Artykuł metodologiczny

Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris

5.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65382

⸱

27 października 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Waterloo

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wykorzystanie transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) do integracji interesujących genów z genomem jądrowym zielonej mikroalgi Chlorella vulgaris, co prowadzi do produkcji stabilnych transformantów.

Streszczenie

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) służy jako szeroko stosowane narzędzie do manipulowania genomami roślin. Jednak A. tumefaciens wykazuje zdolność do transferu genów do różnych gatunków. Wiele gatunków mikroalg nie ma dobrze ugruntowanych metod niezawodnej integracji genów będących przedmiotem zainteresowania z ich genomem jądrowym. Aby wykorzystać potencjalne korzyści płynące z biotechnologii mikroglonów, kluczowe znaczenie mają proste i skuteczne narzędzia do manipulacji genomem. W niniejszym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół AMT dla przemysłowych gatunków mikroalg Chlorella vulgaris, wykorzystujący białko zielonej fluorescencji reporterowej (mGFP5) i marker oporności na antybiotyki dla higromycyny B. Mutanty są wybierane poprzez posiew na pożywce tris-acetate-fosforanu (TAP) zawierającej higromycynę B i cefotaksym. Ekspresja mGFP5 jest określana ilościowo za pomocą fluorescencji po ponad dziesięciu pokoleniach subhodowli, co wskazuje na stabilną transformację kasety T-DNA. Protokół ten pozwala na niezawodne wygenerowanie wielu transgenicznych kolonii C. vulgaris w czasie krótszym niż dwa tygodnie, przy użyciu dostępnego na rynku wektora ekspresji roślinnej pCAMBIA1302.

Wprowadzenie

Agrobacterium tumefaciens, gram-ujemna bakteria przenoszona przez glebę, posiada unikalną zdolność transferu genów między królestwami, dzięki czemu zyskała tytuł "naturalnego inżyniera genetycznego"1. Bakteria ta może przenosić DNA (T-DNA) z plazmidu indukującego nowotwór (plazmid Ti) do komórek gospodarza poprzez system wydzielania typu IV, co powoduje integrację i ekspresję T-DNA w genomie gospodarza1,2,3,4. W środowisku naturalnym proces ten prowadzi do powstawania nowotworów u roślin, powszechnie znanych jako choroba żółciowa korony. Jednak Agrobacterium może również przenosić T-DNA do różnych innych organizmów, w tym drożdży, grzybów, glonów, zarodków jeżowców, a nawet komórek ludzkich w warunkach laboratoryjnych5,6,7,8.

Wykorzystując ten naturalny system, transformacja za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) umożliwia losową integrację interesujących genów z genomem jądrowym komórki gospodarza poprzez modyfikację regionu T-DNA plazmidu Ti. W tym celu powszechnie stosowanym wektorem ekspresji roślinnej AMT jest pCAMBIA13029. Naukowcy mogą zastosować proste procesy klonowania E. coli przed przeniesieniem pożądanego wektora do A. tumefaciens w celu późniejszego przeniesienia do gospodarza zainteresowania.

Zielone mikroalgi to eukarionty, które mają wiele podobieństw do roślin lądowych, ale są bardzo odporne na modyfikacje genetyczne. Jednak transformacja genetyczna odgrywa kluczową rolę zarówno w podstawowych, jak i biotechnologicznych badaniach nad mikroalgami. W przypadku kilku gatunków mikroalg, w szczególności Chlamydomonas reinhardtii, transformacja genetyczna za pomocą AMT z powodzeniem wprowadziła transgeny, takie jak ludzka interleukina-2 (hIL-2), domena wiążąca receptor koronawirusa 2 zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2 RBD) oraz dwa peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMPs)10,11,12,13. Wśród nich Chlorella vulgaris, mniej wybredny i szybko rosnący gatunek zielonych alg, ma znaczny potencjał w zakresie zrównoważonej produkcji węglowodanów, białek, nutraceutyków, pigmentów i innych wysokowartościowych związków14. Jednak brak niezawodnych narzędzi do tworzenia transgenicznych szczepów C. vulgaris hamuje jego komercyjny rozwój. Ze względu na ograniczoną liczbę opublikowanych prac wykorzystujących AMT w C. vulgaris15 oraz biorąc pod uwagę znaczne różnice między uprawą roślin a uprawą mikroalg, optymalizacja protokołu AMT staje się niezbędna.

W tym badaniu, badacze umieścili zielone białko fluorescencyjne (mGFP5) poniżej promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora (CamV) i dodali znacznik histydyny, aby użyć go jako genu reporterowego do ekspresji białka. Transformanty wyselekcjonowano przy użyciu higromycyny B, a po subkulturze przez ponad dwadzieścia pokoleń przemiana pozostała stabilna. Plazmid pCAMBIA1302 zastosowany w tej pracy może być łatwo przystosowany do zawierania dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto przedstawiona metoda i materiały mogą być dostosowane do innych gatunków zielonych alg z aktywnym promotorem CamV35S, ponieważ ten promotor jest używany do selekcji higromycyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie media i roztwory muszą być autoklawowane przed użyciem, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie probówki wirówkowe, końcówki do pipet itp. powinny być sterylne lub autoklawowane przed użyciem. Dla ułatwienia informacji, receptury pożywek stosowane w tym protokole są wymienione w tabeli 1.

