Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele ośrodkowego układu nerwowego (OUN) muszą podsumować złożoną sieć połączonych ze sobą komórek znalezionych in vivo. OUN składa się głównie z neuronów, astrocytów, oligodendrocytów i mikrogleju. Ze względu na coraz większe wysiłki na rzecz zastąpienia i ograniczenia wykorzystywania zwierząt opracowano różne systemy hodowli komórkowych in vitro w celu zbadania wrodzonych właściwości komórek, które umożliwiają opracowanie metod leczenia infekcji i patologii OUN. Podczas gdy niektóre pytania badawcze mogą być rozwiązane przez systemy hodowli komórek opartych na ludziach, takie jak (indukowane) pluripotencjalne komórki macierzyste, praca z komórkami ludzkimi ma swoje własne ograniczenia w odniesieniu do dostępności, kosztów i etyki. W tym miejscu opisujemy unikalny protokół izolacji i hodowli komórek z embrionalnych mózgów myszy. Powstałe w ten sposób mieszane hodowle komórek nerwowych naśladują kilka populacji komórek i interakcji zachodzących w mózgu in vivo. W porównaniu z obecnymi równoważnymi metodami, protokół ten bardziej naśladuje charakterystykę mózgu, a także gromadzi więcej komórek, co pozwala na zbadanie większej liczby warunków eksperymentalnych na jednej ciężarnej myszy. Co więcej, protokół jest stosunkowo łatwy i wysoce powtarzalny. Kultury te zostały zoptymalizowane do użytku w różnych skalach, w tym 96-dołkowych badaniach przesiewowych o wysokiej przepustowości, 24-dołkowej analizie mikroskopowej oraz 6-dołkowych kulturach do cytometrii przepływowej i analizy ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Ta metoda hodowli jest potężnym narzędziem do badania infekcji i odporności w kontekście złożoności OUN z wygodą metod in vitro.
Wprowadzenie
Poprawa naszego zrozumienia ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest kluczowa dla poprawy możliwości terapeutycznych dla wielu chorób neurozapalnych i neurodegeneracyjnych. OUN, złożona sieć połączonych ze sobą komórek w mózgu, rdzeniu kręgowym i nerwach wzrokowych, składa się z neuronów, oligodendrocytów, astrocytów i ich wrodzonych komórek odpornościowych, microglia1. Podejście in vitro może często drastycznie zmniejszyć liczbę myszy potrzebnych do przeprowadzenia znaczących badań; jednak złożony charakter OUN uniemożliwia odtworzenie sytuacji in vivo przy użyciu linii komórkowych. Mieszane hodowle komórek nerwowych stanowią ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z lokalnymi przepisami i wytycznymi dotyczącymi stosowania zwierząt, i zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję Oceny Etyki na Uniwersytecie w Glasgow. Zwierzęta były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów zgodnie z brytyjską ustawą o procedurach naukowych dotyczących zwierząt z 1986 r., pod auspicjami brytyjskiej licencji na projekty Ministerstwa Spraw Wewnętrznych. W tym badaniu wykorzystano wyhodowane we własnym zakresie dorosłe myszy C57BL/6J. Zaleca się stosowanie młodych samic (8-12 tygodni) ze względu na wyższy wskaźnik powodzenia ciąży; Samce mogą być ponownie wykorzystane do wielu rund hodowli....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Mikroskopia
Kultury hodowane na szkiełkach podstawkowych są idealne do analizy mikroskopowej. Aby zwizualizować rozwój kultur, szkiełka utrwalano w 4% paraformaldehydzie (PFA) w wielu punktach czasowych od DIV0 (po przytwierdzeniu komórek) aż do DIV28. Kultury barwiono do obrazowania immunofluorescencyjnego zgodnie z wcześniejszym opisem5, stosując trzy różne kombinacje barwień: NG2 (niedojrzałe oligodendrocyty) i nestynę (neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe) jako mar.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
OUN to złożona sieć, która rozciąga się od mózgu do rdzenia kręgowego i składa się z wielu typów komórek, głównie neuronów, oligodendrocytów, astrocytów i mikrogleju1. Ponieważ każda komórka odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy i generowaniu odpowiednich odpowiedzi na wyzwania w OUN 9,10,11, system hodowli, który zawiera wszystkie te typy komórek, jest użytecznym i wszechstronnym narzędziem do badan.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować członkom laboratoriów Edgara i Liningtona, szczególnie prof. Chrisowi Liningtonowi, dr Dianie Arseni i dr Katji Muecklisch, za ich rady, pomocne komentarze i pomoc w karmieniu kultur podczas tworzenia tych kultur. Szczególne podziękowania kierujemy do dr Muecklischa za wskazanie punktów wyjścia dla procesu tworzenia Cell Profiler. Praca ta była wspierana przez Towarzystwo Stwardnienia Rozsianego (grant 122) oraz fundację Jurija i Lorny Czernajowskich dla MP; Finansowanie Uniwersytetu w Glasgow dla JC i MP; oraz Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) i Radę ds. Badań Medycznych (MRV0109721) na rzecz GJG.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10x Trypsyna | Sigma | T4549-100ML | Do trawienia tkanek |
