Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65329

⸱

9 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zawiera zestaw testów funkcjonalnych neutrofili, które mają być używane jako metoda przesiewowa w celu pokrycia funkcji z różnych ścieżek sygnałowych. Protokół zawiera wstępną i prostą ocenę żywotności komórek, czystości, produkcji reaktywnych form tlenu, migracji w czasie rzeczywistym, fagocytozy oraz wstępną sugestię pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Streszczenie

Neutrofile są znane jako jedna z pierwszych linii obrony we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i mogą wykonywać wiele szczególnych funkcji komórkowych, takich jak chemotaksja, migracja wsteczna, fagocytoza, degranulacja cytotoksycznych enzymów i metabolitów oraz uwalnianie DNA jako zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NET). Neutrofile nie tylko mają ściśle uregulowaną sygnalizację, ale także uczestniczą w regulacji innych składników układu odpornościowego. Ponieważ świeże neutrofile są terminalnie zróżnicowane, krótkotrwałe i bardzo zmienne wśród osobników, ważne jest, aby jak najlepiej wykorzystać pobrane próbki. Badacze często muszą przeprowadzać testy przesiewowe, aby ocenić przegląd wielu funkcji neutrofili, na które mogą mieć wpływ określone warunki podlegające ocenie. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano zestaw testów przeprowadzających pojedynczy proces izolacji neutrofili o normalnej gęstości, poszukując równowagi między szybkością, kompleksowością, kosztami i dokładnością. Wyniki mogą być wykorzystane do uzasadnienia i ukierunkowania dogłębnych badań uzupełniających. Procedura ta może być przeprowadzona w średnim czasie 4 godzin i obejmuje ocenę żywotności komórek, produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), migracji w czasie rzeczywistym i fagocytozy drożdży na szkiełkach szkiełkowych, pozostawiając wystarczającą ilość komórek do bardziej szczegółowych podejść, takich jak badania omiczne. Co więcej, procedura obejmuje sposób na łatwą obserwację wstępnej sugestii NET po szybkim barwieniu panoptycznym zaobserwowanym za pomocą mikroskopii świetlnej, przy braku specyficznych markerów, aczkolwiek wystarczających, aby wskazać, czy dalsze wysiłki w tym kierunku byłyby warte zachodu. Różnorodność testowanych funkcji łączy punkty wspólne dla testów, skracając czas analizy i zmniejszając koszty. Procedura została nazwana NeutroFun Screen i choć ma ograniczenia, równoważy wyżej wymienione czynniki. Co więcej, celem tej pracy nie jest konkretny zestaw testów, ale raczej wytyczna, którą można łatwo dostosować do zasobów i wymagań każdego laboratorium.

Wprowadzenie

Neutrofile są najliczniejszymi wrodzonymi komórkami odpornościowymi w ludzkiej krwi i są znane z tego, że odgrywają główną rolę w infekcjach i stanach zapalnych, będąc pierwszymi ratownikami, którzy docierają do miejsca uszkodzenia tkanki1. W ostatnich latach coraz częściej dostrzega się kluczową rolę, jaką neutrofile odgrywają w różnych chorobach oraz we wspieraniu homeostazy2. Neutrofile nie tylko mają ściśle regulowaną sygnalizację, ale także uczestniczą w regulacji innych składników układu odpornościowego3,4,5. Dlatego badanie neutrofili i ich wielu nietypowych funkcji komórkowych, takich jak chemotaksja, migracja odwrotna6, fagocytoza7, breathing burst8 oraz uwalnianie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NETs)7, jest niezbędne w wielu kontekstach badawczych, w których konieczna jest ocena potencjalnych zmian funkcjonalnych, morfologicznych lub molekularnych neutrofili wywołanych przez określone warunki w warunkach analiza.

Świeżo wyizolowane neutrofile są nieuleczalnie zróżnicowane, krótkotrwałe, bardzo dynamiczne i łatwo aktywowane9. Jednak nie osiągnięto jeszcze skutecznej metody przechowywania, która nie wpływa na odpowiedzi neutrofili, co utrudnia wykonywanie wielu testów, które muszą być nieprzerwane. Co więcej, wcześniej opisane analizy funkcjonalne 10,11, oparte na testach wymagających cytometrii i/lub barwienia fluorescencyjnego, mogą nie być realnym wyborem, gdy potrzebna jest szeroka i wstępna ocena neutrofili.

