Artykuł metodologiczny

Generowanie podocytów pochodzących od pacjenta z biopsji skóry

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65364

⸱

26 maja 2023

 , 
1Department of Nephrology and Hypertension, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University (FAU) Erlangen-Nürnberg, 2Research Center on Rare Kidney Diseases (RECORD), University Hospital Erlangen

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje dwuetapowy protokół generowania specyficznych dla pacjenta podocytów z fibroblastów skóry poprzez episomalne przeprogramowanie w indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) i późniejsze różnicowanie w podocyty

.

Streszczenie

Podocyty to komórki nabłonkowe znajdujące się w miejscu oddawania moczu kłębuszkowej bariery filtracyjnej, które przyczyniają się do selektywnej funkcji filtrowania kłębuszków nerkowych. Mutacje w genach specyficznych dla podocytów mogą powodować ogniskowe segmentalne stwardnienie kłębuszków nerkowych (FSGS), a podocyty są również dotknięte wieloma innymi nefropatiami pierwotnymi i wtórnymi. Ze względu na ich zróżnicowaną naturę, pierwotne modele hodowli komórkowych są ograniczone dla podocytów. Dlatego zwykle stosuje się komórki warunkowo unieśmiertelnione. Jednak te warunkowo unieśmiertelnione podocyty (ciPodocyty) mają kilka ograniczeń: komórki mogą deróżnicować się w hodowli, zwłaszcza gdy osiągną konfluencję, a kilka markerów specyficznych dla podocytów ulega ekspresji tylko nieznacznie lub wcale. Stawia to pod znakiem zapytania wykorzystanie cypodocytów i ich przydatność do celów fizjologicznych, patofizjologicznych i klinicznych. W tym miejscu opisujemy protokół generowania ludzkich podocytów - w tym podocytów specyficznych dla pacjenta - z biopsji dziurkowania skóry poprzez episomalne przeprogramowanie fibroblastów skóry w hiPSC, a następnie różnicowanie w podocyty. Podocyty te znacznie lepiej przypominają podocyty in vivo pod względem cech morfologicznych, takich jak rozwój wyrostków stopy i ekspresja markera specyficznego dla podocytów. Wreszcie, co ważne, komórki te utrzymują mutacje pacjentów, co skutkuje ulepszonym modelem ex vivo do badania chorób podocytów i potencjalnych substancji terapeutycznych w zindywidualizowanym podejściu.

Wprowadzenie

Podocyty to wyspecjalizowane, pomitotyczne komórki nabłonka nerkowego, które wraz z błoną podstawną kłębuszka (GBM), komórkami śródbłonka kłębuszka i glikokaliksem tworzą barierę filtracyjną kłębuszka nerkowego. Fenotypowo podocyty składają się z ciała komórki i pierwotnych, zależnych od mikrotubul wypustek błonowych, a także wypustek wtórnych nazywanych stopkami1,2. Bariera filtracyjna kłębuszka, która filtruje mocz z krwi, składa się z okienkowanego śródbłonka, GBM oraz wyspecjalizowanego rodzaju połączenia międzykomórkowego łączącego sąsiadujące stopki podocytów, zwanego przeponą szczeliny podocytów3. W warunkach fizjologicznych białka większe od albuminy są zatrzymywane przez barierę filtracyjną ze względu na ich rozmiar i ładunek4.

Wiadomo, że mutacje w genach specyficznych dla cytoszkieletu lub podocytów, a także krążące czynniki wpływające na szlaki sygnalizacyjne podocytów, indukują zatarcia, odrywanie się lub apoptozę podocytów, co prowadzi do białkomoczu i stwardnienia kłębuszków. W szczególności kluczowe znaczenie mają reorganizacja cytoszkieletu, zmiany polarności podocytów lub uszkodzenie wypustek stopowych z towarzyszącą utratą szczelin błonowych5. Ze względu na swój stan terminalnego zróżnicowania, podocyty niemal nie podlegają zastępowaniu po oddzieleniu od GBM. Jednakże, jeśli podocyty pozostają przytwierdzone do GBM, mogą one nadal dojść do regeneracji po zatarciu i odtworzyć zazębiające się wypustki stopowe6,7,8. Dalsze zrozumienie zdarzeń prowadzących do uszkodzenia podocytów w różnych schorzeniach kłębuszkowych może dostarczyć nowych celów terapeutycznych, które pomogą w opracowaniu metod leczenia tych chorób. Uszkodzenie podocytów jest cechą charakterystyczną różnych chorób kłębuszkowych, w tym ogniskowego kłębuszkowego stwardnienia segmentowego (FSGS), nefropatii cukrzycowej, choroby zmian minimalnych oraz błoniastego zapalenia kłębuszków nerek, co wymaga wiarygodnych modeli podocytów ex vivo do badania mechanizmów patologicznych i potencjalnych podejść terapeutycznych w tych schorzeniach9,10. Podocyty można badać ex vivo za pomocą klasycznej pierwotnej hodowli komórkowej opartej na izolacji kłębuszków poprzez przesiewanie różnicowe11. Jednak ze względu na stan terminalnego zróżnicowania i ograniczoną zdolność do proliferacji, większość badaczy stosuje linie komórkowe ciPodocyte mysie lub ludzkie, które wykazują ekspresję wariantów antygenu T SV40 wrażliwych na temperaturę. Alternatywnie, ciPodocyty izoluje się z myszy transgenicznych posiadających unieśmiertniający gen SV40 Tag1,12.

ciPodocyty proliferują w temperaturze 33 °C, ale w temperaturze 37 °C wchodzą w stan zatrzymania wzrostu i zaczynają się różnicować13,14. Należy pamiętać, że dane eksperymentalne uzyskane z tych komórek powinny być interpretowane z pewną ostrożnością, ponieważ komórki te są generowane przy użyciu nienaturalnej insercji genu15. Ze względu na to, że komórki te zawierają gen immortalizujący, fizjologia komórkowa jest zmieniona wskutek trwającej proliferacji12. Linie komórkowe podocytów generowane tą metodą zostały niedawno zakwestionowane, ponieważ ciPodocyty myszy, ludzi i szczurów wykazują ekspresję synaptopodyny i nefryny na poziomie białka oraz NPHS1 i NPHS2 na poziomie mRNA w stopniu mniejszym niż 5% w porównaniu z ekspresją kłębuszkową16. Co więcej, większość linii komórkowych podocytów nie wykazuje ekspresji nefryny17,18. Chittiprol i wsp. opisali również znaczną różnicę w mobilności komórek oraz w reakcjach na puromycynę i doksorubicynę w przypadku ciPodocytów16. Podocyty można znaleźć w moczu po ich odłączeniu od GBM w różnych chorobach kłębuszkowych19,20,21,22. Żywe podocyty moczowe można hodować ex vivo przez okres do 2-3 tygodni, jednak większość komórek ulega apoptozie23,24. Co ciekawe, podocyty stwierdza się nie tylko w moczu pacjentów z chorobami kłębuszkowymi, ale także w moczu zdrowych osób, najprawdopodobniej w stanie starzenia się, z ograniczonym potencjałem replikacyjnym w hodowli24. Ponadto liczba podocytów pochodzących z moczu jest ograniczona, a komórki te w hodowli ulegają dedyferencjacji, wykazują mniej wypustek stopkowych, zmieniają morfologię i, co najważniejsze, mają ograniczoną zdolność do proliferacji. Ekspresja genów specyficznych dla podocytów jest nieobecna, zanika w ciągu kilku tygodni lub różni się pomiędzy tymi klonami komórkowymi. Niektóre komórki wykazujące pozytywny wynik dla markera specyficznego dla podocytów współwyrażały marker komórek nabłonkowych kanalików lub myofibroblastów i komórek kłębuszkowych, co sugeruje dedyferencję i/lub transdyferencję hodowlanych podocytów moczowych24,25.

