Artykuł metodologiczny

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65381

⸱

12 maja 2023

 ,  ,  , 
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 2Area Biología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 3Area Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 4Unidad de Microscopía, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie pokazuje szczegółowy protokół do przeprowadzenia mikroskopii ekspansji ultrastruktury w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Uwzględniamy zoptymalizowaną technikę białek cytoszkieletu i znakowania pan-proteomu.

Streszczenie

Opisujemy tutaj zastosowanie mikroskopii rozszerzania ultrastruktury (U-ExM) w Trypanosoma cruzi, techniki, która pozwala zwiększyć rozdzielczość przestrzenną komórki lub tkanki do obrazowania mikroskopowego. Odbywa się to poprzez fizyczne rozszerzenie próbki za pomocą gotowych chemikaliów i zwykłego sprzętu laboratoryjnego.

Choroba Chagasa jest powszechnym i palącym problemem zdrowia publicznego spowodowanym przez T. cruzi. Choroba jest powszechna w Ameryce Łacińskiej i stała się poważnym problemem w regionach nieendemicznych ze względu na zwiększoną migrację. Przenoszenie T. cruzi odbywa się za pośrednictwem hematofagicznych wektorów owadów należących do rodzin Reduviidae i Hemiptera. Po zakażeniu amastigoty T. cruzi namnażają się w organizmie ssaka i różnicują się w trypomastigoty, niereplikacyjną formę krwi. W wektorze owada trypomastigoty przekształcają się w epimastigoty i namnażają się poprzez rozszczepienie binarne. Różnicowanie między etapami cyklu życia wymaga rozległego przegrupowania cytoszkieletu i może być całkowicie odtworzone w laboratorium przy użyciu różnych technik hodowli komórkowych.

Opisujemy tutaj szczegółowy protokół zastosowania U-ExM w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, koncentrując się na optymalizacji immunolokalizacji białek cytoszkieletu. Zoptymalizowaliśmy również użycie estru N-hydroksysukcynimidu (NHS), znacznika pan-proteomu, który umożliwił nam znakowanie różnych struktur pasożytów.

Wprowadzenie

Mikroskopia ekspansywacyjna (ExM) została opisana po raz pierwszy w 2015 roku przez Boydena i wsp.1. Jest to protokół obrazowania, dzięki któremu konwencjonalny mikroskop może osiągnąć rozdzielczość przestrzenną poniżej limitu dyfrakcji. Ta wyższa rozdzielczość jest uzyskiwana dzięki fizycznemu powiększeniu próbki. Aby to osiągnąć, znakowane fluorescencyjnie cząsteczki są sieciowane w hydrożelu, który jest następnie rozprężany izotropowo z wodą. W wyniku tej ekspansji sygnały są rozdzielone prawie izotropowo we wszystkich trzech wymiarach. Metoda ta wykorzystuje tanie chemikalia i umożliwia rozdzielczość przestrzenną około 65 nm przy użyciu konwencjonalnych (konfokalnych) mikroskopów, co jest około czterokrotnie lepszą rozdzielczością niż standardowa rozdzielczość mikroskopu konfokalnego (około 250 nm)1.

Kolejnym kamieniem milowym, który umożliwił zastosowanie mikroskopii ekspansywnej w wielu dziedzinach biologii, było dostosowanie znakowania immunofluorescencyjnego za pomocą konwencjonalnych przeciwciał2. Kolejną adaptacją pierwotnie opublikowanego protokołu ExM jest powiększona analiza proteomu (MAP)3. W metodzie tej zastosowano wysokie stężenia akrylamidu i paraformaldehydu przed zanurzeniem próbki w hydrożelu, aby zapobiec sieciowaniu wewnątrz- i międzybiałkowemu, co doprowadziło do lepszego zachowania zawartości białka w próbkach i architektury subkomórkowej. Ten alternatywny protokół został zoptymalizowany w celu uzyskania lepszej konserwacji ogólnej ultrastruktury izolowanych organelli poprzez wykorzystanie niższych stężeń środków utrwalających (formaldehydu/paraformaldehydu i akrylamidu); podejście to zostało nazwane mikroskopią ekspansji ultrastrukturalnej (U-ExM)4.

Aby uzyskać jeszcze większą rozdzielczość, połączenie ExM z technikami mikroskopii superrozdzielczej, w tym mikroskopią zubożenia emisji stymulowanej lub mikroskopią lokalizacji pojedynczych cząsteczek, zostało również zgłoszone w celu osiągnięcia rozdzielczości poniżej 20 nm5.

Użycie ExM było szeroko opisywane w dziedzinach neuronauki i badań nad cytoszkieletami6, ale przeprowadzono tylko kilka badań na pasożytniczych protistach. Nasze laboratorium jako pierwsze poinformowało o zastosowaniu U-ExM w T. cruzi7. Protokół podstawowy opiera się głównie na poprzednich raportach U-ExM w Toxoplasma gondii, Plasmodium ssp. i Trypanosoma brucei8,9,10,11.

