Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wzbogacenie biblioteki mRNA i mRNA wodorosiarczynowego do sekwencjonowania nowej generacji

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65352

⸱

7 lipca 2023

 , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia łatwy do naśladowania przepływ pracy do przeprowadzenia oczyszczania poli(A) RNA, konwersji wodorosiarczynu i przygotowania biblioteki przy użyciu standardowego sprzętu dla interesującej próbki biologicznej.

Streszczenie

Modyfikacje potranskrypcyjne RNA w różnych typach transkryptów RNA są związane z różnorodną regulacją RNA w komórkach eukariotycznych. Wykazano, że nieprawidłowe modyfikacje 5-metylocytozyny RNA i rozregulowana ekspresja metylotransferaz RNA są związane z różnymi chorobami, w tym nowotworami. Opracowano sekwencjonowanie wodorosiarczynu w całym transkryptomie w celu scharakteryzowania pozycji i ilościowych poziomów metylacji cytozyny w RNA przekształconym w wodorosiarczyn w rozdzielczości par zasad. W niniejszym protokole przedstawiono procedury dwóch rund oczyszczania poli(A) RNA, trzech cykli reakcji wodorosiarczynowej oraz szczegółowego przygotowania biblioteki, aby umożliwić mapowanie miejsc modyfikacji 5-metylocytozyny mRNA w całym transkryptomie. Ocena ilości i jakości RNA po głównej reakcji jest niezbędna do monitorowania integralności RNA i jest kluczowym krokiem w celu zapewnienia wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania. Idealnie byłoby, gdyby procedury można było wykonać w ciągu trzech dni. Dzięki temu protokołowi, użycie wysokiej jakości całkowitego RNA jako danych wejściowych może praktycznie zbudować solidne biblioteki mRNA wodorosiarczynowego do sekwencjonowania nowej generacji z próbki będącej przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Wśród ponad 150 typów modyfikacji potranskrypcyjnych1, modyfikacja 5-metylocytozyny (m5C) została zidentyfikowana w różnych typach RNA, w tym w rybosomalnym RNA, transferowym RNA, informacyjnym RNA, mikro RNA, długim niekodującym RNA, krypcie RNA, wzmacniającym RNA i małych cajal specyficznych dla ciała RNAs2. RNA m5C jest związane z różnymi mechanizmami biologicznymi i patologicznymi, takimi jak regulacja rozwoju korzeni roślin3, ekspresja genów wirusa4 i progresja raka5. Celem tego protokołu jest zapewnienie usprawnionych procesów w celu scharakteryzowania profilu modyfikacji mRNA m5C w całym transkryptomie próbek biologicznych na różnych etapach rozwoju lub w otoczeniu choroby. Sekwencjonowanie wodorosiarczynu w całym transkryptomie zostało opracowane w celu scharakteryzowania pozycji i ilościowych poziomów metylacji cytozyny w RNA przekształconym w wodorosiarczyn w rozdzielczości par zasad6,7,8,9. Jest to szczególnie przydatne podczas badania związkum5Cz ekspresją genów i losem RNA, które są zaangażowane w biologiczne mechanizmy regulacyjne w komórkach. W komórce ssaków znane są dwa czytniki m5C: ALYREF może rozpoznać m5C w jądrze i służy jako transporter jądra mRNA do cytozolu 10, podczas gdy YBX1 może rozpoznać m5C w cytoplazmie i zwiększyć stabilizację mRNA11. Nieprawidłowe mRNA m5C związane ze szlakami immunologicznymi zostały zgłoszone w limfocytach T CD4 + tocznia rumieniowatego układowego12. Badania wykazały związek między modyfikacją mRNA m5C a modulacją odporności na raka a progresją raka13,14. W związku z tym mapowanie profilu modyfikacji m5C na mRNA może dostarczyć kluczowych informacji do wyjaśnienia potencjalnej maszynerii regulacyjnej.

Aby zbadać funkcjonalne role modyfikacji RNA m5C w pewnych warunkach biologicznych, podejścia oparte na konwersji bisulfitu (bsRNA-seq) i wzbogacaniu powinowactwa przeciwciał, takie jak m5C-RIP-seq, miCLIP-seq i 5-Aza-seq mogą być połączone z wysokoprzepustową platformą sekwencjonowania, aby zapewnić skuteczne wykrywanie docelowych regionów i sekwencji z modyfikacjami m5C na skali transkryptomu15,16. Zaletą tego protokołu jest kompleksowy krajobraz RNAm 5C w rozdzielczości pojedynczej zasady, ponieważ podejście oparte na wzbogacaniu powinowactwa przeciwciał opiera się na dostępności wysokiej jakości przeciwciał i może osiągnąć rozdzielczość pojedynczego fragmentu krajobrazu metylacji m5C17.

