Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Chorobowa normemmiczna izolowana perfuzja wątroby u świń

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65336

⸱

9 czerwca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Laboratory of Abdominal Transplantation, KU Leuven, 2Department of Abdominal Transplant Surgery and Coordination, University Hospitals Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany tutaj świński model normotermicznej perfuzji maszynowej wątroby (NMP) może być z powodzeniem wykorzystany do badania NMP jako strategii zachowania, narzędzia do oceny żywotności i platformy do naprawy narządów. Ma wysoką wartość translacyjną, jednak jest trudny technicznie i pracochłonny.

Streszczenie

Modele świńskie normotermicznej perfuzji maszynowej ex situ wątroby (NMP) są coraz częściej wykorzystywane w badaniach transplantacyjnych. W przeciwieństwie do gryzoni, wątroby świń są anatomicznie i fizjologicznie zbliżone do ludzi, mają podobną wielkość narządów i skład żółciowy. NMP zachowuje przeszczep wątroby w warunkach zbliżonych do fizjologicznych poprzez recyrkulację ciepłego, natlenionego i wzbogaconego w składniki odżywcze perfuzatu na bazie czerwonych krwinek przez układ naczyniowy wątroby. NMP może być stosowany do badania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego, zachowania wątroby ex situ przed przeszczepem, oceny funkcji wątroby przed implantacją oraz zapewnienia platformy do naprawy i regeneracji narządów. Alternatywnie, NMP z perfuzatem na bazie krwi pełnej może być stosowany do naśladowania przeszczepu. Niemniej jednak model ten jest pracochłonny, wymagający technicznie i wiąże się z wysokimi kosztami finansowymi.

W tym modelu NMP świń używamy ciepłych wątrob z uszkodzeniem niedokrwiennym (co odpowiada dawstwu po śmierci krążeniowej). Najpierw inicjowane jest znieczulenie ogólne z wentylacją mechaniczną, a następnie indukcja ciepłego niedokrwienia poprzez zaciśnięcie aorty piersiowej na 60 minut. Kaniule wprowadzone do aorty brzusznej i żyły wrotnej umożliwiają wypłukanie wątroby zimnym roztworem konserwującym. Wypłukaną krew przepłukuje się środkiem oszczędzającym komórki w celu uzyskania skoncentrowanych czerwonych krwinek. Po hepatektomii kaniule są wprowadzane do żyły wrotnej, tętnicy wątrobowej i żyły głównej podwątrobowej i podłączane do zamkniętego obwodu perfuzyjnego zaszczepionego ekspanderem osocza i czerwonymi krwinkami. W obwodzie znajduje się natleniacz z pustych włókien i sprzężony z wymiennikiem ciepła w celu utrzymania pO2 na poziomie 70-100 mmHg w temperaturze 38 °C. NMP uzyskuje się poprzez ciągły przepływ bezpośrednio przez tętnicę i przez zbiornik żylny przez żyłę wrotną. Przepływy, ciśnienia i wartości gazometrii krwi są stale monitorowane. Aby ocenić uszkodzenie wątroby, pobiera się próbki perfuzatu i tkanek w określonych punktach czasowych; Żółć pobierana jest za pomocą kaniuli w wspólnym przewodzie żółciowym.

Wprowadzenie

Przeszczep wątroby jest jedynym ostatecznym sposobem leczenia schyłkowej niewydolności wątroby; Jednak jego powodzenie jest ograniczone przez utrzymującą się nierównowagę między pacjentami na liście oczekujących a dostępnością potencjalnych narządów dawców1. Aby zwiększyć pulę dawców, w ciągu ostatniej dekady stopniowo rozszerzano kryteria dawców, w tym starszy wiek dawcy, stłuszczenie wątroby i dawstwo po śmierci krążeniowej (DCD)2,3. Podczas zabiegu DCD wątroba niezmiennie cierpi na okres ciepłego niedokrwienia między odstawieniem terapii podtrzymującej życie, oświadczeniem o zgonie a chłodzeniem i konserwacją in situ, pogarszając uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI)4. W rezultacie, wątroby DCD są związane ze zwiększoną częstością występowania wczesnej dysfunkcji przeszczepu allogenicznego i powikłań żółciowych 5,6.

W przypadku tych wątrob dawców wysokiego ryzyka konwencjonalne przechowywanie w niskiej temperaturze nie zapewnia wystarczającej ochrony przed IRI. W związku z tym alternatywne strategie konserwacji, takie jak normotermiczna perfuzja maszynowa (NMP), zyskały znaczną popularność. Podczas normotermicznej perfuzji maszynowej wątroba jest podłączona ex situ do izolowanego obwodu i perfundowana natlenionym i wzbogaconym w składniki odżywcze perfuzatem w temperaturze ciała. Badania kliniczne sugerują, że NMP zmniejsza uszkodzenie komórek wątroby, co znajduje odzwierciedlenie w zmniejszonym szczytowym uwalnianiu aminotransferaz i wczesnej dysfunkcji przeszczepu allogenicznego7. Jednak niewiele wiadomo na temat biologii komórek wątroby podczas NMP8.