Jedną z największych zalet ExM jest jego modułowy charakter, który pozwala na dużą elastyczność w dostosowywaniu się do różnych próbek biologicznych. Protokół można podzielić na etapy (takie jak utrwalanie, zapobieganie sieciowaniu lub żelowanie), które użytkownik może łatwo dostosować do swoich wymagań eksperymentalnych. Dodatkowo potok ten może być modyfikowany w celu zwiększenia kompatybilności z organizmem modelowym lub osiągnięcia określonej rozdzielczości. W rezultacie, ExM oferuje ogromny potencjał zarówno dla zaawansowanych, jak i niezaawansowanych systemów optycznych, zapewniając szersze zastosowania w przyszłości.

Choroba Chagasa, zwana także trypanosomatozą amerykańską, jest endemiczną chorobą w Ameryce Łacińskiej wywoływaną przez Trypanosoma cruzi, pasożyta pierwotniaka. Cykl życiowy pasożyta jest złożony i obejmuje dwa etapy rozwojowe u ssaków i dwa u żywiciela owada (członka rodziny Triatominidae), który jest biologicznym wektorem tej choroby. Choroba Chagasa należy do grupy zaniedbanych chorób tropikalnych wymienionych przez Światową Organizację Zdrowia i stanowi poważny problem gospodarczy i społeczny w Ameryce Łacińskiej. Badania epidemiologiczne szacują, że 8 milionów ludzi na całym świecie żyje z chorobą Chagasa i ponad 10 000 zgonów rocznie. Liczby te ilustrują znaczenie choroby Chagasa jako problemu zdrowia publicznego na całym świecie. Rozmieszczenie geograficzne choroby Chagasa zmieniło się w ostatnich dziesięcioleciach, a wiele zarażonych osób mieszka obecnie w dużych obszarach miejskich na całym świecie z powodu zwiększonych migracji, w przeciwieństwie do głównie wiejskich obszarów Ameryki Łacińskiej, gdzie pierwotnie została znaleziona12.

Etapy rozwoju T. cruzi różnią się w całym cyklu życia, który może być całkowicie odtworzony in vitro. Epimastigoty są formami replikacyjnymi w wektorze owada i mają kuliste jądro w centralnym obszarze ciała komórki i kinetoplast w kształcie pręta (struktura zawierająca mitochondrialne DNA unikalną dla kinetoplastydów) w przedniej części względem jądra, z wolną wicią. Trypomastigoty są infekcyjną, niereplikacyjną formą i mają wydłużone jądro, zaokrąglony tylny kinetoplast i wić przyczepioną do błony plazmatycznej na całej długości pasożyta. Amastigoty są wewnątrzkomórkową formą replikacyjną; Mają jądro w centralnej części, kinetoplast w kształcie pręcika w przedniej części ciała komórki i zredukowaną wić. Zdolność przystosowania się pasożyta do różnych środowisk jest odzwierciedleniem tych zmian morfologicznych. Warto również wspomnieć, że ten cykl życia obejmuje symetryczny podział i różne przejściowe etapy rozwoju13. Podczas różnicowania cytoszkielet trypanosomatydów odgrywa kluczową rolę. Struktura ta jest utworzona przez gorset mikrotubul podbłonkowych ułożonych w uporządkowany układ stabilnych mikrotubul poniżej błony plazmatycznej. W organizmach tych występuje również pręt paraflagellar, który jest strukturą przypominającą siatkę, która biegnie równolegle i jest dołączona do aksonemu wiciowego14. Precyzyjna organizacja cytoszkieletu i zmiany strukturalne jądra wzdłuż etapów cyklu komórkowego obejmują unikalne mechanizmy regulacji genów specyficzne dla trypanosomatydów, co czyni je interesującymi modelami do badań biologii komórki.

Biorąc pod uwagę mały rozmiar T. cruzi i innych pasożytów pierwotniaków, U-ExM stanowi doskonałe narzędzie do analizy cech strukturalnych tych ważnych patogenów. Jak wspomniano wcześniej, zastosowanie tej techniki na T. cruzi zostało po raz pierwszy potwierdzone przez Dr. Alonso7. Raport ten szczegółowo opisuje kompletny protokół U-ExM, z naciskiem na immunolokalizację białek cytoszkieletu podczas różnych etapów cyklu życiowego T. cruzi. Zoptymalizowaliśmy również użycie estru N-hydroksysukcynimidu (NHS), znacznika pan-proteomu, który umożliwia nam oznaczanie różnych struktur pasożytniczych. Ponadto opisano metodologię in vitro pozwalającą na uzyskanie trzech etapów pasożyta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Rysunek 1 ilustruje kompletny projekt eksperymentalny.

Diagram cyklu życia trypanosomatozy; przygotowanie mikroskopu; mikroskopia ekspansywna; Immunofluorescencji.
Rysunek 1: Przepływ pracy U-ExM dla trzech etapów cyklu życia in vitro T. cruzi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną

  1. Umieść kwadrat folii uszczelniającej o wymiarach 10 cm x 10 cm na szalce Petriego. Umyj szkiełka nakrywkowe, kąpiąc je w absolutnym etanolu na szklanej szalce Petriego o średnicy 35 mm.
  2. Usuń szkiełka nakrywkowe pęsetą z kąpieli etanolowej i odcedź nadmiar płynu bibułą. Umieść szkiełka nakrywkowe na folii uszczelniającej.
  3. Resztę etanolu należy wchłonąć papierem do mikroskopii. Dodać 0,1% v/v roztwór poli-D-lizyny na środek szkiełka nakrywkowego i rozprowadzić go końcówką, aby pokryć około 80% jego powierzchni. Zamknąć szalkę Petriego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W przypadku szkiełek nakrywkowych 22 mm2 należy użyć 200 μl roztworu poli-D-lizyny; w przypadku szkiełek nakrywkowych okrągłych o średnicy 12 mm należy użyć 100 μl roztworu poli-D-lizyny.
  4. Umyj szkiełka nakrywkowe bardzo czystą wodą trzy razy. Użyj aspiracji z odkurzaczem, aby usunąć wodę między każdym praniem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.

2. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotować roztwory podstawowe 38% (m/m) akrylanu sodu (SA).
    1. Powoli dodawać 19 g SA do 31 ml wody wolnej od nukleaz, mieszając.
      UWAGA: Ten roztwór jest bardzo lepki; Zachowaj ostrożność podczas pipetowania.
    2. Po całkowitym rozpuszczeniu SA należy go przechowywać w sterylnym pojemniku. Przechowywać w temperaturze 4 °C i wymieniać co 6 miesięcy.
      UWAGA: SA czasami wykazuje oznaki zanieczyszczenia poliakrylanem sodu w zależności od marki, co jest zauważalne podczas przygotowywania roztworu podstawowego, ponieważ zmienia kolor na żółtawy i mętny. W takim przypadku należy go używać ostrożnie.
  2. Przygotować roztwór podstawowy 40% (w/v) akrylamidu (AA) i roztwór podstawowy 2% (w/v) N'-metylenobisakryloamidu (BIS). Rozpuść każdy związek w ultraczystej wodzie i przefiltruj sterylnym filtrem strzykawkowym 0,22 μm. Przechowywać w sterylnym pojemniku w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: AA i BIS są substancjami wysoce toksycznymi. Pracuj pod wyciągiem i używaj odpowiednich elementów ochronnych (rękawice, odzież ochronna, maska, okulary ochronne).
  3. Przygotować roztwór zapobiegający sieciowaniu białek (CP), mieszając 38 μl 37% roztworu formaldehydu (FA) z 50 μl 40% roztworu podstawowego akryloamidu (krok 2.2) w 912 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; Tabela 1) uzyskać końcowe stężenie 1,4% formaldehydu i 2% akrylamidu.
    UWAGA: Roztwór CP należy zawsze przygotowywać na świeżo i zachowywać szczególną precyzję podczas pipetowania. Na przykład użyj pipety P1000, aby pobrać 900 μl PBS i pipety P20, aby pobrać pozostałe 12 μl PBS.
  4. Przygotować roztwór monomeryczny
    UWAGA: Nie należy stosować roztworu bezpośrednio po przygotowaniu; Przechowywać w temperaturze -20 °C co najmniej 24 godziny przed użyciem.
    1. Zmieszać 500 μl 38% roztworu SA (krok 2.1), 250 μl 40% roztworu AA i 50 μl roztworu BIS (krok 2.2), a także 100 μl 10 x PBS (Tabela 1).
    2. Tę końcową objętość 900 μl rozmieścić w 10 probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml z 90 μl roztworu monomerycznego każda. Przechowywać w temperaturze -20 °C do 2 tygodni.
      UWAGA: Roztwór SA może pozostać na końcówce podczas pipetowania, ponieważ jest bardzo lepki; Bądź ostrożny i dozuj wszystko.
  5. Przygotować roztwór denaturujący
    1. Zmieszać 114,3 ml 350 mM roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS) przygotowanego w wodzie ultraczystej z 10 ml 4 M roztworu chlorku sodu przygotowanego w wodzie ultraczystej. Dodać 12 g Tris, mieszając w zlewce o pojemności 250 ml.
      UWAGA: SDS jest wysoce toksyczny; Używaj go pod wyciągiem w rękawicach, odzieży ochronnej, masce i okularach ochronnych.
    2. Dostosuj pH do 9 za pomocą stężonego roztworu kwasu solnego. Uzupełnić do 200 ml ultraczystą wodą i przechowywać w sterylnej kolbie w temperaturze 4 °C.
  6. Przygotować 10% roztwór nadsiarczanu amonu (APS) i 10% roztwór TEMED.
    1. Rozpuścić 0,1 g APS w 1 ml ultraczystej wody.
    2. Przygotuj 1 ml 10% roztworu TEMED w ultraczystej wodzie.
    3. Przygotować 100 μl porcji obu roztworów w sterylnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać je w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca.
  7. Przygotować roztwór paraformaldehydu.
    1. Rozpuścić 2 g paraformaldehydu w 40 ml PBS, mieszając w temperaturze 60 °C. Dodawać kroplami 1 M NaOH, aż roztwór zmieni kolor z białego na bezbarwny.
      UWAGA: Formaldehyd jest wysoce toksyczny; Używaj go pod wyciągiem w rękawicach, odzieży ochronnej, masce i okularach ochronnych.
    2. Schłodzić roztwór w temperaturze pokojowej i dostosować pH za pomocą NaOH do 7,2 w końcowej objętości 50 ml. Przefiltrować sterylnym filtrem strzykawkowym 0,22 μm i przechowywać w sterylnym pojemniku.
    3. Przygotować porcje po 1 ml w sterylnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  8. Przygotować roztwór paraformaldehydu/aldehydu glutarowego.
    1. Dodać 0,2 g paraformaldehydu do 3,5 ml ultraczystej wody i 50 μl 16 M roztworu NaOH. Podgrzać roztwór do temperatury 60 °C, aby rozpuścić paraformaldehyd.
    2. Ostudzić i dodać 300 μl 70% aldehydu glutarowego. Zwiększyć objętość do 5 ml ultraczystą wodą, a na koniec do 10 ml PBS.
      UWAGA: Paraformaldehyd i aldehyd glutarowy są wysoce toksyczne; Używaj ich pod wyciągiem w rękawicach, odzieży ochronnej, masce i okularach ochronnych.
    3. Przygotować porcje po 1 ml w sterylnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.

