Artykuł metodologiczny

Wykrywanie mitofagii w Caenorhabditis elegans i komórkach ssaków przy użyciu barwników specyficznych dla organelli

DOI:

10.3791/65337

⸱

19 maja 2023

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, Institute for Medical Research, Israel-Canada (IMRIC), The Hebrew University of Jerusalem

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie mitofagii za pomocą mikroskopii elektronowej, czujników genetycznych i immunofluorescencji wymaga kosztownego sprzętu, wykwalifikowanego personelu i znacznej inwestycji czasu. Tutaj pokazujemy skuteczność komercyjnego zestawu barwników fluorescencyjnych w ilościowym określaniu procesu mitofagii zarówno w Caenorhabditis elegans, jak i w linii komórkowej raka wątroby.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są niezbędne dla różnych funkcji biologicznych, w tym produkcji energii, metabolizmu lipidów, homeostazy wapnia, biosyntezy hemu, regulowanej śmierci komórek i generowania reaktywnych form tlenu (ROS). ROS są niezbędne dla kluczowych procesów biologicznych. Jednak niekontrolowane mogą prowadzić do uszkodzeń oksydacyjnych, w tym uszkodzenia mitochondriów. Uszkodzone mitochondria uwalniają więcej ROS, nasilając w ten sposób uszkodzenie komórek i stan chorobowy. Proces homeostatyczny zwany autofagią mitochondrialną (mitofagią) selektywnie usuwa uszkodzone mitochondria, które są następnie zastępowane nowymi. Istnieje wiele szlaków mitofagii, przy czym wspólnym punktem końcowym jest rozpad uszkodzonych mitochondriów w lizosomach.

Kilka metodologii, w tym czujniki genetyczne, immunofluorescencja przeciwciał i mikroskopia elektronowa, używa tego punktu końcowego do ilościowego określenia mitofagii. Każda metoda badania mitofagii ma swoje zalety, takie jak specyficzne celowanie w tkankę/komórkę (za pomocą czujników genetycznych) i duża szczegółowość (za pomocą mikroskopii elektronowej). Jednak metody te często wymagają kosztownych zasobów, wyszkolonego personelu i długiego czasu przygotowań przed właściwym eksperymentem, na przykład do tworzenia zwierząt transgenicznych. W tym miejscu przedstawiamy opłacalną alternatywę pomiaru mitofagii za pomocą dostępnych na rynku barwników fluorescencyjnych ukierunkowanych na mitochondria i lizosomy. Metoda ta skutecznie mierzy mitofagię w nicieniu Caenorhabditis elegans i ludzkich komórkach wątroby, co wskazuje na jej potencjalną skuteczność w innych systemach modelowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są niezbędne dla wszystkich zwierząt tlenowych, w tym dla ludzi. Przekształcają energię chemiczną biomolekuł w trifosforan adenozyny (ATP) poprzez fosforylację oksydacyjną1, syntetyzują heme2, rozkładają kwasy tłuszczowe poprzez utlenianie β3, regulują homeostazę wapnia4 i iron5, kontrolują śmierć komórki poprzez apoptozę6 i generują reaktywne formy tlenu (ROS), które odgrywają istotną rolę w homeostazie redoks7. Dwa uzupełniające się i przeciwstawne procesy utrzymują integralność i prawidłowe funkcjonowanie mitochondriów: synteza nowych składników mitochondrialnych (biogeneza) i selektywne usuwanie uszkodzonych przez autofagię mitochondrialną (tj. mitofagię)8.

Kilka szlaków mitofagii jest zapośredniczonych przez enzymy, takie jak PINK1/Parkin, oraz receptory, w tym FUNDC1, FKBP8 i BNIP/NIX9,10. Warto zauważyć, że selektywna degradacja składników mitochondrialnych może zachodzić niezależnie od maszynerii autofagosomów (tj. poprzez pęcherzyki pochodzące z mitochondriów)11. Jednak punkty końcowe różnych selektywnych szlaków mitofagii są podobne (tj. degradacja mitochondriów przez enzymy lizosomalne)12,13. Z tego powodu różne metody identyfikacji i pomiaru mitofagii opierają się na kolokalizacji markerów mitochondrialnych i lizosomalnych14,15,16,17 i obniżone poziomy białek mitochondrialnych/mitochondrialne DNA18.

Poniżej znajduje się zwięzły opis istniejących eksperymentalnych metodologii pomiaru mitofagii w komórkach zwierzęcych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, kładąc nacisk na fazę końcową mitofagii.