Modele zwierzęce odegrały kluczową rolę w ewolucji przeszczepu wątroby. W przeciwieństwie do modeli gryzoni, świnia jest uważana za osobę o wyższej wartości translacyjnej, ponieważ wątroba świni jest anatomicznie i fizjologicznie zbliżona do ludzkiej, o podobnej wielkości narządów i składzie żółciowym. Niemniej jednak modele przeszczepu wątroby świń są pracochłonne, trudne do standaryzacji i wiążą się ze znacznie wyższymi kosztami finansowymi.

NMP wątroby świń może być używany do różnych celów. Może być stosowany do naśladowania przeszczepu ex situ przy użyciu perfuzatu na bazie krwi pełnej, w celu zachowania wątroby dawcy w środowisku ochronnym z perfugatem na bazie czerwonych krwinek zubożonych w leukocyty, w celu oceny potencjalnych biomarkerów przewidujących czynność wątroby ex situ przed przeszczepem lub jako platforma do badania terapii regeneracyjnej 9,10,11.

Przyjęcie modeli NMP wątroby świń jest trudne, a aspekty techniczne związane z chirurgią i perfuzją są prawie nieopisane. W naszym laboratorium badawczym przyjęliśmy konfigurację NMP pierwotnie opisaną przez Butlera i wsp.12 w celu opracowania i walidacji 24-godzinnego modelu perfuzji wątroby izolowanej ex situ świni, który można wykorzystać zarówno do zachowania przeszczepu wątroby do przeszczepu, jak i do naśladowania przeszczepu. Tutaj opisujemy protokół krok po kroku; Ramy metodologiczne i potencjalne pułapki zostały opublikowane w innym miejscu9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

KU Leuven przestrzega Europejskiej Dyrektywy w sprawie dobrostanu zwierząt (dyrektywa 2010/63/UE) w zakresie badań z udziałem zwierząt. Dyrektywa ta, która została również wdrożona do prawa belgijskiego, kładzie nacisk na zasadę "3R" (zastąpienie, ograniczenie, udoskonalenie) i zapewnia, że wykorzystywanie zwierząt jest uzasadnione potencjalnymi korzyściami i że nie istnieją realne alternatywy. Wszystkie eksperymenty w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z Europejską Dyrektywą w sprawie dobrostanu zwierząt i po zatwierdzeniu przez komitet ds. opieki nad zwierzętami KU Leuven (P054/2020).

1. Informacje o zwierzętach

UWAGA: W tym protokole badania wykorzystuje się samce świń TOPIGS TN70 w wieku 3 miesięcy, o masie ciała około 30 kg i masie wątroby 600-700 g.

  1. Trzymaj zwierzęta w 12-godzinnym rytmie dnia i nocy w pojedynczych kojcach ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody z kranu oraz kontaktem wzrokowym, węchowym i słuchowym między nimi.
  2. Upewnij się, że zwierzęta przybyły co najmniej 2 dni przed zabiegiem, aby przyzwyczaić się do otoczenia. Pościć świnie przez 12 godzin przed zabiegiem z wolnym dostępem do wody.
    UWAGA: Znieczulenie podtrzymuje się izofluranem, a znieczulenie fentanylem. Przez cały okres znieczulenia elektrokardiogram, pulsoksymetria, kapnografia i ciśnienie krwi są stale monitorowane. Eksperymenty są śmiertelne; Świnie są poddawane eutanazji przez wykrwawienie, podczas gdy wątroba jest pobierana w ciągłym znieczuleniu ogólnym i znieczuleniu.