Wszystkie próbki RNA zostaną przetworzone z dwoma rundami wzbogacania mRNA za pomocą kulek oligo(dT), trzema cyklami reakcji wodorosiarczynowej i przygotowaniem biblioteki sekwencjonowania. Aby monitorować jakość RNA, każda próbka RNA zostanie zbadana za pomocą elektroforezy żelu kapilarnego przed i po procedurach oczyszczania mRNA i reakcji wodorosiarczynowej w celu oceny rozkładu fragmentów. Oczyszczone biblioteki zostaną zbadane pod kątem ich właściwości amplikonu PCR, fragmentów rozkładu wielkości DNA za pomocą elektroforezy żelu kapilarnego oraz ich całkowitych ilości zbadanych za pomocą testów ilościowych opartych na barwnikach fluorescencyjnych przed sekwencjonowaniem. System może być również używany do analizy szerokiego spektrum próbek biologicznych, takich jak produkty rolne, izolowane wiriony, linie komórkowe, organizmy modelowe i próbki patologiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Oczyszczanie poli(A) RNA

UWAGA: Użyj całkowitego RNA potraktowanego DNazą I i zbadaj całkowitą jakość i integralność RNA za pomocą kapilarnej lub konwencjonalnej elektroforezy żelowej przed przystąpieniem do oczyszczania poli(A) RNA. Badacze powinni być w stanie zidentyfikować prążki rybosomalne 28S i 18S rRNA w polu o wysokiej masie cząsteczkowej oraz pasmo 5,8S rRNA w polu o niskiej masie cząsteczkowej bez żadnych znaczących prążków rozmazu w elektroferogramie. Etapy oczyszczania zasadniczo są zgodne z instrukcjami producenta z niewielkimi modyfikacjami wskazanymi w poszczególnych krokach. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i instrumentów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