Biosensory mitofagii
Degradacja mitochondriów zachodzi w kwaśnym środowisku lizosomu19. Dlatego składniki mitochondrialne, w tym białka, doświadczają przejścia z obojętnego na kwaśne pH w punkcie końcowym procesu mitofagii. Ten wzorzec leży u podstaw mechanizmu działania kilku biosensorów mitofagii, w tym mito-Rosella18 i tandem mCherry-GFP-FIS114. Czujniki te zawierają białko zielonej fluorescencji (GFP) wrażliwe na pH i białko czerwonej fluorescencji niewrażliwe na pH (RFP). Dlatego w punkcie końcowym mitofagii stosunek fluorescencji od zielonego do czerwonego znacznie spada z powodu wygaszania fluoroforu GFP. Głównymi ograniczeniami tych czujników są: (1) możliwy transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między fluoroforami; 2) zróżnicowany wskaźnik dojrzewania zwykłej dobrej praktyki rolniczej i zapytania ofertowego; (3) dysocjacja między GFP i RFP spowodowana proteolitycznym rozszczepieniem łączącego je polipeptydu; 4) nakładanie się emisji fluorescencji; oraz (5) różnicowa jasność i wygaszanie fluoroforu15,16.

Czujnikiem, który pokonuje niektóre z tych ograniczeń, jest czujnik mitochondrialny Keima17. Czujnik mt-Keima (pochodzący z białka koralowego Keima) pokazuje pojedynczy szczyt emisji (620 nm). Jednak jego piki wzbudzenia są wrażliwe na pH. W rezultacie następuje przejście od wzbudzenia zielonego (440 nm) do czerwonego (586 nm) po przejściu z wysokiego pH do kwaśnego pH16,17. Nowsze urządzenie do pomiaru mitofagii, Mito-SRAI, przyczyniło się do rozwoju tej dziedziny, umożliwiając pomiary w stałych próbkach biologicznych20. Jednak pomimo wielu zalet czujników genetycznych, takich jak zdolność do ekspresji w określonych tkankach/komórkach i kierowania ich do różnych przedziałów mitochondrialnych, mają one również ograniczenia. Jednym z ograniczeń jest to, że czujniki genetyczne muszą być ekspedycja w komórkach lub zwierzętach, co może być czasochłonne i zasobożerne.

Dodatkowo, ekspresja czujników w mitochondriach może wpływać na funkcję mitochondriów. Na przykład ekspresja mitochondrialnego GFP (mtGFP) w mięśniach ściany ciała robaka C. elegans rozszerza sieć mitochondrialną21. Ten fenotyp zależy od funkcji aktywowanego stresem czynnika transkrypcyjnego ATFS-1, który odgrywa istotną rolę w aktywacji odpowiedzi niesfałdowanego białka w mitochondriach (UPRmt)21. Dlatego, chociaż genetycznie kodowane biosensory mitochondriów/mitofagii są niezwykle przydatne do monitorowania homeostazy mitochondriów in vivo, mogą wpływać na sam proces, do którego pomiaru są zaprojektowane.

Mitochondria/przeciwciała i barwniki specyficzne dla lizosomów
Inną strategią testowania kolokalizacji mitochondriów/lizosomów jest użycie przeciwciał przeciwko białkom mitochondrialnym/lizosomalnym, takim jak mitochondrialne białko błony zewnętrznej TOM20 i białko błonowe związane z lizosomami 1 (LAMP1)22. W większości przypadków przeciwciała drugorzędowe, które są sprzężone z fluoroforem, są używane do wykrywania sygnału fluorescencji za pomocą mikroskopii. Inną strategią jest łączenie konstruktów genetycznych z barwnikami mitochondrialnymi/lizosomalnymi, takimi jak ekspresja konstruktu fuzyjnego LAMP1::GFP w komórkach podczas barwienia ich czerwonym barwnikiem mitochondrialnym (np. Mitotracker Red)16. Metodologie te, choć skuteczne, wymagają specyficznych przeciwciał i często obejmują pracę z ustalonymi próbkami lub generowanie komórek/zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję fluorescencyjnie znakowanych mitochondriów/lizosomów.

Tutaj opisujemy wykorzystanie komercyjnego zestawu do barwienia lizosomów/mitochondriów/jądra do oceny właściwości aktywujących mitofagię syntetycznej diaminy O,O (oktan-1,8-diylo)bis(hydroksyloaminy), zwanej dalej VL-85023, w robakach C. elegans i ludzkiej linii komórek rakowych Hep-3B (Rysunek 1). Zestaw do barwienia zawiera mieszaninę barwników lizosomalnych/mitochondrialnych/jądrowych, które specyficznie barwią te organelle23. Wcześniej używaliśmy tego zestawu do zademonstrowania aktywności mitofagicznej 1,8 diaminooktanu (zwanego dalej VL-004) u C. elegans23. Co ważne, zweryfikowaliśmy wyniki zestawu do barwienia za pomocą biosensora mito-Rosella i pomiarów qPCR mitochondrial:nuclear DNA content23. Ten zestaw do barwienia ma następujące zalety. Po pierwsze, nie ma potrzeby generowania transgenicznych zwierząt lub komórek wykazujących ekspresję biosensora mitochondrialnego. Dzięki temu możemy badać niezmodyfikowane zwierzęta lub komórki typu dzikiego, a tym samym zaoszczędzić dużo czasu, pieniędzy i pracy. Ponadto, jak wspomniano, ekspresja biosensorów mitochondrialnych może zmienić funkcję mitochondriów. Po drugie, zestaw jest ekonomiczny, łatwy w użyciu i szybki. Po trzecie, chociaż demonstrujemy metodę na C. elegans i komórkach ludzkich, może ona zostać zmodyfikowana dla innych typów komórek i organizmów.