Aby rozwiązać te problemy, ten protokół opisuje zestaw testów, które mogą być przeprowadzone po pojedynczym procesie izolacji, w tym ocena żywotności komórek, produkcja reaktywnych form tlenu (ROS), migracja w czasie rzeczywistym i fagocytoza Saccharomyces cerevisiae, których wyniki mogą być wykorzystane do przeprowadzenia szczegółowych badań uzupełniających. Procedura ta, nazwana NeutroFun Screen, została zaprojektowana tak, aby obejmowała wiodące czynności efektorowe, z wyjątkiem degranulacji, i może być wykonana w średnim czasie 4 godzin, w tym 1 godzinę aktywacji. Ponadto pozostałe komórki można wykorzystać do bardziej szczegółowych podejść, takich jak badania omiczne. Zaletą tej metody jest równowaga między szybkością, kompleksowością, kosztem i dokładnością.

Ponadto, istnieje sposób na łatwe zaobserwowanie wstępnej sugestii NETs, bez konkretnych znaczników, ale wystarczających, aby wskazać, czy dalsze wysiłki w tym kierunku byłyby warte zachodu. Różnorodność testowanych funkcji ma na celu połączenie punktów wspólnych między testami, skrócenie czasu i kosztów analizy. Głównym celem tej metody jest zapewnienie zrównoważonej, funkcjonalnej analizy dotyczącej szybkości, kompleksowości, kosztów i dokładności, która pozwala na przegląd odpowiedzi neutrofili, co czyni ją użytecznym początkowym krokiem w badaniu wpływu nowych bodźców na neutrofile o normalnej gęstości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty były prowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi etycznymi określonymi przez komisję rewizyjną Uniwersytetu w Brasilii (proces 13364819.0.0000.5558), a próbki oznaczono kodami, aby zapewnić anonimowość dawców. Komórki pozyskano od zdrowych mężczyzn w wieku 18–35 lat, którzy podpisali świadomą zgodę i spełniali następujące kryteria kwalifikacji: niepalenie tytoniu ani papierosów elektronicznych, brak przewlekłych schorzeń oraz brak stanów zapalnych w ciągu ostatnich 14 dni.

1. Pobieranie krwi

  1. Aseptycznie nanieś 0,3 ml heparyny o stężeniu 5 000 IU/ml (patrz Tabela materiałów) w sterylnej strzykawce o pojemności 20 ml w celu jej heparynizacji.
  2. Założyć stazę żylną około 10 cm powyżej miejsca nakłucia i zidentyfikować żyłę łokciową środkową lub żyłę cephaliczną w celu wykonania wenipunkcji.
    UWAGA: Należy upewnić się, że całkowity czas założenia stazy nie przekracza 1 min.
  3. Oczyścić miejsce nakłucia 70% alkoholem i przeprowadzić wenipunkcję.
  4. Po pobraniu krwi należy delikatnie odwrócić strzykawkę trzy lub cztery razy, aby prawidłowo wymieszać krew z heparyną.

2. Izolacja neutrofili

UWAGA: Leukocyty polimorfonuklearne (PMNs) są izolowane poprzez wirowanie w gradiencie gęstości, a następnie hipotoniczną lizę pozostałych erytrocytów (RBC), zgodnie z wcześniejszym opisem11 z pewnymi zmianami. Metoda ta nie jest obowiązkowa do przeprowadzenia testów przesiewowych i może zostać zastąpiona, o ile wybrana metoda zapewni żywotność >97%, priming lub aktywację <3% PMNs oraz dostarczy wystarczającą liczbę komórek do wszystkich testów, powtórzeń i warunków. Przeprowadzanie tych etapów w warunkach aseptycznych i stosowanie roztworów wolnych od endotoksyn jest obowiązkowe, aby uniknąć aktywacji komórek.