  1. preparat
    1. Rozgrzej odczynnik, bufor myjący, kulki oligo(dT) i bufor do lizy w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed wykonaniem poniższych procedur.
    2. Do izolacji RNA wzbogaconego w poli(A) należy przygotować 10-20 μg podwielokrotności wysokiej jakości całkowitego RNA jako materiału wyjściowego, przenosząc odpowiednią ilość RNA do wolnej od nukleaz probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 70 °C przez 5 minut, a następnie trzymać na lodzie przez 2 minuty.
      UWAGA: Ilości całkowitego RNA jako materiału wyjściowego powinny być odpowiednio dostosowane w zależności od pożądanej ilości mRNA i charakteru użytych komórek. Empirycznie RNA wzbogacone w poli(A) może odpowiadać za 1-5% obfitości w całkowitym RNA. Podwielokrotność 10 μg wysokiej jakości całkowitego RNA powinna dostarczyć wysokiej jakości RNA wzbogaconego w poli(A) w zakresie 100-500 ng do dalszej konwersji wodorosiarczynu.
    3. W międzyczasie całkowicie ponownie zawieś koraliki oligo(dT). Przenieś wymagane ilości zawiesiny kulek do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie umieść na magnesie na 3 minuty, aż kulki magnetyczne utworzą osad.
      UWAGA: Użyj 50 μl kulek oligo(dT) na 10 μg całkowitego wejścia RNA. Objętość koralików na tym etapie może być dodatkowo zoptymalizowana w zależności od użytych komórek.
    4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki oligo(dT) z równymi ilościami (objętość zawiesiny kulek użytej w kroku 1.1.3.) buforu do lizy i umieścić na magnesie na 3 minuty przed usunięciem supernatantu.
      UWAGA: Nie przesuszaj koralików; Użytkownik powinien szybko przejść do kroku 1.2.1.
  2. Pierwsza runda oczyszczania
    1. Dodać bufor do lizy do probówki z próbką RNA (stosunek objętości 4:1) i dokładnie wymieszać przed przeniesieniem do kulek oligo(dT).
      UWAGA: Jeśli objętość próbki RNA wynosi 20 μl, dodaj 80 μl buforu do lizy.
    2. Zawiesić RNA: mieszaninę buforu do lizy i kulki oligo(dT) w całości, pipetując co najmniej 10 razy.
    3. Pozostawić próbki do inkubacji z ciągłą rotacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Umieścić próbkę na magnesie na 5 minut lub do momentu, gdy supernatant będzie czysty; wyrzucić supernatant.
    5. Dodaj 600 μl buforu do płukania 1 do kulek i ostrożnie wymieszaj, aby ponownie zawiesić kulki.
    6. Umieścić probówkę na magnesie na 5 minut lub do momentu, gdy supernatant będzie czysty, wyrzucić supernatant i powtórzyć krok mycia 1.2.5 raz.
    7. Umyj kulki, dodając 300 μl buforu do płukania 2 i delikatnie ponownie zawiesić kulki.
    8. Umieścić probówkę na magnesie na 5 minut lub do momentu, gdy supernatant będzie czysty, wyrzucić supernatant i powtórzyć krok prania 1.2.7 raz.
    9. Dodać 30 μl zimnego 10 mM Tris-HCl (bufor elucyjny) do probówki z próbką i inkubować w temperaturze 70 °C przez 5 minut.
    10. Szybko przenieś probówkę na magnes, a gdy zawiesina jest czysta po 20 s lub więcej, przenieś supernatant zawierający wymyty RNA wzbogacony w poli(A) do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  3. Druga runda oczyszczania
    1. Dodać 120 μl (4x objętość eluowanej próbki) buforu do lizy do eluowanej próbki RNA i dokładnie wymieszać.
    2. Przemyć kulki użyte w pierwszej rundzie oczyszczania taką samą ilością buforu do lizy, jak w kroku 1.1.4, odpipetować 10 razy w celu ponownego zawieszenia kulek, a następnie umieścić je na magnesie na 5 minut przed wyrzuceniem supernatantu.
    3. Przenieść mieszaninę RNA: buforu do lizy do przemytych kulek i dokładnie wymieszać, pipetując co najmniej 10 razy.
    4. Inkubować próbkę z ciągłą rotacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Powtórz kroki od 1.2.4 do 1.2.8, aby usunąć sól i inne podtypy RNA.
      UWAGA: Objętość buforu płuczącego można zmniejszyć do 300 μl buforu płuczącego 1 i 150 μl buforu płuczącego 2.
    6. Dodać 25 μl (żądana objętość) zimnego 10 mM Tris-HCl (bufor elucyjny) do probówki z próbką i inkubować w temperaturze 70 °C przez 5 minut.
    7. Szybko przenieś probówkę na magnes, a gdy zawiesina jest czysta po 20 s lub więcej, przenieś supernatant zawierający wyluzowany RNA wzbogacony w poli(A) do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    8. Przenieś 2,2 μl do probówek z 8 paskami w celu oceny jakości ilości i jakości RNA za pomocą testów RNA o wysokiej czułości.
    9. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C przez krótki czas i -70 °C przez dłuższy czas.
      UWAGA: Może to być punkt pauzy w protokole.

2. Konwersja wodorosiarczynu

UWAGA: Wszystkie etapy wirowania zostały przeprowadzone w temperaturze pokojowej. Procedury są zasadniczo wykonywane zgodnie z instrukcjami producenta, ale z dodatkowym krokiem 2.2 w celu dodania sekwencji kontrolnej mRNA z impulsami przed etapem reakcji wodorosiarczynowej 2.3.

