UWAGA: Wszystkie alikwoty do testów funkcjonalnych są pobierane z tej zawiesiny komórkowej, nazywanej w dalszej części systemu aktywacji.

4. Test z błękitnym chlorkiem nitrotetrazoliu (NBT) do oceny produkcji ROS

  1. Przygotowanie roztworu roboczego NBT: Dla każdego stanu eksperymentalnego przygotować roztwór roboczy NBT (patrz Tabela materiałów) o stężeniu 6 mM zgodnie z poniższymi krokami:
    1. Rozpuścić 0,0005 g NBT w 10 µL dimetylosulforku (DMSO) i mieszać na wortexie przez co najmniej 15 min.
    2. Dodać 90 µL HBSS Ca2+Mg2+ i mieszać na wortexie do 2 min.
      UWAGA: Wszystkie kroki z wykorzystaniem NBT muszą być wykonywane w ciemności.
  2. Wykonanie testu NBT na szkiełku.
    1. Po 20 min aktywacji komórek delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i ostrożnie przenieść 2 µL PMN na czyste szkiełko szklane. Inkubować przez 20 min w komorze nawilżanej w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Nie rozprowadzać zawiesiny komórkowej zbyt szeroko po szkiełku; w przeciwnym razie może ona wyschnąć przed inkubacją.
    2. Dodać 1 µL roztworu roboczego NBT na komórki i inkubować dalej przez 20 min w ciemności.
    3. Wysuszyć szkiełko ciepłym powietrzem i utrwalić kroplą metanolu w każdym okienku przez 1 min. Barwić 0,03% safraniną (patrz Tabela materiałów) przez 1 min.
    4. Delikatnie wypłukać szkiełko szklane wodą destylowaną.
    5. Pozostawić szkiełko do wyschnięcia na powietrzu i obserwować pod mikroskopem.
    6. Policzyć 100 losowych komórek w każdym okienku, rozróżniając neutrofile z i bez złogami formazanu.
  3. Wykonanie spektrofotometrycznego testu NBT.
    1. Po 40 min aktywacji komórek delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i przenieść 90 µL PMN z układu aktywacyjnego do czystej mikroprobówki. Następnie ostrożnie dodać 20 µL roztworu NBT 6 mM. Inkubować w ciemności przez 20 min w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 100 µL 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS; patrz Tabela materiałów) i wymieszać na wortexie.
    3. Poddać sonikacji za pomocą sonikatora końcowego przy amplitudzie 60%, stosując pięć cykli po 15 s każdy z 15-sekundowymi odstępami. Wirować przy 12 000 x g przez 5 min.
    4. Przenieść 60 µL supernatantu do płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem i zmierzyć absorbancję produktu formazanu przy 570 nm.

5. Test fagocytozy

  1. Przygotować zawiesinę o stężeniu 33 000 drożdżaków/µL dla każdego stanu, zgodnie z poniższym opisem:
    1. Do 200 µL HBSS Ca2+Mg2+ dodać około 0,75 mg suchych drożdży (Saccharomyces cerevisiae; patrz Tabela materiałów) i inkubować w termomikserze w temperaturze 100 °C przy 500 obr./min przez co najmniej 15 min.
    2. Zmieszać zawiesinę za pomocą wortexa i przenieść 5 µL zawiesiny drożdży do 45 µL 0,2% barwnika błękitu trypanu. Policzyć drożdżaki, używając komory Neubauera.
    3. Dostosować stężenie początkowej zawiesiny do 33 000 komórek drożdży/µL przy użyciu HBSS Ca2+Mg2+. Przechowywać zawiesinę w lodzie do momentu użycia.
  2. Po 20 min aktywacji komórek delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i przenieść 5 µL układu aktywacyjnego do 5 µL zawiesiny Saccharomyces cerevisiae o stężeniu 33 000 drożdżaków/µL do nowej sterylnej mikroprobówki.
    UWAGA: Stosunek neutrofili do drożdżaków wynosi 1:5 (PMN:drożdżaki).
  3. Bezzwłocznie przenieść 6 µL zawiesiny PMN/drożdże do trzech pól czystego szkiełka przedmiotowego (po 2 µL na pole) i inkubować szkiełko w komorze wilgotnościowej przez 40 min.
    UWAGA: Nie rozprowadzać zawiesiny komórkowej zbyt szeroko po szkiełku; w przeciwnym razie może ona wyschnąć przed zakończeniem inkubacji.
  4. Wysuszyć szkiełko strumieniem gorącego powietrza i zabarwić preparatem fast panoptic, zgodnie z opisem w kroku 2.9 powyżej.
    UWAGA: Trzeci etap barwienia metodą fast panoptic jest krytyczny dla analizy mikroskopowej szkiełka. Barwienie szkiełka przez ≥3 s na tym etapie może sprawić, że będzie ono nieprzydatne do analizy, ponieważ utrudni to odróżnienie drożdżaków od lobów jądra neutrofilów.
  5. Obejrzeć szkiełka pod mikroskopem, przeliczając 100 losowych neutrofili w każdym polu i rozróżniając PMN dodatnie i ujemne pod kątem fagocytozy.
    UWAGA: Obecność co najmniej jednej cząsteczki drożdżaków wewnątrz lub w bezpośrednim kontakcie z błoną komórkową PMN wskazuje na PMN dodatni pod kątem fagocytozy. W przypadku zainteresowania stosunkiem drożdżaków do neutrofili, należy policzyć również liczbę pochłoniętych cząsteczek drożdżaków.