Mając to na uwadze, jak każda metoda, protokół zestawu do barwienia ma swoje wady. Na przykład inkubacja robaków z odczynnikiem odbywa się przy braku pożywienia (widzieliśmy, że nawet martwe bakterie znacznie zmniejszają skuteczność barwienia). Chociaż czas inkubacji jest stosunkowo krótki, możliwe jest, że nawet w tym czasie odpowiedzi homeostatyczne mogą ulec zmianie, w tym mitofagii. Ponadto wiązanie barwników z białkami ER/mitochondrialnymi/jądrowymi i innymi biomolekułami może wpływać na aktywność tych organelli. Co więcej, w przeciwieństwie do pomiaru mitofagii za pomocą czujników genetycznych, pracujemy z robakami i komórkami, które zostały poddane chemicznej fiksacji. W związku z tym niemożliwe jest dalsze monitorowanie tych samych robaków/komórek w różnym czasie. Dlatego zalecamy łączenie różnych metodologii w celu walidacji funkcji mitofagii w określonym procesie fizjologicznym. Poniżej przedstawiamy nowe dane pokazujące, że VL-850 indukuje silną mitofagię u robaków C. elegans i komórek Hep-3B. Dlatego dane te dodatkowo wspierają hipotezę, że VL-850 przedłuża żywotność C. elegans i chroni C. elegans przed uszkodzeniem oksydacyjnym poprzez indukcję zdrowej mitofagii. Jako kontrolę pozytywną użyliśmy 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu cyjanku karbonylu i jonoforu protonu (FCCP), który jest silnym induktorem mitofagii24, jako kontrolę pozytywną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Dla wygody czytelników, podzieliliśmy protokół na dwie części: jedna skupia się na protokole pomiaru mitofagii u C. elegans, a druga skupia się na protokole pomiaru mitofagii w komórkach wątroby. Lista materiałów znajduje się w udostępnionej Tabeli Materiałów.

