Artykuł metodologiczny

Hybrydyzacja fluorescencji in situ w całości w celu zbadania spermatogenezy u komara Anopheles

5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65356

⸱

26 maja 2023

 ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Sir Alexander Fleming Building, Imperial College London, 2Department of Entomology, Virginia Tech

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Biorąc pod uwagę ich prostą anatomię, jądra Anopheles oferują dobry model cytologiczny do badania spermatogenezy. Protokół ten opisuje hybrydyzację in situ z fluorescencją na całej górze, technikę stosowaną do badania tego procesu biologicznego, a także fenotyp szczepów transgenicznych zawierających mutacje w genach zaangażowanych w produkcję plemników.

Streszczenie

Spermatogeneza to złożony proces biologiczny, podczas którego diploidalne komórki przechodzą kolejne podziały mitotyczne i mejotyczne, po których następują duże zmiany strukturalne, tworząc haploidalne plemniki. Oprócz aspektu biologicznego, badanie spermatogenezy ma ogromne znaczenie dla zrozumienia i rozwoju technologii genetycznych, takich jak napęd genowy i syntetyczne zniekształcacze proporcji płci, które, zmieniając odpowiednio dziedziczenie mendlowskie i stosunek płci plemników, mogą być wykorzystane do kontrolowania populacji szkodników. Technologie te okazały się bardzo obiecujące w warunkach laboratoryjnych i mogą być potencjalnie wykorzystane do kontrolowania dzikich populacji komarów Anopheles, które są wektorami malarii. Ze względu na prostotę anatomii jąder i ich znaczenie medyczne, Anopheles gambiae, główny wektor malarii w Afryce Subsaharyjskiej, stanowi dobry model cytologiczny do badania spermatogenezy. Protokół ten opisuje, w jaki sposób hybrydyzacja in situ z całą mocowaniem (WFISH) może być wykorzystana do badania dramatycznych zmian w strukturze jądra komórkowego poprzez spermatogenezę przy użyciu sond fluorescencyjnych, które specyficznie barwią chromosomy X i Y. FISH zwykle wymaga przerwania narządów rozrodczych, aby odsłonić chromosomy mitotyczne lub mejotyczne i umożliwić barwienie określonych regionów genomu za pomocą sond fluorescencyjnych. WFISH umożliwia zachowanie natywnej struktury cytologicznej jądra, w połączeniu z dobrym poziomem wykrywania sygnału z sond fluorescencyjnych ukierunkowanych na powtarzalne sekwencje DNA. Dzięki temu naukowcy mogą śledzić zmiany w zachowaniu chromosomalnym komórek poddawanych mejozie wzdłuż struktury narządu, gdzie można wyraźnie wyróżnić każdą fazę procesu. Technika ta może być szczególnie przydatna do badania parowania mejotycznego chromosomów i badania fenotypów cytologicznych związanych na przykład z syntetycznymi zniekształcaczami proporcji płci, hybrydową męskością i nokautem genów zaangażowanych w spermatogenezę.

Wprowadzenie

Malaria stanowi ogromne obciążenie dla zdrowia i dobrobytu globalnej populacji ludzkiej. W 2021 roku Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) oszacowała, że malaria spowodowała 619 000 zgonów, z czego 96% miało miejsce w Afryce Subsaharyjskiej1. Choroba jest przenoszona przez komary należące do rodzaju Anopheles, a w Afryce Subsaharyjskiej trzy gatunki, a mianowicie Anopheles gambiae (An. gambiae), Anopheles coluzzi (An, coluzzi) i Anopheles arabiensis (An. Arabiensis) odgrywają nieproporcjonalnie dużą rolę w przenoszeniu malarii, odpowiadając za 95% przypadków malarii na świecie. Programy kontroli oparte na tradycyjnych metodach, takich jak środki owadobójcze i leki przeciwmalaryczne, uratowały miliony istnień ludzkich; Jednak w ostatnich latach rosnąca odporność na te metody kontroli podważyła ich skuteczność1,2. Ponadto ograniczenia nałożone przez pandemię COVID-19 wpłynęły na dostępność kluczowych interwencji w zakresie kontroli malarii, co według Światowego Raportu WHO na temat malarii z 2022 r. zwiększyło częstość występowania malarii1. W ciągu ostatnich dwóch dekad w warunkach laboratoryjnych opracowano nowatorskie metody kontroli genetycznej w celu zwalczania komarów Anopheles 3,4,5,6,7,8,9,10. Wśród tych strategii obiecująco wypadają te oparte na systemach napędu genowego (GDS) i syntetycznych zniekształcaczach proporcji płci (SD). GDS-y opierają się na możliwości przenoszenia, z bardzo dużą częstotliwością, modyfikacji genetycznej, która wpływa na płodność samic lub upośledza cykl życiowy pasożyta u komarów5,11,12. SD natomiast działają poprzez zniekształcanie proporcji płci potomstwa komarów w stosunku do samców, co z czasem prowadzi do załamania się populacji docelowej z powodu braku samic4,6,13. Główne składniki tych systemów genetycznych działają przede wszystkim na narządy rozrodcze komarów, gdzie gamety, jaja i plemniki są wytwarzane w wyniku podziału mejotycznego14.

