Method Article

Ustalenie i potwierdzenie pourodzeniowego mysiego modelu przeciążenia objętości prawej komory

DOI:

10.3791/65372

⸱

June 9th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Intensive Care Unit, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Shanghai Children’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 3Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 4Department of Radiology, Huangpu Branch, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Institute of Pediatric Translational Medicine, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 6Shanghai Institute for Pediatric Congenital Heart Disease, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia ustanowienie i potwierdzenie modelu poporodowego przeciążenia objętości prawej komory (VO) u myszy z przetoką tętniczo-żylną brzuszną (AVF), który może być zastosowany do zbadania, jak VO przyczynia się do rozwoju serca po urodzeniu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeciążenie objętości prawej komory (RV) jest powszechne u dzieci z wrodzonymi wadami serca. Ze względu na różne etapy rozwoju, mięsień sercowy RV może inaczej reagować na VO u dzieci niż u dorosłych. Niniejsze badanie ma na celu ustalenie pourodzeniowego modelu RV VO u myszy przy użyciu zmodyfikowanej przetoki tętniczo-żylnej brzusznej. Aby potwierdzić powstanie VO oraz następujące zmiany morfologiczne i hemodynamiczne RV, przez 3 miesiące wykonywano USG jamy brzusznej, echokardiografię i barwienie histochemiczne. W rezultacie procedura u myszy po urodzeniu wykazała akceptowalny wskaźnik przeżycia i powodzenia przetoki. U myszy VO jama RV została powiększona o pogrubioną wolną ścianę, a objętość wyrzutowa wzrosła o około 30%-40% w ciągu 2 miesięcy po operacji. Następnie wzrosło ciśnienie skurczowe RV, zaobserwowano odpowiednią niedomykalność zastawki płucnej i pojawiła się przebudowa małej tętnicy płucnej. Podsumowując, operacja zmodyfikowanej przetoki tętniczo-żylnej (AVF) jest możliwa do ustalenia modelu RV VO u myszy po urodzeniu. Biorąc pod uwagę prawdopodobieństwo zamknięcia przetoki i podwyższonego oporu tętnicy płucnej, przed zastosowaniem należy wykonać USG jamy brzusznej i echokardiografię w celu potwierdzenia stanu modelu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeciążenie objętości prawej komory (RV) (VO) jest powszechne u dzieci z wrodzonymi wadami serca (CHD), co prowadzi do patologicznej przebudowy mięśnia sercowego i złego długoterminowego rokowania1,2,3. Dogłębne zrozumienie przebudowy RV i związanych z nią wczesnych interwencji ukierunkowanych jest niezbędne do uzyskania dobrych wyników u dzieci z chorobą niedokrwienną serca. Istnieje kilka różnic w strukturach molekularnych, funkcjach fizjologicznych i reakcjach na bodźce w sercach dorosłych i dzieci1,4,5,6. Na przykład pod wpływem przeciążenia ciśnieniowego proliferacja kardiomiocytów jest główną reakcją w sercach noworodków, podczas gdy zwłóknienie występuje w sercach dorosłych5,6. Ponadto wiele skutecznych leków w leczeniu niewydolności serca u dorosłych nie ma wpływu terapeutycznego na niewydolność serca u dzieci, a nawet może powodować dalsze uszkodzenia7,8. W związku z tym wniosków wyciągniętych z dorosłych zwierząt nie można bezpośrednio zastosować do młodych zwierząt.

Model przetoki tętniczo-żylnej (AVF) był używany do wywoływania przewlekłego VO serca i odpowiadającej mu dysfunkcji serca przez dziesięciolecia u dorosłych zwierząt różnych gatunków9,10,11,12,13. Jednak niewiele wiadomo na temat tego modelu u myszy po urodzeniu. W naszych poprzednich badaniach model myszy po urodzeniu VO został pomyślnie wygenerowany poprzez stworzenie AVF w jamie brzusznej. Wykazano również zmienioną ścieżkę rozwoju RV w sercu po urodzeniu14,15,16,17.