2. Przygotowanie zestawu do perfuzji

  1. Montaż jednorazowego zestawu perfuzyjnego
    1. Ustabilizować zbiornik na ustalonej wysokości, około 15 cm wyżej niż pojemnik wątroby.
    2. Podłącz głowicę pompy do wyznaczonego gniazda w pompie odśrodkowej. Podłącz rurkę tlenową do natleniacza. Podłącz rurki wlotowe i odpływowe nagrzewnicy/chłodnicy do wyznaczonych szczelin w natleniaczu.
    3. Zamontuj jeden zawór zaciskowy na rurze odpływowej pod zbiornikiem. Zamontuj drugi zawór zaciskowy na rurze dopływowej do zbiornika po połączeniu Y, gdzie druga rurka będzie zasilać tętnicę wątrobową.
      UWAGA: Pierwszy zawór zaciskowy będzie kontrolował dopływ do żyły wrotnej. Zamknięcie drugiego zaworu zaciskowego zwiększy przepływ, a tym samym również ciśnienie w tętnicy wątrobowej.
    4. Zamontuj czujnik przepływu dystalnie od pierwszego zaworu zaciskowego na rurze odpływowej zbiornika. Zamontuj drugi czujnik przepływu na rurze dopływowej do głowicy pompy.
      UWAGA: Pierwszy czujnik przepływu zmierzy przepływ do żyły wrotnej. Drugi czujnik przepływu zmierzy odpływ z żyły głównej.
    5. Odetnij rurkę odpływową od natleniacza i włóż filtr tętniczy we właściwym kierunku.
      UWAGA: Przyciąć rurkę nie dłużej niż 2 cm za dotleniaczem; jeśli zostanie pozostawiony zbyt długo, zagnie się, gdy rurka stanie się bardziej miękka, gdy zostanie przetopiona perfuzatem o temperaturze 37 °C. Jeśli nadal się załamuje, podeprzyj filtr tętniczy, przywiązując go do podpory zbiornika.
  2. Montaż rurki recyrkulacyjnej przecieku
    1. Zestaw perfuzyjny zawiera dwie probówki z jedną końcówką 3/16 i jedną końcówką 1/16. Połącz dwie rurki ze sobą, wkładając końcówkę 1/16 do końcówki 3/16. Podłącz końcówkę 3/16 do zbiornika.
    2. Zamontuj rurkę w pompie rolkowej, biorąc pod uwagę kierunek obrotów. Ustaw odpowiednią średnicę rurki i ustaw prędkość na 15-18 obrotów na minutę (rpm). Umieść końcówkę 1/16 w pojemniku na wątrobę i zamocuj w razie potrzeby.
  3. Ciągła kalibracja gazometrii krwi in-line
    1. Włącz analizator gazów i wybierz opcję Kalibruj.
    2. Sprawdź prawidłowy numer seryjny na opakowaniu czujnika i naciśnij OK.
    3. Wyjmij uchwyt czujnika tętniczego z kasety i podłącz do niego czujnik za pomocą niebieskiej nasadki na górze i białego filtra na dole.
    4. Odkręć i zdejmij białą nakrętkę pod filtrem; Nie odkręcaj samego filtra. Poluzuj niebieską nasadkę odpowietrzającą na górze, nie zdejmuj jej. Mocno włóż czujnik i uchwyt czujnika do kasety kalibracyjnej.
    5. Rozpocznij kalibrację. Po zakończeniu kalibracji wyjmij czujnik i uchwyt czujnika z kasety kalibracyjnej. Wyjmij biały filtr na dole i dokręć niebieską nasadkę odpowietrzającą na górze.
    6. Umieścić czujnik w przewodzie do pobierania próbek zestawu do perfuzji. Nie rozpoczynaj analizy gazu, dopóki obwód perfuzyjny nie zostanie zalany.
  4. Gruntowanie obwodu
    1. Wprowadzić linię infuzyjną do worka o pojemności 500 ml z ekspanderem osocza i podłączyć go do zbiornika. Umieść rurkę clamp na przewodzie odpływowym zbiornika i napełnij zbiornik 300 ml ekspandera plazmowego.
    2. Zdejmij rurkę clamp i pozwól ekspanderowi plazmy wypełnić obwód
    3. Odpowietrzyć głowicę pompy i natleniacz. Obwód jest teraz zalany. Włączyć grzałkę/chłodnicę i ustawić ją na 38 °C
  5. Przygotowanie linii infuzyjnych
    1. Pobrać 5 ml (25 000 j.) roztworu heparyny o stężeniu 5 μ/ml do strzykawki o pojemności 50 ml. Pobrać dodatkowe 25 ml 0,9% roztworu NaCl, aby uzyskać całkowitą objętość 30 ml roztworu heparyny (szybkość infuzji: 1 ml/h).
    2. Rozpuść 5 g taurocholanu sodu w 50 ml 0,9% NaCl i wciągnij go do 450 ml 0,9% NaCl, aby osiągnąć stężenie 1%. Potrzebna jest całkowita objętość 168 ml (szybkość infuzji: 7 ml/h).
    3. Pobrać 2 ml (200 j.) roztworu insuliny o stężeniu 100 j./ml do strzykawki o pojemności 50 ml. Pobrać dodatkowe 28 ml 0,9% roztworu NaCl, aby uzyskać całkowitą objętość 30 ml roztworu insuliny (szybkość infuzji: 1 ml/h).
    4. Pobrać 10 ml buforu glicynowego (rozcieńczalnika) i dodać go do fiolki 0,5 mg epoprostenolu. Korzystając z filtra mikrobiologicznego znajdującego się w zestawie epoprostenolu, pobrać 5 ml z fiolki zawierającej epoprostenol rozpuszczony w buforze glicyny w strzykawce o pojemności 50 ml. Pobrać dodatkowe 25 ml 0,9% roztworu NaCl, aby uzyskać całkowitą objętość 30 ml roztworu epoprostenolu (szybkość infuzji: 1 ml/h).