1. Protokół C. elegans

  1. Przygotowanie płytek z podłożem dla nicieni (NGM) i bulionu bakteryjnego Escherichia coli OP50
    UWAGA: Dla wyjaśnienia, chociaż postępowaliśmy zgodnie ze standardowymi protokołami przygotowania płytek NGM i bakterii OP50 stock25,26, zdajemy sobie sprawę, że mogą występować różnice w tych protokołach między różnymi laboratoriami. W związku z tym dołączyliśmy kompletne protokoły, aby zapewnić dokładną replikację eksperymentu.
    1. Wykonać 1 M bufor fosforanu potasu o pH 6, dodając ~ 150 ml 1 M K2HPO4 do 500 ml 1 M KH2PO4 roztworu, aż do osiągnięcia pH 6. Wysterylizuj bufor, przepuszczając go przez próżniowy filtr/system przechowywania 0,22 μm.
    2. Zrobić 0,1 M chlorku wapnia (CaCl2) i siarczanu magnezu (MgSO4) i wysterylizować je filtrem strzykawkowym 0,2 μm.
    3. Przygotuj 5 mg/ml cholesterolu w absolutnym etanolu.
      UWAGA: Ponieważ cholesterol jest wytwarzany w etanolu, nie należy go filtrować.
    4. Przygotuj agar NGM, rozpuszczając 1,5 g chlorku sodu (NaCl), 1,25 g peptonu i 8,5 g agaru w 500 ml podwójnie destylowanej wody (DDW). Autoklaw i pozostawić do ostygnięcia do ~55 °C.
    5. W sterylnych warunkach dodać 12,5 ml buforu fosforanu potasu (pH 6), 0,5 ml 0,1 M CaCl2, 0,5 ml 0,1 MMgSO4 i 1 ml 5 mg/ml cholesterolu. Dobrze wymieszaj po każdym dodaniu.
    6. Dodać 4 ml stopionego agaru NGM do każdej płytki o średnicy 35 mm. Pozostaw naczynia na noc do zestalenia się w temperaturze pokojowej (RT, ~21 °C).
    7. Aby przygotować płytki agarowe Luria-Bertani (LB), rozpuść 5 g NaCl, 5 g tryptonu, 2,5 g ekstraktu drożdżowego i 7,5 g agaru w 400 ml destylowanej wody dejonizowanej (DDW), dostosuj pH roztworu do 7,0, zwiększ objętość do 500 ml za pomocą DDW i autoklawu. Gdy roztwór ostygnie do temperatury 55 °C, wlać 25 ml mieszaniny do każdej płytki Petriego o średnicy 90 mm i pozostawić płytki do wyschnięcia na 2 dni w temperaturze pokojowej. Następnie należy usunąć bakterie OP50 z wysuszonych płytek LB z wywaru glicerolowego i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, aby uzyskać pojedyncze kolonie.
    8. Przygotuj 2x trypton drożdżowy (YT) rozpuszczając 8 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 2,5 g chlorku sodu (NaCl) w 0,5 l DDW. Dostosuj pH do 7 i przeprowadź autoklaw.
    9. Po schłodzeniu zaszczepić kolonię bakterii OP50 ze świeżo prążkowanej płytki LB do 50 ml pożywki 2x YT w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Wytrząsać w temperaturze 37 °C i 250 obr./min do uzyskania gęstości optycznej (OD600) około 0,6.
  2. Przygotowanie nośnika i płyt doświadczalnych
    1. Dodaj 100 μl bakterii OP50 do środka każdej płytki z agarem NGM o średnicy 35 mm. Suszyć przez noc w temperaturze pokojowej 21 °C.
    2. Przygotować 0,5 M VL-850 w DMSO i rozcieńczyć do 10 mM VL-850 za pomocą buforu M9 (22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, pH 7 i 1 mM MgSO4)26. Upewnij się, że pH wynosi 7,0 (jeśli nie, miareczkować 0,1 M HCl) i wysterylizuj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Przygotuj pojazd zgodnie z powyższym opisem, ale bez leku (w tym przypadku VL-850). Wykonać 50 mM FCCP w DMSO, rozcieńczyć do 1 mM FCCP za pomocą buforu M9 i wysterylizować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
    3. Dodać 25 μl nośnika (kontrola ujemna), FCCP (kontrola dodatnia; 5 μM) lub VL-850 (zabieg doświadczalny; 62,5 μM) do oddzielnie wysianych płytek NGM na trawniku bakteryjnym.
    4. Przykryj talerze folią aluminiową i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej 21 °C. Płytki zużyć po ~16 godzinach.
  3. Uzyskiwanie zsynchronizowanych młodych dorosłych hermafrodytów C. elegans
    1. Zrobić 1 l bufora M9 z 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4 i 86 mM NaCl. Sterylizuj w autoklawie i pozwól mu ostygnąć. Po schłodzeniu dodaj 1 ml 1 mM MgSO4 (0,22 μm sterylizowane filtrem).
    2. Zmieszaj 0,8 ml 2,5 N wodorotlenku sodu i 1 ml 5% roztworu podchlorynu sodu z 2,2 ml DDW, aby uzyskać 4 ml alkalicznego roztworu podchlorynu (końcowe stężenie 0,5 N dla wodorotlenku sodu i 1,25% dla podchlorynu sodu).
    3. Zebrać robaki (grawitacyjne hermafrodyty) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, myjąc płytki NGM 1 ml buforu M9 3x, aby upewnić się, że wszystkie matki zostały zebrane do probówki.