  1. Przygotować 12 ml rozcieńczeń mediów separacyjnych o stężeniu 60% i 70% (dostępnych komercyjnie; patrz Tabela materiałów) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml.
  2. Przygotuj gradient od dołu do góry, dodając po 4 ml roztworu o stężeniu 60% nad roztwór o stężeniu 70%, używając pipety o pojemności 5 ml. Czynność tę wykonuj ostrożnie, aby zapobiec zmieszaniu warstw na granicy faz.
  3. Ostrożnie nanieś 12 ml heparynowanej krwi warstwą na gradient gęstości. Centryfuguj przy 200 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Od tego momentu, aż do aktywacji PMN, wszystkie używane odczynniki i probówki muszą być przechowywane w chłodni z lodem.
  4. Odrzuć warstwę osocza/komórek mononuklearnych, a następnie ostrożnie przenieś warstwę znajdującą się nad osadem erytrocytów do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml, rozdzielając ją po około 7,5 ml do każdej z nich. Uzupełnij objętość w probówkach zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS; patrz Tabela materiałów).
  5. Wirować przy 300 x g przez 5 min w temp. 19 °C.
  6. Przemyj osad komórkowy roztworem HBSS.
    1. Odlać supernatant z probówki, a następnie delikatnie resuspender osad w 7 ml HBSS.
    2. Wiruj przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 19 °C aby usunąć wszystkie media separacyjne.
  7. Przeprowadź lizę hipotoniczną pozostałych erytrocytów.
    1. Odrzucić supernatant i połączyć osady w jednej probówce.
    2. Resuspend pellet RBC/PMN w 3 ml sterylnego H2i dodaj 3 ml HBSS (2x) w ciągu 25 s w celu przywrócenia osmolarności. Następnie odwiruj przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 19 °C.
    3. Powtórz kroki 2.8.1 i 2.8.2, aż do uzyskania białego osadu pozbawionego erytrocytów.
      UWAGA: Nadpłyn należy usunąć jak najszybciej, aby zminimalizować kontakt neutrofili z produktami rozpadu erytrocytów. Alternatywnie drugą lizę hipotoniczną można zastąpić delikatnym resuspensowaniem pozostałej warstwy erytrocytów i usunięciem całego nadpłynu, ponieważ pozostałe erytrocyta osadzą się powyżej granulocytów wielniasymiarowych (PMN).
  8. Odlać supernatant, delikatnie resuspender PMN w pozostałym buforze, a następnie przenieść je do schłodzonej na lodzie mikroprobówki.
    UWAGA: Podczas przenoszenia resuspendowanych komórek za pomocą mikropipety należy odnotować ich objętość.
  9. Przenieś 3 x 1 µL zawiesiny komórkowej na czyste szkiełko przedmiotowe (trzy dołki z 1 µL po jednym) i zabarwić preparatem Fast Panoptic (patrz Tabela materiałów) do oceny morfologii i czystości12.
    1. Aby wykonać barwienie preparatem Fast Panoptic, należy pięciokrotnie zanurzyć szkiełko w fiksatorze Panoptic.° 1, sześć razy w eozynie n° 2, a następnie dwukrotnie w hematoksylinie n° 3, przy czym każde zanurzenie trwa 1 s.
    2. Ostrożnie opłucz szkiełko przedmiotowe wodą destylowaną.
    3. Pozostawić do odcieknięcia i wyschnięcia na powietrzu.
  10. Obserwować pod mikroskopem i policzyć 300 losowych komórek w każdej studzience, odróżniając w ten sposób neutrofile od pozostałych granulocytów.
  11. Transfer 1 µL zawiesiny komórkowej do 49 µL 0,2% roztworu błękitu trypanu13 następnie należy policzyć komórki przy użyciu komory Neubauera, rozróżniając komórki martwe od żywotnych.
  12. Dostosuj stężenie komórek do poziomu 6 667 komórek/µL przy użyciu roztworu składającego się z 50% autologicznej plazmy i 50% HBSS z dodatkiem wapnia i magnezu. Podziel 6 667 komórek/µL zawiesinę równomiernie pomiędzy mikroprobówki odpowiadające testowanym warunkom, w tym kontrolę negatywną.
    UWAGA: Można zastosować dowolne stężenie komórek zbliżone do stężenia neutrofili krążących w organizmie modelowym, jednak dla zapewnienia powtarzalności wyników ważne jest stosowanie tego samego stężenia komórek we wszystkich eksperymentach.

Gradient gęstości Percoll; schemat wirowania; lizy RBC; izolacja PMN; metoda separacji komórek.
Rysunek 1: Protokół izolacji neutrofili. Dwa stężenia medium separacyjnego (percoll) (A) są nakładane warstwowo (B), następnie krew zostaje naniesiona na górę gradientu separacyjnego (C). Po wirowaniu PMN znajduje się w warstwie środkowej (D), która zostaje podzielona do dwóch probówek o pojemności 15 mL (E). Zawiesinę komórkową płukano dwukrotnie w HBSS i wirowano (G-I) w celu usunięcia medium, następnie komórki resuspenderowano, a pozostałe RBC poddano dwóm cyklom lizy hipotonicznej (J-M). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie do aktywacji neutrofili

