Protokół testu ścinania w celu określenia właściwości materiału jednokomórkowego

Summary

Ten protokół przedstawia ilościowe określanie właściwości mechanicznych nowotworowych i nienowotworowych linii komórkowych in vitro. Konserwatywne różnice w mechanice komórek nowotworowych i prawidłowych mogą działać jako biomarker, który może mieć wpływ na rokowanie i diagnozę.

Abstract

Nieregularna biomechanika jest cechą charakterystyczną biologii nowotworów, która jest przedmiotem szeroko zakrojonych badań. Właściwości mechaniczne ogniwa są podobne do właściwości materiału. Odporność komórki na stres i napięcie, czas relaksacji i elastyczność to właściwości, które można wyprowadzić i porównać z innymi typami komórek. Ilościowe określenie właściwości mechanicznych komórek nowotworowych (złośliwych) w porównaniu z normalnymi (niezłośliwymi) pozwala naukowcom na dalsze odkrywanie biofizycznych podstaw tej choroby. Chociaż wiadomo, że właściwości mechaniczne komórek nowotworowych stale różnią się od właściwości mechanicznych normalnych komórek, brakuje standardowej procedury eksperymentalnej pozwalającej wywnioskować te właściwości z komórek w hodowli.

Ten artykuł przedstawia procedurę ilościowego określania właściwości mechanicznych pojedynczych komórek in vitro za pomocą testu ścinania płynów. Zasada tego testu polega na zastosowaniu naprężeń ścinających płynu na pojedynczą komórkę i optycznym monitorowaniu powstałej deformacji komórkowej w czasie. Właściwości mechaniczne komórek są następnie charakteryzowane za pomocą cyfrowej analizy korelacji obrazu (DIC) i dopasowywania odpowiedniego modelu lepkosprężystego do danych eksperymentalnych wygenerowanych z analizy DIC. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony tutaj protokół ma na celu zapewnienie bardziej skutecznej i ukierunkowanej metody diagnozowania trudnych do leczenia nowotworów.

Introduction

Badanie różnic biofizycznych między komórkami nowotworowymi i nienowotworowymi pozwala na nowe możliwości diagnostyczne i terapeutyczne¹. Zrozumienie, w jaki sposób różnice w biomechanice/mechanobiologii przyczyniają się do progresji guza i oporności na leczenie, ujawni nowe możliwości terapii celowanej i wczesnej diagnozy².

Chociaż wiadomo, że właściwości mechaniczne komórek rakowych różnią się od normalnych komórek (np. lepkosprężystość błony plazmatycznej i otoczki jądrowej)^3,4,5, brakuje solidnych i powtarzalnych metod pomiaru tych właściwości w żywych komórkach⁶. Metoda testu ścinania służy do ilościowego określenia właściwości mechanicznych komórek poprzez poddanie pojedynczych komórek działaniu płynnego naprężenia ścinającego i analizę ich indywidualnych reakcji i odporności na przyłożone naprężenie^3,4,5,7,8,9. Chociaż do scharakteryzowania właściwości mechanicznych pojedynczych komórek zastosowano kilka metod i technik, mają one tendencję do wpływania na właściwości materiału komórkowego poprzez: i) perforację/uszkodzenie błony komórkowej z powodu głębokości wgłębienia, złożonej geometrii końcówki lub usztywnienia podłoża związanego z mikroskopią sił atomowych (AFM)^10,11, ii) wywoływanie fotouszkodzeń komórek podczas pułapkowania optycznego^12,13, lub iii) wywoływanie złożonych stanów naprężeń związanych z aspiracją mikropipet^14,15. Te zewnętrzne efekty są związane ze znaczną niepewnością co do dokładności pomiarów lepkosprężystości komórek^6,16,17.