Niedawno opisano generowanie linii komórkowych ciPodocyte pochodzących z moczu pacjentów i zdrowych ochotników poprzez transdukcję termoczułym dużym antygenem T SV40 oraz hTERT26. Wykazano ekspresję mRNA dla synaptopodyny, nestyny i białka CD2-associated, jednak w żadnym z klonów nie stwierdzono obecności mRNA podocyny. Oprócz problemów związanych z podocytami moczowymi, komórki te zawierają również wprowadzony gen unieśmiertniający, co wiąże się z omówionymi powyżej wadami.

W przeciwieństwie do nich, ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs) wykazują ogromną zdolność do samoodnawiania i różnicowania się w wiele typów komórek w odpowiednich warunkach. Wykazano wcześniej, że hiPSCs mogą służyć jako niemal nieograniczone źródło podocytów27,28.

W niniejszym materiale opisano dwuetapowy protokół generowania specyficznych dla pacjenta podocytów z fibroblastów skórnych pobranych z biopsji wycinanej skóry, z późniejszym przeprogramowaniem episomalnym do hiPSC oraz końcową różnicowaniem w podocyty pochodzące z hiPSC (Rysunek 1).

Proces terapii genowej podocytów, schemat reprogramowania hiPSC, przesiewanie leków, spersonalizowane leczenie.
Rysunek 1: Protokół generowania specyficznych dla pacjenta podocytów pochodzących z hiPSC. Graficzny przegląd protokołu generowania specyficznych dla pacjenta podocytów z fibroblastów skórnych pobranych z biopsji skóry poprzez reprogramowanie do hiPSC i różnicowanie w podocyty. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W pierwszym kroku somatyczne fibroblasty skóry właściwej wyhodowano z biopsji wycięciowej skóry, a następnie przeprogramowano do hiPSC za pomocą metody bezintegracyjnej poprzez elektroporację plazmidami wykazującymi ekspresję czynników transkrypcyjnych OCT3/4, KLF4, SOX2 i c-MYC29,30,31. Powstałe kolonie hiPSC zostały następnie wyselekcjonowane i namnożone. Różnicowanie rozpoczęto od indukcji linii mezodermalnej poprzez aktywację szlaku sygnalizacyjnego WNT, a następnie wygenerowano komórki progenitorowe nefronów, które nadal posiadały zdolność do proliferacji. W końcowym etapie komórki zróżnicowano do podocytów. W tej procedurze zmodyfikowano i połączono wcześniej opublikowane protokoły przeprogramowania episomalnego w celu generowania hiPSC opracowane przez Bang i współpracowników32 oraz Okitę i współpracowników33, a także protokół różnicowania hiPSC do podocytów opracowany przez Musaha i współpracowników28,34,35.

Rzeczywiście, podocyty uzyskane zgodnie z naszym protokołem wykazywały fenotyp bliższy podocytom in vivo, pod względem rozwoju wyraźnej sieci pierwotnych i wtórnych wypustek stóp oraz ekspresji markerów specyficznych dla podocytów, takich jak synaptopodyna, podocyna i nefryna. Dzięki zastosowaniu podocytów pochodzących z hiPSC, tło genetyczne pacjenta zostaje zachowane podczas reprogramowania i różnicowania. Umożliwia to specyficzne dla pacjenta modelowanie chorób podocytów oraz odkrywanie potencjalnych substancji terapeutycznych ex vivo przy niemal nieograniczonej liczbie komórek. Co więcej, protokół ten jest małoinwazyjny, efektywny kosztowo, akceptowalny etycznie i może otwierać nowe możliwości w opracowywaniu leków.

Protokół

Protokół został zatwierdzony przez komisję etyki Uniwersytetu Friedricha-Alexandra w Erlangen-Norymberdze (251_18B), a wszyscy pacjenci i probanci wyrazili pisemną zgodę. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Skład wszystkich użytych pożywek i roztworów znajduje się w tabeli 1.

1. Wyrostek fibroblastów skóry z biopsji stempla skóry

  1. Przenieś biopsję stempla skóry do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 10 ml podgrzanego podłoża fibroblastowego.
  2. Usuń pożywkę i umyj biopsję stempla skóry trzykrotnie 5 ml sterylnego, wstępnie podgrzanego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przenieś biopsję stempla skóry za pomocą sterylnych kleszczy na 10-centymetrową płytkę do hodowli komórek i przetnij ją wzdłuż na trzy lub cztery części sterylnym skalpelem, pozostawiając naskórek i skórę właściwą.
  3. Przenieś każdy kawałek do sterylnego plastikowego naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm i delikatnie dociśnij je do naczynia do hodowli. Usuń nadmiar pożywki wokół kawałków biopsji. Pozostaw do wyschnięcia na 5-10 minut, aż płyn odparuje, a biopsja zostanie przymocowana do plastikowej hodowli komórkowej.
  4. Dodać kroplami 1 ml pożywki fibroblastowej za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl wokół biopsji i ostrożnie napełnić do końcowej objętości 3 ml. Uprawiać w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 7 dni bez karmienia i przesuwania naczynia. Ostrożnie zmień pożywkę na świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę fibroblastową. Po 7 dniach wyrosłe, wrzecionowate fibroblasty można monitorować wokół biopsji skóry za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym36.
    UWAGA: Gdy wyrośnięte fibroblasty dotrą do krawędzi naczynia, przejdź ponownie od kroku 1.3, aby wygenerować kolejną partię fibroblastów.
  5. W celu ekspansji wyrosłych fibroblastów przemyć 2 ml wstępnie podgrzanego 1x PBS, dysocjować fibroblasty 1 ml 1x kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Przenieś oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i umyj naczynie do hodowli komórkowych 2 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej.
  6. Zebrać pożywkę płuczącą w probówce w celu zneutralizowania środka dysocjacyjnego i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej. Policzyć komórki za pomocą komory Neubauera lub automatycznego licznika komórek przy użyciu błękitu trypanowego i nasion 2,5 x 103 do 5 x 103 fibroblastów nacm2 w kolbach do hodowli świeżych komórek.
  7. Umieścić kolby z powrotem w inkubatorze i równomiernie rozprowadzić komórki, przesuwając kolby trzy razy w każdym kierunku. Następnego dnia zastąp pożywkę świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką fibroblastową. Zmieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu i dziel, gdy fibroblasty osiągną około 80% zbieżności.

2. Zamrażanie fibroblastów skórnych

  1. Aby zamrozić fibroblasty, umyj je 5 ml podgrzanego 1x PBS. Odessać PBS i odciąć fibroblasty za pomocą 4 ml 1x trypsyny-EDTA. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze i inkubować przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 . Monitorować odklejanie za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym i postukać w bok kolby, aby odłączyć komórki.
  2. Przenieść oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyć kolbę do hodowli komórkowych 5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki z fibroblastów. Zebrać medium myjące w stożkowej probówce i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
  3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 2 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej. Policz komórki i przenieś 1 x 106 komórek do nowej stożkowej probówki. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
  4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml zimnego pożywki do zamrażania fibroblastów składającej się z 90% płodowej surowicy cielęcej i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Przenieść do kriowialu, umieścić w pojemniku do zamrażania i zamrażać przez noc w temperaturze -80 °C. W celu długotrwałego przechowywania następnego dnia umieść kriowial w zbiorniku z ciekłym azotem.

