Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele ośrodkowego układu nerwowego (OUN) muszą podsumować złożoną sieć połączonych ze sobą komórek znalezionych in vivo. OUN składa się głównie z neuronów, astrocytów, oligodendrocytów i mikrogleju. Ze względu na coraz większe wysiłki na rzecz zastąpienia i ograniczenia wykorzystywania zwierząt opracowano różne systemy hodowli komórkowych in vitro w celu zbadania wrodzonych właściwości komórek, które umożliwiają opracowanie metod leczenia infekcji i patologii OUN. Podczas gdy niektóre pytania badawcze mogą być rozwiązane przez systemy hodowli komórek opartych na ludziach, takie jak (indukowane) pluripotencjalne komórki macierzyste, praca z komórkami ludzkimi ma swoje własne ograniczenia w odniesieniu do dostępności, kosztów i etyki. W tym miejscu opisujemy unikalny protokół izolacji i hodowli komórek z embrionalnych mózgów myszy. Powstałe w ten sposób mieszane hodowle komórek nerwowych naśladują kilka populacji komórek i interakcji zachodzących w mózgu in vivo. W porównaniu z obecnymi równoważnymi metodami, protokół ten bardziej naśladuje charakterystykę mózgu, a także gromadzi więcej komórek, co pozwala na zbadanie większej liczby warunków eksperymentalnych na jednej ciężarnej myszy. Co więcej, protokół jest stosunkowo łatwy i wysoce powtarzalny. Kultury te zostały zoptymalizowane do użytku w różnych skalach, w tym 96-dołkowych badaniach przesiewowych o wysokiej przepustowości, 24-dołkowej analizie mikroskopowej oraz 6-dołkowych kulturach do cytometrii przepływowej i analizy ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Ta metoda hodowli jest potężnym narzędziem do badania infekcji i odporności w kontekście złożoności OUN z wygodą metod in vitro.
Wprowadzenie
Poprawa naszego zrozumienia ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest kluczowa dla poprawy możliwości terapeutycznych dla wielu chorób neurozapalnych i neurodegeneracyjnych. OUN, złożona sieć połączonych ze sobą komórek w mózgu, rdzeniu kręgowym i nerwach wzrokowych, składa się z neuronów, oligodendrocytów, astrocytów i ich wrodzonych komórek odpornościowych, microglia1. Podejście in vitro może często drastycznie zmniejszyć liczbę myszy potrzebnych do przeprowadzenia znaczących badań; jednak złożony charakter OUN uniemożliwia odtworzenie sytuacji in vivo przy użyciu linii komórkowych. Mieszane hodowle komórek nerwowych stanowią niezwykle cenne narzędzie badawcze do badania zagadnień neuro(immunologicznych) w odpowiednim modelu, zgodnie z zasadami wymiany, redukcji i udoskonalenia (3R)2,3.
Thomson et al. opisali metodę hodowli komórek z wykorzystaniem prenatalnych komórek rdzenia kręgowego, które różnicują się we wszystkie wyżej wymienione główne typy komórek OUN4. W tym systemie dochodzi również do tworzenia synaps, mielinizacji aksonów i węzłów Ranviera. Głównym ograniczeniem tej metody hodowli jest to, że będąc rdzeniem kręgowym, nie modeluje ona w użyteczny sposób mózgu, a plony komórek od 13 dnia embrionalnego (E13) rdzenie kręgowe są zwężające. W związku z tym ogranicza to liczbę warunków eksperymentalnych, które można zbadać. W związku z tym badanie to miało na celu opracowanie nowego systemu hodowli komórkowych, który podsumowuje cechy mózgu ze zwiększoną wydajnością komórek w celu zmniejszenia wymagań stawianych zwierzętom.