  1. Przenieść 19 μl oczyszczonej próbki RNA wzbogaconej poli(A) do probówki o pojemności 0,2 ml z 8 paskami.
  2. Dodaj 1,0 μl kontroli kolca, która jest wolna od jakichkolwiek modyfikacji w ustalonym stosunku ilościowym 1:10 000 (tj. 0,1 ng mRNA lucyferazy: 1 μg oczyszczonego RNA wzbogaconego poli(A)) do próbki RNA z kroku 2.1.
    UWAGA: Sekwencją kontrolną skoku może być RNA lucyferazy świetlika, lucyferazy Renilla lub sekwencja RNA transkrybowana in vitro bez metylowanych cytozyn.
  3. Dodać 130 μl regentu konwersji do probówki i delikatnie odwrócić kilka razy w celu dokładnego wymieszania.
  4. Umieścić probówkę w maszynie do PCR i wykonać trzy cykle ogrzewania w temperaturze 70 °C przez 10 minut, następnie inkubację w temperaturze 64 °C przez 45 minut każdy, a następnie ostatni etap w celu schłodzenia do 4 °C.
  5. Umieścić kolumnę na probówce zbiorczej i przenieść 250 μl buforu wiążącego RNA do kolumny.
  6. Przenieść próbkę z kroku 2.4 do kolumny z kroku 2.5 i dokładnie pipetować.
  7. Dodaj 400 μl 95-100% etanolu do kolumny, szybko zamknij nakrętkę i kilkakrotnie odwróć
    8. .
  8. Odwirować przy 10 000 × g przez 30 s w temperaturze 25 °C i odrzucić przepływ
    9. .
  9. Dodać 200 μl buforu do przemywania RNA do kolumny.
  10. Odwirować przy 10 000 × g przez 30 s w temperaturze 25 °C i odrzucić przepływ
    11. .
  11. Dodać 200 μl buforu do odsulfonowania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  12. Odwirować przy 10 000 × g przez 30 s w temperaturze 25 °C i odrzucić przepływ
    13. .
  13. Dodać 400 μl buforu płuczącego RNA i odwirować w temperaturze 10 000 × g przez 30 s w temperaturze 25 °C i odrzucić przepływ. Powtórz ten krok raz.
  14. Ponownie odwirować przy 10 000 × g przez 2 minuty w temperaturze 25 °C, aby całkowicie usunąć resztki buforu do płukania.
    UWAGA: Drugi etap wirowania 2.14 przez 2 minuty przed elucją, polega na całkowitym usunięciu buforu do płukania. Etap płukania wykonuje się dwukrotnie w celu wypłukania składnika o wysokiej zawartości soli z odczynnika wodorosiarczynowego i buforu odsiarczającego na kolumnie.
  15. Przenieść kolumnę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  16. Dodać 20-30 μl H2O bez nukleaz do kolumny i odstawić w temperaturze pokojowej na 1 minutę.
  17. Wirować przy 10 000 × g przez 30 s w temperaturze 25 °C.
  18. Przenieść 2,2 μl do probówek z 8 paskami w celu oceny ilości i jakości RNA.
  19. Próbkę RNA poddaną działaniu wodorosiarczynu należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez krótki czas i -70 °C przez dłuższy czas.
    UWAGA: Może to być punkt pauzy w protokole.

3. Przygotowanie biblioteki mRNA traktowanej wodorosiarczynem

UWAGA: Postępuj zgodnie z sekcją 4 protokołu przygotowania biblioteki do użytku z oczyszczonym mRNA lub RNA zubożonym w rRNA. Pierwszy etap przygotowania powinien być zgodny z protokołem FFPE RNA, ponieważ obróbka wodorosiarczynem powoduje fragmentację RNA. Wykonaj każdy krok w okapie z przepływem laminarnym i dodaj mieszaninę reakcyjną na chłodzonym lodem stojaku chłodzącym.