  1. W mikroprobówkach 1,5 mL przygotować system aktywacji dla każdego z warunków w taki sposób, aby końcowe stężenie komórek wynosiło 6 600 cells/µL. Na przykład, aby przetestować efekty 100 nM fMLP (N-formylo-metionylu-leucylo-fenyloalaniny; patrz Tabela materiałów), dodać 5 µL fMLP o stężeniu 10 µM do 495 µL zawiesiny o stężeniu 6 667 cells/µL. Jako kontrolę negatywną (niestymulowaną) dodać HBSS zawierający Ca2+ i Mg2+.
    UWAGA: W celu zademonstrowania tej metodologii zastosowano następujące końcowe stężenia stymulatorów: 100 nM fMLP, 16 µM fallaksyny, naturalnie występującego peptydu przeciwdrobnoustrojowego14, oraz 100 nM PMA (12-mirystynianu 13-octanu forbolu) (patrz Tabela materiałów).
  2. Inkubować w temperaturze 37 °C bez rotacji.
    ​UWAGA: Wszystkie alikwoty do testów funkcjonalnych są pobierane z tej zawiesiny komórkowej, nazywanej w dalszej części systemu aktywacji.

4. Test z błękitnym chlorkiem nitrotetrazoliu (NBT) do oceny produkcji ROS

  1. Przygotowanie roztworu roboczego NBT: Dla każdego stanu eksperymentalnego przygotować roztwór roboczy NBT (patrz Tabela materiałów) o stężeniu 6 mM zgodnie z poniższymi krokami:
    1. Rozpuścić 0,0005 g NBT w 10 µL dimetylosulforku (DMSO) i mieszać na wortexie przez co najmniej 15 min.
    2. Dodać 90 µL HBSS Ca2+Mg2+ i mieszać na wortexie do 2 min.
      UWAGA: Wszystkie kroki z wykorzystaniem NBT muszą być wykonywane w ciemności.
  2. Wykonanie testu NBT na szkiełku.
    1. Po 20 min aktywacji komórek delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i ostrożnie przenieść 2 µL PMN na czyste szkiełko szklane. Inkubować przez 20 min w komorze nawilżanej w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Nie rozprowadzać zawiesiny komórkowej zbyt szeroko po szkiełku; w przeciwnym razie może ona wyschnąć przed inkubacją.
    2. Dodać 1 µL roztworu roboczego NBT na komórki i inkubować dalej przez 20 min w ciemności.
    3. Wysuszyć szkiełko ciepłym powietrzem i utrwalić kroplą metanolu w każdym okienku przez 1 min. Barwić 0,03% safraniną (patrz Tabela materiałów) przez 1 min.
    4. Delikatnie wypłukać szkiełko szklane wodą destylowaną.
    5. Pozostawić szkiełko do wyschnięcia na powietrzu i obserwować pod mikroskopem.
    6. Policzyć 100 losowych komórek w każdym okienku, rozróżniając neutrofile z i bez złogami formazanu.
  3. Wykonanie spektrofotometrycznego testu NBT.
    1. Po 40 min aktywacji komórek delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i przenieść 90 µL PMN z układu aktywacyjnego do czystej mikroprobówki. Następnie ostrożnie dodać 20 µL roztworu NBT 6 mM. Inkubować w ciemności przez 20 min w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 100 µL 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS; patrz Tabela materiałów) i wymieszać na wortexie.
    3. Poddać sonikacji za pomocą sonikatora końcowego przy amplitudzie 60%, stosując pięć cykli po 15 s każdy z 15-sekundowymi odstępami. Wirować przy 12 000 x g przez 5 min.
    4. Przenieść 60 µL supernatantu do płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem i zmierzyć absorbancję produktu formazanu przy 570 nm.