6. Test chemotaksji PMN w czasie rzeczywistym

UWAGA: Test migracji jest przeprowadzany analogicznie do protokołu opisanego wcześniej15, z następującymi modyfikacjami:

  1. Przygotuj gradient chemotaktyczny, dodając 160 µL chemoatraktanta (np. fMLP, IL-8, C5 lub LTB4; patrz Tabela materiałów) do dolnej komory płytki analizatora komórkowego w czasie rzeczywistym (RTCA) opartego na impedancji. W przypadku kontroli negatywnych i próbek ślepych dodaj 160 µL HBSS Ca2+Mg2+.
  2. Zamocuj górną komorę i dodaj 25 µL HBSS Ca2+Mg2+. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 h, aby utworzył się gradient chemotaktyczny.
  3. Po 60 min aktywacji komórek delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i nanieś 60 µL zawiesiny komórkowej do górnej komory. Do próbki ślepej dodaj 60 µL HBSS Ca2+Mg2+.
  4. Umieść płytkę RTCA i zaprogramuj oprogramowanie RTCA tak, aby mierzyło indeks komórkowy (CI) co 60 s przez 2 h.
    UWAGA: Płytki RTCA można myć w celu ponownego użycia zgodnie z wcześniejszym opisem16. W skrócie: przemyj komory i elektrody RTCA trzy vezes solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), a następnie dwa razy wodą ultrapurystyczną typu I. Inkubuj dolną i górną komorę z 0,25% trypsyną oraz 0,53 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przez 40 min. Przemyj wodą ultrapurystyczną trzy razy.

7. Analiza sugerująca obecność NET

  1. Po 10 min aktywacji komórek, delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i przenieś 4 µL PMN z każdego badanego systemu aktywacji, dzieląc je na dwie studzienki czystego szkiełka przedmiotowego. Inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  2. Dodaj 1 µL DNAse I do jednej ze studzienek i inkubuj przez 20 min w temperaturze 37 °C (w wilgotnej komorze).
  3. Osusz szkiełko i zabarw preparatem fast panoptic, zgodnie z opisem w kroku 2.9 sekcji „izolacja neutrofili”.
  4. Oceń preparaty pod mikroskopem.
    UWAGA: Poszukuj wszelkich oznak uwalniania NET, charakteryzujących się obecnością struktur przypominających sieć. Po ich zidentyfikowaniu potwierdź, czy traktowanie DNAse I było w stanie usunąć takie struktury. Test ten sugeruje tworzenie się NET, gdyż do potwierdzenia ich obecności wymagane są dodatkowe analizy.

Wyniki

Metoda izolacji oparta na gęstości zastosowana w niniejszym badaniu (Rysunek 1) spełniła kryteria wymagane dla proponowanych eksperymentów. Parametry neutrofili uzyskane tą metodą obejmowały żywotność ≥98%, czystość ≥94% oraz wydajność komórkową ≥1,5 x 107, przy braku wykrywalnej aktywacji w testach przesiewowych. Dwoma istotnymi etapami izolacji PMN są przeciwkrzepliwość oraz usuwanie RBC. Utrzymywanie probówki lub strzykawki z krwią przeciwkrzepliwą w delikatnym ruchu kołyszącym przed nałożeniem na gradient gęstości oraz wybór metody usuwania RBC w celu zapobiegania zarówno aktywacji, jak i kontaminacji mogą wpływać na wydajność i powtarzalność eksperymentu.