3. Indukcja znieczulenia

  1. Sedacja
    1. Przygotować strzykawkę z 2 mg/kg ksylazyny i 8 mg/kg leku Zoletil (4 mg/kg tiletaminy i 4 mg/kg zolazepamu), strzykawkę z 10 ml 0,9% NaCl, zastawkę trójdrogową, przedłużacz i igłę domięśniową 21 G.
    2. Umieść igłę w mięśniu pośladkowym, wstrzyknij mieszaninę ksylazyny i tiletaminy i przepłucz linię przedłużającą 0,9% NaCl. Po 15 minutach świnia jest uspokajona.
    3. Zważ świnię i przetransportuj ją na salę operacyjną.
  2. Znieczulenie
    1. Włącz wentylator
    2. Ułóż świnię w pozycji leżącej na stole operacyjnym i unieruchom kończyny.
    3. Wstępnie natlenić za pomocą maski wentylacyjnej z 1,5 lO2, 1,5 l powietrza i 1% izofluranu.
    4. Przymocuj sondę saturacyjną do ogona lub ucha. Podłącz trzy przewody elektrokardiogramu w celu ciągłego monitorowania.
    5. Wprowadzić cewnik 22 G do żyły usznej, podłączyć do zaworu trójdrogowego i rozpocząć kroplówkę płynów dożylnych (IV) (plazmalitu) z szybkością 400 ml/h.
    6. Umieścić strzykawkę o pojemności 60 ml z 50 μg/ml fentanylu w automatycznym sterowniku strzykawkowym. Podawać bolus 1 ml i rozpocząć ciągłą infuzję z szybkością 0,16 ml/kg mc./h.
    7. Zdejmij maskę wentylacyjną i włóż laryngoskop, podnosząc nagłośnię. Włóż rurkę dotchawiczą do tchawicy i napompuj balon, aby zapobiec wyciekowi powietrza. Przymocuj rurkę taśmą do pyska świni.
      UWAGA: Podczas zdejmowania maski wentylacyjnej należy wyłączyć izofluran.
    8. Podłączyć rurkę dotchawiczą do respiratora.
      UWAGA: Ustawienia wentylatora: 0,4 l objętości oddechowej; średnie ciśnienie w drogach oddechowych 0,5 kPa; ciśnienie w drogach oddechowych 2,5 kPa; dodatnie końcowe ciśnienie wydechowe 0,5 kPa; Częstotliwość 15/min; 4,7-5,3 kPaCO 2 przy końcu pływów.
    9. Podłącz kapnograf do rurki dotchawiczej.