3. Episomalne przeprogramowanie fibroblastów w celu generowania hiPSC

  1. Do przeprogramowania episomalnego użyj fibroblastów 1,5 x 106 od przejścia 4 do 8. Aby osiągnąć tę liczbę komórek, użyj dwóch do trzech kolb o pojemności 250 ml z około 70% konfluencją.
  2. Dzień przed przeprogramowaniem podziel fibroblasty w stosunku 1:2, aby zapewnić ich stan proliferacyjny. W związku z tym należy zassać pożywkę i umyć kolby 5 ml wstępnie podgrzanego 1x PBS na kolbę. Odessać PBS i odciąć fibroblasty za pomocą 4 ml 1x trypsyny-EDTA. Umieścić kolby z powrotem w inkubatorze i inkubować przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Monitorować oderwanie za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym i postukać w bok kolby, aby oderwać komórki od powierzchni tworzywa sztucznego.
  3. Przenieść oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i umyć kolby do hodowli komórkowych 5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki z fibroblastów. Zebrać pożywkę płuczącą w stożkowej probówce i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 6 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej.
  4. Przygotować sześć nowych kolb do hodowli komórkowych, dodając 5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej do kolby. Dodać 1 ml zawiesiny komórek fibroblastów do każdej kolby. Umieścić kolby z powrotem w inkubatorze i równomiernie rozprowadzić komórki, przesuwając kolby trzy razy w każdym kierunku.
  5. W celu przeprogramowania episomalnego należy pokryć dwie 10-centymetrowe płytki do hodowli komórkowej odpowiednie do hodowli hiPSC 4 ml roztworu do powlekania na zimno na płytkę. Inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Do hodowli hiPSC wymagane są różne tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych i dodatkowa powłoka macierzy zewnątrzkomórkowej (patrz Tabela materiałów).
  6. Usunąć pożywkę z fibroblastów i przemyć 10 ml wstępnie podgrzanego 1x PBS na kolbę. Odessać PBS i odciąć fibroblasty za pomocą 4 ml 1x trypsyny-EDTA na kolbę, inkubując przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C. Monitorować oderwanie za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym i, jeśli to konieczne, postukać w bok kolby, aby oderwać komórki od powierzchni tworzywa sztucznego.
  7. Przenieść oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Umyć puste kolby 6 ml wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej, aby zebrać pozostałe komórki i zebrać je w stożkowej probówce. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml świeżego, wstępnie podgrzanego 1x PBS.
  8. Policz komórki i przenieś 1,5 x 106 fibroblastów w nowej stożkowej probówce. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki do elektroporacji i ponownie odwirować. W międzyczasie odessać roztwór powlekający z powlekanych 10 cm płytek do hodowli komórkowych i dodać 7 ml wstępnie podgrzanego podłoża fibroblastowego.
  9. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad ogniw w podłożu do galwanizacji o stężeniu 1,5 x 106 komórek w 250 μl. Przenieść zawiesinę ogniw o objętości 250 μl do kuwety do elektroporacji z odstępem 4 mm (patrz tabela materiałów).
  10. Przygotować mieszaninę do transfekcji plazmidu, dodając 4 μg każdego plazmidu (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) do całkowitej objętości 50 μl pożywki do elektroporacji. Przełóż do kuwety i wymieszaj, delikatnie przesuwając. Elektroporacja jednym impulsem pod napięciem 280 V.
  11. Za pomocą sterylnych nożyczek odciąć końcówkę pipety i przenieść 125 μl elektroporowanych fibroblastów na każdą z przygotowanych 10 cm płytek do hodowli komórkowych. Rozprowadź komórki, mieszając płytki trzy razy we wszystkich kierunkach i umieść je z powrotem w inkubatorze. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 bez zakłóceń.
  12. Aby usunąć martwe komórki, następnego dnia zastąp pożywkę 7 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej. Zmień pożywkę na pożywkę hodowlaną hiPSC 2 dni po elektroporacji i wymieniaj ją co drugi dzień przez następne 20 dni.

4. Wybór, rozbudowa i kontrola jakości generowanych hiPSC

  1. Monitoruj komórki codziennie przez co najmniej 20 dni za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym z obiektywem 10x lub 20x, aby obserwować tworzenie się kolonii hiPSC po elektroporacji. Jeśli kolonie hiPSC mają średnicę około 300 μm z wyraźnymi granicami, a hiPSC wykazują wysoki stosunek jąder do ciał, kolonie hiPSC są gotowe do selekcji poprzez wybór (Rysunek 2B,C i Rysunek 3).
  2. Przed zbiorem pokryć 96-dołkową płytkę odpowiednią do hodowli hiPSC 100 μl roztworu powlekającego na dołek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Podczas inkubacji należy oznaczyć interesujące kolonie na dnie naczynia do hodowli komórkowych za pomocą długopisu. W celu ostatecznego przygotowania płytki 96-dołkowej należy usunąć roztwór powlekający i dodać 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej hiPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK Y27632 do każdej studzienki.
  3. Umyj komórki wstępnie podgrzanym 1x PBS i dodaj świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę hodowlaną hiPSC zawierającą 10 μM inhibitor ROCK Y27632 przed pobraniem w celu usunięcia martwych komórek. Aby wybrać kolonie hiPSC, użyj igły pomiarowej i podziel kolonie hiPSC na małe kawałki, rysując siatkę do każdej kolonii.
  4. Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym sprawdź, czy kolonie zostały pomyślnie podzielone na części. Przenieś je pipetą o pojemności 100 μl na przygotowaną płytkę 96-dołkową. Trzymaj pipetę pionowo nad kolonią, nie dotykając komórek, aby uniknąć zarysowania i utraty kolonii.
  5. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i pozostawić komórki na noc bez zakłóceń. Przechowuj naczynia z mieszanką fibroblastów i hiPSC, na wypadek, gdyby zbiór się nie powiódł. W związku z tym należy usunąć inhibitor ROCK Y27632, zmieniając pożywkę na pożywkę hodowlaną hiPSC i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze.
  6. Następnego dnia zmień pożywkę z 96-dołkowej płytki na 200 μl świeżej pożywki hodowlanej hiPSC i zmieniaj ją co drugi dzień. Następnego dnia monitoruj 96-dołkową płytkę i oznacz studzienki pomyślnie wybranymi klonami.
    UWAGA: Jeśli wybrane klony hiPSC nie są w pełni wybrane po pierwszej próbie, a fibroblasty można znaleźć w studzience, powtórz pobieranie z 96-dołka lub zeskrob fibroblasty z płytki.

5. Rozszerzenie wybranych klonów hiPSC

  1. Monitoruj klony hiPSC za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Jeśli wybrane hiPSC osiągną około 70% konfluencji, klony hiPSC są gotowe do ekspansji.
  2. Pokryć 48-dołkową płytkę odpowiednią do hodowli hiPSC 250 μl roztworu powlekającego na studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zastąp roztwór powlekający 200 μl świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej hiPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK Y27632.
  3. Aby odłączyć hiPSC od płytki 96-dołkowej, zeskrob plastikową powierzchnię końcówką do pipety o pojemności 1 000 μl. Przenieść odłączone hiPSC z płytki 96-dołkowej do płytki 48-dołkowej. Następnego dnia zmień pożywkę na świeżą, wstępnie ogrzaną pożywkę hodowlaną hiPSC, aby usunąć martwe komórki i inhibitor ROCK Y27632.
  4. Jeśli klony hiPSC osiągną około 70% konfluencji, przenieś hiPSC do płytki 24-dołkowej. W związku z tym pokryć 24-dołkową płytkę odpowiednią do hodowli hiPSC 400 μl roztworu powlekającego na dołek przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zastąp roztwór powlekający 400 μl świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej hiPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK Y27632. Odessać pożywkę z 48 dołków i przemyć 500 μl podgrzanego 1x PBS.
  5. Zastąpić PBS 100 μl enzymatycznego roztworu do oddzielania komórek zawierającego 10 μM inhibitor ROCK Y27632 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 minuty. Wypłukać hiPSC z płytki za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl. Przenieś zdysocjowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyć pustą 48-dołkową płytkę pożywką hodowlaną hiPSC zawierającą 10 μM inhibitor ROCK Y27632 i umieścić ją w stożkowej probówce.
  6. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić hiPSC w 1 ml pożywki hodowlanej hiPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK Y27632 i przenieść na płytkę 24-dołkową. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i rozprowadzić komórki, mieszając płytkę trzy razy we wszystkich kierunkach. Pozwól komórkom przyczepić się przez noc bez zakłóceń.
  7. Następnego dnia zmień pożywkę na pożywkę hodowlaną hiPSC bez inhibitora ROCK Y27632.
    UWAGA: Jeśli klony hiPSC osiągną około 70% konfluencji, przenieś hiPSC na płytkę 12-dołkową, powtarzając kroki od 5,4 do 5,7 ze zwiększonymi objętościami odpowiednimi dla formatu 12-dołkowego. Jeśli hiPSC z płytki 12-dołkowej osiągną około 70% konfluencji, przenieś klony hiPSC na płytkę 6-dołkową o zwiększonej objętości dla formatu 6-dołkowego.