Aby rozwiązać te ograniczenia, opisana tutaj metoda testu ścinania zapewnia wysoce kontrolowane i proste podejście do symulacji fizjologicznego przepływu w ciele bez wpływu na właściwości materiału komórkowego w tym procesie. Naprężenia ścinające płynów w tym teście reprezentują naprężenia mechaniczne doświadczane przez komórki w ciele przez płyny w śródmiąższu guza lub we krwi podczas krążenia^18,19,20. Co więcej, te stresy płynne sprzyjają różnym złośliwym zachowaniom w komórkach nowotworowych, w tym progresji, migracji, przerzutom i śmierci komórki^19,21,22,23, które różnią się między komórkami rakotwórczymi i nienowotworowymi. Co więcej, zmienione cechy mechaniczne komórek rakowych (tj. często są one "bardziej miękkie" niż normalne komórki znajdujące się w tym samym narządzie) pozwalają im przetrwać we wrogim mikrośrodowisku guza, atakować otaczające normalne tkanki i dawać przerzuty do odległych miejsc^24,25,26. Tworząc pseudobiologiczne środowisko, w którym komórki doświadczają fizjologicznych poziomów naprężeń ścinających płyny, osiąga się proces, który jest fizjologicznie istotny i nie jest destrukcyjny dla komórki. Reakcje komórkowe na te przyłożone naprężenia ścinające płyn pozwalają nam scharakteryzować właściwości mechaniczne komórki.

Ten artykuł zawiera protokół testu ścinania do obszernego badania właściwości mechanicznych i zachowania komórek rakowych i nierakowych pod wpływem przyłożonego naprężenia ścinającego. Komórki reagują na siły zewnętrzne w sposób elastyczny i lepki, dlatego mogą być idealizowane jako materiał lepkosprężysty³. Technika ta dzieli się na: (i) hodowlę rozproszonych pojedynczych komórek, (ii) kontrolowane zastosowanie naprężeń ścinających płynu, (iii) obrazowanie in situ i obserwację zachowania komórek (w tym odporności na naprężenia i deformacje), (iv) analizę odkształceń komórek w celu określenia zakresu deformacji oraz (v) charakterystykę właściwości lepkosprężystych pojedynczych komórek. Badając te mechaniczne właściwości i zachowania, złożona mechanobiologia komórkowa może zostać wydestylowana do wymiernych danych. Protokół opisujący tę metodę pozwala na katalogowanie i porównywanie różnych typów komórek złośliwych i niezłośliwych. Kwantyfikacja tych różnic może pomóc w ustaleniu biomarkerów diagnostycznych i terapeutycznych.

Protocol

1. Przygotowanie do testu ścinania jednokomórkowego

1. Hodowla komórkowa
   1. Wysiewać około 50 000 zawieszonych pojedynczych komórek na szalce Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm zawierającej 2 ml pożywki hodowlanej.
      UWAGA: Wiruj zawieszone komórki przed wysiewem, aby rozbić agregaty komórek.
   2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i odczekać od 10 do 48 godzin na przyłączenie komórek i całkowite wytworzenie białka cytoszkieletu.
      UWAGA: Weź pod uwagę czas trwania przyłączenia komórkowego, a także tempo proliferacji i wzrostu, aby zapewnić odpowiedni wzrost i przywiązanie komórek, unikając agregacji komórek. Te parametry różnią się w zależności od typu komórki.