    4. Osadzać robaki przez odwirowanie w stężeniu 500 × g przez 1 minutę i odrzucić supernatant do momentu, aż pozostanie objętość 1 ml.
    5. Dodaj 1 ml alkalicznego roztworu podchlorynu i wymieszaj, odwracając probówkę 5x. Delikatnie obracaj probówkę przez 3 minuty, aby wspomóc uwalnianie jaj i obserwuj stan robaków pod stereoskopem preparacyjnym.
    6. Gdy około 50% robaków zostanie rozbitych, dodaj 5 ml buforu M9 i natychmiast osadź jaja, wirując przez 1 minutę przy 500 × g.
    7. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu. Dodać 5 ml buforu M9 i powtórzyć procedurę mycia 2x.
    8. Usunąć supernatant do momentu, aż pozostanie 2 ml i obracać probówkę (obrót o 360°) z prędkością 20 obr./min przez ~16 godzin (RT, 21 °C), aby uzyskać zsynchronizowane larwy L1. Z tej probówki weź kroplę o pojemności 5 μl na szklane szkiełko, policz liczbę larw pod stereoskopem, powtórz ten krok 3x, weź średnią z trzech zliczeń i oszacuj liczbę robaków na mikrolitr (μl). Na podstawie tych obliczeń dodaj ~200 larw na płytkę NGM obsianą bakteriami OP50.
    9. Larwy L1 należy hodować w temperaturze 21 °C przez ~48 godzin, aż do stadium młodego osobnika dorosłego.
  4. Leczenie farmakologiczne i procedura mikroskopowa
    1. Umieść 100 robaków na każdej z płytek doświadczalnych lub kontrolnych. Upewnij się, że płytki ujemne, dodatnie i eksperymentalne zawierają nośnik, odpowiednio 5 μM FCCP i 62.5 μM VL-850. Inkubować w temperaturze 21 °C przez 6 godzin.
    2. Użyj 1 ml buforu M9, aby przemyć robaki z każdej płytki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Krótko zakręć probówką (~3 s) w miniwirówce. Następnie wyrzucić supernatant, delikatnie odpipetowując bufor M9, nie naruszając osadu robaka. Powtórz ten krok mycia 2x, a następnie delikatnie usuń supernatant, nie naruszając osadu robaka.
    3. Do osadu robaka dodać 200 μl buforu M9, który zawiera 0,1% v/v Poloxamer 188, 0,1% v/v Pluronic F127 i 2 μl odczynnika z zestawu do barwienia. Pozwól mieszaninie obracać się z prędkością 20 obr./min (obrót o 360°) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej 21 °C. Aby chronić barwniki przed światłem, przykryj probówki folią aluminiową.
    4. Delikatnie zakręć robakami, jak opisano w kroku 1.3.4. Następnie usuń roztwór barwiący, nie naruszając osadu robaka. Następnie umyj robaki zgodnie z opisem w kroku 1.3.2 i przenieś je na płytkę agarową z nasionami NGM zawierającą odpowiednią obróbkę - na przykład robaki poddane działaniu FCCP przenosi się na płytkę zawierającą FCCP. Przykryj płytki folią aluminiową, ponieważ odczynnik barwiący jest wrażliwy na światło.
      UWAGA: Przenieśliśmy robaki na płytki hodowlane zawierające bakterie i odpowiedni środek do obróbki, aby zminimalizować szum tła spowodowany nadmiarem barwnika. Na przykład robaki leczone FCCP zostały przeniesione na płytki uzupełnione FCCP i tak dalej.
    5. Zmyć robaki z płytek do świeżych probówek do mikrowirówek, używając 1 ml buforu M9; umyć robaki w ten sam sposób 2x. Następnie utrwal robaki 1% formaldehydem na lodzie przez 30 minut i umyj robaki 1 ml buforu M9 3x, aby usunąć resztki formaldehydu. Po umyciu odwiruj robaki do postaci osadu i zasysaj maksymalną ilość supernatantu, utrzymując osad robaka w stanie nienaruszonym w 10 μl M9.
    6. Aby przygotować 2,5% agarozy, odważ 0,125 g agarozy do probówki ze szkła borokrzemianowego o pojemności 10 ml, dodaj 5 ml buforu M9 i rozpuść agarozę, delikatnie podgrzewając probówkę palnikiem Bunsena. Przenieść stopioną agarozę do suchej kąpieli w temperaturze 75 °C i za pomocą końcówki o pojemności 1 ml umieścić 100 μl stopionej agarozy na szkle nakrywkowym mikroskopu Deckgläser (24 mm x 60 mm). Natychmiast połóż kolejny szkiełko prostopadle na kropli agarozy, tworząc kształt krzyża. Odczekaj ~2 minuty i delikatnie rozdziel szkiełka, (delikatnie) dociskając górną pokrywę, pozostawiając w ten sposób podkładkę agarozową na szkiełku dolnej pokrywy.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas podgrzewania agarozy w probówce i upewnij się, że rurka jest trzymana z dala od ciała. Odetnij krawędź końcówki o pojemności 1 ml, aby zminimalizować krzepnięcie agarozy.