6. Zamrażanie wybranych klonów hiPSC

  1. Aby zamrozić wybrane klony hiPSC, należy odessać pożywkę z płytki 6-dołkowej. Umyj studzienki 2 ml 1x PBS. Odessać i odciąć hiPSC za pomocą 1 ml enzymatycznego roztworu do odrywania komórek zawierającego 10 μM Y27632. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i inkubować przez 4 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Wypłukać hiPSC z płytki za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyć płytkę 2 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej hiPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK Y27632. Umieścić w stożkowej probówce i wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 2 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej hiPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK Y27632.
  3. Policz komórki i przenieś 1 x 106 komórek do nowej stożkowej probówki. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Odessać supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnej, pozbawionej surowicy pożywki do zamrażania hiPSC i zamrozić w kriowiale przy użyciu pojemnika do zamrażania przez noc w temperaturze -80 °C. W celu długotrwałego przechowywania następnego dnia umieść kriowial w zbiorniku z ciekłym azotem.

7. Kontrola jakości HiPSC

  1. Charakterystyka morfologii hiPSC
    1. Sprawdź charakterystyczną morfologię hiPSC za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym z obiektywem 20x. Po przeprogramowaniu morfologia komórki zmienia się z długich, wrzecionowatych fibroblastów na małe, okrągłe hiPSC, wykazujące wysoki stosunek jąder do ciał rosnących w koloniach o wyraźnych granicach (Rysunek 2C).
    2. Jeśli kolonie hiPSC stają się zbyt gęste i dochodzi do spontanicznego różnicowania, zeskrob zróżnicowane części z płytki za pomocą końcówki pipety (Rysunek 3). Ponieważ hiPSC mają wysoki współczynnik proliferacji, kultury hiPSC należy codziennie karmić świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką hiPSC.
  2. Charakterystyka markerów pluripotencji metodą barwienia immunofluorescencyjnego
    1. Aby sprawdzić wygenerowane hiPSC pod kątem markera pluripotencji za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, należy umieścić plastikowe szkiełka nakrywkowe na 24-dołkowej płytce i pokryć 250 μl roztworu powlekającego przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zastąp roztwór powlekający 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej hiPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK Y27632.
    2. Seed 1,9 x 104 zdysocjowane hiPSC na 24 dołki. Pozwól, aby hiPSC przyczepiły się na noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 bez zakłóceń. Patrz kroki od 5.4 do 5.6, aby zapoznać się z dysocjacją hiPSC. Następnego dnia zastąp pożywkę pożywką hodowlaną hiPSC bez inhibitora ROCK Y27632.
    3. W celu barwienia umyj komórki 1 ml wstępnie podgrzanego 1x PBS, a następnie utrwal hiPSC za pomocą 4% paraformaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć utrwalone hiPSC 1x PBS i zablokować niespecyficzne miejsca wiązania 200 μl roztworu preinkubacyjnego na studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) w rozcieńczalniku przeciwciał.
    4. Oczyść folię plastikową z 70% etanolem i umieść ją w komorze barwienia wypełnionej zbiornikiem na wodę. Umieścić kropelki 30 μl rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych na folii. Umieścić utrwalone próbki do góry nogami w rozcieńczeniu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    5. Następnego dnia przemyć próbki trzykrotnie 1x PBS przez 5 minut i umieścić 30 μl kropelek rozcieńczonych przeciwciał wtórnych (1:1 000) w czystych miejscach na folii. Umieść szkiełka pokrywy do góry nogami w rozcieńczeniu. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
    6. Po inkubacji przemyć trzykrotnie 1x PBS przez 5 minut. Próbki zamontować na szkiełkach podstawowych w podłożu montażowym zawierającym DAPI. Pozostawić do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej i w ciemności, a następnie zobrazować próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego (Rysunek 4).
  3. Wykluczenie skażenia bakteriami i mykoplazmą
    1. Aby wykluczyć zanieczyszczenie bakteryjne, przenieś 500 μl zdysocjowanych hiPSC do 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki Luria-Bertani (LB). Patrz kroki od 5.4 do 5.6, aby zapoznać się z dysocjacją hiPSC. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Jeśli podłoże LB wydaje się mętne, prawdopodobnie doszło do skażenia bakteryjnego. Wyrzuć komórki.
    2. Aby wykluczyć zanieczyszczenie mykoplazmą, należy pobrać pożywkę, która nie była wymieniana przez 2 dni z 6 studzienek z około 90% zbiegających się hiPSC. Użyj ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) do wykrycia zanieczyszczenia mykoplazmą. W tym celu dostępnych jest wiele komercyjnych zestawów do wykrywania mykoplazmy.