W tym protokole, postęp w technikach cytogenetycznych jest wykorzystywany do badania spermatogenezy w An. gambiae, skupiając się na zachowaniu chromosomów in situ. Struktura jądra komara i procesy biologiczne, które w nim zachodzą, zostały wcześniej zbadane przy użyciu wielu metod cytologicznych, takich jak immunofluorescencja, fluorescencyjne transgeny reporterowe oraz fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA i RNA (FISH)15,16,17,18,19,Dnia 20; Narządy mają kształt wrzecionowaty, w którym dolny biegun jest przymocowany do przewodu deferentnego połączonego z męskimi gruczołami dodatkowymi. W górnym biegunie nisza komórek macierzystych linii zarodkowej namnaża się i różnicuje w komórki spermatogonii osadzone w spermatocystach utworzonych przez komórki somatyczne. Po wielu rundach podziału mitotycznego spermatogonia różnicują się w spermatocyty, które wchodzą w mejozę. W profazie chromosomy autosomu i płci łączą się ze swoimi homologami i następuje krzyżowanie. Po podziałach mejotycznych powstają okrągłe haploidalne plemniki, które wchodzą w spermiogenezę, a proces ten prowadzi do powstania dojrzałych haploidalnych plemników, w których cytoplazma została usunięta, chromatyna jądrowa jest skondensowana, a wici wyłaniają się w podstawowej części jąder21,22 (Rysunek 1 i Rysunek 2).

Ogólnie rzecz biorąc, spermiogeneza zaczyna się mniej więcej w połowie stadium poczwarki, a dojrzałe plemniki można wykryć w późnym stadium poczwarki w rezerwuarze plemników23. Proces dojrzewania spermatocyst trwa w dorosłym życiu23,24,25. W jądrach Anopheles każdy etap spermatogenezy można łatwo zidentyfikować, patrząc na morfologię jądrową komórek w każdej spermatocyście (Ryc. 2). Hybrydyzacja in situ z fluorescencją całomocowaną (WFISH), opisana w tym protokole, pozwala naukowcom na specyficzne oznakowanie regionu chromosomalnego i śledzenie go podczas spermatogenezy, przy jednoczesnym zachowaniu natywnej struktury narządu i pozycji jąder komórkowych; Stanowi to zaletę w porównaniu ze standardowym protokołem DNA FISH, w którym narząd jest zwykle zgniatany, co prowadzi do uszkodzenia tkanki19. W obecnym protokole sondy fluorescencyjne są używane do barwienia powtarzających się sekwencji na chromosomach płci, a tym samym śledzenia ich zachowania podczas spermatogenezy, od diploidalnych komórek dzielących się do dojrzałych haploidalnych plemników. WFISH może być szczególnie przydatny do badania parowania mejotycznego chromosomów płci i badania fenotypów cytologicznych związanych z, na przykład, syntetycznymi zniekształcaczami proporcji płci, hybrydową bezpłodnością samców i nokautem genów zaangażowanych w spermatogenezę4,19,26,27.

Biorąc pod uwagę ich rolę jako wektorów malarii, komary Anopheles są celem coraz większej liczby strategii kontroli wektorów genetycznych, które często działają w narządach rozrodczych tych organizmów. Wygenerowano kilka mutantów komarów i fenotypów cytologicznych, które wymagają zbadania nowych technik cytologicznych26,27,28,29. Metoda opisana w tym badaniu rzuca światło na zrozumienie spermatogenezy, a także mechanizmów cytologicznych stojących za strategiami genetycznymi, które mają potencjał do kontrolowania komarów przenoszących malarię.

Protokół

1. Znakowanie sondą DNA

UWAGA: Poniżej znajdują się techniczne kroki do generowania fluorescencyjnych sond DNA, które specjalnie oznaczają chromosomy płciowe komarów An. gambiae.

  1. Etykietowanie sondy za pomocą PCR
    1. Wyodrębnij genomowe DNA od poczwarek lub dorosłych samców w celu oznaczenia chromosomów X lub Y za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji genomowego DNA (patrz tabela materiałów).
    2. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR: 200 ng genomowego DNA, 0,05 mM nieznakowanego nukleotydu (dATP, dCTP, dGTP), 0,015 mM dTTP i 1 uL fluorescencyjnie znakowanego dUTP (Cy3, Cy5 lub innego fluorochromu), 50 pmol startera do przodu i do tyłu (Tabela 1), 5 μL 10x buforu PCR i 10 U polimerazy DNA Taq (patrz Tabela materiałów).
    3. Aby znakować 18S rDNA i satelitarny AgY53B (Tabela 1), należy przeprowadzić reakcję PCR przy użyciu następujących parametrów PCR: jeden cykl 95 °C przez 10 min; 35 cykli 95 °C przez 30 s, 52 °C przez 30 s i 72 °C przez 45 s; jeden cykl 72 °C przez 5 min; i końcowe zatrzymanie w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Aby uzyskać dobre stężenie sondy metodą znakowania PCR (~1 μg w 5 μL), co ma kluczowe znaczenie dla udanego WFISH, reakcja PCR powinna być bardzo wydajna. Z tego powodu przed oznakowaniem sondy zdecydowanie zaleca się przetestowanie skuteczności starterów wybranych do amplifikacji. Ponadto włączenie kontroli pozytywnej do reakcji PCR (bez fluorescencyjnego dUTP) pomoże zweryfikować skuteczność reakcji znakowania.
    4. Przechowuj sondę w temperaturze -20 °C w ciemnym miejscu.
  2. Otrzymywanie 3' fluorescencyjnych sond oligonukleotydowych
    1. Otrzymać dostępne na rynku fluorescencyjne sondy oligonukleotydowe jako zmodyfikowane oligonukleotydy poprzez dodanie fluorochromów Cy3 lub Cy5 (lub dowolnego innego fluorochromu) do końca 3' sekwencji nukleotydowej (patrz tabela materiałów). Patrz startery/oligonukleotydy w tabeli 1 dla sekwencji referencyjnych używanych do oznaczania regionu połączenia AgY477-AgY53B satelity sprzężonego z Y i satelity sprzężonego z chromosomem X od Contig_240.
      UWAGA: Nie ma przeszkód technicznych związanych ze stężeniem oligonukleotydów znakowanych na końcu 3', ponieważ użytkownik zazwyczaj może to wybrać przed zakupem. Sugerujemy rozcieńczenie ~ 800 ng roztworu sondy oligo w buforze hybrydyzacyjnym w celu wydajnego etykietowania za pomocą sondy oligo. Specyficzne dla X i Y oligosondy były wcześniej używane dla WFISH przez Liang i Sharakhov19, a sekwencję referencyjną można znaleźć w Tabeli 1.