3. Przygotowanie kultur pasożytów

  1. Uprawa T. cruzi epimastigotes.
    1. Użyć kultury aksenicznej w kolbie T-25 (25cm2 obszar wzrostu) i utrzymać kultury w fazie logarytmicznej, podhodowlując co 48-72 godziny w pożywce tryptozy do infuzji wątroby (LIT) z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS; Tabela 1).
    2. Upewnij się, że nakrętka jest dobrze zamknięta i utrzymuj kolbę hodowlaną pionowo w temperaturze 28 °C do inkubacji. Monitoruj wzrost pasożyta poprzez zliczanie komórek w komorze Neubauera podczas każdej subhodowli.
      UWAGA: W przypadku szczepu Dm28c użytego w tym badaniu stężenie epimastigotów w kulturach w fazie logarytmicznej wynosi od 1 do 5 x 107 pasożytów/ml.
    3. Przygotować zawiesinę 2 x 106 epimastigotów/ml z kultury w fazie logarytmicznej w pożywce LIT uzupełnionej 10% FCS. Odwirować zawiesinę o stężeniu 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Przemyć PBS raz lub dwa razy i ponownie zawiesić w 200 μl PBS.
    4. Przykleić do okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm, uprzednio pokrytego poli-D-lizyną (sekcja 1). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut. Przejdź do etapu zapobiegania sieciowaniu (sekcja 4).
      UWAGA: Alternatywnie, utrwalić epimastigoty zimnym metanolem przez 7 minut lub roztworem paraformaldehydu/aldehydu glutarowego (krok 2.8) przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed przylgnięciem pasożytów do szkiełka nakrywkowego. Utrwalone pasożyty można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
  2. Uzyskaj amastigoty z zakażonych komórek Vero.
    1. Położyć sterylne okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm na dnie 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Przygotować zawiesinę 2 x 105 komórek Vero/ml w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 2% płodową surowicą cielęcą (FCS). Wysiewać 500 μl zawiesiny na dołek.
      UWAGA: W tym badaniu wykorzystano DMEM z 2% FCS, aby umożliwić komórkom wolniejszy wzrost.
    2. Inkubować przez noc (ON; 12-16 h) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu zapewnienia przyłączenia komórek.
    3. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie przy użyciu 500 μl sterylnego PBS. Dodać trypomastigoty T. cruzi do komórek przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10 na 100 μL DMEM z 2% FCS na studzienkę, co odpowiada milionowi trypomastigotów na studzienkę. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 6 godzin.
    4. Po inkubacji przepłukać płytki dwukrotnie PBS. Dodać 500 μL DMEM uzupełnionego 2% FCS. W tym momencie przejdź do etapu zapobiegania sieciowaniu (sekcja 4).
      UWAGA: Wewnątrzcytoplazmatyczne amastigoty będą widoczne przez odwrócony mikroskop optyczny 2 dni po zakażeniu (rysunek uzupełniający 1). Alternatywnie, utrwalić trypomastigoty zimnym metanolem przez 7 minut w temperaturze -20 °C lub paraformaldehydem/aldehydem glutarowym przez 10 minut w temperaturze pokojowej, przed przylgnięciem pasożytów do szkiełka nakrywkowego.
  3. Uzyskaj trypomastigoty z zakażonych komórek Vero.
    1. Zbierz supernatant monowarstwy komórek Vero (30%-40% konfluencji) zakażonej trypomastigotami (MOI 1:10; ON inkubacji) 4 dni po zakażeniu.
      UWAGA: W przypadku kolby T-25 początkowe stężenie użytych komórek Vero wynosi 800 000 komórek, a w przypadku kolby T-75 wynosi dwa miliony komórek.
    2. Oznaczyć stężenie trypomastigoty za pomocą komory Neubauera do zliczania komórek. Odwirować 4 x 106 trypomastigotów przy 7 000 x g przy temperaturze pokojowej przez 10 min.
    3. Dwukrotnie spłukać PBS i ponownie zawiesić w 200 μl PBS. Nakładać na okrągłe szkiełko nakrywkowe o grubości 12 mm pokryte poli-D-lizyną (sekcja 1). Inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Kontynuować etap zapobiegania sieciowaniu (sekcja 4).
      UWAGA: Alternatywnie, utrwalić trypomastigoty zimnym metanolem przez 7 minut w temperaturze -20 °C lub paraformaldehydem/aldehydem glutarowym przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed przylgnięciem pasożytów do szkiełka nakrywkowego.