1. Przygotowanie elektrokompetentnych komórek A. tumefaciens

  1. Zaszczepić Agrobacterium (AGL-1) w sterylnej kolbie wytrząsającej o pojemności 25 ml z pożywką LB (uzupełnioną ryfampicyną, 20 mg/L-1) z zamrożonego glicerolu i rosnąć przez noc w temperaturze 28-30 °C i 150 obr./min.
    UWAGA: Szczep Agrobacterium AGL-1 jest (patrz tabela materiałów) odporny na ryfampicynę, ampicylinę, chloramfenikol i streptomycynę i można go uzyskać od kilku dostawców.
  2. Następnego dnia rozcieńczyć kulturę 1 000 000 razy, dodając 0,5 μl kultury na noc do 50 ml autoklawowanej ultraczystej wody i rozprowadzić 10 μl tej rozcieńczonej kultury na płytce LB, a następnie inkubować w temperaturze 28-30 °C przez 1-3 dni.
  3. Wybierz kolonię i rozpocznij 20 ml nocnej hodowli w LB z ryfampicyną w temperaturze 28-30 °C.
  4. Następnego dnia zaszczepić 500 ml pożywki LB (bez antybiotyku) w kolbie z wytrząsarką z 9 ml nocnej kultury i rosnąć w temperaturze 28-30 °C, aż OD600 osiągnie 0,5.
  5. Podzielić kulturę równomiernie na dziesięć probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i schłodzić na lodzie przez 30 minut. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
  6. Odwirować probówki w temperaturze 4 °C i 4000 x g przez 15 minut. Następnie usunąć jak najwięcej supernatantu za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w każdej probówce w 50 ml lodowatej wody.
  7. Odwirować komórki w temperaturze 4 °C i 4000 x g przez 15 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 25 ml lodowatej wody w każdej probówce.
  8. Odwirować komórki w temperaturze 4 °C i 4000 x g przez 15 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego 10% (w/v) glicerolu w każdej probówce.
  9. Połączyć wszystkie probówki w jedną probówkę o pojemności 50 ml i odwirować komórki w temperaturze 4 °C i 4000 x g przez 15 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 μl lodowatej glicerolu o stężeniu 10% (w/v). Koncentracja komórek powinna wynosić około 1-3 x 1010 komórek/ml.
  10. Rozprowadzić komórki w postaci podwielokrotności 50 μl w sterylnych, wstępnie schłodzonych mikroprobówkach. Zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.

2. Elektroporacja A. tumefaciens

  1. Dodać 50 μl elektrokompetentnych komórek AGL-1 A. tumefaciens do wstępnie schłodzonej kuwety 0,1 mm i dodać 2 μl plazmidu pCAMBIA1302 lub podobnego plazmidu (stężenie 15 ng/μl) (patrz tabela materiałów).
  2. Elektroporować przy napięciu 2400 V za pomocą elektroporatora (200 Ω, przedłużacz pojemności 250 μFD, pojemność 25 μFD, zanik wykładniczy, patrz tabela materiałów). Stała czasowa powinna wynosić >4,5 ms, aby elektroporacja zakończyła się sukcesem z rozpadem wykładniczym.
  3. Natychmiast dodaj 1 ml pożywki LB do kuwety i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Przenieść 1 ml zawieszonych komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze 28-30 °C przez co najmniej 1 godzinę w celu odzyskania sprawności.
  4. Umieść komórki na agarze LB zawierającym odpowiedni antybiotyk (tj. 50 mg/l kanamycyny dla pCAMBIA1302 do selekcji prokariotycznej).
  5. Inkubować w temperaturze 28-30 °C przez 2-3 dni.
  6. Wybierz jedną kolonię, hoduj przez noc w LB z odpowiednią selekcją (50 mg/L kanamycyny dla pCAMBIA1302) i kriokonserwuj szczep zawierający plazmid przy użyciu 50% glicerolu w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

3. AMT C. vulgaris

UWAGA: Przygotuj kultury C. vulgaris (UTEX 395, zobacz Tabelę Materiałów) i A. tumefaciens równolegle do wspólnej hodowli. Hodowlę bakterii C. vulgarinależy rozpocząć na 3 dni przed przygotowaniem kultur bakterii A. tumefaciens. Protokół został zmodyfikowany na podstawie tego opublikowanego przez Kumar et al.7.