Aby zbadać podstawowy zmodyfikowany proces chirurgiczny i cechy obecnego modelu, przedstawiono szczegółowy protokół; model jest oceniany przez 3 miesiące w tym badaniu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie przedstawione tutaj procedury były zgodne z zasadami określonymi w Deklaracji Helsińskiej i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt i Badań nad Ludźmi w Szanghajskim Centrum Medycznym dla Dzieci (SCMC-LAWEC-2023-003). Do niniejszego badania wykorzystano młode myszy C57BL/6 (P7, samce, 3-4 g). Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Młode myszy i ich karmiące matki (młode: matki = 6:1 w pojedynczej klatce) były trzymane w warunkach laboratoryjnych wolnych od specyficznych patogenów w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności w temperaturze 22 ± 2 °C ze swobodnym dostępem do wody i dietą odżywczą. Szczenięta zostały losowo przydzielone do dwóch grup: grupy VO i grupy pozorowanej (pozorowanej).

1. Przygotowanie sprzętu i narzędzi chirurgicznych

UWAGA: Szczegóły handlowe wszystkich materiałów/sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

  1. Upewnij się, że następujące rodzaje sprzętu są gotowe i prawidłowo działające: stół operacyjny (panel z tworzywa piankowego), aparat do znieczulenia wziewnego, mikroskop z oświetleniem pionowym i wbudowaną kamerą, ultrasonograf z przetwornikiem 24 MHz oraz termostatyczna platforma grzewcza.
  2. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne (tj. uchwyt na mikroigły, kleszczyki z cienką końcówką i sprężynowe nożyczki Vannas z okrągłą rękojeścią).
  3. Zbierz następujące materiały eksploatacyjne: igły chirurgiczne do szwów 11-0 i 9-0 (stożkowe) z gwintem, paskami taśmy, igłami do strzykawek 5 ml, jedwabiem 2-0 (mocowanie chirurgiczne), sterylnymi wacikami bawełnianymi i żelem do ultradźwięków.
  4. Upewnij się, że obecne są następujące odczynniki: betadyna, 70% etanol, normalna sterylna sól fizjologiczna, izofluran, paracetamol, maść okulistyczna i krem do depilacji.

2. Zabieg chirurgiczny

UWAGA: Procedura operacji przetoki została zmodyfikowana zgodnie z wcześniej opisaną metodą11. Rysunek 1 przedstawia schemat działania AVF u myszy po urodzeniu.

  1. Znieczulenie i krępowanie
    1. Umieścić młode myszy w pojemniku do znieczulenia zawierającym 2% izofluran/tlen przez 2 minuty z przepływem ustawionym na 1 l/min. Podawać paracetamol (0,1 ml PO 80 mg/2,5 ml) za pomocą strzykawki do gruźlicy.
    2. Ułóż młode w pozycji leżącej na stole operacyjnym z wdychaniem donosowym 1,5% izofluranu o przepływie 0,8 l/min w celu utrzymania znieczulenia. Dostosuj pozycję szczeniaka, przywiązując nogi do stałych igieł strzykawki. Nałóż maść okulistyczną na oczy szczeniąt, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
    3. Uszczypnij ogon znieczulonego szczeniaka, aby sprawdzić jego reakcję na ból; brak wyraźnych ruchów ciała wskazuje na odpowiednie znieczulenie.
  2. Operacja przetoki
    1. Zdezynfekuj skórę trzema naprzemiennymi peelingami z betadyny i 70% etanolu, a następnie ułóż miejsce operowane. Przeciąć ścianę brzucha i otrzewną od dolnej części brzucha do wyrostka mieczykowatego, aby całkowicie odsłonić jamę otrzewnej, uważając, aby nie uszkodzić narządów jamy brzusznej. Wlej normalną sterylną sól fizjologiczną, aby zwilżyć uzewnętrznione narządy.
    2. Delikatnie odciągnij przewód pokarmowy i pęcherz moczowy od pola operacyjnego za pomocą bawełnianych wacików, aby uwidocznić pionową aortę brzuszną (AA) i żyłę główną dolną (IVC) pod zaotrzewnową. Obróć stół operacyjny o 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i wyreguluj powiększenie mikroskopu, aby wyraźnie uwidocznić dwa poziome naczynia
      3. .
    3. Nakłuć przetokę od AA do IVC w kierunku skośnym 1 cm dystalnie do tętnicy nerkowej za pomocą igły do szwów 11-0 (średnica = 0,07 mm). Zweryfikuj pomyślne utworzenie przetoki na podstawie obrzęku i zmieszania krwi żylnej i tętniczej w IVC.
    4. Następnie należy szybko zacisnąć miejsce krwawienia za pomocą odpowiedniej siły przyłożonej suchymi wacikami przez 15 s. Wymień żołądek, jelita i pęcherz moczowy w jamie brzusznej tak szybko, jak to możliwe, aby przyspieszyć kompresję hemostatyczną.
    5. Zszyj ścianę jamy brzusznej i otrzewną ściegiem kocowym za pomocą nici do szycia 9-0. Przerwij znieczulenie i podawaj szczeniętom 100% tlenu przez 1 minutę.
  3. Resuscytacja anestezjologiczna
    1. Umieść szczenięta na platformie grzewczej o temperaturze 38 °C. Po całkowitym przebudzeniu się z witalnością zwróć szczenięta do ich karmiącej matki. Cała procedura trwa około 15 min.
      UWAGA: W niniejszym badaniu grupa pozorowana przechodzi tę samą procedurę, z wyjątkiem etapu nakłuwania.