8. Różnicowanie hiPSC na podocyty

  1. Przygotowanie i przechowywanie czynników wzrostu
    1. Aby przygotować stężenie podstawowe 10 mM Y27632, rozpuść 10 mg Y27632 (masa cząsteczkowa 320,26 g/mol) w 3,12 ml sterylnej wody. Przechowywać 100 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C i rozcieńczyć w stosunku 1:1 000 w pożywce do hodowli komórkowych do osiągnięcia końcowego stężenia 10 μM.
    2. Aby przygotować stężenie podstawowe 30 mM CHIR99021, należy rozpuścić 5 mg CHIR99021 (masa cząsteczkowa 465,34 g/mol) w 358,2 μl sterylnego DMSO. Przechowywać 50 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C i rozcieńczyć w stosunku 1:10 000 w pożywce do hodowli komórkowych do osiągnięcia końcowego stężenia 3 μM.
    3. Aby przygotować podstawowe stężenie 100 μg/ml aktywiny A, należy rozpuścić 100 μg aktywiny A w 1 ml 1x PBS zawierającego 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Przechowywać 100 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C i rozcieńczyć w stosunku 1:2 000 w pożywce do hodowli komórkowych do osiągnięcia końcowego stężenia 50 ng/ml.
    4. Aby przygotować podstawowe stężenie 100 μg/ml białka morfogennego kości 7 (BMP7), należy rozpuścić 100 μg BMP7 w 1 ml sterylnej wody zawierającej 0,1% BSA. Przechowywać 100 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C i rozcieńczyć w stosunku 1:2 000 w pożywce do hodowli komórkowych do osiągnięcia końcowego stężenia 50 ng/ml.
    5. Aby przygotować stężenie podstawowe 100 μg/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF), należy rozpuścić 100 μg VEGF w 1 ml sterylnej wody. Przechowywać 100 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C i rozcieńczyć w stosunku 1:4 000 w pożywce do hodowli komórkowych do osiągnięcia końcowego stężenia 25 ng/ml.
    6. Aby przygotować 10 mM stężenia podstawowego kwasu all-trans retinowego, rozpuść 10 mg kwasu all-trans retinowego w 3,33 ml sterylnego DMSO. Przechowywać 100 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C i rozcieńczyć w stosunku 1:100 w pożywce do hodowli komórkowych do osiągnięcia końcowego stężenia 0,5 μM.
  2. Aktywacja szlaku sygnałowego WNT w celu indukcji linii mezodermy
    1. W celu różnicowania hiPSC w podocyty pochodzące z hiPSC, należy użyć płytek lub kolb do hodowli komórek płaszczowych odpowiednich do hodowli hiPSC z roztworem powlekającym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Całkowita objętość roztworu powlekającego wynosi 1 ml na 6-dołkową płytkę do hodowli lub 4 ml na 10-centymetrową płytkę do hodowli komórkowej.
    2. Odessać pożywkę i umyć hiPSC wstępnie podgrzanym 1x PBS. Odessać PBS i dodać enzymatyczny roztwór do odrywania komórek zawierający 10 μM Y27632 o całkowitej objętości 1 ml na 6-dołkową płytkę hodowlaną lub 4 ml na 10 cm płytkę do hodowli komórkowej.
    3. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i inkubować przez 4 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Wypłukać hiPSC z płytki za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl. Przenieś oderwane komórki do stożkowej rurki.
    4. Umyć płytkę świeżą, wstępnie ogrzaną pożywką hodowlaną hiPSC zawierającą 10 μM inhibitor ROCK Y27632. Zebrać pożywkę płuczącą w stożkowej probówce, aby zneutralizować odczynnik dysocjacyjny. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 2 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej hiPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK Y27632.
    5. Policz komórki i zasiew 1 x 104 hiPSC/cm2. Rozprowadź komórki, mieszając trzykrotnie we wszystkich kierunkach. Pozostawić hiPSC na noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 bez zakłóceń.
    6. Następnego dnia zastąp pożywkę 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej mezodermę, zawierającej 1x suplement B27, 1% penicyliny-streptomycyny, 3 μM CHIR99021, 50 ng/ml aktywiny A i 10 μM inhibitora ROCK Y27632.
  3. Różnicowanie w komórki progenitorowe nefronu
    1. Po 2 dniach zmień pożywkę mezodermy na 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej progenitory nefronu zawierającej 1x suplement B27, 1% penicyliny-streptomycyny, 3 μM CHIR99021, 50 ng/ml aktywiny A i 50 ng/ml BMP7 na 6-dołkową płytkę hodowlaną lub 6 ml na 10 cm płytkę do hodowli komórkowej. Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez następne 14 dni.
      UWAGA: Komórki progenitorowe nefronu namnażają się i mogą być pasażowane i zamrażane po 7 dniach różnicowania w pożywce ekspansyjnej progenitorów nefronu.
    2. Aby rozszczepić komórki progenitorowe nefronu, należy pokryć tworzywa sztuczne hodowli komórkowych odpowiednie do hodowli hiPSC roztworem powlekającym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zastąp roztwór powlekający pożywką ekspandującą progenitor nefronu. Odessać pożywkę i umyć komórki wstępnie podgrzanym 1x PBS. Usuń PBS i oddziel komórki za pomocą 1x trypsyny-EDTA.
    3. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Monitoruj oderwanie komórek za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. W razie potrzeby postukaj w bok plastiku, aby oderwać komórki od powierzchni. Spłucz komórki z płytki i przenieś do stożkowej probówki. Przemyć pustą kolbę lub płytkę taką samą objętością wstępnie podgrzanego podłoża do ekspandowania progenitorów nefronu, jak odczynnik dysocjacyjny.
    4. Zebrać płyn myjący w stożkowej rurce. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 2 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki do ekspandowania progenitorów nefronu. Policz komórki i zasiew 1,5 x 104 komórki progenitorowe nefronu nacm2 w celu dalszego różnicowania.
      UWAGA: Aby zamrozić komórki progenitorowe nefronu, ponownie zawieś 1 x 106 komórek w 1 ml zimnej pożywki do kriokonserwacji bez surowicy i przenieś do kriowiolistyki. Zamrażać przez noc w pojemniku do zamrażania w temperaturze -80 °C i przenieść do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.
    5. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze i równomiernie rozprowadzić komórki przez trzykrotne mieszanie we wszystkich kierunkach. Następnego dnia zmień pożywkę na świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę różnicującą progenitory nefronu. Pożywkę należy wymieniać co drugi dzień, aż komórki zróżnicują się w pożywce różnicującej progenitory nefronu.
  4. Końcowe różnicowanie do podocytów pochodzących z hiPSC
    1. Odessać pożywkę i dodać 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki do różnicowania podocytów zawierającej 1x suplement B27, 1% penicyliny-streptomycyny, 3 μM CHIR99021, 50 ng/ml aktywiny A, 50 ng/ml BMP7, 25 ng/μL VEGF i 0,5 μM kwasu all-trans-retinowego na 6-dołkową płytkę hodowlaną lub 6 ml na 10-centymetrową płytkę do hodowli komórkowej. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę co drugi dzień przez 4 dni ze świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką do różnicowania podocytów.
    2. Aby utrzymać podocyty hiPSC w hodowli po różnicowaniu, należy karmić komórki dwa razy w tygodniu pożywką podtrzymującą podocyty zawierającą 10% płodowej surowicy cielęcej, 1% penicyliny-streptomycyny i 0,1% insuliny-transferyny-selenu.
      UWAGA: Terminalnie zróżnicowane hiPSC-podocyty już się nie namnażają. Możliwe jest jednak trzymanie ich w hodowli komórkowej do 4 tygodni.
  5. Rozmrażanie i namnażanie zamrożonych komórek progenitorowych nefronu
    1. Nową kolbę z tworzywa sztucznego do hodowli komórkowych odpowiednią do hodowli hiPSC pokryć roztworem powlekającym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zastąp roztwór powlekający 5 ml pożywki rozprężającej progenitor nefronu.
    2. Przygotuj stożkową probówkę o pojemności 15 ml z 7 ml wstępnie podgrzanej pożywki rozprężającej progenitor nefronu. Rozmrażać zamrożone komórki w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej bez ruchu przez około 20 s. Wyjmij kriowial z łaźni wodnej, gdy połowa komórek zostanie rozmrożona i pozostanie trochę lodu.
    3. Spryskaj kriowial 70% etanolem i umieść w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przenieś rozmrożone komórki do stożkowej rurki z podgrzanym podłożem ekspansywnym progenitorowym nefronu. Użyj pipety o pojemności 1 000 μl i pozwól, aby komórki spływały po ściance probówki bardzo powoli.
    4. Umyj pusty kriowial 1 ml pożywki ekspansywnej progenitora nefronu, aby zebrać pozostałe komórki i zebrać je w stożkowej probówce. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżym, wstępnie podgrzanym podłożu do ekspandowania progenitorów nefronu.
    5. Przenieść rozmrożone komórki do kolby powlekanej i następnego dnia zmienić pożywkę na świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę do ekspandowania progenitorów nefronu. Przed dalszym różnicowaniem pozwól komórkom namnażać się w pożywce ekspansującej progenitor nefronu, zmieniając pożywkę co drugi dzień i przejdź od kroku 8.3.5.

9. Charakterystyka podocytów pochodzących z hiPSC za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego

  1. Aby sprawdzić zróżnicowane podocyty pod kątem markera specyficznego dla podocytów za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, należy umieścić plastikowe szkiełka nakrywkowe na 24-dołkowej płytce i pokryć 250 μl roztworu powlekającego przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Zastąp roztwór powlekający 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki do ekspandowania progenitorów nefronu. Wysiew 2,5 x 104 zdysocjowane komórki progenitorowe nefronu na 24-dołkową płytkę. Patrz kroki od 8.3.2 do 8.3.4 w celu zapoznania się z dysocjacją komórek progenitorowych nefronu.
  2. Pozwól ogniwom przyczepić się przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 bez zakłóceń. Zastąp pożywkę następnego dnia wstępnie podgrzaną pożywką różnicującą progenitory nefronu.
  3. Zakończ różnicowanie, zmieniając pożywkę co drugi dzień, aż komórki zróżnicują się, łącznie przez 14 dni w pożywce różnicującej progenitorów nefronów i dodatkowe 5 dni w pożywce różnicującej podocyty.
  4. Po ostatecznym różnicowaniu umyj komórki 1 ml podgrzanego 1x PBS. Utrwalić podocyty hiPSC za pomocą 4% paraformaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć utrwalone komórki 1x PBS i zablokować niespecyficzne miejsca wiązania 200 μl roztworu preinkubacyjnego na studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe synaptopodynę (1:200), podocynę (1:100) i nefrynę (1:25) w rozcieńczalniku przeciwciał i umieścić kropelki 30 μl rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych na czystej folii z tworzywa sztucznego w komorze barwienia zawierającej zbiornik wodny.
  6. Umieść szkiełka nakrywkowe z zamocowanymi podocytami hiPSC do góry nogami w rozcieńczeniu. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia umyj trzy razy 1x PBS przez 5 min. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (1:1,000) w 1x PBS i umieścić kropelki 30 μl rozcieńczenia przeciwciał drugorzędowych w czystych miejscach na folii. Umieść szkiełka pokrywy do góry nogami w rozcieńczeniu.
  7. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Po inkubacji przemyć trzykrotnie 1x PBS przez 5 min. Umieścić próbki na szkiełkach podstawowych w podłożu montażowym zawierającym DAPI. Pozostawić do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej i w ciemności. Zobrazuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Wyniki