Korzystając z Thomsona i wsp. jako punktu wyjścia, opracowaliśmy model hodowli komórkowej pochodzący wyłącznie z prenatalnych mózgów myszy. Kultury te mają te same populacje komórek, wzajemne połączenia i opcje leczenia co hodowle rdzenia kręgowego, z wyjątkiem tego, że w porównaniu z nimi występuje mniejsza mielinizacja. Jednak posiadanie modelu OUN in vitro z około trzykrotnie wyższą wydajnością komórek jest bardziej wydajne, wymaga mniejszej liczby myszy i mniej czasu na przetwarzanie zarodków. Zoptymalizowaliśmy ten unikalny system hodowli pod kątem wielu dalszych zastosowań i skal, w tym przy użyciu szklanych szkiełek nakrywkowych do analizy mikroskopowej i różnych rozmiarów plastikowych płytek studziennych, w tym płytek 96-dołkowych do badań o wysokiej przepustowości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z lokalnymi przepisami i wytycznymi dotyczącymi stosowania zwierząt, i zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję Oceny Etyki na Uniwersytecie w Glasgow. Zwierzęta były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów zgodnie z brytyjską ustawą o procedurach naukowych dotyczących zwierząt z 1986 r., pod auspicjami brytyjskiej licencji na projekty Ministerstwa Spraw Wewnętrznych. W tym badaniu wykorzystano wyhodowane we własnym zakresie dorosłe myszy C57BL/6J. Zaleca się stosowanie młodych samic (8-12 tygodni) ze względu na wyższy wskaźnik powodzenia ciąży; Samce mogą być ponownie wykorzystane do wielu rund hodowli. Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd opisanej metody generowania mieszanych kultur neuronalnych i glejowych.
1. Przygotowanie materiałów eksploatacyjnych do hodowli tkankowych
- Przygotować płytki i/lub naczynia zawierające szkiełka nakrywkowe do mikroskopii w komorze bezpieczeństwa klasy 2. Wysterylizuj wszystkie odczynniki lub autoklaw, aby zapewnić sterylność w okresie hodowli.
- Dodać odpowiednią objętość BA-PLL (13,2 μg/ml bromowodorku poli-L-lizyny [PLL] w buforze kwasu borowego [BA] [50 mM kwasu borowego, 12,5 mM tetraboranu sodu, pH 8,5]; patrz Tabela materiałów) do każdej studzienki (1 000 μl / studzienkę na płytce 6-dołkowej, 100 μl / studzienkę na płytce 96-dołkowej; objętości podsumowano w Tabeli 1). W przypadku mikroskopowych szkiełek nakrywkowych dodaj 20 ml BA-PLL do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 9 cm zawierającego 200 sterylnych szkiełek nakrywkowych i zamieszaj, aby równomiernie rozprowadzić.
- Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny.
- Usunąć roztwór BA-PLL z każdej studzienki lub naczynia zawierającego szkiełka nakrywkowe do mikroskopii i przemyć, dodając 20 ml sterylnej wody, obracając szkiełka nakrywkowe, a następnie usuwając wodę. Powtórz ten krok prania trzy razy. W przypadku naczynia zawierającego szkiełka nakrywkowe, podczas końcowego mycia pozostaw sterylną wodę w naczyniu do hodowli tkankowych, aby łatwo usunąć szkiełka nakrywkowe.
- Usuń jak najwięcej płynu sterylną pipetą i pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 2 godziny do nocy.
- Powlekane płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 miesięcy.
UWAGA: Przygotowany roztwór kwasu borowego z poli-l-lizyną (BA-PLL) można ponownie użyć do trzech razy, za każdym razem dodając nowy PLL. Przechowywać BA-PLL w temperaturze 4 °C. Naczynia są poddawane obróbce BA-PLL, ponieważ PLL pozwala komórkom przywierać i rosnąć. Bez tego leczenia komórki uniosą się po około 1 tygodniu hodowli i nie będą już w stanie się różnicować.
2. Sekcja mózgów embrionalnych E17
- Trzymaj jedną lub wiele samic myszy z samcem myszy. Codziennie sprawdzaj samice pod kątem czopa śluzowego, wskazującego, że doszło do krycia.
UWAGA: Wszystkie "podłączone" samice myszy muszą zostać oddzielone od samca, aby zapewnić prawidłową datę rozpoczęcia ciąży. Myszy mogą być ważone w celu potwierdzenia ciąży lub monitorowane wizualnie. - Ubój ciężarnej myszy w E17 przy użyciu odpowiednich metod zgodnie z lokalnymi wytycznymi i przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt, na przykład poprzez zwiększenie stężenia dwutlenku węgla (CO2 ), przedawkowanie śmiertelnego środka znieczulającego lub zwichnięcie szyi.
UWAGA: Wybrana metoda nie może powodować uszkodzenia zarodków. W tym badaniu ekspozycja na rosnące stężenie gazowego dwutlenku węgla, a następnie potwierdzenie zgonu przez przecięcie tętnicy udowej została wykorzystana do usunięcia ciężarnych matek. - Połóż odstrzeloną, ciężarną mysz na grzbiecie na desce sekcyjnej; chociaż przygwożdżenie jej nie jest wymagane, może ułatwić to niedoświadczonym badaczom. Ściśnij linię środkową brzucha za pomocą kleszczy. Za pomocą ostrych nożyczek rozetnij brzuch przez skórę i otrzewną nad linią środkową od genitaliów do klatki piersiowej, uważając, aby nie przebić macicy.