W celu przeprowadzenia funkcjonalnego przeglądu działania neutrofili opracowano schemat postępowania, który pozwolił na wykonanie proponowanych testów przesiewowych przez co najmniej dwóch badaczy w średnim czasie 4 h, przy czym 1 h przeznaczono na aktywację, a 2 h na monitorowanie migracji w czasie rzeczywistym, co przedstawiono na Rysunku 2.

Proces izolacji PMN, schemat badania NET, oś czasu migracji komórek; mikroskopia, konfiguracja analizy RTCA.
Rycina 2: Schemat NeutroFun Screen. W celu oceny panelu odpowiedzi funkcjonalnych wywołanych przez specyficzne badane warunki, schemat NeutroFun Screen zakłada udział co najmniej dwóch badaczy. Badacz 1 (R1) rozpoczyna proces izolacji PMN, po którym następuje dostosowanie stężenia komórek i inkubacja w systemie aktywacyjnym, podczas gdy równolegle badacz 2 (R2) przygotowuje materiały do przeprowadzenia kolejnych testów, które są podzielone między nich: R1 wykonuje testy fagocytozy, NET oraz spektrofotometryczne testy NBT; R2 przeprowadza testy migracji w czasie rzeczywistym oraz testy NBT na szkiełkach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Klasyczny test NBT17 zoptymalizowano zarówno pod kątem oceny na preparatach, jak i spektrofotometrycznej oceny tworzenia formazanu w wyniku reakcji NBT z RWP generowanymi przez PMN. Analiza spektrofotometryczna umożliwiła względną kwantyfikację pomiędzy poszczególnymi warunkami, natomiast analiza mikroskopowa była przydatna do opisu i analizy półilościowej, pozwalając ocenić regularność rozmieszczenia kryształów, morfologię oraz liczbę komórek zawierających formazan. Wyniki analizy spektrofotometrycznej przedstawiono na Rysunku 3A, wskazując, że 100 nM PMA indukuje zwiększoną produkcję RWP (w średnim stosunku 3:2:1) w porównaniu z grupami fMLP i kontrolną. Wyniki testu NBT na preparatach (Rysunek 3B) potwierdziły wyniki spektrofotometryczne, wykazując również PMA jako najsilniejszy bodziec indukujący produkcję RWP w porównaniu z fMLP (Rysunek 3C), co zostało wcześniej wykazane poprzez bezpośredni pomiar RWP za pomocą cytometrii18. W odniesieniu do liczenia komórek, liczba neutrofili zawierających kryształy formazanu wykazała stosunek 7:4:1 w warunkach PMA:fMLP:kontrola, ujawniając również różne wzorce rozmieszczenia formazanu pomiędzy PMN aktywowanymi przez fMLP a PMA; traktowanie fMLP prowadziło do intensywnej aktywacji pojedynczych komórek, podczas gdy PMA indukowało tworzenie kryształów formazanu rozproszonych w całej cytoplazmie w większości PMN. Ponadto zaobserwowano kilka cech morfologicznych różniących te warunki, takich jak wyraźna agregacja komórek po traktowaniu PMA. Brak takich typowych cech aktywacji oraz niskie poziomy formazanu w grupie kontrolnej wskazały, że stan spoczynku nie został istotnie zaburzony. Zatem test NBT okazał się prostym, niedrogim i niezawodnym badaniem produkcji RWP przez neutrofile, które może być stosowane do oceny zdolności i intensywności danego bodźca do indukcji produkcji RWP.

Wykres absorbancji, obrazy z mikroskopu i wykres słupkowy przedstawiają odpowiedź neutrofili na CTRL, fMLP, PMA.
Rysunek 3: Test NBT. (A>) Ocena spektrofotometryczna wyrzutu oddechowego neutrofili w różnych warunkach (kontrola negatywna: 100 nM fMLP i 100 nM PMA) na podstawie absorbancji formazanu (490-630 nm). Dane od czterech dawców przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). * = wszystkie grupy różnią się od siebie (p≤ 0,05); £ = Porównania CTRL względem PMA oraz fMLP względem PMA wykazują istotne różnice (p≤ 0,05). (B>) Test na szkiełku może być analizowany jakościowo, określając intensywność złogów formazanu, ich lokalizację wewnątrz komórki oraz agregację komórek. Czarne strzałki wskazują kryształy formazanu. Paski skali: 20 µm. (C>) Liczba PMN zawierających formazan, policzona za pomocą mikroskopii optycznej. Dane od ośmiu dawców przedstawiono jako średnia ± SD. *** p < 0,0001, test t Studenta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Preparaty do badania fagocytozy wykorzystano do określenia wskaźnika fagocytozy jako procentu neutrofili wykazujących aktywność fagocytarną, co przedstawiono na Rysunku 4. Chociaż zarówno 100 nM fMLP, jak i 16 µM peptydy przeciwdrobnoustrojowej indukowali pozornie zwiększone pochłanianie drożdżaków, różnica ta nie była istotna statystycznie aż do momentu podwójnej stymulacji, która znacząco nasiliła fagocytozę w porównaniu z grupą kontrolną i może sugerować występowanie odpowiedzi w wyniku podwójnej stymulacji.