3. Ultradźwiękowe potwierdzenie przetoki

UWAGA: Ogólne działanie urządzenia ultrasonograficznego było identyczne jak w poprzednich raportach18,19.

  1. Potwierdzenie przetoki za pomocą USG jamy brzusznej
    1. Po indukcji znieczulenia (krok 2.1.1) przymocuj myszy paskami taśmy w pozycji leżącej na ciepłej platformie. Następnie podłącz myszy do monitora elektrokardiogramu (EKG) z żelem do ultradźwięków. Utrzymuj znieczulenie, stosując 1,5% izofluranu o przepływie 0,8 l/min.
    2. Przygotuj skórę klatki piersiowej i brzucha za pomocą kremu do depilacji. Po kilku sekundach usuń krem ciepłą bawełnianą końcówką nasączoną wodą. Umieść przetwornik (24 MHz) na linii środkowej części brzucha i obróć znacznik przetwornika do głowy myszy.
    3. Przesuń platformę w dół na lewą lub prawą stronę myszy i użyj trybu B i trybu kolorowego Dopplera, aby zobrazować widok długiej osi naczyń krwionośnych i sygnałów krwi18,19. Zmierz prędkość przepływu krwi w AA, IVC i przetoce, aby potwierdzić drożność AVF w trybie Dopplera z falą pulsacyjną.
      UWAGA: Na udane utworzenie przetoki w badaniu ultrasonograficznym wskazywał sygnał przepływu turbulentnego widoczny między AA a IVC (Rysunek 2C). Dopplerowska prędkość przepływu krwi w miejscu AVF była znacznie podwyższona w porównaniu ze stosunkowo niższą prędkością skurczową w AA (Rysunek 2A, C). Co więcej, w przeciwieństwie do normalnych wzorców przepływu w IVC (Rysunek 2B), przebieg pulsacyjny przepływu krwi IVC proksymalnie do AVF również potwierdził pomyślne utworzenie przetoki (Rysunek 2D).
  2. Potwierdzenie VO za pomocą echokardiografii
    1. Przesuń tylną część platformy w dół, umieść przetwornik (24 MHz) na klatce piersiowej i obróć znacznik przetwornika na prawe ramię myszy. Wizualizacja zmodyfikowanego przymostkowego widoku długiej osi tętnicy płucnej (PA) przy użyciu trybu B i trybu kolorowego Dopplera.
    2. Korzystając z trybu Dopplera fali pulsacyjnej, zmierz sygnały przepływu krwi w PA, w tym całkę w czasie prędkości (PA-VTI), średnicę zastawki PA (PAD), czas przyspieszenia tętnicy płucnej (PAT) i czas wyrzutu RV (RVET) (Rysunek 2E, F i Rysunek 3A,B).
    3. Zmierz parametry ultradźwięków od średniej z trzech kolejnych pomiarów. Oblicz objętość wyrzutową RV (RVSV, ml) i ciśnienie skurczowe RV (RVSP, mmHg) za pomocą następujących wzorów20:
      RVSV [ml] =1/4 × πD2 × VTIPA
      RVSP [mmHg] = -83,7 × PAT/RVET - indeks + 63,7
      UWAGA: Biorąc pod uwagę błąd pomiaru ultrasonograficznego, wzrost o >15% w RVSV lub VTIPA u myszy VO w porównaniu z myszami w grupie pozorowanej uznano za VO w RV (Figura 2E,F).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wskaźnik przeżycia i drożność AVF w ciągu 3 miesięcy
W sumie 30 (75%) myszy w grupie VO i 19 (95%) myszy w grupie pozorowanej przeżyło operację AVF (Figura 4A). W grupie VO osiem myszy zmarło w ciągu 1 dnia po operacji z powodu nadmiernego krwawienia (n = 5) lub kanibalizacji (n = 3), podczas gdy dwie myszy zmarły z nieznanych przyczyn po 1 miesiącu.