4. Zabieg chirurgiczny

  1. Cewnik do żył głębokich i linia tętnicza
    1. Zdezynfekuj pole operacyjne betadyną i umieść serwety po obu stronach linii środkowej.
    2. Wykonaj nacięcie o długości 7 cm od lewej strony górnej części mostka bocznie do mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego i umieść retraktor ortostatyczny.
    3. Wypreparuj tkankę podskórną z mięśnia w kierunku bocznym i zidentyfikuj żyłę szyjną zewnętrzną. Wypreparuj żyłę, podwiązując boczne gałęzie, jeśli są obecne.
    4. Umieść dwie ligatury 2/0 wokół żyły szyjnej zewnętrznej i zawiąż ligaturę czaszki.
    5. Rozciąć żyłę ogonową od zawiązanej ligatury i wprowadzić 12 francuskich cewników żylnych.
      UWAGA: Upewnij się, że cewnik żylny jest przepłukany heparynizowaną solą fizjologiczną przed wprowadzeniem.
    6. Unieruchomić cewnik za pomocą drugiej ligatury. Jeśli cewnik żylny w żyle usznej jest delikatny lub zbyt mały, przełączyć płyn dożylny i przewody fentanylu na cewnik do żył głębokich. W przeciwnym razie nie należy go używać do czasu pobrania krwi do urządzenia oszczędzającego komórki.
    7. Wypreparować przyśrodkową krawędź mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego i wymienić retraktor ortostatyczny, otwierając płaszczyznę między mięśniem mostkowo-obojczykowo-sutkowym po stronie bocznej a tchawicą po stronie przyśrodkowej.
    8. Usuń grasicę, aby odsłonić tętnicę szyjną. Powtórz krok 4.1.4 dla tętnicy.
    9. Włóż linię tętniczą do tętnicy szyjnej w kierunku ogonowym i unieruchomij. Podłącz linię tętniczą do linii z czujnika ciśnienia.
  2. Rozwarstwienie aorty i żyły głównej
    1. Wykonaj laparotomię linii środkowej od mieczykowatej kości do kości łonowej.
      UWAGA: U samców świń, ogonowo od prącia, naciąć 1 cm z boku od linii środkowej, aby uniknąć uszkodzenia podskórnej cewki moczowej.
    2. Przeciąć więzadło pępowinowe. Umieść retraktor brzuszny. Pociągnij jelita w lewo na boki i czaszkę, aby uwidocznić aortę i żyłę główną.
      UWAGA: Jelito świni jest nierotowane; Dlatego nie jest konieczna mobilizacja jelita grubego, aby uzyskać dostęp do przestrzeni zaotrzewnowej.
    3. Wypreparuj około 3 cm aorty tuż przy czaszce rozwidlenia biodrowego i umieść dwie ligatury wokół aorty.
      UWAGA: W pobliżu aorty znajduje się duże naczynie limfatyczne; Uważaj, aby go nie uszkodzić, ponieważ spowoduje to rozmycie pola operacyjnego i skomplikuje rozwarstwienie.
    4. Wypreparuj żyłę główną na tym samym poziomie co aortę i umieść dwie ligatury.
  3. Rozwarstwienie więzadła żołądka i dwunastnicy
    1. Rozpocznij rozwarstwienie po bocznej stronie więzadła żołądkowo-dwunastniczego, wypreparuj wspólny przewód żółciowy i okrąż pętlą naczynia.
    2. Cofnij przewód żółciowy na stronę przyśrodkową, odsłaniając żyłę wrotną. Usuń duży węzeł chłonny po bocznej stronie żyły wrotnej
    3. Uwolnij żyłę wrotną w kierunku trzustki; Często znajduje się gałąź z żołądka i trzustki, która musi zostać podwiązana i przecięta. Otaczaj żyłę wrotną pętlą naczyniową z boku wątroby i ligaturą z boku trzustki. Cofnij żyłę wrotną na boki, uważając, aby jej nie zamknąć.
    4. Zidentyfikuj wspólną tętnicę wątrobową i opocz ją pętlą naczynia.
  4. Rozwarstwienie aorty piersiowej
    1. Pociągnij wątrobę ogonową i otwórz centralną ścięgnistą część przepony brzusznie od żyły głównej nadwątrobowej. Cofnij przełyk na prawą stronę, odsłaniając aortę piersiową.
    2. Wypreparuj z otaczającej tkanki i uważaj, aby nie uszkodzić żyły azygotycznej.
      UWAGA: Nie jest konieczne otaczanie aorty piersiowej; Rozwarstwienie powinno być wystarczająco rozciągnięte, aby umieścić zacisk naczyniowy.
  5. Przygotowanie wygaszacza komórek
    1. Zawieś zbiornik w czarnym pierścieniu, zdejmij nasadkę z pojedynczej nogi adaptera i przymocuj rurkę do portu wylotowego 3/8 cala na dnie zbiornika do pobierania krwi.
    2. Odkręć rurkę ssącą/antykoagulacyjną i podłącz ją do jednego z 1/4 cala otworów wlotowych krwi na górnej krawędzi zbiornika do pobierania krwi.
    3. Włóż miskę zestawu do mycia, obracając; Upewnij się, że słychać kliknięcie.
    4. Umieść rurkę w pompie rolkowej i rozdzielaczu rury.