  1. Przygotowanie wejściowego RNA
    1. Przenieś żądaną ilość próbki mRNA poddanej działaniu wodorosiarczynu w łącznej maksymalnej ilości 5 μl lub dodaj H2O wolne od nukleaz, aby uzyskać łącznie 5 μL.
      UWAGA: Do tego typu przygotowania biblioteki RNA i do wygenerowania końcowej molowości produktu bibliotecznego 4 nM zaleca się co najmniej 10 ng mRNA poddanego działaniu wodorosiarczynu jako dane wejściowe.
    2. Dodać 1 μl startera losowego (liliowego) do próbki i wymieszać pipetując.
    3. Umieścić probówkę z próbką w maszynie do PCR nastawioną na 65 °C i przykryć w temperaturze 105 °C na 5 minut i utrzymać w temperaturze 4 °C.
  2. Synteza pierwszej nici cDNA
    1. Do próbki dodać 4 μl buforu do reakcji syntezy (liliowy), 8 μl odczynnika do oznaczania swoistości nici (brązowy) i 2 μl mieszanki enzymów syntezy (brązowy) do próbki, co daje całkowitą objętość 20 μl. Dokładnie wymieszać, pipetując co najmniej 10 razy i szybko odwirować.
    2. Umieścić probówkę z próbką w maszynie do PCR nastawioną na 25 °C przez 10 minut, 42 °C przez 50 minut, 70 °C przez 15 minut i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W przypadku wkładek powyżej 200 zasad sugerowany jest okres inkubacji w temperaturze 42 °C wynoszący 50 minut; dla wielkości płytki poniżej 200 zasad sugeruje się okres inkubacji w temperaturze 42 °C wynoszący 15 minut.
  3. Synteza drugiej nici cDNA
    1. Dodać 8 μl buforu do reakcji syntezy z mieszanką dUTP (kolor pomarańczowy), 4 μl mieszaniny enzymów syntezy (kolor pomarańczowy) i 48 μlH2O, bez nukleaz. Dokładnie wymieszać, pipetując co najmniej 10 razy i szybko odwirować.
    2. Umieścić probówkę z próbką w maszynie do PCR ustawionej na 16 °C na 1 godzinę ze zdjętą pokrywką lub w temperaturze ≤40 °C.
  4. Oczyszczanie dwuniciowego cDNA za pomocą kulek oczyszczających DNA
    1. Podgrzej kulki oczyszczające DNA 30 minut przed przeprowadzeniem oczyszczania i wiruj, aby ponownie zawiesić kulki.
    2. Dodać 144 μl zawieszonych kulek oczyszczających DNA do próbki cDNA z kroku 3.3.2 i dokładnie wymieszać, pipetując co najmniej 10 razy.
    3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Umieść probówkę z próbką na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż roztwór będzie klarowny, a następnie usuń supernatant i zachowaj kulki zawierające DNA.
    5. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówki z kulkami, trzymając próbkę na stojaku magnetycznym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s.
    6. Usunąć supernatant i powtórzyć krok 3.4.5 jeden raz, ale tym razem ostrożnie usunąć cały pozostałości supernatantu.
    7. Suszyć kulki na powietrzu przez 1-5 minut, trzymając próbkę na magnesie.
      UWAGA: Nie przesuszaj koralików; Kolor powinien być ciemnobrązowy.
    8. Wyjmij próbkę ze stojaka magnetycznego i eluuj DNA, dodając 53 μl 0,1x buforu TE (10 mM Tris-HCl i 1 mM EDTA, pH 8,0) do kulek. Dokładnie wymieszać pipetując co najmniej 10x i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    9. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 5 minut lub do momentu, gdy roztwór będzie klarowny.
    10. Przenieść 50 μl supernatantu zawierającego dwuniciowy cDNA do nowej probówki z 8 paskami.
      UWAGA: W tym momencie protokół można zatrzymać, a próbkę można przechowywać w temperaturze -30 °C.
  5. Zakończenie przygotowania biblioteki cDNA
    1. Dodać 7 μl buforu reakcyjnego do polerowania końcowego (zielony) i 3 μl mieszanki enzymatycznej do polerowania końcowego (zielony) do eluowanej dwuniciowej próbki cDNA.
    2. Wymieszaj mieszaninę, pipetując 10 razy z ustawioną objętością 50 μl bez tworzenia pęcherzyków, a następnie szybko odwiruj próbkę.
    3. Umieścić próbkę w maszynie do PCR i inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 minut, w temperaturze 65 °C przez 30 minut i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  6. Podwiązanie adaptera
    1. Rozcieńczyć adapter (czerwony) zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Do próbki dodać 2,5 μl rozcieńczonego łącznika, 1 μl wzmacniacza ligacji (czerwony) i 30 μl Ligation Master Mix (czerwony) do próbki.
    3. Wymieszać mieszaninę, pipetując 10 razy z ustawieniem objętości 80 μl bez tworzenia pęcherzyków, a następnie szybko odwirować próbkę.
    4. Umieścić próbkę w maszynie do PCR i inkubować w temperaturze 20 °C przez 15 minut.
    5. Dodać 3 μl mieszaniny glikozylazy DNA uracylu i endonukleazy VIII (niebieskiej) glikozylazy DNA i dokładnie odpipetować.
    6. Umieścić próbkę z powrotem w maszynie do PCR i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut z pokrywką ustawioną na 75 °C.
  7. Oczyszczanie cDNA poddanych działaniu reakcji ligacji
    UWAGA: W tym celu można użyć zarówno rozmiaru za pomocą koralików SPRIselect, jak i opcjonalnie koralików AMpure XP18.
    1. Podgrzej kulki 30 minut przed przeprowadzeniem oczyszczania i wiruj, aby je ponownie zawiesić.