2. Przygotowanie roztworu hybrydyzacyjnego

UWAGA: Sondy fluorescencyjne wygenerowane w kroku 1 muszą zostać włączone do roztworu chemicznego, który hybrydyzuje z sekwencjami docelowymi.

  1. Wytrącanie sondy przed fluorescencyjną hybrydyzacją in situ
    1. Do probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 5 μl znakowanej sondy DNA (jeśli uzyskano ją metodą znakowania PCR) lub 2,2 μl zmodyfikowanej 3' sondy oligo (~800 ng sondy) z etapu 1 i 5 μl DNA plemników łososia (patrz tabela materiałów). Połącz sondy specyficzne dla różnych regionów genomu w tej samej probówce i użyj ich jako unikalnego rozwiązania w poniższych krokach.
    2. Wytrącić sondę DNA, dodając 0,1 objętości 3 M octanu sodu i 2 objętości 100% etanolu. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2,5 godziny (wydłużenie czasu inkubacji w temperaturze -20 °C zwiększy ostateczną wydajność). Na tym etapie sondy można również przechowywać przez noc przed odwirowaniem.
    3. Wirować przy 17 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut, usunąć etanol i wysuszyć granulki na powietrzu w temperaturze pokojowej w ciemności przez ~20 minut.
  2. Rozwiązanie do hybrydyzacji
    1. Przed przystąpieniem do rozbioru jądra (krok 3) należy przygotować bufor hybrydyzacyjny, mieszając następujące odczynniki w probówce o pojemności 1,5: 500 μl formamidu, 0,2 g siarczanu dekstranu, 100 μl 20x cytrynianu soli fizjologicznej (SSC) i 200 μl sterylnego H20 (patrz tabela materiałów). Wirować roztwór hybrydyzacyjny przez 1 minutę i pozostawić siarczan dekstranu do rozpuszczenia w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    2. Rozpuścić osad z kroku 2.1.3 w 20-30 μl buforu hybrydyzacyjnego (wirować przez około 1 minutę, szybko wirować i przechowywać probówki w temperaturze 37 °C w ciemności) w celu otrzymania roztworu hybrydyzacyjnego.

3. Sekcja i utrwalenie jądra

  1. W temperaturze pokojowej (RT) przeanalizuj21 co najmniej ~20 jąder od poczwarek lub 1-dniowych dorosłych w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym 1x fosforanem (PBS) i przenieś je na czyste szkiełko mikroskopowe zawierające świeżą kroplę 1x roztworu PBS.
  2. Przenieś jądra za pomocą końcówki z filtrem P1,000 o szerokim otworze lub końcówki igły preparacyjnej z kropli 1x PBS do naczynia zarodkowego zawierającego 3,7% formaldehydu w 1x PBS z 0,1% Tween-20 (PBST) i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umyć jądra w 1x PBST przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować jądra w 0,1 mg/ml RNAzy A (patrz Tabela Materiałów) rozcieńczonej w sterylnym 1x PBS przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Usunąć roztwór RNAzy, dodać roztwór penetrujący (1% Triton/0,1 M HCl w 1x PBST) i inkubować w temperaturze RT przez 10 min.
    UWAGA: Proteinaza K może być stosowana jako środek penetrujący w końcowym stężeniu 10 μg/ml w 1x PBST w celu zwiększenia przepuszczalności jąder.
  5. Umyj jądra w 1x PBST dwa razy po 5 minut w RT.

4. Hybrydyzacja

UWAGA: Ta sekcja opisuje końcowe etapy hybrydyzacji in situ.

  1. Po etapie płukania (krok 3.5) przenieść jądra do 1,5 ml probówki z 20-30 μl roztworu hybrydyzacyjnego zawierającego wcześniej przygotowaną sondę (krok 2.2.2). Użyj końcówki pipety, aby delikatnie wymieszać roztwór. Delikatnie przesuń rurkę pięć razy, zanim przejdziesz do kolejnych kroków.
  2. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 75 °C w celu denaturacji DNA.
  3. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C (jeśli to możliwe, kołysząc przy prędkości mniejszej niż 100 obr./min) w celu przeprowadzenia hybrydyzacji DNA-DNA.
  4. Przenieś jądra z powrotem do naczynia z zarodkami za pomocą filtrowanej końcówki P1,000 o szerokim otworze i umyj je w 2x SSC podgrzanym do 50 °C przez 5 min.
    UWAGA: Po etapie hybrydyzacji wymagany jest końcowy etap mycia przy użyciu 2x SSC; Odgrywa to ważną rolę w usuwaniu wszelkich sygnałów tła spowodowanych obecnością niehybrydyzowanych sond w tkance narządu. Jeśli obecny jest silny sygnał tła, zaleca się powtórzenie ostatniego kroku prania.
  5. Usunąć 2x SSC i zamontować jądra za pomocą dostępnego w handlu podłoża montażowego z 4′,6-dimidino-2-fenyloindolem (DAPI) (patrz tabela materiałów) na szkiełku podstawowym z matowego szkła, uszczelnić uszczelniaczem do szkiełek nakrywkowych i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
  6. Wykonaj obrazowanie konfokalne. Całe jądra można wizualizować za pomocą obiektywów zanurzeniowych z olejkiem 40x lub 63x. Jeśli wykonywany jest stos z, sugerujemy użycie kroku z 1,25 μm.