Analiza fagocytozy; wykres słupkowy; efekty peptydów przeciwdrobnoustrojowych; obrazy mikroskopowe; porównanie danych.
Rycina 4: Test fagocytozy. Neutrofile oceniano pod kątem ich zdolności do fagocytozy (liczenie neutrofili zawierających drożdże). Chociaż ekspozycja na 100 nM fMLP lub 16 µM peptyd przeciwdrobnoustrojowy przed inkubacją z drożdżami zwiększyła fagocytozę w porównaniu z grupą kontrolną, (A) wzrost ten nie był istotny statystycznie. Co interesujące, wstępna inkubacja z fMLP, a następnie dodanie peptydy przeciwdrobnoustrojowego, doprowadziła do znaczącego zwiększenia fagocytozy w ludzkich neutrofilach (gwiazdka między CTRL a fMLP + peptyd przeciwdrobnoustrojowy). (B) Czarne strzałki wskazują komórki drożdży, zielone strzałki wskazują same neutrofile, a czerwone strzałki wskazują neutrofile dokonujące fagocytozy. Dane od pięciu dawców przedstawiono jako średnia ± SD. Paski skali: 20 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przykład wyników migracji komórek w czasie rzeczywistym przedstawiono na Rysunku 5, obrazującym znany efekt chemotaktyczny 100 nM fMLP na neutrofile. Kinetyka migracji komórek została dopasowana do modelu Gompertza, co umożliwiło porównanie jego parametrów.

Wykres porównujący wzrost indeksu komórkowego; fMLP vs CTRL; dopasowanie danych za pomocą funkcji wykładniczej; serie czasowe.
Rycina 5: Migracja komórek w czasie rzeczywistym. Indeks komórkowy odzwierciedla impedancję elektryczną wynikającą z migracji komórek. W tym teście fMLP zastosowano jako kontrolę pozytywną migracji neutrofilów, dodając 100 nM fMLP do dolnej komory. Kontrola negatywna (CTRL) zawierała w dolnej komorze wyłącznie HBSS. Nałożone krzywe przedstawiają dopasowanie danych do modelu Gompertza, zmodyfikowanego w celu optymalnego dopasowania do nachyleń wstępujących i opadających. Dane od trzech dawców, przedstawione jako średnia ± SD.* p < 0,05, test t Studenta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Na koniec przedstawiono prosty test z użyciem mikroskopii optycznej sugerujący obecność NET, w którym PMN-y barwiono barwnikiem panoptycznym. Można zaobserwować, że w przypadku niektórych specyficznych bodźców indukujących NET, takich jak PMA lub niektóre peptydy przeciwdrobnoustrojowe, nawet po krótkim czasie aktywacji (1 h) widoczne są włókniste struktury przypominające sieci w pobliżu komórek, podczas gdy nie występuje to w innych warunkach, takich jak kontrola negatywna i fMLP (Rycina 6). Aby lepiej poprzeć tę tezę, po 40 min aktywacji komórek za pomocą 100 nm PMA lub peptydu przeciwdrobnoustrojowego dodano DNazę I, co doprowadziło do usunięcia struktur typu NET (Rycina 6). Chociaż metoda ta nie nadaje się do pełnej charakterystyki NET i może być podatna na artefakty, stanowi ona tani, prosty i interesujący punkt wyjścia do uzasadnienia dalszych nakładów na analizę NET, szczególnie w kontekstach, w których efekty bodźców są nieznane lub słabo opisane.