4. Zapobieganie sieciowaniu (DZIEŃ 1)

  1. Zanurzyć 12 mm szkiełko nakrywkowe z przylegającymi pasożytami lub zakażonymi komórkami (skierowanymi do góry) w 24-dołkowej płytce z 0,5 ml roztworu CP (krok 2.3) w każdym dołku.
  2. Napełnij puste studzienki wodą, aby zmniejszyć parowanie. Uszczelnij płytę folią uszczelniającą. Inkubować przez 5 godzin w temperaturze 37 °C. Etap ten można przedłużyć do inkubacji ON w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Szkiełko nakrywkowe należy zawsze zanurzać w roztworze; Nie należy pipetować roztworu utrwalającego na szkiełka nakrywkowe.

5. Przeprowadzanie żelowania próbki

  1. Zmontuj wilgotną komorę na szalce Petriego z folią uszczelniającą na wierzchu bibuły (Rysunek 2A). Dodać wodę do bibuły i inkubować w temperaturze -20 °C przez 20 minut do ostygnięcia. Rozmrażać podwielokrotność TEMED i APS na lodzie przez 20 minut (krok 2.6).
    UWAGA: Nie zamrażaj i nie rozmrażaj APS więcej niż trzy razy.
  2. Połóż chłodną, wilgotną komorę na lodzie (Rysunek 2A). Wyjąć z inkubatora 24-dołkową płytkę przygotowaną w sekcji 4. Odessać roztwór CP za pomocą pipety Pasteura o pojemności 3 ml, pozostawiając trochę roztworu, w przeciwnym razie szkiełka nakrywkowe będą trudne do usunięcia.
  3. Usuń 12 mm szkiełka nakrywkowe z roztworu utrwalającego za pomocą pęsety i połóż je na bibułce pasożytami skierowanymi do góry.
    UWAGA: Pomocne jest użycie sterylnej igły do podniesienia szkiełka nakrywkowego, a następnie przytrzymanie go pęsetą.
  4. Do podwielokrotności 90 μl roztworu monomerycznego (krok 2.4) dodać 5 μl TEMED i 5 μl uprzednio rozmrożonego APS. Mieszaj mikserem wirowym nie dłużej niż 2-3 s; Nie ma potrzeby zamykania rurki pokrywką.
    UWAGA: Zawsze dodawaj TEMED jako pierwszy, a APS na końcu. Dodanie APS jako pierwszego, a TEMED jako ostatniego do roztworu monomerycznego sprawia, że proces żelowania jest szybszy, nie dając czasu na manipulowanie nim.
  5. Szybko nanieść jedną kroplę 35 μl na folię uszczelniającą wilgotnej komory dla każdego szkiełka nakrywkowego. Natychmiast podnieś szkiełko nakrywkowe pęsetą i połóż się na kropli (Rysunek 2B) pasożytami skierowanymi w dół.
    UWAGA: Wykonaj maksymalnie dwa szkiełka nakrywkowe na raz; Ważne jest, aby nie zwlekać z tym krokiem, ponieważ roztwór polimeryzuje bardzo szybko.
  6. Inkubować wilgotną komorę przez 5 minut na lodzie, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Włączyć blok grzewczy o temperaturze 95 °C, aby zapewnić odpowiednią temperaturę do następnego kroku.

Enkapsulacja komórek w żelu; A-B: szalka Petriego na lodzie; C: schemat komórek pod żelem, ustawienie szkiełka nakrywkowego.
Rysunek 2: Szczegóły etapu żelowania. (A) Montaż komory wilgotnościowej. (B) Upuszczenie szkiełek nakrywkowych na roztwór monomeru za pomocą TEMED i APS w celu żelowania. (C) Schematyczne przedstawienie żelu zmontowanego do obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Denaturyzacja zżelowanych próbek i przeprowadzanie ekspansji izotropowej

  1. Usunąć roztwór denaturacyjny (krok 2.5) z temperatury 4 °C. Jeśli zostanie wytrącony, umieść go w gorącej kąpieli wodnej, aż całkowicie się rozpuści.
  2. Dodać 2 ml roztworu denaturującego do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Przenieść szkiełka nakrywkowe z kroku 5.3 na płytkę z roztworem denaturacyjnym. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając, aby żel oderwał się od szkiełka nakrywkowego.
  3. Ostrożnie przenieść żel (usuwając go z szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm) za pomocą metalowej szpatułki do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z 1 ml roztworu denaturującego. Użyj zaślepek, aby zabezpieczyć rurki. Inkubować przez 1 godzinę i 30 minut w temperaturze 95 °C w bloku grzewczym.
    UWAGA: Na tym etapie żele zaczynają się rozszerzać; Zachowaj ostrożność podczas przenoszenia żelu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Po inkubacji probówka zawierająca żel ma temperaturę 95 °C, co może być niebezpieczne. Używaj rękawic ochronnych i pozwól rurkom ostygnąć przed ich użyciem, aby uniknąć oparzeń i wystających elementów.
  4. Wykonaj pierwszą rundę ekspansji
    1. Odessać roztwór denaturujący z probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml za pomocą żelu za pomocą pipety P1000. Przenieść żel z probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml na szalkę Petriego z 10 ml ultraczystej wody przez 30 minut za pomocą małej szpatułki.
    2. Wymień ultraczystą wodę za pomocą jednorazowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml. Inkubuj ON w RT.
      UWAGA: Z żelami należy obchodzić się delikatnie, ponieważ po pierwszych 30 minutach inkubacji stały się one kruche.
    3. Jeszcze raz zmień ultraczystą wodę za pomocą jednorazowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml.
      UWAGA: Wystarczą trzy inkubacje wodne po 30 minut każda, ale ze względów praktycznych lepiej pozostawić drugą inkubację WŁĄCZONĄ.