2. Eksperyment z testem ścinania

1. Przygotowanie lepkich mediów przepływowych do oznaczania ścinania
   1. Aby zapewnić lekko lepki przepływ pożywki (0,015-0,02 Pa·s), odmierz i dodaj 0,05% wag. nietoksycznej i niealergizującej metylocelulozy (4 Pa·s) do pożywki hodowlanej.
   2. Aby zapewnić jednorodną mieszankę, podgrzej podstawowe podłoże hodowlane przez ~10-20 minut w temperaturze ~60-70 °C za pomocą mieszadła magnetycznego/płyty grzejnej. Ciągle mieszając pożywkę, delikatnie dodaj metylocelulozę, aby szybko się rozproszyła, aby uniknąć koagulacji cząstek metylocelulozy. Pozwól temu procesowi kontynuować przez ~ 15-24 godziny, aby zapewnić klarowny roztwór pożywki + celulozy.
      UWAGA: Unikaj nadmiernego podgrzewania roztworu.
   3. Aby zmierzyć lepkość pożywki przepływowej, przetestuj ~0,5-1 ml reprezentatywnego medium przepływowego za pomocą reometru. Na podstawie odczytu określ lepkość płynu i wykorzystaj tę wartość do przedstawienia lepkości ośrodka płynu ścinającego (μ) do obliczenia naprężenia ścinającego za pomocą równania (2).
2. Konfiguracja aparatu ścinającego
   1. Skonfiguruj system prób ścinania podwójnych strzykawek (60 ml lub 100 ml) podłączonych do programowalnej pompy strzykawkowej do infuzji i pobierania lepkiej pożywki hodowlanej (Rysunek 1).
   2. Podłącz obie strzykawki do komory przepływowej za pomocą rurki 1/16 cala i łączników przewodów.
   3. Zamocuj gumową uszczelkę, aby zapewnić kontrolowany, równomierny przepływ w pojedynczych komórkach wzdłuż ścieżki przepływu (Rysunek 1). Gumowa uszczelka jest dostępna w różnych rozmiarach w zależności od profilu przepływu, który ma zostać osiągnięty (laminarny lub turbulentny) i pożądanego obszaru obserwacji (np. długość 22,5 mm, szerokość 2,5 mm i wysokość 0,254 mm) (Rysunek 1).
   4. Zaprogramuj pompę tak, aby zaparzała i pobierała określoną objętość płynu (np. 60 ml) z określoną szybkością (np. 1 ml/min) i wybierz odpowiednie strzykawki (np. 60 ml).
      UWAGA: Weź pod uwagę ustawienia maksymalnej objętości infuzji i odstawienia, aby uniknąć zakleszczenia lub nieprawidłowego działania. Użyć równania (2) do obliczenia wymaganej szybkości ścinania pompy (zakładając, że znane jest wymagane naprężenie i lepkość).
3. Konfiguracja wstępnego ścinania
   1. Napełnić strzykawkę przygotowanym lepkim podłożem przepływowym.
   2. Podłączyć strzykawkę wypełnioną 60 lub 100 ml (lub w razie potrzeby) lepkiej pożywki przepływowej i pustą strzykawkę o pojemności 60 ml w odpowiednich miejscach na programowalnej pompie strzykawkowej. Za pomocą przewodów i łączników do przewodów podłączyć obie strzykawki do komory przepływowej.
   3. Aby zapewnić łatwą identyfikację pojedynczych komórek i mocne połączenie między komorą przepływową a szalką Petriego, przymocuj gumową uszczelkę do komory przepływowej.
   4. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z szalki Petriego zawierającej komórki będące przedmiotem zainteresowania.
   5. Zmyć martwe komórki i luźno przyczepione komórki za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   6. Zassać PBS.
   7. Włóż i zamocuj komorę przepływową i gumową uszczelkę (~34 mm x 9 mm) na szalce Petriego (35 mm x 10 mm) zawierającej dołączone komórki.
   8. Umieść dopasowaną komorę przepływu mikroprzepływowego + komórki na szalce hodowlanej na odwróconym mikroskopie, z obiektywem mikroskopu wystarczająco wysokim, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy o wysokich wartościach pikseli (zwykle od 40x do 63x powiększenia) i monitorem.
   9. Wybierz opcję obrazu na żywo (poklatkowego w niektórych programach) w oprogramowaniu mikroskopu na monitorze. Upewnij się, że oprogramowanie mikroskopu na komputerze ma funkcję t (poklatkową) lub może nagrywać wideo.
   10. Ustaw ostrość obiektywu mikroskopu, zapewniając odpowiedni kontrast i wyraźne krawędzie komórek. Jest to konieczne do analizy obrazu po ścinaniu. Przesuń stolik mikroskopu, aby upewnić się, że komórki są wyraźnie widoczne na monitorze wyświetlacza i są obrazami na żywo.
   11. Wybierz komórkę lub wiele odrębnych komórek w obrębie ścieżki obrazowania/przepływu dopasowanej komory przepływowej + szalki Petriego (obszar/ścieżka utworzona przez dopasowanie uszczelki do komory przepływowej).
4. Ścinanie i obrazowanie
   1. Aby utrzymać ciągły, równomierny przepływ, wybierz podobne szybkości infuzji i wycofania oraz zapewnij laminarny przepływ płynu, zwykle od 1 ml/min do 5 ml/min. W przypadku reżimów niskiego przepływu laminarnego należy upewnić się, że liczba Re Reynoldsa wynosi < 100.
   2. Kliknij Uruchom na pompie ścinającej, aby wstrzykiwać i odbierać płyn ścinający (przygotowane lepkie media) w sposób ciągły. Upewnij się, że podczas infuzji płynów nie ma pęcherzyków, ponieważ może to spowodować zewnętrzny, niewyjaśniony stres na komórkach.
   3. Rozpocznij nagrywanie wideo, klikając przycisk nagrywania w oprogramowaniu mikroskopu, zanim podany płyn ścinający wejdzie w kontakt z komórką (komórkami) będącą przedmiotem zainteresowania pod mikroskopem.
   4. Kontynuuj nagrywanie przez 7 minut lub przez żądany czas ekspozycji na stres lub do momentu, gdy interesujące Cię komórki odetną się od dna naczynia. Kliknij przycisk Zatrzymaj nagrywanie w oprogramowaniu mikroskopu, gdy przebieg zostanie zakończony zgodnie z potrzebami.
   5. Zapisz nagranie i rozpakuj jako .tiff pliki. Najlepiej wyodrębniać obrazy z prędkością 1 klatki na sekundę w celu łatwej analizy.