Reakcja neutrofili pod wpływem PMA, fMLP i peptydów; mikroskopia, odpowiedź komórkowa, badanie immunologiczne.
Rysunek 6: Test sugerujący tworzenie NET. Jakościowa analiza neutrofili barwionych panoptykiem po 1 h aktywacji na szkiełku przedmiotowym może wskazywać na uwalnianie NET. Grupy CTRL (A,B) oraz fMLP (C,D) nie wykazały żadnych oznak uwalniania NET, podczas gdy aktywacja PMA (E-H) indukowała tworzenie struktur podobnych do NET, które uległy degradacji po zastosowaniu DNase I (I-L). Badanie wpływu peptydu przeciwbakteryjnego na neutrofile wykazało, że taki bodziec może być w stanie wywołać uwalnianie NET, ponieważ na szkiełkach pojawiły się struktury podobne do NET (M-P), które zostały zdegradowane przez DNase I (Q-T). Czerwone strzałki wskazują struktury podobne do NET. Paski skali: 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Neutrofile są bardzo dynamicznymi i wrażliwymi komórkami, które żyją krótko i nie mogą być jeszcze kriokonserwowane19, co sprawia, że badania nad ich biologią są trudne. Dlatego ważne jest, aby postępować ostrożnie w celu uzyskania żywotnych, wzbogaconych i spoczynkowych neutrofili 11,20. W badaniu tym zastosowano technikę izolacji opartą na gęstości, która kładzie nacisk na delikatną i minimalną manipulację, a także stosowanie niskich temperatur aż do etapu aktywacji. Dodatkowo przetwarzanie krwi musi nastąpić w ciągu 30 minut po wkłuciu żyły i być przechowywane w temperaturze pokojowej. Niniejsza praca przedstawia możliwość zmniejszenia stresu manipulacyjnego i czasu eksperymentu. Aby jeszcze bardziej uprościć ten proces, wprowadziliśmy nowy krok (jako opcję) w protokole, który polega na usunięciu erytrocytów poprzez delikatne ponowne zawieszenie i aspirację warstwy erytrocytów po pojedynczej procedurze hemolizy. Ten etap zmniejsza stres manipulacyjny i czas eksperymentu, ponieważ usuwa większość erytrocytów za pomocą tylko jednego etapu hemolizy hipotonicznej. Należy jednak zauważyć, że umiejętności operatora mają duży wpływ na skuteczność tego kroku i nie zawsze może on całkowicie usunąć erytrocyty. Co więcej, aspiracja erytrocytów może prowadzić do utraty neutrofili, ale nie wpływa to na plon, ponieważ więcej neutrofili zostało początkowo odzyskanych z gradientu, gdy zbierano je bliżej warstwy erytrocytów. W związku z tym aspiracja RBC jest zalecana, jeśli testy nie wymagają najwyższej możliwej czystości lub jeśli operator ma niezmiennie dobre wyniki. W przypadku przedstawionych tutaj badań przesiewowych niewielka ilość zanieczyszczeń krwinkami czerwonymi (<3%) nie zakłóciłaby wyników.

Aby upewnić się, że wszystkie procedury są wykonywane w odpowiednim czasie, w tym przygotowanie odczynników, przedstawiono przepływ pracy (rysunek 2), który szczegółowo określa harmonogram i podział zadań między dwoma badaczami. Po zakończeniu wszystkich testów funkcjonalnych pozostałe komórki można przygotować do dalszych badań molekularnych, takich jak badania omiczne poprzez lizę komórek z odpowiednim buforem do lizy i przechowywaniem.

Produkcja ROS
Wybuch oddechowy jest cechą charakterystyczną pobudzania i aktywacji neutrofili18,21, a ocena produkcji ROS jest powszechną metodą stosowaną do szacowania stanu aktywacji neutrofili. W badaniu tym oceniano produkcję ROS przy użyciu dwóch podejść: mikroskopii optycznej i spektrofotometrii.

Test NBT jest dobrze znanym podejściem do oceny wybuchu oddechowego u neutrofili22,23. Dwie powszechnie stosowane metody to testy oparte na mikroskopii optycznej (lub teście szkiełkowym) i spektrofotometrii 24,25,26. Chociaż mikroskopia optyczna pozwala na wizualizację szczegółów na poziomie komórki, jest podatna na stronniczość użytkownika. W związku z tym test szkiełkowy NBT służy jako jakościowe uzupełnienie testu spektrofotometrycznego dotyczącego cech fenotypowych, takich jak wzorce tworzenia formazanu, intensywność i agregacja komórek.