Dzięki temu protokołowi krok po kroku, który łączy reprogramowanie episomalne i różnicowanie, możliwe jest generowanie podocytów niosących mutację pacjenta w genie istotnym dla funkcjonowania podocytów. Umożliwia to analizę specyficznych dla danej choroby zmian w podocytach ex vivo. Tło genetyczne pacjenta jest zachowane podczas całego protokołu na wszystkich etapach rozwoju komórek. Ponadto, ograniczenie wynikające z niewystarczającej liczby terminalnie zróżnicowanych, nieproliferujących podocytów można pokonać, wykorzystując podocyty pochodzące z hiPSC. Chociaż generowanie podocytów hiPSC z namnożonych fibroblastów skóry właściwej via reprogramowanie do hiPSC i późniejsze różnicowanie w podocyty zajmuje kilka miesięcy, możliwe jest zamrożenie komórek na trzech różnych etapach protokołu (Rysunek 2). Zamrażanie jest możliwe w przypadku fibroblastów, hiPSC oraz komórek progenitorowych nefronu po 7 dniach różnicowania w medium do różnicowania progenitorów nefronu. Dzięki temu możliwe jest tworzenie banków komórek roboczych oraz przeprowadzanie eksperymentów na szeroką skalę.

Schemat przeprogramowania episomalnego z hiPSC i różnicowaniem do podocytów; obrazy mikroskopowe.
Rysunek 2: Poszczególne etapy protokołu widziane przez mikroskop kontrastowy. (A) Przerośnięte fibroblasty skórne. (B) Tworzenie się kolonii hiPSC po przeprogramowaniu. (C) Wyselekcjonowana hodowla hiPSC. (D) Komórki mezodermy po 2 dniach różnicowania. (E) Komórki progenitorowe nefronów po 14 dniach różnicowania w medium do różnicowania progenitorów nefronów. (F) Terminalnie zróżnicowane podocyty pochodzące z hiPSC. Paski skali reprezentują 300 µm (A,B,D-F) oraz 150 µm (C). Symbol płatka śniegu wskazuje możliwe etapy mrożenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Ponieważ generowane podocyty pochodzące z hiPSC przechodzą przez długi protokół z drastycznymi zmianami typu i morfologii komórek, charakterystyka komórkowa jest obowiązkowa. Morfologię komórek, taką jak rozmiar i kształt, a także charakterystykę wzrostu, można monitorować za pomocą mikroskopu w kontraście fazowym. Fibroblasty wykazują wydłużony, wrzecionowaty fenotyp o rozmiarach od 150 µm do 300 µm (Ryc. 2A). Po przeprogramowaniu pojawiają się kolonie małych hiPSC o rozmiarze 50 µm. Kolonie te mają wyraźne granice, a komórki hiPSC charakteryzują się wysokim stosunkiem wielkości jądra do cytoplazmy oraz zwiększoną szybkością proliferacji (Ryc. 2C). Ponieważ podocyty są komórkami ostatecznie zróżnicowanymi, szybkość proliferacji spada wraz z postępującym różnicowaniem, a morfologia komórek zmienia się w duże, gwiazdowate podocyty o rozmiarze 300 µm z wyraźnymi wypustkami stopkowymi (Ryc. 2F).

Stopień zrastań (konfluencja) jest krytycznym punktem hodowli hiPSC, a spontaniczna różnicowanie może wystąpić, gdy kolonie stają się zbyt gęste (Rysunek 3). Kolonie te muszą zostać usunięte przed pasażowaniem poprzez zeskrobanie dotkniętych obszarów naczynia hodowlanego.

Obrazy z mikroskopii kultur komórkowych, sześć typów: morfologia komórkowa, skala 300 μm. Analiza optyczna.
Rycina 3: Przykłady hiPSC o różnej jakości. Obrazy w kontraście fazowym pomyślnie (A) przeprogramowanych kolonii hiPSC i (B) wyselekcjonowanych hiPSC, a także (C) różnicowania spontanicznego, (D,E) kolonii niebędących hiPSC oraz (F) zbyt gęstej hodowli hiPSC. Paski skali reprezentują 300 µm. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Różne typy komórek w tym protokole muszą zostać zwalidowane pod kątem ekspresji specyficznego markera. Po reprogramowaniu hiPSC odzyskują zdolność do pluripotencji i wykazują ekspresję markerów proliferacji i pluripotencji, takich jak SSEA4, OCT3/4 oraz Ki67 (Rycina 4)38,39,40. Znane jest, że reprogramowanie, podobnie jak długotrwała hodowla hiPSC i różnicowanie, może prowadzić do nieprawidłowego kariotypu lub indukować mutacje41. Dlatego też tło genetyczne hodowanych komórek powinno być monitorowane w czasie i przy różnych pasażach za pomocą prążkowania G oraz sekwencjonowania całego egzomu.

Analiza immunofluorescencyjna: markery komórkowe Ki67, OCT3/4, SSEA4; obraz mikroskopowy, skala 100 µm.
Rycina 4: Charakterystyka wygenerowanych hiPSC za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Charakterystyka wygenerowanych hiPSC poprzez barwienie na (A) marker proliferacji Ki67, a także markery pluripotencji (B) OCT3/4 oraz (C) SSEA4. Paski skali reprezentują 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Pod kątem morfologicznym podocyty pochodzące z hiPSC mają kształt gwiazdy i wykazują odmienną sieć długich pierwotnych i wtórnych wypustek stóp w porównaniu do ciPodocytes (Rysunek 5). Podocyty pochodzące z hiPSC wykazują ekspresję białek markerowych specyficznych dla podocytów, takich jak synaptopodyna, nefryna i podocyna (Rysunek 6A-C)42.

Obrazy w kontraście fazowym i SEM komórek hPSC i ePodo, pokazujące różnice w morfologii komórkowej.
Rysunek 5: Morfologia podocytów pochodzących z hiPSC w porównaniu do ciPodocytów.Porównanie (A,B) podocytów pochodzących z hiPSC od zdrowego dawcy z (C,D) ciPodocytami pod kątem morfologii komórkowej i filopodiów przy użyciu mikroskopu kontrastowego fazowego (A,C) oraz skaningowego mikroskopu elektronowego (B,D). Paski skali reprezentują 150 µm (A,C) oraz 20 µm (B,D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W związku z tym porównanie podocytów pochodzących z hiPSC nie tylko od zdrowych dawców, ale także od pacjentów z mutacjami w genach specyficznych dla podocytów, pozwala na indywidualną charakterystykę mutacji pacjenta ex vivo.

Ekspresja białek w podocytach pochodzących z iPSC oraz cPodocytach; synaptopodyna, nefryna, podocyna; obrazy mikroskopowe.
Rysunek 6: Charakterystyka markera specyficznego dla podocytów w podocytach pochodzących z hiPSC oraz ciPodocytach. Porównanie (A-C>) podocytów pochodzących z hiPSC od zdrowego dawcy z (D-F>) ciPodocytami pod kątem białek markerowych specyficznych dla podocytów: synaptopodyny (A,D), nefryny (B,E) i podocyny (C,F). Paski skali odpowiadają 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1. Skład wszystkich pożywek i roztworów do hodowli komórkowych użytych w badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Ten protokół oparty na hodowlach komórkowych łączy episomalne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów skóry w specyficzne dla pacjenta hiPSC, a następnie różnicowanie w podocyty pochodzące z hiPSC. To pozwala nam badać związane z mutacjami zmiany podocytów u pacjentów z genetyczną chorobą kłębuszków nerkowych w odniesieniu do uszkodzenia podocytów. Protokół przeprogramowania fibroblastów skóry metodą bezintegracyjną za pomocą elektroporacji został zaadaptowany z opublikowanych prac Bang i wsp.32 oraz Okita i wsp.33. Protokół różnicowania podocytów od hiPSC jest zaadaptowany z opublikowanego protokołu z Musah i wsp.28,34,35. Dostępne są już publikacje opisujące powstawanie podocytów z hiPSC 27,34,35. Jednak dostarczony tutaj protokół jest zoptymalizowany i tańszy pod względem różnicowania hiPSC w podocyty. W porównaniu z opublikowanym protokołem Musah i wsp., przetestowaliśmy ten protokół na różnych odczynnikach powlekających, takich jak witronektyna, laminina silk-511 i rozpuszczona matryca błony podstawnej. Stężenia witronektyny i lamininy silk-511 można zmniejszyć do 2,5 μg/ml zamiast 5 μg/ml 28,34,35. Ponadto udało się obniżyć stężenie BMP7 i aktywiny A - dwóch bardzo drogich czynników wzrostu - o 50%, ze 100 ng/ml do 50 ng/ml.

