Protokół testu ścinania w celu określenia właściwości materiału jednokomórkowego

Summary

Ten protokół przedstawia ilościowe określanie właściwości mechanicznych nowotworowych i nienowotworowych linii komórkowych in vitro. Konserwatywne różnice w mechanice komórek nowotworowych i prawidłowych mogą działać jako biomarker, który może mieć wpływ na rokowanie i diagnozę.

Abstract

Nieregularna biomechanika jest cechą charakterystyczną biologii nowotworów, która jest przedmiotem szeroko zakrojonych badań. Właściwości mechaniczne ogniwa są podobne do właściwości materiału. Odporność komórki na stres i napięcie, czas relaksacji i elastyczność to właściwości, które można wyprowadzić i porównać z innymi typami komórek. Ilościowe określenie właściwości mechanicznych komórek nowotworowych (złośliwych) w porównaniu z normalnymi (niezłośliwymi) pozwala naukowcom na dalsze odkrywanie biofizycznych podstaw tej choroby. Chociaż wiadomo, że właściwości mechaniczne komórek nowotworowych stale różnią się od właściwości mechanicznych normalnych komórek, brakuje standardowej procedury eksperymentalnej pozwalającej wywnioskować te właściwości z komórek w hodowli.

Ten artykuł przedstawia procedurę ilościowego określania właściwości mechanicznych pojedynczych komórek in vitro za pomocą testu ścinania płynów. Zasada tego testu polega na zastosowaniu naprężeń ścinających płynu na pojedynczą komórkę i optycznym monitorowaniu powstałej deformacji komórkowej w czasie. Właściwości mechaniczne komórek są następnie charakteryzowane za pomocą cyfrowej analizy korelacji obrazu (DIC) i dopasowywania odpowiedniego modelu lepkosprężystego do danych eksperymentalnych wygenerowanych z analizy DIC. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony tutaj protokół ma na celu zapewnienie bardziej skutecznej i ukierunkowanej metody diagnozowania trudnych do leczenia nowotworów.

Introduction

Badanie różnic biofizycznych między komórkami nowotworowymi i nienowotworowymi pozwala na nowe możliwości diagnostyczne i terapeutyczne¹. Zrozumienie, w jaki sposób różnice w biomechanice/mechanobiologii przyczyniają się do progresji guza i oporności na leczenie, ujawni nowe możliwości terapii celowanej i wczesnej diagnozy².

Chociaż wiadomo, że właściwości mechaniczne komórek rakowych różnią się od normalnych komórek (np. lepkosprężystość błony plazmatycznej i otoczki jądrowej)^3,4,5, brakuje solidnych....

Protocol

1. Przygotowanie do testu ścinania jednokomórkowego

1. Hodowla komórkowa
   1. Wysiewać około 50 000 zawieszonych pojedynczych komórek na szalce Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm zawierającej 2 ml pożywki hodowlanej.
      UWAGA: Wiruj zawieszone komórki przed wysiewem, aby rozbić agregaty komórek.
   2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i odczekać od 10 do 48 godzin na przyłączenie komórek i całkowite wytworzenie białka cytoszkieletu.
      UWAGA: Weź pod uwagę czas trwania przyłączenia komórkowego, a także tempo proliferacji i wzrostu, aby zapewnić odpowiedni wzrost i przywiązanie komórek, unikając agregacji komórek. Te par....

Results

Protokół testu ścinania w połączeniu z analizą deformacji przy użyciu DIC i modelu lepkosprężystego jest skuteczny w ilościowym określaniu właściwości mechanicznych pojedynczej komórki in vitro. Ta metoda została przetestowana na ludzkich i mysich liniach komórkowych, w tym na normalnych ludzkich komórkach piersi (MCF-10A)^3,4,9, mniej przerzutowych potrójnie ujemnych komórek raka piersi (MDA-MB-468)³

Discussion

Metoda testu ścinania, która obejmuje stworzenie pseudo-mechanobiologicznego środowiska w celu symulacji interakcji komórek z otaczającym mikrośrodowiskiem mechanicznym i ich reakcji na naprężenia mechaniczne, stworzyła katalog właściwości mechanicznych komórek, których wzorce wskazują na zachowaną fizyczną atypię wśród linii komórek nowotworowych 3,4,5,7,8 . .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL CULTURE
,25% Trypsyna, 2,21 mM EDTA, 1x[-] wodorowęglan sodu	Corning	25-053-ci	Do oddzielania komórek od substratu w hodowli komórkowej
15 ml Probówki wirówkowe	Falcon firmy Corning	05-527-90
35 mm szalki Petriego	Corning	430165
50 ml Probówki	wirówkoweFalcon by Corning	14-432-22
Wirówka	dowolna		Do sterylnej hodowli komórkowej
Modyfikacja pożywki Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Lub dowolna inna pożywka do hodowli komórek. DMEM użyto do hodowli komórek U87
Rękawice	dowolne		Do sterylnej hodowli komórek
Heracell Vios 160i Inkubator CO2	Thermo Scientific	51033770	Do inkubacji podczas hodowli komórkowej
Kaptur	dowolny		Do sterylnej hodowli komórek
Mikropipeta	dowolna		Do sterylnej hodowli komórek
Końcówki do mikropipet	dowolny		Do sterylnych hodowli komórkowych
Mikroskop	Leica/dowolny		Do sterylnych hodowli komórkowych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez wapnia i magnezu PBS, 1x	Corning	21-040-CM
Pipetman	dowolny		Do sterylnych hodowli komórkowych
Końcówki do pipet	dowolne		Do sterylnej hodowli komórek
Precyzyjny inkubator płynny GP 10	Thermo Scientific	TSGP02
T25 Kolba	Corning	430639
T75 Kolba	Corning	430641U
SHEAR TEST
100 mL zlewka	dowolna		Do tworzenia lepkiego podłoża ścinającego DMEM + metylocelulozy
DMEM	Corning
Komora przepływowa + uszczelka gumowa	Glycotech	31-001	Zestaw komory przepływowej okrągłej (do naczyń do hodowli tkankowych 35 mm)
Reometr hybrydowy	HR-2 Discovery Reometr		Do oznaczania lepkości płynu ścinającego
Mieszadło magnetyczne	dowolne		Do tworzenia lepkich mediów ścinających DMEM + metyloceluloza
Mieszadło magnetyczne	dowolne		Do tworzenia DMEM + metyloceluloza lepkie media ścinające
Metyloceluloza	dowolna		Aby zwiększyć lepkość DMEM w mediach przepływowych
Pompa strzykawkowa	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	Do programowania infuzji i pobierania płynów
Strzykawki, rurki i łączniki			Do konfiguracji aparatu ścinającego
SOFTWARE
Oprogramowanie ABAQUS	Oprogramowanie Simulia
Digitial Image Correlation	LaVision, Niemcy	DAVIS 10.1.2
Oprogramowanie do obrazowania	Leica/dowolne oprogramowanie
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B