- Macica myszy ma dwa rogi, z których każdy zwykle zawiera od jednego do pięciu zarodków. Usuń macicę zawierającą zarodki od matki i natychmiast umieść ją na lodzie.
- Przeciąć worek żółtkowy z boku łożyska, uważając, aby nie uszkodzić zarodków, i wyjąć zarodki z worka na żółtko.
- Natychmiast odetnij głowę embrionom. Dodaj odcięte głowy do naczynia ze zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) bez wapnia (Ca2+) i magnezu (Mg2+) (HBSS-/-) na lodzie.
UWAGA: Jeśli wymagane jest genotypowanie, na tym etapie można usunąć ogon w celu analizy genetycznej. Gdy spodziewanych jest wiele genotypów, głowy każdego zarodka powinny być trzymane oddzielnie do hodowli. - Za pomocą kleszczy kątowych ułóż głowę na boku skierowaną w lewo.
- Przekłuj oko jedną krawędzią kleszczy, drugą mocno trzymając podbródek.
- Zaczynając od karku, delikatnie rozerwij skórę głowy wzdłuż linii środkowej w kierunku czubka pyska.
- Wchodząc przez rdzeń kręgowy, widoczny jako biały owal, użyj kątowych kleszczy, aby otworzyć czaszkę wzdłuż linii środkowej, odsłaniając mózg.
- Delikatnie oderwij czaszkę po stronie skierowanej do góry, odsłaniając mózg.
- Wyjmij mózg z czaszki, pozbywając się czaszki, gdy mózg zostanie całkowicie usunięty.
- Za pomocą kleszczy usuń opony mózgowe, które są widoczne jako cienka błona z gęstymi naczyniami krwionośnymi.
- Umieść mózgi w biżu (patrz Tabela Materiałów) zawierającym 2 ml HBSS-/- na lodzie.
- Powtórz kroki od 2.6 do 2.13 z pozostałymi mózgami, dodając do czterech mózgów na bijou.
- Dodaj 250 μl 10x trypsyny do bijou i rozcieraj mózgi, potrząsając bijou. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Wszystkie kroki od tego momentu powinny być wykonywane w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych. - Rozmrozić 2 ml inhibitora trypsyny sojowej (SD) (Leibovitz L-15, 0,52 mg/ml inhibitora trypsyny z soi, 40 μg/ml DNazy I, 3 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej [BSA] frakcji V; patrz tabela materiałów) od -20 °C, umieszczając go w temperaturze 37 °C.
- Dodać 2 ml inhibitora SD do każdego mózgu zawierającego bijou (na bijou zawierającego do czterech mózgów), ponownie potrząsając biżu, aby równomiernie go rozprowadzić.
UWAGA: Inhibitor SD zmniejsza aktywność trypsyny, aby zapobiec niepotrzebnemu trawieniu próbek i zachować żywotność komórek. - Bez odwirowania usunąć 2 ml supernatantu z każdego biżu i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, uważając, aby nie przenieść grudek komórek.
- Pozostałe komórki w biżuterii należy rozcierać za pomocą igły 19 G dołączonej do strzykawki o pojemności 5 ml, dwukrotnie odsysając zawiesinę. Spowoduje to stworzenie gęstej mieszaniny podobnej do śluzu.
- Powtórzyć jeszcze dwa razy za pomocą igły 21 G. Jeśli pozostały grudki, należy je ponownie rozprowadzić za pomocą igły 21 G.
- Przenieść komórki z biżuterii do tej samej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml (z kroku 2.18) za pomocą igły o stężeniu 23 G.
- Wirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 min.
- Usunąć cały sklarat nad osadem za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml i przenieść go do innej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, uważając, aby nie naruszyć luźnej osadki na dnie zawierającej wymagane komórki.
- Ponownie odwirować supernatant przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min.
UWAGA: Ten krok nie jest niezbędny, ale jeśli ktoś potrzebuje wielu komórek lub ma niewiele zarodków, może wykonać ten krok, aby odzyskać jak najwięcej komórek z supernatantu. - Używając 10 ml pożywki galwanicznej (PM) (49% zmodyfikowanej pożywki orła Dulbecco [DMEM], 1% penicyliny/streptomycyny [Pen/Strep], 25% surowicy końskiej, 25% HBSS z Ca2+ i Mg2+ [HBSS+/+]; patrz Tabela materiałów), połącz i ponownie zawieś dwa granulki razem, aby utworzyć zawiesinę całych komórek.
- Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru lub cyfrowego licznika komórek, a następnie rozcieńczyć zawiesinę komórek za pomocą PM do stężenia 1,8 x 106 komórek/ml.
3. Powlekanie komórek
- Dodać wymaganą objętość zawiesiny komórek do wymaganego formatu, jak wyszczególniono w tabeli 1: 1 000 μl na basenik w formacie 6-dołkowym, 50 μl na basenik w formacie 96-dołkowym lub 100 μl na szkiełko nakrywkowe.
- Inkubować przez 2-4 godziny w temperaturze 37 °C z 5%-7% CO2 . Sprawdź, czy komórki przylegają do siebie za pomocą odwróconego mikroskopu.
- Usunąć pożywkę i uzupełnić nową pożywką różnicującą (DM+: DM- w tym 10 μg/ml insuliny. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 nM hydrokortyzon, 10 ng/ml biotyny, 2,5 ml 100x suplement N1; patrz tabela materiałów). Objętości są wyszczególnione w tabeli 1. Dociśnij pływające szkiełka nakrywkowe za pomocą sterylnej końcówki pipety.
4. Utrzymanie kultur
UWAGA: Te kultury wymagają karmienia trzy razy w tygodniu, aby wspierać optymalny wzrost i różnicowanie. Kultury osiągną optymalny stan zdrowia i dojrzałość do eksperymentów na DIV (dniach in vitro) 21. Komórki można przechowywać w hodowli do 28 dni, po czym kultury szybko się degenerują.
- Trzy razy w tygodniu do DIV12 zastąpić część supernatantu świeżym DM+, usuwając 500 μl na basenik w formacie 6-dołkowym, 50 μl na basenik w formacie 96-dołkowym lub 500 μl na szalkę zawierającą trzy szkiełka nakrywkowe i dodając 600 μl na basenik w formacie 6-dołkowym, 60 μl na basenik w formacie 96-dołkowym, lub 600 μl na naczynie na szkiełko nakrywkowe (tabela 1).
- Trzy razy w tygodniu, począwszy od DIV13, zastąpić część supernatantu świeżym DM, usuwając 500 μl na studzienkę w formacie 6-dołkowym, 50 μl na basenik w formacie 96-dołkowym lub 500 μl na miskę zawierającą trzy szkiełka nakrywkowe, i dodając 600 μl na basenik w formacie 6-dołkowym, 60 μl na basenik w formacie 96-dołkowym, lub 600 μl na naczynie na szkiełko nakrywkowe (tabela 1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Mikroskopia
Kultury hodowane na szkiełkach podstawkowych są idealne do analizy mikroskopowej. Aby zwizualizować rozwój kultur, szkiełka utrwalano w 4% paraformaldehydzie (PFA) w wielu punktach czasowych od DIV0 (po przytwierdzeniu komórek) aż do DIV28. Kultury barwiono do obrazowania immunofluorescencyjnego zgodnie z wcześniejszym opisem5, stosując trzy różne kombinacje barwień: NG2 (niedojrzałe oligodendrocyty) i nestynę (neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe) jako mar...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
OUN to złożona sieć, która rozciąga się od mózgu do rdzenia kręgowego i składa się z wielu typów komórek, głównie neuronów, oligodendrocytów, astrocytów i mikrogleju1. Ponieważ każda komórka odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy i generowaniu odpowiednich odpowiedzi na wyzwania w OUN 9,10,11, system hodowli, który zawiera wszystkie te typy komórek, jest użytecznym i wszechstronnym narzędziem do badan...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować członkom laboratoriów Edgara i Liningtona, szczególnie prof. Chrisowi Liningtonowi, dr Dianie Arseni i dr Katji Muecklisch, za ich rady, pomocne komentarze i pomoc w karmieniu kultur podczas tworzenia tych kultur. Szczególne podziękowania kierujemy do dr Muecklischa za wskazanie punktów wyjścia dla procesu tworzenia Cell Profiler. Praca ta była wspierana przez Towarzystwo Stwardnienia Rozsianego (grant 122) oraz fundację Jurija i Lorny Czernajowskich dla MP; Finansowanie Uniwersytetu w Glasgow dla JC i MP; oraz Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) i Radę ds. Badań Medycznych (MRV0109721) na rzecz GJG.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10x Trypsyna | Sigma | T4549-100ML | Do trawienia tkanek |
| 140 mm TC Naczynie | Fisher | 11339283 | Umieść 8 szalek 35 mm na 1 140 mm szalki |
| 15 ml Falcon | Sarstedt | 62554502 | Do zbierania komórek w osady w celu ponownego zawieszenia w pożywce galwanicznej |
| Igła 18 G | Henke Sass Wolf | 4710012040 | Do rozcierania próbki |