Spośród myszy VO które przeżyły (n = 30), ultrasonografia potwierdziła pomyślne utworzenie przet...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej klasyczny model RV VO został stworzony przy użyciu niedomykalności zaworu21; jednak w porównaniu z AVF, operacja zastawki na otwartym sercu może wymagać bardziej wyrafinowanych technik i może wiązać się ze znacznie wyższą śmiertelnością, szczególnie u myszy po urodzeniu. Ponieważ badania na zwierzętach wykazały, że ten sam efekt VO został osiągnięty przez AVF22, w tym badaniu zastosowano zmodyfikowaną operację przetoki brzusznej z mniejszym urazem.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauki Chin (nr 82200309) oraz Projekt Innowacyjny Wybitnego Zespołu Medycznego w Ningbo (nr 2022020405)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
70% etanolTiandz, Chia
ACETAMINOPHEN Roztwór doustnyVistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USANDC 66689-054-01
Maszyna do znieczuleniaRWD Life Science, ChinyR550IP
Maska anestezjologicznaRWD Life Science, Chiny68680
C57BL / 6 myszyXipu' er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Szanghaj, Chiny)
Krem do depilacjiVeet, FrancjaVT-200
Zestaw hematoksyliny i eozyny Beyotime biotech Silnik C0105M 
IzofluranRWD Nauki przyrodnicze, ChinyMikroskop R510-22-10
  Yuyan Instruments, ChinySM-301
Igły do szwów chirurgicznychNINGBO MEDICAL NEEDLE CO., LTD, Chiny
Termostatyczna platforma grzewczaQingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, Chiny
Urządzenie ultradźwiękoweFUJIFILM VisualSonics, Inc.Vevo 2100Tryby obrazu obejmują tryb B, tryb kolorowego Dopplera i tryb dopplerowski fali pulsacyjnej
Żel ultradźwiękowyParker Laboratories, Stany ZjednoczoneREF 01-08
Przetwornik ultradźwiękowyFUJIFILM VisualSonics, Inc.MS 400