    2. Przenieść 25 μl zawieszonych kulek do próbki cDNA z kroku 3.6.6 i dokładnie wymieszać, pipetując co najmniej 10 razy.
    3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Umieścić probówkę z próbką na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż roztwór będzie klarowny, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki z 8 paskami i wyrzucić kulki.
    5. Dodać 10 μl zawieszonych kulek do supernatantu i dokładnie wymieszać, pipetując co najmniej 10 razy.
    6. Umieść probówkę z próbką na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż roztwór będzie klarowny, a następnie wyrzuć supernatant i nie naruszaj kulek.
    7. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówki z kulkami, trzymając próbkę na stojaku magnetycznym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s.
    8. Usunąć supernatant i powtórzyć krok 3.7.7 jeden raz, ale tym razem ostrożnie usunąć cały pozostałość supernatantu.
    9. Suszyć kulki na powietrzu przez 1-5 minut, trzymając próbkę na magnesie.
      UWAGA: Nie przesuszaj koralików; Kolor powinien być ciemnobrązowy.
    10. Wyjmij próbkę ze stojaka magnetycznego i eluuj DNA, dodając 17 μl 0,1x buforu TE do kulek. Dokładnie wymieszać pipetując co najmniej 10x i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    11. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż roztwór będzie klarowny.
    12. Przenieść 15 μl supernatantu, który zawiera docelowy dDNA przygotowany na końcu, do nowej probówki z 8 paskami.
  8. Wzbogacanie metodą PCR DNA podwiązanego adaptorowo
    1. Dodać 25 μl mieszanki wzorcowej (niebieskiej), 5 μl startera 5' adaptora i 5 μl startera 3' adaptora do próbki DNA podwiązanej adaptorem. Dokładnie wymieszać, pipetując co najmniej 10 razy.
    2. Umieścić próbkę w maszynie do PCR i przeprowadzić amplifikację PCR, wykonując następujące czynności: (1) 98 °C przez 30 s, (2) 98 °C przez 10 s, (3) 65 °C przez 75 s, (4) 65 °C przez 5 min i (5) utrzymywać w temperaturze 4 °C; w których kroki (2) i (3) należy powtórzyć dla numeru cyklu N+2, gdzie N jest równe ilości wejściowej RNA w Instrukcja obsługi. Oznacza to, że potrzebne są 2 dodatkowe cykle ze względu na dwustronny dobór wielkości próbek przeprowadzony w kroku 3.7.
      UWAGA: Na przykład 8 ng oczyszczonego wejścia mRNA byłoby zalecane przy 9-10 cyklach PCR; ale w przypadku dwustronnego, dobranego rozmiaru, ligowanego cDNA w kroku 3.7 zalecany cykl PCR wynosiłby 11-12 cykli.
  9. Oczyszczanie bibliotek amplifikowanych PCR
    1. Podgrzej kulki oczyszczające DNA przez 30 minut przed przeprowadzeniem oczyszczania i wiruj, aby ponownie zawiesić kulki.
    2. Przenieść 45 μl (0,9x) zawieszonych kulek do produktu PCR z kroku 3.8.2 i dokładnie wymieszać, pipetując co najmniej 10 razy.
    3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Umieść probówkę z próbką na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż roztwór będzie klarowny, a następnie usuń supernatant i zachowaj kulki zawierające DNA.
    5. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówki z kulkami, pozostaw próbkę na stojaku magnetycznym i pozostaw ją w temperaturze pokojowej na 30 s.
    6. Usunąć supernatant i powtórzyć krok 3.9.5 jeden raz, ale tym razem ostrożnie usunąć cały pozostałości supernatantu.
    7. Suszyć kulki na powietrzu przez 1-5 minut, trzymając próbkę na magnesie.
      UWAGA: Nie przesuszaj koralików; Kolor powinien być ciemnobrązowy.
    8. Zdejmij próbkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 22 μl 0,1x buforu TE do kulek, aby wymyć DNA. Dokładnie wymieszać pipetując co najmniej 10x i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    9. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odstaw na 5 minut lub do momentu, gdy roztwór będzie klarowny w temperaturze pokojowej.
    10. Przenieść 20 μl supernatantu do nowej probówki z 8 paskami.
    11. Przenieś 2,2 μl do probówek 8-paskowych w celu oceny jakości i ilości biblioteki.
      UWAGA: Ilość biblioteki można również wykryć za pomocą qPCR (patrz Tabela materiałów).
    12. Przechowywać próbkę biblioteki bsRNA-seq w temperaturze -20 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Seria bibliotek bsRNA-seq z linii komórkowych19 zostały wygenerowane zgodnie z procedurami opisanymi w niniejszym raporcie (Rycina 1)Po całkowitej puryfikacji RNA z jednoczesną obróbką nukleazą DN//ase przeprowadzonej na próbkach linii komórkowych oraz sprawdzeniu jakości za pomocą elektroforezy żelowej i spektrofotometrii UV-Vis (A260/A280), próbka RNA może zostać poddana wzbogaceniu o RNA poly(A). Aby ustalić, czy podwójna puryfikacja pozwoliła usun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole osiągnięto szczegółowy proces wzbogacania poli(A), konwersji wodorosiarczynu i przygotowania biblioteki dzięki wykorzystaniu znormalizowanych komponentów. Dalsza analiza sekwencjonowania pozwoliła na zidentyfikowanie mRNA 5-metylocytozyny w próbkach będących przedmiotem zainteresowania.