Umożliwia to tańsze różnicowanie. Komórki progenitorowe nefronu od 7 dnia nadal się namnażały, a możliwość zamrożenia została pokazana już wcześniej. Namnażaliśmy te komórki po rozmrożeniu, a przed ostatecznym różnicowaniem w pożywce podstawowej zawierającej zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) i B27 firmy Dulbecco przez kilka dni, co jeszcze bardziej obniżyło koszty. Oprócz etapów różnicowania, protokół ten opisuje wzrost fibroblastów z biopsji skóry z późniejszym generowaniem specyficznych dla pacjenta hiPSC poprzez przeprogramowanie episomalne. Połączenie tych dwóch metod umożliwia generowanie podocytów specyficznych dla pacjenta. W związku z tym przedstawiono tutaj kompletny protokół krok po kroku do generowania specyficznych dla pacjenta podocytów pochodzących z hiPSC, który nie został wcześniej opisany tak szczegółowo.

Ponieważ ogólny protokół obejmuje kilka różnych typów komórek, ważne jest, aby scharakteryzować wygenerowane typy komórek na różnych etapach. Komórki są w hodowli przez dłuższy czas, dlatego kontrola jakości powinna być przeprowadzana na różnych pasażach. Podczas pracy z hiPSC konieczne jest codzienne karmienie, a także monitorowanie zachowania i morfologii komórek. Sterylność pożywek różnicujących musi być zapewniona przez sterylizację filtra przez filtr 0,2 μm. Cały protokół, od biopsji skóry do podocytów pochodzących z hiPSC, trwa kilka miesięcy, ale możliwe jest zamrożenie komórek na różnych etapach procesu. Fibroblasty, wybrane klony hiPSC i proliferacyjne komórki progenitorowe nefronu po 7 dniach w pożywce różnicującej progenitory nefronu można zamrozić i wygenerować działający bank komórek.

Mimo że zdrowe podocyty pochodzące z hiPSC rozwijają wyraźną sieć pierwotnych i wtórnych procesów stopy (Figura 5A,B) i wyrażają typowy marker specyficzny dla podocytów (Figura 6A-C), charakterystyczne membrany szczelinowe, widoczne in vivo, są trudne do naśladowania w klasycznych dwuwymiarowych modelach hodowli komórkowych. Co więcej, komunikacja międzykomórkowa z innymi typami komórek kłębuszkowych nie jest możliwa w tym środowisku monohodowli.

Ze względu na ich końcowy stan zróżnicowany i brak zdolności do proliferacji, trudno jest badać podocyty ex vivo. Za pomocą warunkowego unieśmiertelniania pierwotnych podocytów możliwe jest przezwyciężenie tego ograniczenia poprzez wstawienie przełącznika termoczułego, w wyniku czego uzyskuje się model hodowli komórkowej, w którym komórki namnażają się w temperaturze 33 °C i różnicują się w temperaturze 37 °C13,14. Chociaż te ciPodocyty mają duży potencjał do badań nad podocytami, istnieją ograniczenia, takie jak brak ekspresji markerów, odróżnicowana morfologia i brak tworzenia wyrostków stopy15,16.

Różnicowanie podocytów od komórek somatycznych pochodzących od pacjenta umożliwia generowanie i porównywanie chorych podocytów ze zdrowymi komórkami kontrolnymi ex vivo. To pozwala nam badać uszkodzenia podocytów spowodowane mutacjami w genach specyficznych dla podocytów. Co więcej, praca z hiPSC ma potencjał do tworzenia trójwymiarowych modeli chorób w hodowlach komórkowych, a raczej organoidów43,44. Wspólna hodowla podocytów pochodzących z hiPSC z innymi komórkami kłębuszków nerkowych, takimi jak komórki śródbłonka kłębuszków nerkowych lub komórki mezangialne, może prowadzić do nowych informacji na temat komunikacji międzykomórkowej w zdrowiu i chorobie kłębuszków nerkowych.