Krytycznymi etapami zarówno dla szkiełka NBT, jak i testów spektrofotometrycznych są całkowita rozpuszczalność NBT i formazanu. Wbrew zaleceniom producenta, NBT nie rozpuszcza się dobrze w wodzie. Jednak homogenizacja NBT w DMSO przez co najmniej 15 minut, a następnie dodanie wody/HBSS i wirowanie przez 2 minuty zapewnia całkowitą rozpuszczalność. Ponadto, aby przeanalizować absorbancję formazanu, należy osiągnąć dwa krytyczne etapy: (1) uwolnienie kryształów formazanu z komórek przez lizę PMN oraz (2) całkowite rozpuszczenie kryształów formazanu. Oba etapy osiągnięto poprzez potraktowanie osadu komórkowego 10% SDS, jak ostatnio sugerowano27, a następnie analizę sonikacji i absorbancji supernatantu przy 570 nm.

Ponadto wyniki NBT w ujemnych i pozytywnych grupach kontrolnych są pierwszym etapem badań przesiewowych, które należy ocenić. Ten krok musi wykazać niezwykłą różnicę, ponieważ ocena produkcji ROS za pomocą formazanu wskazuje, czy proces izolacji mógł być odpowiedzialny za niepożądane zmiany w stanie spoczynku komórek, czy to poprzez stymulację, czy hamowanie.

Inne metody, takie jak redukcja cytochromu c28 lub analiza cytometrii przepływowej29, są często stosowane do wykrywania ROS; Biorąc jednak pod uwagę podejście przesiewowe, ich zastosowanie wymaga dłuższego czasu eksperymentu, użycia specjalnych markerów i drogich instrumentów. Chemiluminescencja luminolu/izoluminolu jest szybką i opłacalną metodą wykrywania ROS, a jednocześnie umożliwia różnicowanie wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych ROS. Jednak do tej metody wymagany jest luminometr30,31. Chociaż koszt instrumentu można obejść poprzez wykorzystanie urządzenia, nadal nie nadawałoby się ono do analizy przesiewowej wykonywanej jednocześnie z innymi testami.

Fagocytozy
Inkubacja PMN/drożdży zapewnia przegląd zdolności i skuteczności fagocytozy neutrofili poprzez zliczenie liczby neutrofili wykonujących fagocytozę oraz liczby drożdży pochłoniętych na neutrofil. Jednakże, ponieważ cząstka drożdży sama w sobie jest sygnałem aktywacji, porównanie grupy kontrolnej ze wstępnie potraktowanym PMN stanowi system podwójnej stymulacji, który może nie wykazywać znaczących zmian, jak pokazano w przypadku PMN traktowanego CTRL w porównaniu z fMLP (Figura 4). Niemniej jednak test ten jest przydatny do wskazania, czy potencjalny modulator miałby jakikolwiek wpływ na fagocytozę. Za pomocą tego testu przetestowano nowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy, a wyniki wskazują na interesującą potencjalną reakcję na tę kombinację bodźców, która została niedawno omówiona jako potrzebna do skutecznej aktywacji32.

Krytycznym etapem tego testu jest barwienie, ponieważ analiza staje się niewiarygodna, jeśli szkiełko jest trzymane na panoptyce nr 3 (hematoksylinie) przez ≥3 s. Dzieje się tak, ponieważ komórek drożdży i płatów jądrowych neutrofili nie można od siebie odróżnić. Co więcej, podejście to pozwala na analizę morfologii neutrofili po ekspozycji na modulatory. Cytometria przepływowa jest kolejną skuteczną techniką analizy fagocytozy33, chociaż ma ograniczenia wynikające z trudności w rozróżnieniu między cząstkami związanymi z błoną a pochłoniętymi przez błonę oraz innymi czynnikami związanymi z proponowanym zestawem przesiewowym, jak omówiono w poprzednim temacie. To samo ograniczenie obserwuje się w metodzie opisanej w niniejszym dokumencie, chociaż należy ją traktować jako wstępne badanie przesiewowe w celu ukierunkowania dalszych badań.

Migracja w czasie rzeczywistym
Protokół badań przesiewowych w czasie rzeczywistym został zoptymalizowany pod kątem oceny zdolności migracyjnej PMN. Chociaż poprzednie badanie sugerowało, że pokrycie spodu płytki RTCA było konieczne, aby test migracji wykazał różnicę między kontrolą ujemną a traktowaniem IL-815, badanie to wykazało wysokie wartości przedziału ufności (CI) dla komórek traktowanych fMLP bez dodatku środków powlekających. Wyniki wykazały wysoką powtarzalność przy znacznej migracji od 12 minut. Co więcej, analiza dopasowania krzywych uzyskanych danych migracyjnych może ujawnić parametry, takie jak maksymalny indeks komórek oraz wzrost i spadek nachylenia, które są przydatne do zrozumienia dynamiki migracji i mogą zależeć od stężenia lub różnić się w zależności od warunków. Najlepszym dopasowaniem do krzywych migracji neutrofili (ryc. 5) była skorygowana funkcja Gompertza34, pokazująca, że fMLP zwiększa maksymalny indeks komórek i zwiększa nachylenie.