Wyniki

W niniejszej pracy metodę WFISH wykorzystano do zbadania zachowania chromosomów podczas spermatogenezy u An. gambiae. Pierwszym kluczowym krokiem w zastosowaniu tego protokołu jest uzyskanie jąder z niskim poziomem zmian morfologicznych po sekcji. Do pomyślnego przeprowadzenia sekcji jąder wymagana jest podstawowa wiedza z anatomii komara; poniżej przedstawiono wytyczne dotyczące tej procedury. U komara z rodzaju Anopheles dojrzałe jądra znajdują się w szóstym segmencie odwłoka w stadiach poczwarki i imago21. Jak pokazano na Rysunku 1, vas deferens (przewód spermagonalny) łączy jądra z gruczołami akcesoryjnymi samca (MAGs), które znajdują się w ostatnim segmencie odwłoka. MAGs są połączone z pojedynczym przewodem ejakulacyjnym, który dostarcza plemniki i płyny nasienne do narządu kopulacyjnego i zewnętrznej części aparatu kopulacyjnego samca21. Cały wewnętrzny aparat kopulacyjny samca można wypreparować różnymi metodami, w zależności od stadium rozwojowego komara. W stadium poczwarki jądra można łatwo zidentyfikować pod stereomikroskopem przez cienką kutykulę, obserwując stronę brzuszna odwłoka w okolicy szóstego segmentu (Rysunek 1). Aby wypreparować jądra, dolną część odwłoka, w tym szósty segment, można odizolować od reszty ciała za pomocą igieł i przenieść do czystej kropli 1x PBS. Po usunięciu ostatniego segmentu cały aparat można wycisnąć z odwłoka, wywierając delikatny nacisk igłami sekcyjnymi. W przypadku preparowania jąder od dorosłych samców pierwszym krokiem jest odizolowanie całego odwłoka w świeżej kropli 1x PBS, a następnie wyciągnięcie ostatniego segmentu z chwytnikami, które stanowią kopulacyjne struktury samca (Rysunek 1). Na tym etapie powinna pojawić się dolna część MAGs, łatwo rozpoznawalna dzięki żółtemu kolorowi. Następnie cały aparat samca można powoli wyciągnąć za pomocą igły lub pęsety w kropli 1x PBS, aż do momentu, gdy widoczna stanie się para jąder przyczepiona do vas deferens. Przed przystąpieniem do fiksacji ważne jest oddzielenie jąder od pozostałych części aparatu samca poprzez przecięcie w okolicy dolnej części vas deferens (Rysunek 1).

Wiek poczwarek lub dorosłych samców jest istotnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę w zależności od badanego etapu spermatogenezy. U An. gambiae spermatogeneza rozpoczyna się we wczesnej lub środkowej fazie poczwarki i trwa przez całe życie osobnika24. Od 3 h do 10 h po przepoczwarczeniu w jądrach bardziej reprezentowane są etapy przedmeiotyczne i meiotyczne (profaza mejozy, podziały meiotyczne), DNA spermatyd jest stosunkowo rozluźnione, a dojrzałe plemniki nie zostały jeszcze uformowane. Późne poczwarki oraz 1-dniowe osobniki dorosłe zapewniają dobrą równowagę między etapami przedmeiotycznymi, meiotycznymi i pozameiotycznymi (Rycina 2 i Rycina 3). U osobników dorosłych w wieku powyżej 4 dni etapy przedmeiotyczne i spermatocyty są słabiej reprezentowane, a jądra są zajęte głównie przez dojrzałe plemniki znajdujące się w zbiorniku plemników.

Aby zbadać zachowanie chromosomów płci podczas różnych etapów spermatogenezy, przeprowadzono WFISH w jądrach wyciętych w późnym stadium poczwarki, aby zapewnić reprezentatywność całego procesu. Do śledzenia zachowania tych chromosomów użyto sond fluorescencyjnych specyficznych dla sekwencji powtarzalnych zlokalizowanych wyłącznie na chromosomie X lub Y. Sondy fluorescencyjne można wytworzyć za pomocą PCR lub nabyć komercyjnie jako oligonukleotydy znakowane na końcu 3'. W celu zapewnienia dobrej detekcji sygnału z fluorescencyjnej sondy oligonukleotydowej zaleca się stosowanie oligo o długości >40 bps. Z naszego doświadczenia wynika, że oligonukleotydy znakowane na końcu 3' sprawdzają się lepiej w detekcji sygnału niż sondy znakowane metodą PCR. Ponadto liczba kopii sekwencji docelowej jest czynnikiem, który może wpływać na skuteczność WFISH. W przypadku niepowodzenia znakowania sugeruje się zastosowanie metody znakowania PCR na dłuższym fragmencie lub zaprojektowanie kilku oligo specyficznych dla regionu docelowego.