7. Znakowanie fluorescencyjne docelowych białek (DZIEŃ 2)

  1. Usuń wodę z szalki Petriego z żelem za pomocą jednorazowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml. Zmierz średnicę żelu za pomocą suwmiarki, aby obliczyć rozszerzalność (od czterech do pięciu razy).
  2. Przemyć dwukrotnie 10 ml PBS przez 15 minut. Pokrój żel żyletką na kwadraty o wymiarach około 10 mm x 10 mm w środku okrągłego żelu. Użyj jednego kwadratu na warunek, który chcesz przetestować.
    UWAGA: Żel kurczy się po inkubacji PBS. Żele można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
  3. Przenieść każdy kwadrat na 12-dołkową płytkę i inkubować z 500 μl pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w 2% PBS-albumina surowicy bydlęcej (BSA) przez 2 godziny i 30 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem><. UWAGA: Alternatywną inkubację przeciwciał można przeprowadzić ON w temperaturze 4 °C. Minimalna objętość przeciwciała, którą można zastosować, to 300 μl w płytce 24-dołkowej. Zasadniczo należy stosować dwa razy większe stężenie przeciwciał niż stosowane w konwencjonalnym znakowaniu immunologicznym.
  4. Przemyć trzykrotnie 2 ml PBS z 0,1% polisorbatem 20 przez 10 minut, wstrząsając na płytce 6-dołkowej.
  5. Przenieść żel na 12-dołkową płytkę i inkubować z 500 μl przeciwciała drugorzędowego w PBS z DAPI i 10 μg/ml estru NHS sprzężonego z pożądanym fluoroforem przez 2 godziny i 30 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając.
    UWAGA: Z reguły należy stosować dwukrotne stężenie przeciwciał stosowanych do konwencjonalnego znakowania immunologicznego. Alternatywnie, inkubację tę można przeprowadzić w temperaturze 4 °C.
  6. Przemyć trzykrotnie 2 ml PBS z 0,1% polisorbatem 20 przez 10 minut, wstrząsając na płytce 6-dołkowej.
  7. Przenieś żel na szalkę Petriego z ultraczystą wodą. Inkubować przez 30 minut. Dwukrotnie zmień wodę za pomocą jednorazowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml, jak to opisano w kroku 6.4.