Należy zwrócić szczególną uwagę, aby uniknąć pęcherzyków w systemie RTCA, ponieważ mogą one blokować ogniwa przechodzące przez elektrody, zagrażając eksperymentowi. Czynnikiem ograniczającym jest wysoki koszt płyt. Chociaż tańsze techniki analizują migrację komórek, brakuje im dobrej odtwarzalności lub są trudne i czasochłonne, jak w przypadku komory Boydena35. W związku z tym RTCA jest wiarygodną analizą migracji kompatybilną z innymi przedstawionymi tutaj testami przesiewowymi.

Sieci
Wreszcie, opracowano obiecujący, łatwy i tani test do wstępnej oceny powstawania NET przy użyciu mikroskopii optycznej. Uzyskano go na podstawie obserwacji szkiełek fagocytozy, w których PMA, specyficzny bodziec indukujący NET, badany pod kątem wpływu na zdolność fagocytozy, indukował również tworzenie struktury przypominającej pajęczynę w porównaniu z grupami CTRL i fMLP. W tej pracy postawiono hipotezę, że struktury te mogą wskazywać na wydanie NET. Hipotezę taką przetestowano, traktując próbki DNazą I po aktywacji, gdzie nie znaleziono żadnych nitkowatych struktur w neutrofilach aktywowanych PMA. Założenie, że takie struktury mogą być NET, opiera się na fakcie, że PMA jest cytowany jako dobrze znany induktor powstawania NET36,37, odkryciu podobnych struktur za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu specyficznych markerów dla NET38,39 oraz degradacji NET katalizowanej przez DNazę I40,41. Należy podkreślić, że nie jest to metoda potwierdzania powstawania NET, a jedynie wstępne badanie, które sugeruje obecność NET. Chociaż ten test ma ograniczenia, ponieważ NET można pomylić z artefaktami barwiącymi, służy on istotnemu celowi, sugerując tworzenie NET w szybkim i tanim badaniu przesiewowym, które można przeprowadzić razem z innymi testami funkcjonalnymi. Po wykryciu, że mogą być istotne dla badania przesiewowego, NET mogą być dalej oceniane za pomocą mikroskopii konfokalnej lub elektronowej42, jak omówiono później.

W naszym laboratorium nowe peptydy przeciwdrobnoustrojowe, które również mogą mieć działanie immunomodulujące, są często oceniane za pomocą tego zestawu testów przesiewowych, aby lepiej kierować dalszą analizą wpływu niektórych peptydów na ludzkie neutrofile, ponieważ niektóre wykazują interesujące właściwości ROS43, fagocytozy, migracji i / lub modulacji NET.

Podsumowując, NeutroFun Screen oferuje cenne narzędzie do identyfikacji potencjalnych modulatorów aktywności neutrofili o normalnej gęstości na podstawie dużej liczby nieprzebadanych związków. Należy jednak pamiętać, że ta metoda służy jedynie jako wstępne badanie przesiewowe. Po tym wstępnym badaniu przesiewowym droższe, bardziej zaawansowane i czasochłonne metodologie mogą zostać skierowane do określonych funkcji lub ścieżek sugerowanych przez te pierwsze wyniki w celu walidacji danych. W przypadku produkcji ROS, fagocytozy i tworzenia NET istnieją alternatywne metody walidacji danych i uzyskiwania dalszych wyników ilościowych. Wizualizację i kwantyfikację NET można przeprowadzić za pomocą analizy mikroskopii immunofluorescencyjnej, która określa obecność i nakładanie się zewnątrzkomórkowego DNA i białek ziarnistych, takich jak mieloperoksydaza i elastaza neutrofilowa, jak opisano szczegółowo niedawno42. ROS odgrywają różne kluczowe role w wielu procesach biologicznych, dlatego ich badanie jest bardzo rozpowszechnione i zróżnicowane. Do najbardziej uznanych metodologii należą te, które wykorzystują przeciwciała, takie jak test immunoenzymatyczny (ELISA) i immunoblotting luminescencji lub wykrywanie fluorescencji - takie jak cytometria przepływowa komórek pod różnymi znakami - za pomocą DCFDA, spektroskopii EPR i pomiarów aktywności enzymatycznej44. Podobnie, solidna ocena fagocytozy jest również przeprowadzana na kilka sposobów; Alternatywne metody obejmują samą cytometrię przepływową45,46 lub w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną47. Opisana migracja komórek w czasie rzeczywistym jest solidnym i wystarczającym testem, który nie wymaga dalszej walidacji i przedstawia parametry, których inne metodologie nie mogą uwzględnić. Inne kombinacje takich metod mogą lepiej pasować do konkretnych scenariuszy, ale podsumowując, jest to szybka i niedroga kombinacja, która obejmuje wiele aktywności neutrofili.