Obecne metody, oparte na zastosowaniu roztworu penetrującego (1% Triton/0,1 M HCl w 1x PBST), zapewniają dobry poziom permeabilizacji jąder w jądrach oraz penetracji sond, co skutkuje pomyślną reakcją hybrydyzacji. Sondy oligonukleotydowe specyficzne dla sekwencji powtarzalnych chromosomów płci mogą być projektowane w oparciu o obszerną charakterystykę elementów powtarzalnych przeprowadzoną przez Halla i wsp.20. Dodatkowo, sekwencje konsensus specyficzne dla elementów powtarzalnych sprzężonych z chromosomem X lub Y można uzyskać za pomocą platformy bioinformatycznej, takiej jak potok RedKmer30. Należy zauważyć, że sondy chromosomów płci mogą być skierowane przeciwko elementom powtarzalnym, takim jak satelity i retrotranspozony, i mogą wykazywać różny poziom hybrydyzacji z chromosomami X lub Y w zależności od badanego gatunku20,31,32. Jak pokazano na Rysunku 3, dobry poziom hybrydyzacji sond oraz niskie tło umożliwiły wizualizację docelowych chromosomów w trakcie całej spermatogenezy. Sparowanie znakowanych chromosomów płci można było zaobserwować w etapach przedmeiotycznych i meiotycznych. Następnie wykryto chromosomy X lub Y w jądrach komórek haploidalnych powstałych w wyniku podziałów meiotycznych. W konsekwencji można było śledzić spermatydy niosące chromosom X lub Y w trakcie spermiogenezy, charakteryzującej się różnymi stopniami kondensacji DNA, aż do końcowego etapu dojrzałych plemników o kształcie strzałki. W obecnym układzie eksperymentalnym wykorzystano serie obrazów konfokalnych (Z-stacks) w celu uzyskania informacji na temat trójwymiarowej organizacji przestrzennej komórek podczas tego procesu (Wideo 1).

figure-results-1
Rysunek 1: Jądra wypreparowane z poczwarek i 1-dniowych dorosłych samców Anopheles gambiae. (A) Odcinka odwłoka wypreparowana na późnym etapie poczwarki, pokazująca położenie jąder w pobliżu szóstego segmentu odwłoka. Jądra można zidentyfikować przez kutykulę; widoczne są jako brązowawe struktury po obu stronach odwłoka (oznaczone strzałkami). (B) Jądra wypreparowane na etapie poczwarki, pokazujące dojrzałe jądra (1), vas deferens (2), gruczoły MAG (3) oraz przewód ejakulacyjny (4). (C) Odcinek odwłoka wypreparowany z 1-dniowego dorosłego samca po usunięciu podstawowego segmentu chwytnego. Gruczoły MAG można wycisnąć z odwłoka, stosując delikatny nacisk (biała strzałka). (D) Wewnętrzny aparat rozrodczy samca wypreparowany z 1-dniowego dorosłego samca. Biała strzałka wskazuje miejsce zajmowane przez dojrzałe plemniki, które widoczne są jako biały agregat u bieguna podstawowego jądra. Paski skali: (A,C) 20 µm; (B,D) 10 µm. Cyfry rzymskie od I do VIII oznaczają segmenty odwłoka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przedstawienie spermatogenezy u Anopheles gambiae. Obraz po lewej stronie przedstawia jądro późnej poczwarki An. gambiae po barwieniu DAPI całego preparatu. Po prawej znajduje się wersja schematyczna dla lepszej wizualizacji. Obserwując kształt jądra i stopień kondensacji, stosunkowo łatwo jest śledzić wszystkie etapy spermatogenezy – od komórek diploidalnych do haploidalnych plemników. Nisza komórek macierzystych znajduje się w górnym biegunie narządu, gdzie rozpoczyna się różnicowanie w spermatogonia. Liczba komórek spermatogonialnych zwiększa się po podziale mitotycznym (komórki zielone), a spermatocysty zwiększają swój rozmiar (komórki żółte). Komórki spermatogonialne różnicują się w spermatocyty po wielu rundach podziałów mitotycznych (komórki niebieskie). Spermatocyty, charakteryzujące się stosunkowo większymi jądrami niż komórki na innych etapach procesu, są komórkami, które przejdą podział meiotyczny. Komórki przechodzące mejozę można wykryć, obserwując obecność chromosomów w różnych etapach mejozy; chiasmata i chromosomy w metafazie są widoczne nawet przy niskim powiększeniu. Etapy przedmeiotyczne są nadreprezentowane w jądrach wyizolowanych na wczesnym etapie poczwarki. Po pierwszym i drugim podziale meiotycznym powstają spermatydy, które zazwyczaj znajdują się w środkowej części jądra. Jądra spermatyd wykazują pewien stopień zmienności kształtu, od okrągłego do strzałkowatego. Spermatydy wchodzą w proces spermiogenezy, podczas którego jądra zaczynają się kondensować, a ich struktura zmienia się w strzałkowate kropki. Gdy komary osiągają dojrzałość płciową po wyjściu z poczwarki, spermatocysty zawierające dojrzałe plemniki mogą zajmować większość objętości jądra kosztem spermatocyst na innym etapie rozwoju. Pasek skali: 20 µm. Gwiazdka (*) oznacza część apicalną jądra. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: WFISH w jądrze An. gambiae wypreparowanym z późnego stadium poczwarki. WFISH przeprowadzono przy użyciu sond specyficznych dla chromosomów X (Contig_240) i Y (sonda oligonukleotydowa specyficzna dla AgY53B). (A) WFISH pozwala na śledzenie zachowania chromosomów płci podczas spermatogenezy, od komórek diploidalnych po haploidalne plemniki. Na tym obrazie można dostrzec gwałtowne zmiany, jakim podlegają jądra podczas spermatogenezy. Oznakowanie chromosomów płci umożliwia rozróżnienie między komórkami diploidalnymi a haploidalnymi. W komórkach diploidalnych sygnał z chromosomów płci jest powiązany z tymi samymi jądrami. W komórkach haploidalnych (spermatydach i plemnikach) sygnały chromosomów płci są rozdzielone w wyniku meiotycznej redukcji. (B,C) Obraz jądra przedstawionego na (A) przy większym powiększeniu (63x). Zostały one wykonane w różnych pozycjach wzdłuż osi Z. Białe przerywane ramki wskazują obszar akwizycji. (B) Stadium przejściowe między spermatocytami a spermatydami, pokazujące powstawanie komórek haploidalnych i rozdzielenie sygnałów chromosomów płci do osobnych jąder. (C) Stadium przejściowe między haploidalnymi spermatydami a dojrzałymi plemnikami. Etap ten pokazuje zmiany w stopniu kondensacji jądra; dojrzałe plemniki wykazują bardziej skondensowany i wydłużony kształt niż spermatydy. Paski skali: (A), 30 µm; (B,C), 10 µm; Szary: DAPI. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Sekwencja docelowaSekwencja starterów i konsensus sond oligonukleotydowychBibliografia
Kontig_240 (X)5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC
AAAATCTACGTCTAGC-3’-[Fluorochrom]		19
AgY53B (Y)5’AGAATAGAATCAGAATAGTCGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrom]		Niniejsze badanie
AgY477-
AgY53B
złącze
region (Y)		5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGAT
GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrom]		19
18S rDNA (X)F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC
R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA		19
AgY53B (Y)F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT
R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG		19