8. Obrazowanie i przetwarzanie obrazów (DZIEŃ 3)

  1. Usunąć wodę z szalek Petriego za pomocą jednorazowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml i zmierzyć średnicę żelu za pomocą suwmiarki, aby obliczyć współczynnik rozszerzalności.
  2. Wytnij żyletką mały kawałek o wymiarach ~10 mm x 10 mm i umieść go na naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
    UWAGA: Alternatywnie umieść żel między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym (bez poli-D-lizyny). Szkiełko powinno mieć dwie mniejsze części szkiełka wycięte diamentowym nożem przymocowanym po bokach, aby utworzyć komorę o grubości żelu.
  3. Sprawdź orientację przy powiększeniu 10x lub 20x. Aby prawidłowo ustawić ostrość, upewnij się, że pasożyty są skierowane w stronę szkiełka nakrywkowego; w przeciwnym razie trzeba obrócić żel i sprawdzić ponownie (Rysunek 2C).
  4. Po znalezieniu właściwej orientacji osusz pozostały żel bibułą mikroskopową. Przykryj żel szkiełkiem nakrywkowym pokrytym poli-D-lizyną.
  5. Dodaj małą kroplę ultraczystej wody do żelu, aby uwidocznić za pomocą mikroskopu konfokalnego.
    UWAGA: Aby zapewnić prawidłowe obrazowanie, ważne jest, aby utrzymać orientację żelu przez cały proces tak, aby strona żelu zawierająca komórki w pobliżu jego powierzchni była skierowana w stronę naczynia ze szklanym dnem na końcu. W przypadku stosowania szalek o średnicy 35 mm dodanie poli-D-lizyny do szkiełka nakrywkowego umieszczonego na dnie zmniejsza przesuwanie się żelu podczas akwizycji obrazu.
  6. Parametry akwizycji obrazu
    1. Zobrazuj próbki w mikroskopie konfokalnym (tabela materiałów) za pomocą obiektywu z 63-krotnym zanurzeniem w oleju 1,4 apertury numerycznej (NA).
    2. Uzyskaj stosy Z, szerokość każdego kroku z i czas ekspozycji na piksel, które zostaną określone empirycznie w zależności od próbki, intensywności sygnału i optymalizacji czasów akwizycji. W razie potrzeby użyj zoomu skanowania, aby uzyskać efektywne powiększenie.
    3. Otwórz stos Z za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu (Spis materiałów). Dla każdego kanału pogrupuj ułożone w stos obrazy, korzystając z opcji Grupuj projekt Z. Wybierz projekcję maksymalnej intensywności.
    4. Aby scalić obrazy, użyj narzędzia Scal kanały i wybierz kolor każdego kanału. Dodaj podziałkę liniową za pomocą narzędzia Podziałka liniowa w oprogramowaniu do przetwarzania.
      UWAGA: Alternatywnie można pokolorować każdy kanał zgodnie z potrzebami (patrz przykłady w reprezentatywnych wynikach).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jeśli protokół został poprawnie wykonany (Rysunek 1), próbki będą widoczne jako płaski i półprzezroczysty żel, który może być rozszerzony do 4-4,5x w wodzie (Rysunek 3A). To rozszerzenie zapewniło efektywną rozdzielczość około 70 nm, która może się różnić w zależności od końcowego współczynnika rozszerzalności i zastosowanego systemu obrazowania. Po drugim procesie ekspansji i akwizycji obrazu w mikroskopie konfokalnym udało nam się zaobserwować współczynniki ekspansji na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej to technika, która pozwala na uzyskanie obrazów próbek biologicznych o wysokiej rozdzielczości poprzez fizyczne rozszerzenie ich do kilkukrotnego rozmiaru pierwotnego. Protokół U-ExM obejmuje kilka krytycznych kroków, które należy starannie wykonać, aby osiągnąć optymalne wyniki4. Najpierw próbka musi zostać utrwalona za pomocą środka CP i osadzona w pęczniejącej matrycy hydrożelowej. Formaldehyd obecny w roztworze CP oddziałuje z wolnymi wiązaniami kowalen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Dolores Campos za pomoc w hodowli komórek Vero i Romnie Manarin za pomoc w hodowli T. cruzi. Prace te były wspierane przez Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva z Argentyny (PICT2019-0526), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (PIBAA 1242) oraz Research Council United Kingdom [MR/P027989/1].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 mikrometra sterylne filtry strzykawkowe PESRoztwory membranoweSFPES030022S
1 l zlewkaSchott Duran10005227
1,5 ml Mikroprobówka wirówkowa SPINWINTarsonT38-500010
10 ml jednorazowa sterylna symutkaNP66-32
10 ml pipeta serologiczna sterylnaJet BiofilGSP211010
Szkiełka nakrywkowe 12 mmMerienfeld GmbH01 115 20Szkiełka nakrywkowe okrągłe
Płytki 12-dołkoweJet BiofilTCP011012
Szkiełka nakrywkowe 22 mmCorning2845-22Szkiełka nakrywkowe kwadratowe
Płytki 24-dołkoweJet BiofilTCP-011-024
Zlewka 250 mlSchott DuranC108.1
3 ml Pasteur pipetaDeltalab200037
35-milimetrowe naczynia ze szklanym dnemSzkło Matsunami indD11130H
4′,6-Diamidine-2′-phenylindol dichlorowodorekSigma AldrichD9542DAPI
5 ml pipeta serologiczna sterylnaJet BiofilGSP010005
płytki 6-dołkoweSarstedt83.3920
AkrylamidBioRad1610101
Nadsiarczan amonuSigma AldrichA3678-25GAPS
ATTO 647 NHS esterBOC SciencesF10-0107Do znakowania pan-proteomu
Szafka bezpieczeństwaTelstarBio II A/P
Albumina sodu bydlęcegoSigma AldrichA7906BSA
CO2 InkubatorSanyoMCO-15A
Mikroskop konfokalnyZeissLSM 880
Jednorazowe Tarsony Petridish460095średnicy 90 mm
Thermo Fisher Cientific12100046Powderwysokiej zawartości glukozy
Elektroniczna suwmiarka cyfrowaRadarRADAR-SLIDE-CALIPER
Etanol AbsoluteSupelco1,00,98,31,000
Surowica cielęca płoduInternegocios SAFCS FRA 500Sterylny i inaktywowany termicznie
pakiet do przetwarzania obrazu FidżiImageJdoi:10.1038/nmeth.2019
Formaldehyd 37%Sigma AldrichF8775FA
Glass PetridishMarienfeld SuperiorPM-3400300średnica 60 mm
Glukoza D(+)Cicarelli
Aldehyd glutarowy 70%Sigma AldrichG7776
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG Alexa Fluor 555InvitrogenA-21422
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG Przeciwciało wtórne FICTJackson Immunoresearch115-095-003
Cylinder z podziałkąNalgene3663-1000
Szklana kolbaz podziałkąGlasscoGL-274.202.01100 mL
Blok grzewczyIBRMade in house
HeminFrontier ScientificH651-9
Kwas solny 36,8-38,0%Ciccarelli918110
Wiadro na lódInkubator Corning1167U68
Tecno DalvoTOC130
Napar z wątrobyDifco226920
Mieszadło magnetyczne i grzałkaTowarzysz laboratoryjnyHP-3000
Szpatułka metalowaSALTTECH200MM
Pęseta metalowaMarienfeld SuperiorPM-6633002
Metanol absolutCicarelli897110
Probówka do mikrowirówki 1,5 mlTarson500010-N
Papier mikroskopowy KimWipes KimtechScienceB0013HT2QW
Milli-Q sistem wodnyMerk MilliporeIQ-7003
mysi klon anty-alfa tubuliny DM1ASigma AldrichT9026
mysie przeciwciała anty-PFROczyszczone Podarowaneprzez Dr. Ariel Silber (USP
)N,N´-metylenobisakryloamidICN193997Bis
Na2HPO4Cicarelli834214
komora NeubaueraPipeta BoecoBOE 01
p1000końcówkiPIPETMAN P1000
p1000 PipetaTarsonTAR-521020B
p20GilsonPIPETMAN P20
p20 końcówki do pipetTarsonTAR-527108
p200 pipetaGilsonPIPETMAN P200
p200 końcówki do pipetTarsonTAR-521010Y
ParaformaldehydSigma AldrichP6148PFA
pH / ORP / ° Miernik CHANNA InstrumentsHI 2211
Poli-D-lizyna 0,1%Sigma AldrichP8920
Chlorek potasuCicarelli867212KCl
ŻyletkaPrintexBS 2982:1992
Folia uszczelniająca "Parafilm M"BemisPM996
Akrylan soduSigma Aldrich408220-25GSA
Wodorowęglan soduCicarelli929211NaHCO3
Chlorek soduCicarelli750214NaCl
Dodecylosiarczan soduBioRad1610302SDS
Wodorotlenek soduMerk1-06498Wirówka NaOH
Sorvall ST 16Thermo Fisher Scientific75004380
Kolby T-25Corning430639
TEMEDInvitrogen15524-010
BibułaElite
TriptoseMerck1106760500
TrisBioRad1610719
Tween-20Biopack2003-07Polisorbat 20
PompapróżniowaOgniwa SilfabN33-A
VeroATCCCRL-1587
Vortex MIxerDragon LabMX-S
DMEM, o716214 do pipet Gilson pipeta