Co więcej, charakterystyka i leczenie podocytów specyficznych dla pacjenta może być przeprowadzane ex vivo w analizie wysokoprzepustowej. Zindywidualizowane podejście otwiera możliwość zbadania nowych celów terapeutycznych dla określonych mutacji i prowadzenia zindywidualizowanej medycyny w przyszłości.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) Uniwersytetu Friedricha-Alexandra w Erlangen-Norymberdze z grantem numer M4-IZKF-F009 przyznanym Janinie Müller-Deile, oraz przez Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) pod nazwą projektu STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, grant numer 01GM2202D przyznany Janinie Müller-Deile. Dziękujemy Annalenie Kraus za wsparcie w wykonaniu zdjęć SEM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; m sterylny filtrRotilabP668.1do sterylizacji podłoża różnicującego
kwas all-trans retinowyStem Cell Technologies72262suplement do różnicowania
B27 suplement (50 x), bez surowicyGibco17504044suplement do różnicowania bez surowicy
BG iMatrix-511 JedwabbiogemsRL511Sdodatkowa opcja odczynnika do macierzy zewnątrzkomórkowej stosowanego w roztworze powlekającym do powlekania tworzyw sztucznych do hodowli komórkowych odpowiednich do hodowli hiPSC
Albumina surowica bydlęca (BSA) Roth8076.4
CELLSTAR Filter Cap Kolby do hodowli komórkowych, T75, 250 mlGreiner bio-one82050-856tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych odpowiednie do hodowli fibroblastów
CHIR99021 (5 mg)Sigma-Aldrich252917-06-9 Dodatek do różnicowania
Matryca kwalifikowana przez Corning Matrigel hESC Corning354277dodatkową opcję odczynnika do macierzy zewnątrzkomórkowej stosowanego w roztworze powlekającym do powlekania tworzyw sztucznych do hodowli komórkowych odpowiednich do hodowli hiPSC (solubilized basement membrane matrix)
countess Szkiełka do komory do liczenia komórekInvitrogenC10283do zliczania komórek
countess II FL  Automatyczny licznik komórekInvitrogendo zliczania komórek
probówki cryoPure, 2 ml, zakrętka QuickSeal, białaSarstedt72380do zamrażania komórek
dimetylosulfotlenek (DMSO) RothA994.1do pożywki do zamrażania fibroblastów
DMEM/F12 (1:1) (1 x)Gibco11320074podstawowa pożywka do różnicowania
DMEM/F12 + GlutamaxGibco10565018podstawowa pożywka do podłoża fibroblastowego
System obrazowania EVOS M5000Thermo Fisher ScientificAMF5000fazowy mikroskop kontrastowy
płodowa surowica bydlęca premium, inaktywowana (FCS)PAN Biotech P301902serum do pożywki fibroblastowej, pożywki do zamrażania fibroblastów i pożywki do konserwacji podocytów
fisherbrand Kuwety do elektroporacji Plus, szczelina 4 mm, 800 &mikro; Pojemność L, sterylnaFisherbrand FB104używana do elektroporacji/episomalnego przeprogramowania fibroblastów (odstęp 4 mm)
Podłoże montażowe fluoromount-G, z DAPIInvitrogen00-4959-52Podłoże montażowe zawierające
igłę do miernika DAPI (0,6 x 30 mm)BD Microlance3300700do rozdzielania kolonii hiPSC na małe kawałki
ludzkie rekombinowane białkoaktywiny A78001.1Technologie komórek macierzystychsuplement do różnicowania
ludzkie rekombinowane białko morfogenetyczne kości 7 (BMP7)Peprotech120-03Psuplement do różnicowania
ludzkiego białka rekombinowanego VEGF-165Thermo ScientificPHC9394suplement do różnicowania
insulina-transferyna-selen (ITS -G) (100 x)Gibco41400045suplement do pożywka do konserwacji podocytów
Pożywka LBRothX964.1do testu sterylności hodowli hiPSC
lookOut Mycoplasma PCR Detection KitSigma AldrichMP0035-1KTkomercyjny zestaw do wykrywania mykoplazmy
szkiełka mikroskopoweDiagonal GmbH & Co.KG21,102
mikroprobówka 1,5 mL Sarstedt72706400
mTeSR1 Kompletny zestawStem Cell Technologies85850podstawowa pożywka do pożywki hodowlanej hiPSC bez surowicy
pojemnik do zamrażania nalgene Mr.FrostyRothAC96.1 w celu zapewnienia optymalnych warunków zamrażania
normalna surowica koziaabcamab 7481do roztworu preinkubacyjnego i rozcieńczalnika przeciwciał
nunc 24-dołkowe płytkiThermo Scientific142485tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych odpowiednie do hodowli hiPSC
płytki 48-dołkowe nunc Thermo Scientific152640odpowiednie do hodowli hiPSC
nunc 6-dołkowe Termo Scientific140685tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych odpowiednie do hodowli hiPSC
nunc Naczynia EasYDish Dish 100 mmTermo Scientific150466tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych odpowiednie do hodowli hiPSC
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon z powłoką Delta, z płaskim dnem MicroplateThermo Scientific167008tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych odpowiednie do hodowli hiPSC
nutriFreez D10 Podłoże do kriokonserwacjiSartorius05-713-1E bezsurowicowa pożywka do kriokonserwacji komórek progenitorowych hiPSC i nefronów
Opti-MEMGibco11058021medium do elektroporacji 
pCXLE-hMLNAddgene#27079plazmid do przeprogramowania episomalnego
plazmid pCXLE-hOCT3/4Addgene#27077plazmid do przeprogramowania epizodycznego
plazmid pCXLE-hSKAddgene#27078plazmid do episomalnego przeprogramowania
penicyliny-streptomycynySigma-AldrichP4333-100MLw celu uniknięcia zanieczyszczenia bakteryjnego
tworzywo sztuczne szkiełka nakrywkoweSarstedt  83.1840.002do barwienia immunofluorescencyjnego hiPSC i podocytów pochodzących z hiPSC
ROTI HistofixRothP087.3handlowy paraformaldehyd (4 %) do utrwalania komórek
RPMI 1640 + L-GlutaminaGibco21875034podstawowa pożywka do konserwacji podocytów
komora barwiąca StainTray pokrywaRothHA51.1
stemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórekGibcoA1110501enzymatyczny roztwór do oddzielania komórek stosowany do dysocjacji hiPSC
sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (1 x)Gibco14190094stosowany do mycia i powlekania
sterylnej wodyRothT1432
strzykawka bez igły 20 mlBD Plastipak300629do filtracji sterylizacji podłoże różnicujące
TC szalka 100 mmSarstedt8,33,902sterylne tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych stosowane do cięcia biopsji skóry i hodowli fibroblastów
TC szalka 35 mmSarstedt8,33,900sterylne tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych stosowane do wyrastania fibroblastów z biopsji skóry
triton X 100Roth3051.3do roztworu preinkubacyjnego 
trypan Blue Stain (0,4 %) do stosowania z automatycznym licznikiem komórek CountessInvitrogenT10282do zliczania komórek
trypsyna-EDTA (10 x) OdczynnikX0930-100stosowany do fibroblastów i komórek progenitorowych nefronów
probówka 15 mlGreiner bio-one188271-N
probówka 50 mlGreiner bio-one227261
witronektyna ACFSartorius05-754-0002odczynnik do macierzy zewnątrzkomórkowej stosowany w roztworze powlekającym do powlekania tworzyw sztucznych do hodowli komórkowych odpowiednich do hodowli
hiPSCDichlorowodorek Y-27632 (10 mg)Tocris1254w celu uniknięcia apoptozy hiPSC podczas rozszczepiania
Przeciwciała pierwotne
OCT4 Stem Cell Technologies60093.1marker pluripotencji, rozcieńczenie 1:200
SSEA-4Stem Cell Technologies60062FI.1marker pluripotencji, rozcieńczenie 1:100
Ki67Abcamab15580marker proliferacji, rozcieńczenie 1:300
synaptopodynaProteintech21064-1-APmarker specyficzny dla podocytów, rozcieńczenie 1:200
nefrynaProgenMarkerspecyficzny dla podocytów GP-N2, rozcieńczenie 1:25
podocytów podocinproteintech20384-1-AP, rozcieńczenie 1:100
przeciwciała drugorzędowe< / strong>
kozi IgG świnki morskiej (H+L) Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 555InvitrogenA21435wtórne i ciało, rozcieńczenie 1:1000
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, wysoce zaadsorbowane krzyżowoInvitrogenA31634wtórne i ciało, rozcieńczenie 1:1000
osło anty-Królicze IgG (H + L) Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 488InvitrogenA21206wtórne i jego ciało, rozcieńczenie 1:1000
kozie przeciwciało anty-mysie anty-IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 555InvitrogenA21422wtórne i itbody, rozcieńczenie 1:1000
kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488InvitrogenA11001wtórne i jego ciało, rozcieńczenie 1:1000
Kriowiale kuweta Tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych dysocjacyjny Biowest marker specyficzny dla

Bibliografia

  1. Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
  2. Grgic, I., et al. Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).
  3. Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub. Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).
  4. Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. Structural determinants of glomerular permeability. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).
  5. Schell, C., Huber, T. B. The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).
  6. Muller-Deile, J., Schiffer, M. Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out. Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).
  7. Boehlke, C., et al. Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement. American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).
  8. Schiffer, M., et al. Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models. Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).
  9. Kopp, J. B., et al. Podocytopathies. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68(2020).
  10. Wiggins, R. C. The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases. Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).
  11. Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
  12. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).
  13. Saleem, M. A., et al. A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).
  14. Eto, N., et al. Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression. Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).
  15. Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
  16. Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).
  17. Shih, N. Y., et al. CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain. The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).
  18. Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).
  19. Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. Dipping your feet in the water: podocytes in urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).
  20. Camici, M. Urinary detection of podocyte injury. Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).
  21. Muller-Deile, J., et al. Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 3621(2018).
  22. Schenk, H., et al. Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb. Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).
  23. Petermann, A., Floege, J. Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity. Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).
  24. Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).
  25. Petermann, A. T., et al. Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable. Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).
  26. Sakairi, T., et al. Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).
  27. Rauch, C., et al. Differentiation of human iPSCs into functional podocytes. PLoS One. 13 (9), e0203869(2018).
  28. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).
  29. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  30. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  31. Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell. Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).
  32. Bang, J. S., et al. Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts. Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).
  33. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  34. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  35. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).
  36. Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).
  37. Hoffding, M. K., Hyttel, P. Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).
  38. Bharathan, S. P., et al. Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells. Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).
  39. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  40. Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
  41. Vaz, I. M., et al. Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming. Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147(2021).
  42. Reiser, J., Altintas, M. M. Podocytes. F1000Research. 5, 114(2016).
  43. Ohmori, T., et al. Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells. Scientific Reports. 11 (1), 3982(2021).
  44. Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Biopsja skóryprzeprogramowanie episomalnefibroblasty skóry właściwejindukowane pluripotencjalne komórki macierzysteróżnicowanie podocytówmodel choroby podocytówwypustki stopoweekspresja markerów podocytówmodel podocytów ex vivo
Generowanie podocytów pochodzących od pacjenta z biopsji skóry
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.