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sanz, J., Sanchez-Quintana, D., Bossone, E., Bogaard, H. J., Naeije, R. Anatomy, function, and dysfunction of the right ventricle: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (12), 1463-1482 (2019).
  2. Alonso-Gonzalez, R., Dimopoulos, K., Ho, S., Oliver, J. M., Gatzoulis, M. A. The right heart and pulmonary circulation (IX). The right heart in adults with congenital heart disease. Revista Española de Cardiología. 63 (9), 1070-1086 (2010).
  3. Kovacs, A., Lakatos, B., Tokodi, M., Merkely, B. Right ventricular mechanical pattern in health and disease: beyond longitudinal shortening. Heart Failure Reviews. 24 (4), 511-520 (2019).
  4. Ye, L., et al. Role of blood oxygen saturation during postnatal human cardiomyocyte cell cycle activities. JACC: Basic to Translational Science. 5 (5), 447-460 (2020).
  5. Ye, L., et al. Pressure overload greatly promotes neonatal right ventricular cardiomyocyte proliferation: a new model for the study of heart regeneration. Journal of the American Heart Association. 9 (11), e015574(2020).
  6. Geraets, I. M. E., Glatz, J. F. C., Luiken, J., Nabben, M. Pivotal role of membrane substrate transporters on the metabolic alterations in the pressure-overloaded heart. Cardiovascular Research. 115 (6), 1000-1012 (2019).
  7. Burns, K. M., et al. New mechanistic and therapeutic targets for pediatric heart failure: report from a National Heart, Lung, and Blood Institute working group. Circulation. 130 (1), 79-86 (2014).
  8. Shaddy, R. E., et al. Carvedilol for children and adolescents with heart failure: a randomized controlled trial. Journal of the American Medical Association. 298 (10), 1171-1179 (2007).
  9. Flaim, S. F., Minteer, W. J., Nellis, S. H., Clark, D. P. Chronic arteriovenous shunt: evaluation of a model for heart failure in rat. American Journal of Physiology. 236 (5), H698-H704 (1979).
  10. Liu, Z., Hilbelink, D. R., Crockett, W. B., Gerdes, A. M. Regional changes in hemodynamics and cardiac myocyte size in rats with aortocaval fistulas. 1. Developing and established hypertrophy. Circulation Research. 69 (1), 52-58 (1991).
  11. Scheuermann-Freestone, M., et al. A new model of congestive heart failure in the mouse due to chronic volume overload. European Journal of Heart Failure. 3 (5), 535-543 (2001).
  12. Du, Y., Plante, E., Janicki, J. S., Brower, G. L. Temporal evaluation of cardiac myocyte hypertrophy and hyperplasia in male rats secondary to chronic volume overload. The American Journal of Pathology. 177 (3), 1155-1163 (2010).
  13. Wu, J., Luo, X., Huang, Y., He, Y., Li, Z. Hemodynamics and right-ventricle functional characteristics of a swine carotid artery-jugular vein shunt model of pulmonary arterial hypertension: An 18-month experimental study. Experimental Biology and Medicine. 240 (10), 1362-1372 (2015).
  14. Sun, S., et al. Postnatal right ventricular developmental track changed by volume overload. Journal of the American Heart Association. 10 (16), e020854(2021).
  15. Wang, S., et al. Metabolic maturation during postnatal right ventricular development switches to heart-contraction regulation due to volume overload. Journal of Cardiology. 79 (1), 110-120 (2022).
  16. Zhou, C., et al. Downregulated developmental processes in the postnatal right ventricle under the influence of a volume overload. Cell Death Discovery. 7 (1), 208(2021).
  17. Cui, Q., et al. Volume overload initiates an immune response in the right ventricle at the neonatal stage. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 772336(2021).
  18. Cheng, H. W., et al. Assessment of right ventricular structure and function in mouse model of pulmonary artery constriction by transthoracic echocardiography. Journal of Visualized Experiments. (84), e51041(2014).
  19. Sawada, H., et al. Ultrasound imaging of the thoracic and abdominal aorta in mice to determine aneurysm dimensions. Journal of Visualized Experiments. (145), e59013(2019).
  20. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (2), 157-163 (2010).
  21. Mori, Y., et al. A new dynamic three-dimensional digital color doppler method for quantification of pulmonary regurgitation: validation study in an animal model. Journal of the American College of Cardiology. 40 (6), 1179-1185 (2002).
  22. Bossers, G. P. L., et al. Volume load-induced right ventricular dysfunction in animal models: insights in a translational gap in congenital heart disease. European Journal of Heart Failure. 20 (4), 808-812 (2018).
  23. Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
  24. Jouannic, J. M., et al. The effect of a systemic arteriovenous fistula on the pulmonary arterial blood pressure in the fetal sheep. Prenatal Diagnosis. 22 (1), 48-51 (2002).
  25. Jouannic, J. M., et al. Systemic arteriovenous fistula leads to pulmonary artery remodeling and abnormal vasoreactivity in the fetal lamb. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (3), L701-L709 (2003).
  26. Patel, M. D., et al. Echocardiographic assessment of right ventricular afterload in preterm infants: maturational patterns of pulmonary artery acceleration time over the first year of age and implications for pulmonary hypertension. Journal of the American Society of Echocardiography. 32 (7), 884-894 (2019).
  27. Habash, S., et al. Normal values of the pulmonary artery acceleration time (PAAT) and the right ventricular ejection time (RVET) in children and adolescents and the impact of the PAAT/RVET-index in the assessment of pulmonary hypertension. The International Journal of Cardiovascular Imaging. 35 (2), 295-306 (2019).
  28. Arkles, J. S., et al. Shape of the right ventricular Doppler envelope predicts hemodynamics and right heart function in pulmonary hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (2), 268-276 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Right Ventricular OverloadArteriovenous FistulaPostnatal Mouse ModelCongenital Heart DiseaseAbdominal UltrasoundEchocardiographyHemodynamic ChangesPulmonary Artery RemodelingHistochemical StainingStroke Volume

Related Articles