| Igła 21 G | BD | 304432 | Do rozcierania próbki |
| Igła 23 G | Henke Sass Wolf | 4710006030 | Do rozcierania próbki |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 Szkiełka nakrywkowe powlekane PLL na 1 35 mm szalka |
| Strzykawka 5 ml | Fisher | 15869152 | Do rozcierania próbki |
| 6-dołkowej | Corning | 3516 | Do płytki komórek do RT-qPCR i przepływu cytometria |
| 7 ml Bijoux | Fisher | DIS080010R | Do umieszczania mózgów intp |
| 96 płytki dołkowej | Corning | 3596 | Do płytki komórek do testów wysokoprzepustowych |
| ACSA-2 Przeciwciało, anty-mysie, PE | Miltenyi | 130-123-284 | Do barwienia astrocytów cytometrią przepływową |
| Kleszcze kątowe | Dumont | 0108-5/45-PO | Do preparacji |
| Biotyna | Sigma | B4501 | Dla DM+/- |
| Kwas Borowy | Sigma | B6768-500G | Do buforu kwasu borowego |
| Brilliant Violet 421 anty-mysie przeciwciało CD24, klon M1-69 | Biolegend | 101825 | Do barwienia neuronów i astrocytów cytometrią przepływową |
| Przeciwciało anty-mysie CD45 Brilliant Violet 605, klon 30-F11 | Biolegend | 103139 | Do barwienia mikrogleju |
| cytometrią przepływowąBrilliant Violet 785 przeciwciało anty-mysie/ludzkie CD11b, klon M1/70 | Biolegend | 101243 | Do barwienia cytometrią przepływową mikrogleju |
| BSA Frakcja V | Sigma | A3059-10G | Do inhibitora SD |
| CNP | Abcam | AB6319 | Dojrzałe oligodendrocyty |
| Szkiełko nakrywkowe | VWR | 631-0149 | Do wycinania komórek do mikroskopii |
| Nożyczki preparacyjne | Sigma | S3146-1EA | Do rozwarstwiania |
| DMEM Wysoka glukoza, pirogronian sodu, L-glutamina | Gibco | 21969-035 | Dla DM+/- i dla mediów galwanicznych |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | Dla inhibitora SD, można użyć tej lub innej Dnazy z sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | Dla inhibitora SD, można użyć tej lub innej Dnazy od thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Żywa / martwa plama |
| Drobne kleszcze | Dumont | 0102-SS135-PO | Do rozwarstwienia |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocyty |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | Do mediów galwanicznych |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | Do mózgów dodawanych do |
| surowicy | końskiejGibco | 26050-070 | Do mediów galwanicznych |
| Hydrokortyzon | Sigma | H0396 | Dla DM+/- |
| IBA1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglea |
| Insulina Sigma | I1882 | Dla DM + | |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | Dla inhibitora SD |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | mieliny |
| Mysz CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | Zestaw ELISA do ilościowego określania stężenia CCL5 w supernatantach 96-dołkowej płytki |
| N1 suplement pożywki | Sigma | N6530-5ML | dla DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Ciało komórki neuronalnej |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Niedojrzałe oligodendrocyty |
| Przeciwciało O4, anty-ludzkie/mysie/szczurze, APC | Miltenyi | 130-119-155 | Do barwienia oligodendrocytów cytometrią przepływową |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | Do DM+/- i do pożywek galwanicznych |
| Bromek poli-L-lizyny | Sigma | P1274 | Do roztworu kwasu borowego / poli-L-lizyny do powlekania szkiełek nakrywkowych |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Aksony |
| Tetraboran sodu | Sigma | 221732-100G | Do buforu kwasu borowego |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | Do lizy komórek do RT-qPCR |
| Inhibitor trypsyny z soi | Sigma | T9003-100MG | Do inhibitora SD |
Bibliografia
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754(2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117(2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135(2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357(2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83(2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133(2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59(2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45(2022).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