Tabela 1: Lista sond oligonukleotydowych specyficznych dla chromosomu X lub Y u An. gambiae.

Wideo 1: Stos 3D z WFISH wykonany na jądru An. gambiae wypreparowanym z późnego stadium poczwarki. Aby uzyskać trójwymiarową reprezentację procesu spermatogenezy, można wykonać stos 3D za pomocą mikroskopu konfokalnego na jądrach wykazujących niewielką liczbę zmian strukturalnych. W niniejszym badaniu stosy wykonano z interwałem 1,25 µm między dwiema sekcjami optycznymi przy użyciu obiektywu olejowego 63x lub 40x, aby nie utracić informacji o przestrzennej organizacji 3D komórek. Szary: DAPI, żółty: Contig_240 (X), magenta: AgY53B (Y). Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Dyskusja

Zazwyczaj protokoły FISH wymagają zgniecenia narządu będącego przedmiotem zainteresowania, aby umożliwić barwienie chromosomów. Powoduje to utratę informacji dotyczących przestrzennego rozmieszczenia komórek w tym narządzie33. Protokół ten opisuje, w jaki sposób procesy biologiczne, takie jak spermatogeneza, mogą być badane in situ przy zachowaniu nienaruszonej natywnej struktury jądra i jego wewnętrznej organizacji cytologicznej. Sondy ukierunkowane na różne powtarzalne elementy DNA, które są szczególnie wzbogacone w chromosomy płci20, mogą być jednocześnie wykorzystywane do ujawnienia dynamiki dojrzewania plemników. W zależności od czasu wycięcia jądra, WFISH oferuje możliwość zbadania różnych etapów spermatogenezy poprzez rozwój komara. WFISH jest przydatny do badania określonych zjawisk, takich jak niezgodność hybryd, która u komarów Anopheles jest spowodowana obecnością defektów mejotycznych, takich jak niewydolność premejotyczna i brak dysjunkcji chromosomów płciowych 19,34,35. Oprócz aspektu biologicznego, spermatogeneza jest celem wielu strategii genetycznych opracowanych w celu zwalczania owadów szkodników, takich jak komary Anopheles. W tym kontekście, locus rDNA sprzężony z chromosomem X An. gambiae został wykorzystany jako cel do opracowania syntetycznego zniekształcacza proporcji płci, który, uszkadzając plemniki zawierające X, skłania potomstwo w stronę samców 4,8,13.

Technologia ta odzwierciedla działanie naturalnych popędów mejotycznych w stosunku płci, które zostały zidentyfikowane u kilku taksonów, w tym komarów, ale które nadal pozostają słabo poznane 28,36,37,38,39,40,41. WFISH daje możliwość zbadania tego zjawiska i toruje drogę do udoskonalenia lub ulepszenia strategii genetycznych opartych na zniekształceniach płciowych, na przykład poprzez dostarczenie informacji na temat tego, w jaki sposób na cytologię produkcji plemników wpływa wybór miejsc docelowych wykorzystywanych do rozdrabniania chromosomów płciowych. Chociaż z naszego doświadczenia wynika, że WFISH ma duże szanse na sukces, porażka nadal może się zdarzyć. Może to być spowodowane nieefektywnym poziomem przepuszczalności tkanek, który można przezwyciężyć poprzez wydłużenie czasu inkubacji roztworu penetrującego. Alternatywnie, proteinaza K może być stosowana na etapie przepuszczalności. W niektórych przypadkach zauważyliśmy niejednorodny poziom penetracji sondy, z wyższym sygnałem w jądrach spermatocytów i niższym sygnałem lub jego brakiem na etapie mejozy i spermiogenezy. Może to być spowodowane różnicą w poziomie przepuszczalności w zależności od stadium komórki. Ponadto projekt WFISH okazał się przydatny przy użyciu sond fluorescencyjnych zaprojektowanych do celowania w sekwencje DNA obecne w dużej liczbie kopii. W przypadku celowania w geny z pojedynczą kopią, wykrywanie sygnału może być niewystarczające. W takim przypadku należy zintegrować metody wzmacniania sygnału, takie jak wzmocnienie sygnału tyramidu (TSA)42.