Podsumowując, badanie to ma na celu dostarczenie zestawu testów składających się z prostych, szybkich i tanich metodologii do oceny wielu odpowiedzi neutrofili na nowe cząsteczki i warunki, jako sposób na lepsze skierowanie wysiłków w kierunku zaawansowanych metodologii. Jako główne ograniczenia, wyniki testów ROS, NET i fagocytozy należy uznać za wstępne i wymagają dalszej walidacji za pomocą bardziej szczegółowych i wyszukanych testów, a te, które opierają się na niezautomatyzowanym zliczaniu komórek pod mikroskopem, są podatne na nieświadome uprzedzenia.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy uznają następujące agencje finansujące: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP i FINATEC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CIM-Plate 16Agilent 
Czytnik płytek CLARIOstar BMG LABTECHUS Numer patentu 9,733,124
Szczegóły Produktu: Oprogramowanie do analizy danych MARS
Dimetylosulfotlenek Dinâ mika1582
DNAza ISigma - AldrichDN 25
Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodnaSigma - AldrichE5134
Szybkie barwienie panoptyczneLaborclin620529
Szkiełko szkiełkoweExacta7102
Hank' s Zrównoważony roztwór soli z wapniem, z magnezem, bez czerwieni fenolowej.Sigma - Aldrich55037C
Hank' s Zrównoważony roztwór soli bez chlorku wapnia, siarczanu magnezu i wodorowęglanu sodu.Sigma - AldrichH4641
HeparinBlau 
Komora laminarnaVecoVLFS-12
Mikroskop Zeiss415501-0101-002Szczegóły Produktu:
Blok mieszającyBIOERMB-102
Neubauer ulepszony jasny NewOptik1110000
N-formylo-metionylo-leucylo-fenyloalaninaSigma - AldrichF3506
Nitroblue tetrazoliumNeonCAS 298-83-9
PercollCytiva17089101media separacyjne
Phorbol 12-mirystynian 13-octanSigma - AldrichP8139
Tabletka soli fizjologicznej buforowanej fosforanamiSigma - AldrichP4417
ROTOFIX 32 AHettich1206
Saccharomyces cerevisiaeFleischmann
SafraninSigma - Aldrich50240
Dodecylosiarczan soduCytiva17-1313-01
SonicatorQsonicaQ125
Roztwór błękitu trypanowegoVetecCI 23850
Vortex Genie 2Scientific Industries, Inc.0K-0500-902
xCELLigence Analiza komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) DP (podwójne zastosowanie)Agilent 380601050Szczegóły produktu: System RTCA składający się ze sprzętu detekcyjnego, płytek ogniw i oprogramowania
56658250017896014655229 Primostar 1

Bibliografia

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
  3. Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345(2017).
  4. Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
  5. Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147(2019).
  6. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  7. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  8. El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
  9. Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
  10. Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770(2021).
  11. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
  12. Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
  14. Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
  15. Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
  16. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
  17. Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
  18. Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
  19. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  20. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837(2021).
  21. Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991(2021).
  22. Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41(2019).
  23. Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316(2019).
  24. Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
  25. Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153(2019).
  26. Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
  27. Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637(2021).
  28. Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
  29. Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
  30. Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
  31. Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
  32. Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106(2021).
  33. Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27(2021).
  34. Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582(2020).
  35. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337(2017).
  36. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  37. de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
  38. Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
  39. Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
  40. Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
  41. Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
  42. Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
  43. Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790(2020).
  44. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  45. Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825(2021).
  46. Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
  47. Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przesiewowe badanie neutrofiliywotno kom rekreaktywne formy tlenutest fagocytozymigracja w czasie rzeczywistymzewn trzkom rkowe pu apki neutrofiloweizolacja w gradiencie g sto citest NBTtest chemotaksji
Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.