5. Test fagocytozy

  1. Przygotować zawiesinę o stężeniu 33 000 drożdżaków/µL dla każdego stanu, zgodnie z poniższym opisem:
    1. Do 200 µL HBSS Ca2+Mg2+ dodać około 0,75 mg suchych drożdży (Saccharomyces cerevisiae; patrz Tabela materiałów) i inkubować w termomikserze w temperaturze 100 °C przy 500 obr./min przez co najmniej 15 min.
    2. Zmieszać zawiesinę za pomocą wortexa i przenieść 5 µL zawiesiny drożdży do 45 µL 0,2% barwnika błękitu trypanu. Policzyć drożdżaki, używając komory Neubauera.
    3. Dostosować stężenie początkowej zawiesiny do 33 000 komórek drożdży/µL przy użyciu HBSS Ca2+Mg2+. Przechowywać zawiesinę w lodzie do momentu użycia.
  2. Po 20 min aktywacji komórek delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i przenieść 5 µL układu aktywacyjnego do 5 µL zawiesiny Saccharomyces cerevisiae o stężeniu 33 000 drożdżaków/µL do nowej sterylnej mikroprobówki.
    UWAGA: Stosunek neutrofili do drożdżaków wynosi 1:5 (PMN:drożdżaki).
  3. Bezzwłocznie przenieść 6 µL zawiesiny PMN/drożdże do trzech pól czystego szkiełka przedmiotowego (po 2 µL na pole) i inkubować szkiełko w komorze wilgotnościowej przez 40 min.
    UWAGA: Nie rozprowadzać zawiesiny komórkowej zbyt szeroko po szkiełku; w przeciwnym razie może ona wyschnąć przed zakończeniem inkubacji.
  4. Wysuszyć szkiełko strumieniem gorącego powietrza i zabarwić preparatem fast panoptic, zgodnie z opisem w kroku 2.9 powyżej.
    UWAGA: Trzeci etap barwienia metodą fast panoptic jest krytyczny dla analizy mikroskopowej szkiełka. Barwienie szkiełka przez ≥3 s na tym etapie może sprawić, że będzie ono nieprzydatne do analizy, ponieważ utrudni to odróżnienie drożdżaków od lobów jądra neutrofilów.
  5. Obejrzeć szkiełka pod mikroskopem, przeliczając 100 losowych neutrofili w każdym polu i rozróżniając PMN dodatnie i ujemne pod kątem fagocytozy.
    UWAGA: Obecność co najmniej jednej cząsteczki drożdżaków wewnątrz lub w bezpośrednim kontakcie z błoną komórkową PMN wskazuje na PMN dodatni pod kątem fagocytozy. W przypadku zainteresowania stosunkiem drożdżaków do neutrofili, należy policzyć również liczbę pochłoniętych cząsteczek drożdżaków.

6. Test chemotaksji PMN w czasie rzeczywistym

UWAGA: Test migracji jest przeprowadzany analogicznie do protokołu opisanego wcześniej15, z następującymi modyfikacjami:

  1. Przygotuj gradient chemotaktyczny, dodając 160 µL chemoatraktanta (np. fMLP, IL-8, C5 lub LTB4; patrz Tabela materiałów) do dolnej komory płytki analizatora komórkowego w czasie rzeczywistym (RTCA) opartego na impedancji. W przypadku kontroli negatywnych i próbek ślepych dodaj 160 µL HBSS Ca2+Mg2+.
  2. Zamocuj górną komorę i dodaj 25 µL HBSS Ca2+Mg2+. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 h, aby utworzył się gradient chemotaktyczny.
  3. Po 60 min aktywacji komórek delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i nanieś 60 µL zawiesiny komórkowej do górnej komory. Do próbki ślepej dodaj 60 µL HBSS Ca2+Mg2+.
  4. Umieść płytkę RTCA i zaprogramuj oprogramowanie RTCA tak, aby mierzyło indeks komórkowy (CI) co 60 s przez 2 h.
    UWAGA: Płytki RTCA można myć w celu ponownego użycia zgodnie z wcześniejszym opisem16. W skrócie: przemyj komory i elektrody RTCA trzy vezes solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), a następnie dwa razy wodą ultrapurystyczną typu I. Inkubuj dolną i górną komorę z 0,25% trypsyną oraz 0,53 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przez 40 min. Przemyj wodą ultrapurystyczną trzy razy.