Bibliografia

  1. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  2. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  3. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  4. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2018).
  5. Tillberg, P. W., Chen, F. Expansion microscopy: Scalable and convenient super-resolution microscopy. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 35, 683-701 (2019).
  6. Jurriens, D., van Batenburg, V., Katrukha, E. A., Kapitein, L. C. Mapping the neuronal cytoskeleton using expansion microscopy. Methods in Cell Biology. 161, 105-124 (2021).
  7. Alonso, V. L. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) in Trypanosoma cruzi: localization of tubulin isoforms and isotypes. Parasitology Research. 121 (10), 3019-3024 (2022).
  8. Kalichava, A., Ochsenreiter, T. Ultrastructure expansion microscopy in Trypanosoma brucei. Open Biology. 11 (10), 210132(2021).
  9. Amodeo, S., et al. Characterization of the novel mitochondrial genome segregation factor TAP110 in Trypanosoma brucei. Journal of Cell Science. 134 (5), (2021).
  10. Liffner, B., Absalon, S. Expansion microscopy reveals plasmodium falciparum blood-stage parasites undergo anaphase with a chromatin bridge in the absence of mini-chromosome maintenance complex binding protein. Microorganisms. 9 (11), 2306(2021).
  11. Dos Santos Pacheco, N., Soldati-Favre, D. Coupling auxin-inducible degron system with ultrastructure expansion microscopy to accelerate the discovery of gene function in Toxoplasma gondii. Methods in Molecular Biology. 2369, 121-137 (2021).
  12. Lidani, K. C. F., et al. Chagas disease: From discovery to a worldwide health problem. Frontiers in Public Health. 7, 166(2019).
  13. Carrea, A., Diambra, L. Systems biology approach to model the life cycle of Trypanosoma cruzi. PloS One. 11 (1), e0146947(2016).
  14. Vidal, J. C., De Souza, W. Morphological and Functional Aspects of Cytoskeleton of Trypanosomatids. Cytoskeleton - Structure, Dynamics, Function and Disease. , InTech. (2017).
  15. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617(2020).
  16. Laporte, M. H., Klena, N., Hamel, V., Guichard, P. Visualizing the native cellular organization by coupling cryofixation with expansion microscopy (Cryo-ExM). Nature Methods. 19 (2), 216-222 (2022).
  17. Sahabandu, N., et al. Expansion microscopy for the analysis of centrioles and cilia. Journal of Microscopy. 276 (3), 145-159 (2019).
  18. Wen, G., Leen, V., Rohand, T., Sauer, M., Hofkens, J. Current progress in expansion microscopy: chemical strategies and applications. Chemical Reviews. 123 (6), 3299-3323 (2023).
  19. Trinks, N., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging of immunological synapse formation between NK cells and A. fumigatus by expansion microscopy. Communications Biology. 4 (1), 1151(2021).
  20. White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
  21. Steib, E., et al. TissUExM enables quantitative ultrastructural analysis in whole vertebrate embryos by expansion microscopy. Cell Reports Methods. 2 (10), 100311(2022).
  22. Shaib, A. H., et al. Visualizing proteins by expansion microscopy. bioRxiv. , (2023).
  23. M'Saad, O., et al. All-optical visualization of specific molecules in the ultrastructural context of brain tissue. bioRxiv. , (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia ekspansyjna ultrastrukturychoroba Chagasabia ka cytoszkieletumikroskopia konfokalnaimmunolokalizacjaznakowanie ca ego proteomustadium epimastigotaaksonema wici

Powiązane artykuły