    7. Przenieś robaki na podkładkę agarozową za pomocą szklanej pipety Pasteura (tj. cała ilość w probówce, ~10 μL). Nadmiar płynu usunąć wykonanym z chusteczki laboratoryjnej, a następnie przykryć robaki mniejszym szkiełkiem przykrywającym (24 mm x 40 mm). Nałóż przezroczysty lakier do paznokci na obrzeża mniejszego szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec parowaniu. Umieść szkiełko w ciemnym pudełku, aby chronić je przed światłem.
    8. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować robaki w ciągu 24 godzin na odpowiednich długościach fal (patrz poniżej) za pomocą soczewki o 60-krotnym powiększeniu.
      1. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu.
      2. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i kliknij prawym przyciskiem myszy szary obszar oprogramowania. Otwarta akwizycja | Pełna podkładka Ti2 | Akwizycja ND | LUT, klikając opcje w wyskakującym okienku, które pojawia się w wyniku kliknięcia prawym przyciskiem myszy.
      3. W obszarze Ti2 Full Pad (Pełny pad) wybierz opcję 60x.
      4. W obszarze Akwizycja wybierz Dia okularu i ustaw ostrość robaków za pomocą pokrętła precyzyjnego ustawiania ostrości mikroskopu. W obszarze Pobieranie wybierz pozycję Obracający się dysk, a następnie wybierz opcję 16-bitowy — bez kategoryzacji. Dla każdego filtra fluorescencyjnego ustaw czas ekspozycji na 500 ms i 20 ms dla jasnego pola. Po ustawieniu tych parametrów wybierz opcję Uruchom teraz i poczekaj, aż obraz wyjściowy zostanie wygenerowany jako plik ND2.
        UWAGA: Czas naświetlania należy określić eksperymentalnie, ponieważ różne konfiguracje obrazowania mają różne cechy. Użyj tabel przeglądowych (LUT), aby zbadać intensywność fluorescencji dla każdej długości fali.
  5. Analiza obrazu
    1. Otwórz obrazy konfokalne (tutaj, pliki Nikon ND2) w ImageJ27 za pomocą wtyczki kolokalizacyjnej. Każdy plik ND zawiera płaszczyzny obrazu wykonane na trzech długościach fali (przy użyciu filtrów DAPI, GFP/FITC [zielony] i Texas Red [czerwony]) oraz w świetle widzialnym. Aby uzyskać dostęp do tych obrazów, otwórz plik ND na serwerze ImageJ i wybierz opcję Podziel obrazy w oknie dialogowym. Praca z obrazami kanału jasnego (BF), kanału zielonego i kanału czerwonego.
    2. Wygeneruj duplikaty tych obrazów, aby oryginalny obraz pozostał nietknięty, klikając Obraz | Zduplikuj lub użyj skrótu klawiaturowego Shift + D.
    3. Aby zmniejszyć tło, wygeneruj kolejny duplikat obrazu, jak wspomniano powyżej. Odejmij tło o promieniu toczenia równym 100 i wybierz opcję Utwórz tło (nie odejmuj), aby wygenerować obraz z tłem danego obrazu. Następnie przejdź do punktu menu Proces | Kalkulator obrazów i odejmij pierwszy zduplikowany obraz od drugiego zduplikowanego obrazu. Powstałe obrazy można wykorzystać do analizy kolokalizacji.
    4. Aby użyć wtyczki kolokalizacyjnej, przekonwertuj obrazy kanału zielonego i czerwonego na 8-bitowy. Aby to zrobić, kliknij Obraz | Rodzaj | 8 bitów.
    5. Kliknij Wtyczki | Kolokacja. Aby zmierzyć kolokalizację sygnałów mitochondriów i lizosomów za pomocą wtyczki kolokalizacji (patrz wyżej), użyj następujących parametrów: Współczynnik = 75%, Próg kanału czerwonego = 80,0, Próg kanału zielonego = 50,0. Wynikiem jest 8-bitowy obraz binarny zawierający kolokalizowaną puncta i kombinację trzech 8-bitowych obrazów (zielony, czerwony i obraz kolokalizowany) w obrazie RGB.
    6. Skoncentruj się na puncta w mięśniu głowy-ścianie ciała, ręcznie zaznaczając ten obszar i tworząc maskę, klikając Edytuj | Selekcja | Utwórz maskę, która wybiera obszar zainteresowania (Rysunek 2A, B). Selektywnie usuń inne barwione elementy (np. mięśnie gardła), aby przeanalizować obszar mięśni głowy, ciała i ściany.
    7. Aby wybrać cząstki w obszarze zainteresowania (ROI), wybierz kolokalizowane obrazy 8-bitowe i maskuj je za pomocą kalkulatora obrazów. Następnie użyj operacji AND (Rysunek 3A), aby wybrać puncta w ROI. Spowoduje to wygenerowanie obrazu z puncta w ROI (Rysunek 3B).
    8. Aby przeanalizować obszar kolokalizowanych mitochondriów i lizosomów, wybierz pozycję Analizuj | Przeanalizuj cząstki i zmierz sumę puncta między 0,1625 μm2 a 4 μm2.