| 140 mm TC Naczynie | Fisher | 11339283 | Umieść 8 szalek 35 mm na 1 140 mm szalki |
| 15 ml Falcon | Sarstedt | 62554502 | Do zbierania komórek w osady w celu ponownego zawieszenia w pożywce galwanicznej |
| Igła 18 G | Henke Sass Wolf | 4710012040 | Do rozcierania próbki |
| Igła 21 G | BD | 304432 | Do rozcierania próbki |
| Igła 23 G | Henke Sass Wolf | 4710006030 | Do rozcierania próbki |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 Szkiełka nakrywkowe powlekane PLL na 1 35 mm szalka |
| Strzykawka 5 ml | Fisher | 15869152 | Do rozcierania próbki |
| 6-dołkowej | Corning | 3516 | Do płytki komórek do RT-qPCR i przepływu cytometria |
| 7 ml Bijoux | Fisher | DIS080010R | Do umieszczania mózgów intp |
| 96 płytki dołkowej | Corning | 3596 | Do płytki komórek do testów wysokoprzepustowych |
| ACSA-2 Przeciwciało, anty-mysie, PE | Miltenyi | 130-123-284 | Do barwienia astrocytów cytometrią przepływową |
| Kleszcze kątowe | Dumont | 0108-5/45-PO | Do preparacji |
| Biotyna | Sigma | B4501 | Dla DM+/- |
| Kwas Borowy | Sigma | B6768-500G | Do buforu kwasu borowego |
| Brilliant Violet 421 anty-mysie przeciwciało CD24, klon M1-69 | Biolegend | 101825 | Do barwienia neuronów i astrocytów cytometrią przepływową |
| Przeciwciało anty-mysie CD45 Brilliant Violet 605, klon 30-F11 | Biolegend | 103139 | Do barwienia mikrogleju |
| cytometrią przepływowąBrilliant Violet 785 przeciwciało anty-mysie/ludzkie CD11b, klon M1/70 | Biolegend | 101243 | Do barwienia cytometrią przepływową mikrogleju |
| BSA Frakcja V | Sigma | A3059-10G | Do inhibitora SD |
| CNP | Abcam | AB6319 | Dojrzałe oligodendrocyty |
| Szkiełko nakrywkowe | VWR | 631-0149 | Do wycinania komórek do mikroskopii |
| Nożyczki preparacyjne | Sigma | S3146-1EA | Do rozwarstwiania |
| DMEM Wysoka glukoza, pirogronian sodu, L-glutamina | Gibco | 21969-035 | Dla DM+/- i dla mediów galwanicznych |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | Dla inhibitora SD, można użyć tej lub innej Dnazy z sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | Dla inhibitora SD, można użyć tej lub innej Dnazy od thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Żywa / martwa plama |
| Drobne kleszcze | Dumont | 0102-SS135-PO | Do rozwarstwienia |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocyty |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | Do mediów galwanicznych |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | Do mózgów dodawanych do |
| surowicy | końskiejGibco | 26050-070 | Do mediów galwanicznych |
| Hydrokortyzon | Sigma | H0396 | Dla DM+/- |
| IBA1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglea |
| Insulina Sigma | I1882 | Dla DM + | |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | Dla inhibitora SD |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | mieliny |
| Mysz CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | Zestaw ELISA do ilościowego określania stężenia CCL5 w supernatantach 96-dołkowej płytki |
| N1 suplement pożywki | Sigma | N6530-5ML | dla DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Ciało komórki neuronalnej |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Niedojrzałe oligodendrocyty |
| Przeciwciało O4, anty-ludzkie/mysie/szczurze, APC | Miltenyi | 130-119-155 | Do barwienia oligodendrocytów cytometrią przepływową |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | Do DM+/- i do pożywek galwanicznych |
| Bromek poli-L-lizyny | Sigma | P1274 | Do roztworu kwasu borowego / poli-L-lizyny do powlekania szkiełek nakrywkowych |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Aksony |
| Tetraboran sodu | Sigma | 221732-100G | Do buforu kwasu borowego |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | Do lizy komórek do RT-qPCR |
| Inhibitor trypsyny z soi | Sigma | T9003-100MG | Do inhibitora SD |
Bibliografia
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