Protokół ten można połączyć z barwieniem immunologicznym lub z transgenicznymi szczepami reporterowymi zawierającymi markery fluorescencyjne specyficzne dla linii zarodkowej16,18, ponieważ dodałoby to informacji o lokalizacji białka i ekspresji genów in situ. W niniejszej pracy WFISH jest opisany jako technika badania spermatogenezy u komarów Anopheles; Jednak biorąc pod uwagę wspólną anatomię męskich narządów rozrodczych, protokół ten można zastosować do innych gatunków komarów, które odgrywają rolę w przenoszeniu chorób. Podobnie, żeńska gametogeneza może być badana przy użyciu tej techniki. Ponadto można przeprowadzić badania cytologiczne w narządach lub tkankach będących przedmiotem zainteresowania, takich jak jelito środkowe komara, które jest celem inwazji pasożytów, lub nietypowe tła genetyczne, takie jak te u komarów hybrydowych43. Co więcej, technika ta może być potencjalnie przeniesiona na inne organizmy z rzędu muchówek.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem z Fundacji Billa i Melindy Gatesów oraz Open Philanthropy. Dziękujemy Facility for Imaging by Light Microscopy (FILM) w Imperial College London za analizę mikroskopową. Rysunek 2 został utworzony za pomocą Biorender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nukleotydy fluorescencyjne Amersham CyDye, Cy3-dUTPCytivaPA53022
Nukleotydy fluorescencyjne Amersham CyDye, Cy5-dUTPCytivaPA55022
ART Końcówki do pipet z filtrem szerokootworowymThermoFisher Scientific2079GPK
CytoBond Zdejmowany uszczelniacz do szkiełek nakrywkowychSciGene2020-00-1
Sól sodowa siarczanu dekstranu z Leuconostoc spp.Sigma-AldrichD8906-5G
DNeasy Krew & Zestawy chusteczek Qiagen69504
Naczynia z zarodkamiVWR70543-30
Etanol, klasa molekularnaSigma-Aldrich51976
FormamidThermoFisher Scientific17899
Polimeraza DNA GoTaq G2PromegaM7841
Kwas solny, 37%Sigma-Aldrich320331
Szkiełka mikroskopowe, SuperFrostVWR 631-0114
- PBS (10x), pH 7,4ThermoFisher Scientific70011044
Pierce 16% Formaldehyd (w/v), bez metanoluThermoFisher Scientific28906
ProLong Gold Antifade Mountant z DAPIThermoFisher ScientificP36941
RNase A/T1 MixThermoFisher ScientificEN0551
Zestaw dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU1330
Roztwór octanu soduThermoFisher ScientificR1181
SP8 odwrócony mikroskop konfokalnyLeica
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379
UltraPure Roztwór DNA plemników łososiaThermoFisher Scientific
UltraPure SSC 20xThermoFisher Scientific15557044
Primer sekwencje
5'-CAATAAATTTCCTTTTTTTAATGATGC
AAAATCTACGTCTCTCTAGC-3'-[Fluorochrome]		Eurofins GenomicsContig_240 (X)
5' AGAAGAATAGAATCAGAAATAGT
CGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3'-[Fluorochrome]		Eurofins GenomicsAgY53B (Y)
5'-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA
T
GAAGAAACCGACTATTC-3'-[Fluorochrome]		Eurofins GenomicsAgY477-
AgY53B
junction
region (Y)
F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC
R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA		Eurofins Genomics18S rDNA (X)
F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT
R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG		Eurofins GenomicsAgY53B (Y)
15632011