    5. Zawieś worek do pobierania krwi z cytrynianem, fosforanem, dekstrozą, adeniną (CPDA)-1 na słupie i upewnij się, że połączenie jest szczelne.
      UWAGA: Skład worka na krew CPDA-1 (63 ml): 2,99 g/l bezwodnego kwasu cytrynowego; 26,3 g/l dihidrowy cytrynian sodu; 2,22 g/l monohysratu fosforanu sodu; 31,9 g/l dekstroza jednowodna; 0,275 g/l adeniny.
    6. Zawieś worek na odpady z boku pralki (upewnij się, że jest prawidłowo zamknięty) i podłącz go do zestawu do prania (żółta nasadka).
    7. Podłącz obie probówki w kształcie litery Y (białe nakrętki) do worka zawierającego 3 litry 0,9% NaCl.
    8. Przymocuj probówkę z niebieską nasadką do rurki adaptera na dnie zbiornika do pobierania krwi. Włączyć system autotransfuzji.
  6. Kaniulacja aorty i żyły głównej
    1. Podawać 500 j.m./kg heparyny i pozostawić ją do krążenia przez 2 minuty. Zawiąż więzadło ogonowe wokół aorty i włóż 20-letnią kaniulę francuską do aorty i zamocuj. Ta sama procedura jest powtarzana dla żyły głównej.
  7. Aby naśladować procedurę DCD, ciepłe niedokrwienie jest wywoływane przez zaciśnięcie aorty piersiowej przez pewien czas, w tym przypadku 60 minut.
    UWAGA: Podczas ciepłego niedokrwienia otwierany jest drenaż jamy głównej i szyjnej oraz rozpoczyna się pobieranie krwi do wygaszacza komórek. Powoduje to wykrwawienie świni. Zgon potwierdza się za pomocą EKG, pulsoksymetrii, kapnografii i pomiaru ciśnienia krwi.
  8. Płukanie wątroby
    1. Pod koniec ciepłego niedokrwienia zainicjuj zimne płukanie 2 litrami lodowatego (4-6 °C) roztworu konserwującego przez kaniulę aorty i schłodzić brzuch miejscowym zastosowaniem lodu błotnego.
      UWAGA: Podczas zimnego płukania cała pozostała krew jest wypłukiwana i zbierana do wygaszacza komórek.
    2. Po przepłukaniu pierwszych 2 litrów wyjmij kaniulę z aorty, zawiąż ligaturę na żyle wrotnej i kaniuluj żyłę wrotną. Następnie umocuj go za pomocą pętli naczynia.
    3. Przepłukać wątrobę przez żyłę wrotną kolejnymi 2 litrami lodowatego (4-6°C) roztworu konserwującego.
  9. Hepatektomia
    1. Usuń lód z brzucha. Przeciąć przewód żółciowy w pobliżu trzustki.
    2. Usuń kaniulę wrotną i podziel żyłę wrotną. Cofnij jelita w lewo, aby odsłonić żyłę podwątrobową główną.
    3. Wypreparuj żyłę główną z żyły zaotrzewnowej i podziel tylko żyłę czaszkową od nerkowej. Przeciąć wspólną tętnicę wątrobową aż do tętnicy trzewnej i pochodzenie od aorty.
      UWAGA: Cięcie odpowiedniej membrany może poprawić ekspozycję.
    4. Podziel tętnicę żołądkowo-dwunastniczą i wytnij tętnicę trzewną za pomocą łaty aorty. Przeciąć sieć mniejszą blisko żołądka, czaszkowo aż do przełyku
    5. Zmobilizuj lewą wątrobę, przecinając lewe więzadło trójkątne. Przetnij przeponę po lewej stronie żyły głównej.
    6. Zmobilizuj prawą wątrobę, przecinając prawą przeponę od brzusznej do grzbietowej, kończąc się zaledwie doogonowo od przecięcia żyły głównej podwątrobowej.
    7. Przetnij żyłę główną nadwątrobową i odetnij wszelkie pozostałe przyczepy. Wątroba jest teraz wolna; Wyjmij go i umieść w misce z lodowatą wodą.
  10. Procedura przy tylnym stole
    1. Zważ wątrobę. Kankaniuluj żyłę wrotną za pomocą 25-krotnej francuskiej kaniuli i zabezpiecz ligaturami. Kanulować tętnicę wątrobową za pomocą 14 francuskiej wzmocnionej kaniuli i utrwalić za pomocą ligatur.
    2. Kanniulować żyłę podwątrobową główną i umieścić końcówkę kaniuli na poziomie, na którym żyły wątrobowe odpływają w żyle głównej. Zafiksuj za pomocą ligatur.
    3. Umieść sznurek torebki wokół krawędzi przepony, aby zapobiec krwawieniu z jakichkolwiek żył przeponowych i zawiąż żyłę główną nadwątrobową.
    4. Odwietrzyć kaniulę wrotną i wykonać płukanie żyły wrotnej za pomocą 250 ml ekspandera zimnej plazmy. Sprawdź, czy nie ma wycieków.
      UWAGA: Sprawdź, czy przez kaniulę kawantylową jest odpowiedni odpływ.
    5. Po przepłukaniu portalu umieść zacisk rurki na kaniuli wrotnej, upewniając się, że powietrze nie dostaje się do kaniuli i żyły wrotnej.
    6. Odpowietrzyć kaniulę tętniczą i przepłukać 250 ml ekspandera zimnego osocza przez tętnicę wątrobową. Sprawdź, czy nie ma wycieków i przypnij boczne gałęzie. Umieść zacisk rurki na kaniuli tętniczej i głównej.