7. Analiza sugerująca obecność NET

  1. Po 10 min aktywacji komórek, delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i przenieś 4 µL PMN z każdego badanego systemu aktywacji, dzieląc je na dwie studzienki czystego szkiełka przedmiotowego. Inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  2. Dodaj 1 µL DNAse I do jednej ze studzienek i inkubuj przez 20 min w temperaturze 37 °C (w wilgotnej komorze).
  3. Osusz szkiełko i zabarw preparatem fast panoptic, zgodnie z opisem w kroku 2.9 sekcji „izolacja neutrofili”.
  4. Oceń preparaty pod mikroskopem.
    UWAGA: Poszukuj wszelkich oznak uwalniania NET, charakteryzujących się obecnością struktur przypominających sieć. Po ich zidentyfikowaniu potwierdź, czy traktowanie DNAse I było w stanie usunąć takie struktury. Test ten sugeruje tworzenie się NET, gdyż do potwierdzenia ich obecności wymagane są dodatkowe analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metoda izolacji oparta na gęstości zastosowana w niniejszym badaniu (Rysunek 1) spełniła kryteria wymagane dla proponowanych eksperymentów. Parametry neutrofili uzyskane tą metodą obejmowały żywotność ≥98%, czystość ≥94% oraz wydajność komórkową ≥1,5 x 107, przy braku wykrywalnej aktywacji w testach przesiewowych. Dwoma istotnymi etapami izolacji PMN są przeciwkrzepliwość oraz usuwanie RBC. Utrzymywanie probówki lub strzykawki z krwią przeciwkrzepliwą w delikatnym ruchu kołyszącym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Neutrofile są bardzo dynamicznymi i wrażliwymi komórkami, które żyją krótko i nie mogą być jeszcze kriokonserwowane19, co sprawia, że badania nad ich biologią są trudne. Dlatego ważne jest, aby postępować ostrożnie w celu uzyskania żywotnych, wzbogaconych i spoczynkowych neutrofili 11,20. W badaniu tym zastosowano technikę izolacji opartą na gęstości, która kładzie nacisk na delikatną i minimalną manipulację, a także stosowanie niskich tem...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy uznają następujące agencje finansujące: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP i FINATEC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CIM-Plate 16Agilent 
Czytnik płytek CLARIOstar BMG LABTECHUS Numer patentu 9,733,124
Szczegóły Produktu: Oprogramowanie do analizy danych MARS
Dimetylosulfotlenek Dinâ mika1582
DNAza ISigma - AldrichDN 25
Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodnaSigma - AldrichE5134
Szybkie barwienie panoptyczneLaborclin620529
Szkiełko szkiełkoweExacta7102
Hank' s Zrównoważony roztwór soli z wapniem, z magnezem, bez czerwieni fenolowej.Sigma - Aldrich55037C
Hank' s Zrównoważony roztwór soli bez chlorku wapnia, siarczanu magnezu i wodorowęglanu sodu.Sigma - AldrichH4641
HeparinBlau 
Komora laminarnaVecoVLFS-12
Mikroskop Zeiss415501-0101-002Szczegóły Produktu:
Blok mieszającyBIOERMB-102
Neubauer ulepszony jasny NewOptik1110000
N-formylo-metionylo-leucylo-fenyloalaninaSigma - AldrichF3506
Nitroblue tetrazoliumNeonCAS 298-83-9
PercollCytiva17089101media separacyjne
Phorbol 12-mirystynian 13-octanSigma - AldrichP8139
Tabletka soli fizjologicznej buforowanej fosforanamiSigma - AldrichP4417
ROTOFIX 32 AHettich1206
Saccharomyces cerevisiaeFleischmann
SafraninSigma - Aldrich50240
Dodecylosiarczan soduCytiva17-1313-01
SonicatorQsonicaQ125
Roztwór błękitu trypanowegoVetecCI 23850
Vortex Genie 2Scientific Industries, Inc.0K-0500-902
xCELLigence Analiza komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) DP (podwójne zastosowanie)Agilent 380601050Szczegóły produktu: System RTCA składający się ze sprzętu detekcyjnego, płytek ogniw i oprogramowania
56658250017896014655229 Primostar 1

Bibliografia

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
  3. Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345(2017).
  4. Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
  5. Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147(2019).
  6. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  7. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  8. El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
  9. Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
  10. Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770(2021).
  11. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
  12. Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
  14. Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
  15. Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
  16. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
  17. Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
  18. Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
  19. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  20. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837(2021).
  21. Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991(2021).
  22. Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41(2019).
  23. Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316(2019).
  24. Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
  25. Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153(2019).
  26. Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
  27. Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637(2021).
  28. Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
  29. Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
  30. Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
  31. Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
  32. Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106(2021).
  33. Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27(2021).
  34. Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582(2020).
  35. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337(2017).
  36. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  37. de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
  38. Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
  39. Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
  40. Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
  41. Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
  42. Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
  43. Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790(2020).
  44. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  45. Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825(2021).
  46. Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
  47. Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Przesiewowe badanie neutrofiliżywotność komórekreaktywne formy tlenutest fagocytozymigracja w czasie rzeczywistymzewnątrzkomórkowe pułapki neutrofiloweizolacja w gradiencie gęstościtest NBTtest chemotaksji
Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.