3. Przetwarzanie danych

1. Procedura cyfrowej korelacji obrazu (analiza obrazu)
   1. Jeśli nagranie z mikroskopu zostało wyodrębnione jako plik wideo, należy je przekonwertować na klatki obrazu (najlepiej .tiff formacie pliku).
   2. Zaimportuj obrazy pochodzące z zapisu testu ścinania do oprogramowania Davis 10.1.2 (oprogramowanie DIC), aby śledzić ruch naturalnie wzorzystych struktur komórki, lokalizując każdy blok piksela (podzbiór) obrazu referencyjnego na odpowiednich nowych obrazach (zdeformowane obrazy) ( Rysunek 2).
   3. Aby uzyskać zoptymalizowaną korelację, należy użyć rozmiaru podzbioru 31 x 31 pikseli, rozmiaru kroku (odległości deformacji każdego podzbioru) wynoszącej 20 pikseli oraz sumy opcji ścieżki różnicowej, która śledzi deformację nowego obrazu w stosunku do ostatniego obrazu. Wynikiem tej korelacji jest wykres odkształcenia w czasie (Rysunek 3), który można wyeksportować jako plik .csv do dalszej analizy w MATLAB.
   4. Odwzorowuj obszar zainteresowania dla wybranej pojedynczej komórki. Wybierz dowolne punkty w odwzorowanej komórce, aby śledzić deformację. W przypadku nieregularnego kształtu, takiego jak komórka, użyj maski wielokąta, aby odwzorować geometrię komórki.
   5. Po zmapowaniu wybierz określone punkty na komórce (jądrze lub cytoplazmie), które mają być analizowane, klikając dodaj tensometr i rysując poszczególne tensometry w punktach w zdefiniowanej granicy komórki.
   6. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć przetwarzanie szczepu i uzyskać dane dotyczące odkształcenia w funkcji czasu.
   7. Kliknij dwukrotnie (lub kliknij prawym przyciskiem myszy) wygenerowany wykres odkształcenia w czasie i wybierz opcję eksportuj dane jako arkusz kalkulacyjny.