Bibliografia

  1. World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2022 (2022).
  2. Bhatt, S., et al. The effect of malaria control on Plasmodium falciparum in Africa between 2000 and 2015. Nature. 526 (7572), 207-211 (2015).
  3. Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
  4. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5 (1), 3977(2014).
  5. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  6. Simoni, A., et al. A male-biased sex-distorter gene drive for the human malaria vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 38 (9), 1054-1060 (2020).
  7. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), E6736-E6743 (2015).
  8. Bernardini, F., Kriezis, A., Galizi, R., Nolan, T., Crisanti, A. Introgression of a synthetic sex ratio distortion system from Anopheles gambiae into Anopheles arabiensis. Scientific Reports. 9 (1), 5158(2019).
  9. Hammond, A. M., Galizi, R. Gene drives to fight malaria: Current state and future directions. Pathogens and Global Health. 111 (8), 412-423 (2017).
  10. Garrood, W. T., et al. Driving down malaria transmission with engineered gene drives. Frontiers in Genetics. 13, 891218(2022).
  11. Hoermann, A., et al. Gene drive mosquitoes can aid malaria elimination by retarding Plasmodium sporogonic development. Science Advances. 8 (38), (2022).
  12. Nash, A., et al. Integral gene drives for population replacement. Biology Open. 8 (1), (2019).
  13. Galizi, R., et al. A CRISPR-Cas9 sex-ratio distortion system for genetic control. Scientific Reports. 6 (1), 31139(2016).
  14. Terradas, G., Hermann, A., James, A. A., McGinnis, W., Bier, E. High-resolution in situ analysis of Cas9 germline transcript distributions in gene-drive Anopheles mosquitoes. G3: Genes, Genomes, Genetics. 12 (1), (2022).
  15. Durant, A. C., Donini, A. Ammonium transporter expression in sperm of the disease vector Aedes aegypti mosquito influences male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (47), 29712-29719 (2020).
  16. Taxiarchi, C., et al. High-resolution transcriptional profiling of Anopheles gambiae spermatogenesis reveals mechanisms of sex chromosome regulation. Scientific Reports. 9 (1), 14841(2019).
  17. Pompon, J., Levashina, E. A. A new role of the mosquito complement-like cascade in male fertility in Anopheles gambiae. PLoS Biology. 13 (9), e1002255(2015).
  18. Papathanos, P. A., Windbichler, N., Menichelli, M., Burt, A., Crisanti, A. The vasa regulatory region mediates germline expression and maternal transmission of proteins in the malaria mosquito Anopheles gambiae: A versatile tool for genetic control strategies. BMC Molecular Biology. 10 (1), 13(2009).
  19. Liang, J., Sharakhov, I. V. Premeiotic and meiotic failures lead to hybrid male sterility in the Anopheles gambiae complex. Proceedings of the Royal Society B. 286 (1906), 20191080(2019).
  20. Hall, A. B., et al. Radical remodeling of the Y chromosome in a recent radiation of malaria mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), E2114-E2123 (2016).
  21. Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes. Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction. , CABI. Wallingford, Oxfordshire. (1992).
  22. Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 218-227 (2014).
  23. Helinski, M. E., Parker, A. G., Knols, B. G. Radiation biology of mosquitoes. Malaria Journal. 8, S6(2009).
  24. Huho, B. J., et al. A reliable morphological method to assess the age of male Anopheles gambiae. Malaria Journal. 5 (1), 62(2006).
  25. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
  26. Li, M., et al. Suppressing mosquito populations with precision guided sterile males. Nature Communications. 12 (1), 5374(2021).
  27. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13677-13681 (2011).
  28. Haghighat-Khah, R. E., et al. Cellular mechanisms regulating synthetic sex ratio distortion in the Anopheles gambiae germline. Pathogens and Global Health. 114 (7), 370-378 (2020).
  29. Yamamoto, D. S., et al. A synthetic male-specific sterilization system using the mammalian pro-apoptotic factor in a malaria vector mosquito. Scientific Reports. 9 (1), 8160(2019).
  30. Papathanos, P. A., Windbichler, N. Redkmer: An assembly-free pipeline for the identification of abundant and specific X-chromosome target sequences for X-shredding by CRISPR endonucleases. The CRISPR Journal. 1 (1), 88-98 (2018).
  31. Sharma, A., Kinney, N. A., Timoshevskiy, V. A., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. Structural variation of the X chromosome heterochromatin in the Anopheles gambiae complex. Genes. 11 (3), 327(2020).
  32. Krzywinski, J., Sangaré, D., Besansky, N. J. Satellite DNA from the Y chromosome of the malaria vector Anopheles gambiae. Genetics. 169 (1), 185-196 (2005).
  33. Timoshevskiy, V. A., Sharma, A., Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. Fluorescent in situ hybridization on mitotic chromosomes of mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (67), e4215(2012).
  34. Liang, J., Hodge, J. M., Sharakhov, I. V. Asymmetric phenotypes of sterile hybrid males from reciprocal crosses between species of the Anopheles gambiae complex. Frontiers in Ecology and Evolution. 9, 660207(2021).
  35. Slotman, M., Torre, A. D., Powell, J. R. The genetics of inviability and male sterility in hybrids between Anopheles gambiae and An. arabiensis. Genetics. 167 (1), 275-287 (2004).
  36. Wood, R. J., Newton, M. E. Sex-ratio distortion caused by meiotic drive in mosquitoes. The American Naturalist. 137 (3), 379-391 (1991).
  37. Cazemajor, M., Joly, D., Montchamp-Moreau, C. Sex-ratio meiotic drive in Drosophila simulans is related to equational nondisjunction of the Y chromosome. Genetics. 154 (1), 229-236 (2000).
  38. Jaenike, J. Sex chromosome meiotic drive. Annual Review of Ecology and Systematics. 32 (1), 25-49 (2001).
  39. Courret, C., Chang, C. H., Wei, K. H., Montchamp-Moreau, C., Larracuente, A. M. Meiotic drive mechanisms: Lessons from Drosophila. Proceedings of the Royal Society B. 286 (1913), 20191430(2019).
  40. Zanders, S. E., Unckless, R. L. Fertility costs of meiotic drivers. Current Biology. 29 (11), R512-R520 (2019).
  41. Newton, M. E., Wood, R. J., Southern, D. I. A cytogenetic analysis of meiotic drive in the mosquito, Aedes aegypti (L.). Genetica. 46 (3), 297-318 (1976).
  42. Carabajal Paladino, L. Z., Nguyen, P., Šíchová, J., Marec, F. Mapping of single-copy genes by TSA-FISH in the codling moth, Cydia pomonella. BMC Genomic Data. 15, S15(2014).
  43. Bernardini, F., et al. Cross-species Y chromosome function between malaria vectors of the Anopheles gambiae species complex. Genetics. 207 (2), 729-740 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

FISH w preparatach ca ych tkanekanaliza spermatogenezynap d genowyzaburzenie proporcji p cizachowanie chromosom wcytologia j derznakowanie sond DNAbufor do hybrydyzacji

Powiązane artykuły