2. Protokół komórek rakowych Hep-3B

  1. Przygotowanie roztworu podstawowego leku
    1. Przygotuj 100 mM VL-850 w DMSO. Rozcieńczyć go do 5 mM 0,5 M buforem HEPES o pH 7,3 i wysterylizować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Następnie należy przygotować pojazd zgodnie z wcześniejszym opisem, ale bez leku (w tym przypadku VL-850).
  2. Hodowla komórek Hep-3B do eksperymentu, leczenia farmakologicznego i procedury mikroskopowej
    1. Hoduj komórki Hep-3B na 10-centymetrowych płytkach do hodowli tkankowych zawierających zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnione 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2% L-glutaminy i 1% tetracykliny (zwanej dalej kompletną DMEM). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Wybierz płytkę z komórkami Hep-3B wykazującymi 70%-80% zbiegu komórek (logarytmiczna faza wzrostu), usuń pożywkę i umyj płytkę 5 ml wstępnie podgrzanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Usunąć PBS i inkubować komórki z 1 ml wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny/0,02% EDTA przez ~ 3 minuty w temperaturze 37 °C; Obserwuj komórki pod mikroskopem kultur tkankowych (10x). Przerwij trawienie trypsyny, gdy komórki staną się okrągłe i zacznij dysocjować od płytki, dodając 5 ml kompletnego DMEM. Odwirować komórki w stężeniu 1 000 × g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pełnego DMEM.
    3. Określ stężenie komórek. Zmieszać 50 μl zawiesiny komórek z 50 μl błękitu trypanowego. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub za pomocą hemocytometru 5x i uśrednij te zliczenia, aby zapewnić dokładność zliczeń.
    4. Wysiewaj 42 000 komórek Hep3G w każdym 8-dołkowym μ-szkiełku w 400 μl kompletnego DMEM (jak opisano powyżej). Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    5. Po 24 godzinach przy konfluencji ~80%-85% należy usunąć 250 μl pożywki z każdej ze studzienek i dodać 50 μl pożywki z odpowiednią obróbką lub nośnikiem. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, potraktuj komórki 100 μM VL-850, 5 μM FCCP i nośnikiem jako kontrolą.
    6. Po 6 godzinnej inkubacji ze związkami dodać 50 μl pożywki do każdej studzienki zawierającej odczynnik barwiący (0,5 μl barwnika na 250 μl w każdym dołku). Inkubować komórki z barwnikiem przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Ponieważ odczynnik barwiący jest wrażliwy na światło, zminimalizuj ekspozycję na światło, przykrywając próbki folią aluminiową i pracując w słabym świetle (jeśli to możliwe).
    7. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl delikatnie usuń całe podłoże (250 μl) z każdego dołka, a następnie umyj komórki 200 μl podgrzanego PBS.
    8. Utrwalić komórki za pomocą 200 μl roztworu utrwalającego zawierającego 4% formaldehydu i 2,5% aldehydu glutarowego przygotowanego w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Zdekantować roztwór utrwalający i krótko przemyć 200 μl PBS.
    10. Dodać 200 μl PBS, przykryć komórki i chronić je przed światłem w temperaturze 4 °C, a następnie wykonać obraz w ciągu 24 godzin
      UWAGA: Użyliśmy mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem w czterech kanałach, w tym DIC, TRITC, FITC i DAPI, jak w kroku 1.4.8. Zobrazowaliśmy ~300 komórek na zabieg.
  3. Analiza obrazu
    1. Wykonaj kroki 1.5.1-1.5.5. Aby uzyskać zwrot z inwestycji komórek, wygeneruj obraz, który podkreśla obszar komórek. W tym celu należy wybrać obraz z kolokalizowanymi punktami (RGB) (Rysunek 4A). Aby zaznaczyć cały obszar komórki, wybierz pozycję Proces | Binarny | Utwórz maskę, aby uzyskać obraz binarny (Rysunek 4B). Aby przeanalizować obszar komórki, wybierz pozycję Analizuj | Analizuj cząstki i mierz wszystkie cząstki na obrazie od 0 do nieskończoności, co jest domyślnym ustawieniem dla opcji Analizuj cząstki.
    2. Aby przeanalizować obszar kolokalizowanych mitochondriów i lizosomów, wybierz kolokalizowany obraz 8-bitowy, przekonwertuj go na binarny, wybierając opcję Proces | Binarny | Utwórz plik binarny, wybierz pozycję Analizuj | Analizuj cząstki i zmierz sumę puncta między 0,1625 μm2 a 4 μm2. Aby zmierzyć kolokalizowaną puncta, podziel obszar kolokalizowanych mitochondriów i lizosomów przez całkowitą powierzchnię komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indukcja silnej odpowiedzi mitofagicznej zarówno u robaków C. elegans, jak i komórek Hep-3B za pomocą VL-850