4. Charakterystyka właściwości mechanicznych

1. Charakterystyka właściwości lepkosprężystych
   1. Zapisz plik .csv zawierający dane dotyczące czasu odkształcenia z oprogramowania DIC w osobnym folderze, aby był łatwy do odczytania przez MATLAB.
   2. Uruchom MATLAB i kliknij kartę edytora, aby otworzyć stronę edytora i napisać kod, który odczytuje arkusz kalkulacyjny, komórka po komórce.
   3. Zmień ścieżkę MATLAB (ścieżkę folderu, który uzyskuje dostęp do interesującego Cię pliku), aby uzyskać dostęp do folderu zawierającego dane do analizy, na przykład Użytkownicy/Nazwa użytkownika/Pulpit/dane.
   4. Na stronie edytora MATLAB uzyskaj dostęp do danych arkusza kalkulacyjnego przy użyciu dostosowanego kodu. Na przykład: a1= xlsread('data','run1','A4:A183'), gdzie a1 reprezentuje identyfikator, xlsread to funkcja MATLAB, która odczytuje plik .csv (w tym przypadku jako arkusz kalkulacyjny), dane to nazwa pliku, run1 to nazwa arkusza, a A4:A183 to zakres danych będących przedmiotem zainteresowania w komórce A danych arkusza kalkulacyjnego do analizy. Aby uzyskać pełne dopasowanie, przeanalizuj x i y (odpowiednio czas i odkształcenie). Na przykład:
      a1=xlsread('dane','run1','A4:A183');
      b1=xlsread('dane','run1','B4:B183');
      A1 = X (czas) i B1 = Y (odkształcenie).
   5. W programie MATLAB kliknij pozycję Aplikacje | Instalator krzywych | Równanie niestandardowe. Wyczyść reprezentatywne równanie niestandardowe i wprowadź równanie modelu lepkosprężystego [równanie (1)], gdzie ε reprezentuje zmienną x, a t oznacza zmienną y.
      (1)
      Tutaj ε reprezentuje odkształcenie, σ reprezentuje naprężenie ścinające, η₁ reprezentuje lepkość, E reprezentuje elastyczność, t reprezentuje czas, a τ reprezentuje czas relaksacji, który charakteryzuje maksymalny czas potrzebny do powrotu komórki do pierwotnego kształtu po pierwotnym odkształceniu. Jest ona wyrażona jako τ = , gdzie η₂ to drugorzędny składnik lepkości dla drugiego łącznika (Rysunek 4).
   6. Ponowne przypisywanie nowych zmiennych do parametrów lepkosprężystych w interfejsie równania niestandardowego. (ε, η₁, E, σ, t i τ = ) będzie reprezentować odpowiednio (x, a, b, K, y i c). Tutaj x i y są odpowiednio zmiennymi niezależnymi i zależnymi. Naprężenie ścinające (σ) można wyznaczyć za pomocą równania (2):
      (2)
      Tutaj μ reprezentuje lepkość medium ścinającego, Q to natężenie przepływu pompy, a w i h to szerokość i wysokość kanału przepływowego pokazane odpowiednio na Rysunek 1C.
   7. Kliknij Wybierz dane, aby wybrać czas (a1) i odkształcenie (b1) dla każdego zestawu danych.
   8. Upewnij się, że opcja Automatyczne dopasowanie jest zaznaczona. Dopasowanie jest uruchamiane automatycznie po wybraniu danych (x i y).
   9. Wybierz metody montażu, aby dokręcić warunki brzegowe. Kliknij Opcje zaawansowane w kategorii Metody i wybierz opcję Najmniejsze kwadraty nieliniowe. W obszarze Solidny wybierz pozycję Wyłączone, a następnie w obszarze Algorytm wybierz pozycję Region zaufania. Pozostaw wszystkie inne parametry bez zmian.
   10. Nowe zmienne po dopasowaniu (a, b i c) reprezentują odpowiednio właściwości lepkosprężyste, lepkość, elastyczność i czas relaksacji (η₁, E, EQUAT) komórki (Rysunek 5).
   11. Poszukaj wysokiej wartości R-kwadrat dopasowania (R² > 80%), aby upewnić się, że dane wyjściowe można uznać za rzeczywiste dopasowanie modelu lepkosprężystego (Rysunek 3)