Krytycznym etapem jest jakość materiału wyjściowego - całkowitego RNA - ponieważ degradacja RNA wpłynęłaby na szybkość odzyskiwania oczyszczania poli(A) RNA. Z próbką należy obchodzić się ostroż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Radę Nauki i Technologii Tajwanu. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System bioanalizatora elektroforezy Agilent 2100Agilent, Santa Clara, CAWykrywanie jakości RNA
Koraliki AMpure XPBeckman CoulterA63881oczyszczanie
Bioanalizatora DNA Zestaw o wysokiej czułości DNAAgilent, Santa Clara, CA5067-4626
Bioanalizator jakości DNA RNA 6000 Zestaw PicoAgilent, Santa Clara, CA5067-1513RNA wykrywanie jakości
DiaMag02 - stojak magnetycznyDiagenode, Denville, NJB04000001pomoc w przygotowaniu biblioteki
DiaMag1.5 - stojak magnetycznyDiagenode, Denville, NJB04000003wspomaganie oczyszczania poli(A) RNA
Dynabeads Zestaw do oczyszczania mRNA DIRECTThermo Fisher Scientific, Waltham, MA61011oczyszczanie poli(A) RNA; Bufor do płukania 1 i bufor do płukania 2
EtanolJ.T.Baker64-17-5
Zestaw do metylacji RNAEZ Zymo, Irvine, CAR5002leczenie wodorosiarczynem
mRNA lucyferazy świetlikaPromega, Madison, WI, USAL4561skok w sekwencji kontrolnej 
Zestawy kwantyfikacyjne biblioteki KAPARoche, SzwajcariaKwantyfikacja bibliotekiKK4824
Spektrofotometr nanokroplowyThermo Fisher Scientific, Waltham, MAWykrywanie całkowitej ilości RNA
NEBNext multipleks Oligosy dla illumina (indeks Zestaw starterów1)New England Biolabs, Ipswich, MAPrzygotowanie
biblioteki E7335SNEBNext Ultra figure-materials-1 Kierunkowy zestaw do przygotowania biblioteki RNA dla IlluminaNew England Biolabs, Ipswich, MAPrzygotowanie bibliotekiE7760S
Woda bez nukleazPipetman Thermo Fisher ScientificAM9932
P2Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA4641010
Fluorometr Qubit 2.0 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAWykrywanie ilości RNA
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32854Wykrywanie ilości DNA
Zestaw do oznaczania kubitowego RNA HSThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32852Wykrywanie ilości RNA

Bibliografia

  1. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
  2. Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102(2019).
  3. Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959(2023).
  4. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  5. Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
  6. Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
  7. Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
  8. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1(2017).
  9. Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40(2020).
  10. Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606(2017).
  11. Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
  12. Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430(2020).
  13. Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15(2022).
  14. Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43(2020).
  15. Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
  16. Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
  17. Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231(2020).
  18. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).
  19. Chen, S. -Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
  20. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  21. Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
  22. Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
  23. Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
  24. Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
  25. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
  26. Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281(2019).
  27. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602(2013).
  28. Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
  29. Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198(2021).
  30. Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
  31. Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045(2022).
  32. Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
  33. Chao, H. -P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekwencjonowanie RNA z konwersj bisulfitowmetylacja RNAmodyfikacja 5 metylocytozynymetylotransferaza RNAoczyszczanie RNA Poly Ametylacja cytozynyintegralno RNArak trzustki
Wzbogacenie biblioteki mRNA i mRNA wodorosiarczynowego do sekwencjonowania nowej generacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.