VL-850 chroni robaki C. elegans i ludzkie keratynocyty (komórki HaCaT) przed stresem oksydacyjnym23. Aby dokładniej zbadać jego mechanizm działania, zbadaliśmy, czy VL-850 indukuje mitofagię w C. elegans i innych komórkach ludzkich. Aby to przetestować, wystawiliśmy robaki C. elegans (młode dorosłe, 3 dni po L1) na działanie 62,5 μM V...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele szlaków mitofagii obejmuje różne białka i biomolekuły (np. kardiolipinę29). Jednak punkt końcowy tych szlaków jest podobny - degradacja mitochondriów przez enzymy lizosomalne12,13. Rzeczywiście, kilka metod wykorzystuje ten punkt końcowy do ilościowego określenia mitofagii. Jednak niektóre metody, takie jak mikroskopia elektronowa, wymagają dostępu do kosztownego sprzętu, przeszkolonych ekspertów oraz wydłużonego czasu przygotowania ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Grossa za krytyczną lekturę manuskryptu oraz ich komentarze i rady. Dziękujemy Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC), które jest finansowane przez National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), za dostarczenie niektórych szczepów. Badania te zostały wsparte grantem firmy Vitalunga Ltd i Izraelskiej Fundacji Naukowej (grant nr 989/19). Graficzny rysunek abstrakcyjny (rysunek 1) został wygenerowany za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik lub zasób
Waga analitycznaMettler-Toledo
Bacto AgarBD-Difco214010
Bacto PeptonBD-Difco211677
Bacto TryptonBD-Difco211705
Ekstrakt drożdżowy BactoBD-Difco212750
Chlorek wapniaSigmaC1016
4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu (FCCP)SigmaC2920
Chemicals
CholestrolThermo FisherC/5360/48
DMEM o wysokiej zawartości glukozyPrzemysł biologiczny01-055-1A
Woda podwójnie destylowana (DDW)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)Biological Industries02-023-1A
FBS inaktywowany termicznieInvitrogenM7514
Gluteradehyd (25%)SigmaG5882
Bufor HEPES 1 MBiological Industries03-025-1B
L-gluataminaPrzemysł biologiczny03-020-1B
Lizosom / Mitochondria / Barwienie jądrowe Odczynnik cytomalarzAbcamab139487
Siarczan magnezuSigmaM7506
Nonidet P 40Sigma74385
Paraformalydehyd (16%)Mikroskopia elektronowa Nauki15720
Poloxamer 188 RoztwórSigmaP5556
Diwodorofosforan potasuMilipor1.04873.1000
Fosforan potasu dwuzasadowySigmaP3786
SeaKem LE AgarozaLonza50004
Chlorek soduBio-Lab1903059100
Wodorotlenek soduGadot1310732
Fosforan sodu dwuzasadowy dwunastowodzianSigma4273
Chlorowodorek tetracyklinySigma87128-25G
Trypsyna-EDTAPrzemysł biologiczny03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooksyoktanOpatentowany
szklany/plastikowy jednorazówki
0,22 μ m filtr strzykawkowyMillex GVSLGV033RS
1,7 ml MikroprobówkiLifegeneLMCT1.7B-500
10 cm Płytki PetriegoCorning430167
1,000 ml Kolba ErlenmeyeraIsoLab, Niemcy
15 ml Sterylna probówka polipropylenowaLifegeneLTB15-500
35 mm szalki PetriegoBar Naor
500  mL filtr próżniowy/system butelek do przechowywania, 0,22  μ mLifegeneLG-FPE205500S
50 ml Sterylna probówka polipropylenowaLifegeneLTB50-500
Deckglä ser Szkło osłonowe mikroskopu 24 x 60 mmMarienfeld101152
Probówki szklane (10 ml- 13 x 100 mm) Szkło borokrzemianowePyrex99445-13
iBiDi 8 dołków μ-szkiełkaiBiDi80826
Szkło osłonowe mikroskopu 24 x 40 mmBar NaorBN1052421ECALN
Drut platynowy iryd 0,25 mMWorld Precision InstrumentsPT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BFDeNovixCellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400BiosanBS-010201-AAA
Mikroskop konfokalny Nikon Yokogawa W1 z filtrami DAPI, FITC i TRITC oraz jasnym polem, z obiektywem planapochromatycznym typu Lambda 60x CFI (soczewka powietrzna) i oprogramowaniemNIS-ElementsNikonCSU-W1
Olympus SZ61 mikroskop stereoskopowyOlympusSZ61
pH-metrMettler-ToledoMT30019032
Rewolwer Regulowany rotator laboratoryjnyLabnetH5600
wirówkowe BN9015810

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
  2. Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
  3. Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
  4. Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
  5. Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
  6. Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
  7. Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
  8. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
  9. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
  10. Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
  11. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64(2017).
  12. Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
  13. Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
  14. Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  15. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  16. Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
  17. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
  18. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  19. Yim, W. W. -Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6(2020).
  20. Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
  21. Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479(2021).
  22. Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706(2022).
  23. Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
  24. Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
  25. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  26. Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1988).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
  29. Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie mitofagiiautofagia mitochondri wmikroskopia konfokalnaanaliza kolokalizacjibarwienie lizosom wbarwienie mitochondri wkolokalizacja w ImageJ

Powiązane artykuły