Results

Protokół testu ścinania w połączeniu z analizą deformacji przy użyciu DIC i modelu lepkosprężystego jest skuteczny w ilościowym określaniu właściwości mechanicznych pojedynczej komórki in vitro. Ta metoda została przetestowana na ludzkich i mysich liniach komórkowych, w tym na normalnych ludzkich komórkach piersi (MCF-10A)^3,4,9, mniej przerzutowych potrójnie ujemnych komórek raka piersi (MDA-MB-468)³

Discussion

Metoda testu ścinania, która obejmuje stworzenie pseudo-mechanobiologicznego środowiska w celu symulacji interakcji komórek z otaczającym mikrośrodowiskiem mechanicznym i ich reakcji na naprężenia mechaniczne, stworzyła katalog właściwości mechanicznych komórek, których wzorce wskazują na zachowaną fizyczną atypię wśród linii komórek nowotworowych 3,4,5,7,8 . ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL CULTURE
,25% Trypsyna, 2,21 mM EDTA, 1x[-] wodorowęglan sodu	Corning	25-053-ci	Do oddzielania komórek od substratu w hodowli komórkowej
15 ml Probówki wirówkowe	Falcon firmy Corning	05-527-90
35 mm szalki Petriego	Corning	430165
50 ml Probówki	wirówkoweFalcon by Corning	14-432-22
Wirówka	dowolna		Do sterylnej hodowli komórkowej
Modyfikacja pożywki Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Lub dowolna inna pożywka do hodowli komórek. DMEM użyto do hodowli komórek U87
Rękawice	dowolne		Do sterylnej hodowli komórek
Heracell Vios 160i Inkubator CO2	Thermo Scientific	51033770	Do inkubacji podczas hodowli komórkowej
Kaptur	dowolny		Do sterylnej hodowli komórek
Mikropipeta	dowolna		Do sterylnej hodowli komórek
Końcówki do mikropipet	dowolny		Do sterylnych hodowli komórkowych
Mikroskop	Leica/dowolny		Do sterylnych hodowli komórkowych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez wapnia i magnezu PBS, 1x	Corning	21-040-CM
Pipetman	dowolny		Do sterylnych hodowli komórkowych
Końcówki do pipet	dowolne		Do sterylnej hodowli komórek
Precyzyjny inkubator płynny GP 10	Thermo Scientific	TSGP02
T25 Kolba	Corning	430639
T75 Kolba	Corning	430641U
SHEAR TEST
100 mL zlewka	dowolna		Do tworzenia lepkiego podłoża ścinającego DMEM + metylocelulozy
DMEM	Corning
Komora przepływowa + uszczelka gumowa	Glycotech	31-001	Zestaw komory przepływowej okrągłej (do naczyń do hodowli tkankowych 35 mm)
Reometr hybrydowy	HR-2 Discovery Reometr		Do oznaczania lepkości płynu ścinającego
Mieszadło magnetyczne	dowolne		Do tworzenia lepkich mediów ścinających DMEM + metyloceluloza
Mieszadło magnetyczne	dowolne		Do tworzenia DMEM + metyloceluloza lepkie media ścinające
Metyloceluloza	dowolna		Aby zwiększyć lepkość DMEM w mediach przepływowych
Pompa strzykawkowa	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	Do programowania infuzji i pobierania płynów
Strzykawki, rurki i łączniki			Do konfiguracji aparatu ścinającego
SOFTWARE
Oprogramowanie ABAQUS	Oprogramowanie Simulia
Digitial Image Correlation	LaVision, Niemcy	DAVIS 10.1.2
Oprogramowanie do obrazowania	Leica/dowolne oprogramowanie
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B