5. Perfuzja maszynowa Normothermiczna

  1. Perfuzja
    1. Podczas przygotowania na tylnym stole dodaj do obwodu wytworzone przez oszczędzacz komórek, umyte czerwone krwinki, aby uzyskać pożądany hematokryt na poziomie 30%. Uruchomić pompę, aby wymieszać czerwone krwinki z ekspanderem osocza. Uruchom ciągły analizator gazów.
      UWAGA: Wzór na objętość czerwonych krwinek w celu uzyskania pożądanego hematokrytu: (masa wątroby + objętość gruntowania) x pożądany hematokryt/hematokryt po umyciu. Ciągły analizator gazów dostarcza również informacji zwrotnych na temat temperatury perfuzji, która zwykle odpowiada ustawieniu grzałki na 38 °C.
    2. Dodać 10 ml 10% glukonianu wapnia, 2 ml heparyny (10 000 j.m.) i 750 mg cefuroksymu w 10 ml 0,9% NaCl do perfuzatu. Ustawić ręczny mieszalnik gazu na 0,5 l/min FiO2 na poziomie 21%.
  2. Rozpoczęcie perfuzji
    1. Włączyć czujniki ciśnienia, czujniki przepływu i pompę rolkową w celu recyrkulacji wycieków.
    2. Umieść wątrobę w pojemniku. Umieść rurkę clamps na portalu i rurze dopływu tętniczego oraz rurze odpływowej obwodu i wytnij łącznik Y.
    3. Podłącz kaniule do odpowiednich rurek wlotowych i odpływowych za pomocą łącznika T pomiędzy nimi. Zapobiegaj przedostawaniu się powietrza do obwodu.
    4. Zamontuj kurki trójdrogowe na trójnikach i podłącz do nich przewody ciśnieniowe. Zeruj ciśnienie w przewodach i rozpocznij ciągłe monitorowanie ciśnienia.
    5. Ustaw zawory zaciskowe, prawie całkowicie je zamykając, aby zapobiec przepływom suprafizjologicznym i stresowi śródbłonka.
    6. Rozpocznij perfuzję, usuwając zaciski rurki z dopływu portalu. Natychmiast po rozpoczęciu dopływu portalu należy zdjąć zaciski z odpływu kawałkowego i uruchomić pompę. Prędkość pompy jest regulowana ciśnieniem, więc należy dążyć do ciśnienia w odpływie kawanowym między -5 mmHg a -2 mmHg. Dąż do przepływu wrotnego 0,75 ml/min/g wątroby.
    7. Gdy perfuzja wrotna jest stabilna, a ciśnienie w kawałku jest odpowiednie, usuń zaciski z rurki tętniczej. Celuj w ciśnienie około 55-60 mmHg i przepływy około 0,25 ml/min/g wątroby.
  3. Utrzymanie stabilnej hemodynamiki perfuzji
    1. Przykryj wątrobę szklaną kopułą lub plastikową folią, aby zapobiec utracie ciepła z powierzchni.
    2. Jeśli przepływ portalu jest zbyt wysoki, zamknij zawór zaciskowy na rurze dopływu portalu.
    3. Jeśli ciśnienie w kawałku staje się zbyt ujemne, zwiększa się ryzyko wytworzenia podciśnienia wewnątrz żyły głównej. Nadmiernemu podciśnieniu można przeciwdziałać poprzez spowolnienie prędkości obrotowej pompy. Alternatywnie, zwiększenie dopływu przez żyłę wrotną zmniejsza ujemne ciśnienie odpływu, zapewniając większą objętość żyle głównej.
    4. Jeśli ciśnienie tętnicze jest zbyt niskie, można je zwiększyć, zwiększając prędkość pompy lub zamykając zawór zaciskowy w kierunku zbiornika portalowego, aby przepchnąć większy przepływ przez rurkę doprowadzającą tętnicę.
  4. Pobieranie próbek
    1. Pobrać próbki perfuzatu z zaworu trójdrogowego odpływu kawowego lub wyznaczonego przewodu do pobierania próbek między natleniaczem a zbiornikiem portalowym.
    2. Uzyskaj biopsje igłowe przez cały czas perfuzji. Otwory po igłach muszą być zszyte, ponieważ nie ma krzepnięcia z powodu heparynizacji obwodu.
    3. Zbierz żółć, mocując francuską kaniulę 8 w przewodzie żółciowym. Upewnij się, że przewód torbielowaty jest podwiązany.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony protokół perfuzji wykorzystuje samoregulację przepływu krwi w wątrobie w celu osiągnięcia stabilnych warunków hemodynamicznych przez okres do 24 godzin i symulacji fizjologicznego rozkładu przepływu krwi w żyle wrotnej i tętnicy wątrobowej. Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd obwodu perfuzji. Rycina 2A przedstawia spójny rozkład przepływu krwi, przy czym żyła wrotna i tętnica wątrobowa odpowiadają odpowiednio za około 75% i 25% całkowitego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj szczegółowo opisaliśmy nasze doświadczenia z NMP wątroby świń. Zaletami tej techniki są wysoka wartość translacyjna i wszechstronność. NMP wątroby świń może być stosowany zarówno w celu zbadania i poszerzenia wiedzy na temat tej ulepszonej techniki konserwacji, jak i alternatywnie, do naśladowania przeszczepu. Ta konfiguracja umożliwia ręczną kontrolę nad każdym aspektem perfuzji, umożliwiając regulację ciśnienia i przepływu zarówno wrotnego, jak i tętniczego na różne sposoby.

Aby jak na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować wszystkim studentom wydziału lekarskiego KU Leuven zaangażowanym w te eksperymenty.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa strzykawkowa Alaris GH PlusBD Care Fusion80023 UN 01-G
Urządzenie anestezjologiczneDrä GerTitus
Cewnik tętniczy Cavafix CertoBraun, Melsungen, NiemcyBRAU4152557
Analizator parametrów krytycznychRadiometerABL815 powiedział:
Glukonian wapnia 10%Braun, Melsungen, Niemcy570/13596667/1214
KapnografDrä GerScio powiedział:
Oszczędzanie komórekFirma MedtronicAutomatyczny rejestr
Pompa odśrodkowa BiomedicusFirma Medtronic85315 WERSJA 3.0
Wirówka Rotina 420R HettichFirma VWR521-1156
Wykonany na zamówienie obwód perfuzyjnyFirma MedtronicM323901C
Jednorazowy zestaw oszczędzacza komórekFirma MedtronicATLS24
DLP Kaniula żylna jednostopniowa, prosta 20FFirma Medtronic66120
EpoprostenolGlaxoSmithKline Belgium, Wavre, BelgiaFlolan powiedział:
Fentanyl-Janssen 0,05 mg/mlJanssenHK-08700 powiedział:
Czujnik przepływu BioPro TTEm-Tec12271
Formaldehyd 4%Firma VWRVWRK4078.9005
Zamrażarka -80 ° CNaukowy Nowy BrunszwikU570-86
LodówkaLiebherr powiedział:KUBEK 3513
GeloplazmaFresenius-Kabi, Bad Homburg, NiemcySwobodny flex
Chłodnica nagrzewnicyStö ckert-Shiley, grupa Sorin16-02-1950
Heparyna 5000 j.m./mlLeo Pharma, Ballerup, DaniaHeparynaLew
Kaniula tętnicy wątrobowejFirma MedtronicBIO-MEDICUS 12F
Roztwór do konserwacji narządów IGL-1Instytut Georges'a LopezaIGL-1/1000/D
Analizator parametrów krytycznych krwi in-lineTERUMOKalibrator 3MCDI 540/CDI 500
Insulina 200 j.m. ActrapidNovo Nordisk, Dagsvaerd, DaniaMEDI-00018
Izofluran 1000 mg/g Para wziewnaChanelle PharmaIso-Vet
Cewnik dożylny BD Insyte-W 20 GBD381334
Zbiornik ciekłego azotuIzoterma KGWS22 powiedział:
Mersilene 250CM M3 USP2/0 ligapak bez igłyJNJ medycznyZobacz materiał F4503
Mersilene 250CM M3.5 USP0 ligapak bez igiełJNJ medycznyZobacz materiał F4504
Mersilene 5X70CM M3.5 USP0 bez igiełJNJ medycznyEH6935H
Mersilene 6X45CM M3 USP2/0 bezigłowyJNJ medycznyEH6734H
Mikropipety 1000 i mikro; LSocorex powiedział:82,51,000
MonitoringSimensZobacz materiał SC 8000
Plazmalit ViafloBaxterPlazmalit Viaflo
Żyła wrotna kaniulaUSPOKOJONE LABORATORIA18F RV-40018
Czujnik ciśnieniaStö ckert-Shiley, grupa Sorin22-06-2000
Regulator ciśnienia serwoFirma MedtronicZobacz materiał BM 9505-2
Prolen 4-0JNJ medycznyEH7151H
Pompa rolkowaStulecie Cobe Stany Zjednoczone468048-000 REV C
Wodorowęglan sodu 8,4%Braun, Melsungen, Niemcy362 2339
Taulocholan soduSigma Aldrich, Burlington, Stany Zjednoczone86339
Skalpel chirurgiczny nr 24Swann Morton0211
Cewnik żylny, 3-świetlny; 12FRSTRZAŁAAK-12123-F
Vicryl Vio 250CM M2 USP3/0 gigapak bezigłowyJNJ medycznyV1205G
Ksylazyna 2%VMD Hodowla zwierząt gospodarskich FarmacjaXYL-M 2%
Zinacef Cefuroksym 750 mg tabletki powlekaneGlaxoSmithKline Belgium, Wavre, BelgiaNDC 0173-0353-32
Zoletil 100 powiedział:Wirus VirbacZoletil 100 powiedział:

Bibliografia

  1. Dunson, J. R., Bakhtiyar, S. S., Joshi, M., Goss, J. A., Rana, A. Intent-to-treat survival in liver transplantation has not improved in 3 decades due to donor shortage relative to waitlist growth. Clinical Transplantation. 35 (10), e14433(2021).
  2. Monbaliu, D., Pirenne, J., Talbot, D. Liver transplantation using donation after cardiac death donors. Journal of Hepatology. 56 (2), 474-485 (2012).
  3. Croome, K. P., Taner, C. B. The changing landscapes in DCD liver transplantation. Current Transplantation Reports. 7 (3), 194-204 (2020).
  4. Coffey, J. C., et al. The influence of functional warm ischemia time on DCD liver transplant recipients' outcomes. Clinical Transplantation. 31 (10), (2017).
  5. Meurisse, N., et al. Outcomes of liver transplantations using donations after circulatory death: A single-center experience. Transplantation Proceedings. 44 (9), 2868-2873 (2012).
  6. Ruck, J. M., et al. Temporal trends in utilization and outcomes of DCD livers in the United States. Transplantation. 106 (3), 543-551 (2022).
  7. Nasralla, D., et al. A randomized trial of normothermic preservation in liver transplantation. Nature. 557 (7703), 50-56 (2018).
  8. Blondeel, J., Monbaliu, D., Gilbo, N. Dynamic liver preservation: Are we still missing pieces of the puzzle. Artificial Organs. 47 (2), 248-259 (2022).
  9. Gilbo, N., et al. Porcine liver normothermic machine perfusion: Methodological framework and potential pitfalls. Transplantation Direct. 8 (1), e1276(2021).
  10. Maione, F., et al. Porcine isolated liver perfusion for the study of ischemia reperfusion injury: A systematic review. Transplantation. 102 (7), 1039-1049 (2018).
  11. Gilbo, N., et al. Coagulation factors accumulate during normothermic liver machine perfusion regardless of donor type and severity of ischemic injury. Transplantation. 106 (3), 510-518 (2021).
  12. Butler, A. J., et al. Successful extracorporeal porcine liver perfusion for 72 hr. Transplantation. 73 (8), 1212-1218 (2002).
  13. Eshmuminov, D., et al. An integrated perfusion machine preserves injured human livers for 1 week. Nature Biotechnology. 38 (2), 189-198 (2020).
  14. Xu, J., Buchwald, J. E., Martins, P. N. Review of current machine perfusion therapeutics for organ preservation. Transplantation. 104 (9), 1792-1803 (2020).
  15. Martins, P. N., Turco, S. D., Gilbo, N. Organ therapeutics during ex-situ dynamic preservation. a look into the future. European Journal of Transplantation. 1, 63-78 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Normotermiczna perfuzja maszynowaperfuzja w troby wi skiejmodel transplantacji w trobyuszkodzenie reperfuzyjnekonserwacja w troby ex situprzep yw krwi w w trobiesk ad perfuzatukanulacja przewodu ciowegoop r naczyniowyterapia regeneracyjna
Chorobowa normemmiczna izolowana perfuzja wątroby u świń
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.