  1. Przygotuj kulturę C. vulgaris
    1. C. vulgaris jest tradycyjnie przechowywany na skosach lub utrzymywany w kulturach w fazie logarytmicznej w warunkach oświetleniowych. Z kultury w fazie logarytmicznej przy OD600 = 1,0, rozprowadzić 0,5 ml na płytkach agarowych z tris-acetat-fosforanu (TAP, patrz Tabela 1) i rosnąć przez 5 dni w temperaturze 25 °C z oświetleniem (50 μE/m2s). Da to około 5 x 106 komórek.
  2. Przygotować kulturę A. tumefaciens
    1. Wyhodować szczep A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 w kolbie wytrząsającej, zaszczepiając 10 ml pożywki LB uzupełnionej 15 mM glukozy, 20 mg/l ryfampicyny i 50 mg/l kanamycyny (patrz tabela materiałów) przy użyciu glicerolu. Inkubować przez noc w temperaturze 28-30 °C i 250 obr./min.
    2. Zaszczepić 1 ml kultury przez noc w 50 ml LB z 15 mM glukozy, 20 mg/l ryfampicyny i 50 mg/l kanamycyny i inkubować w temperaturze 28-30 °C i 250 obr./min, aż OD600 osiągnie 1,0.
  3. Współuprawa C. vulgaris i A. tumefaciens
    1. Aby przygotować kulturę A. tumefaciens do wspólnej hodowli, przenieś wyhodowaną kulturę do probówki o pojemności 50 ml i odwiruj przy 4000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą pipety i dwukrotnie przemyć komórki pożywką indukcyjną.
      UWAGA: Stosowane media indukcyjne to media TAP dostosowane do pH 5,5 i uzupełnione metalami śladowymi F/2 medium i witaminami z acetosyringonem 200 μM (AS, patrz tabela materiałów). Ponownie zawiesić ogniwa w mediach indukcyjnych tak, aby OD600 = 0,5.
    2. Aby przygotować kulturę C. vulgaris do wspólnej hodowli, dodać 25 ml pożywki indukcyjnej do płytki C. vulgaris zawierającej ~ 5 x 106 komórek. Przenieść do probówki o pojemności 50 ml. Odwirować komórki przy 4000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
    3. Wymieszać osad z komórek glonów z 200 μl zawiesiny bakteryjnej (OD600: 0,5) i inkubować je w wytrząsarce obrotowej w temperaturze 21-25 °C przy 150 obr./min przez 1 godzinę.
    4. Rozprowadzić mieszaną kulturę (200 μl) na płytkach indukcyjnych uzupełnionych 15 mM glukozy i inkubować w temperaturze 21-25 °C w ciemności przez 3 dni.
    5. Po 3 dniach należy użyć 10 ml pożywki TAP uzupełnionej cefotaksymem o stężeniu 400 mg/l lub 20 mg/l tetracykliny (patrz tabela materiałów) w celu zebrania mikroalg i inkubacji w ciemności w temperaturze 21-25 °C przez 2 dni w celu wyeliminowania A. tumefaciens z hodowli.
    6. Umieścić 500 μl kultury na selektywnych pożywkach, np. pożywkach TAP uzupełnionych 20-70 mg/l higromycyny B (w przypadku stosowania pCAMBIA1302) i 400 mg/L-1 cefotaksymu lub 20 mg/l tetracykliny. Inkubować w temperaturze 21-25 °C w ciemności przez 2 dni przed umieszczeniem ich w oświetlonej komorze.
      UWAGA: Odporne kolonie pojawią się 5-7 dni po ekspozycji na światło.
    7. Pobrać pojedyncze kolonie z płytki transformacyjnej i ponownie rozprowadzić je na płytkach agarowych TAP uzupełnionych 400 mg/l cefotaksymu lub 20 mg/l tetracykliny i 20-70 mg/l higromycyny B.

4. Colony PCR (cPCR) w celu potwierdzenia integracji genów w transformantach C. vulgaris

  1. Wyodrębnić genomowe DNA z transformantu C. vulgaris po co najmniej dwukrotnej subkulturze z jednej kolonii przy użyciu zestawu do ekstrakcji genomowego DNA roślinnego (zob. tabela materiałów). Używając tego jako matrycy do PCR, zaprojektuj startery dla regionu mgfp5 T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' i M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
    1. Korzystając z zestawu do mieszania głównej polimerazy DNA o wysokiej wierności Q5 (patrz tabela materiałów), przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), aby zwalidować integrację transgenu.
      UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano następujące warunki: 98 °C przez 3 min; 35 cykli (98 °C przez 10 s, 57 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min); 72 °C przez 5 min. Stosować pCAMBIA1302 jako kontrolę pozytywną i genomowe DNA C. vulgaris typu dzikiego jako kontrolę negatywną.
  2. Aby potwierdzić, że w próbce nie ma pCAMBIA1302 z powodu pozostałego zanieczyszczenia A. tumefaciens, należy użyć PCR kolonii. Dodać niewielką ilość komórek transformacyjnych do 10 μl sterylnej wody i gotować w temperaturze 98 °C przez 15 minut. Użyj tego jako szablonu do PCR.
    1. Zaprojektuj startery dla regionu poza T-DNA na pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAAGAACTTTTC 3' i B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano następujące warunki: 94 °C przez 3 min; 30 cykli (94 °C przez 30 s, 48 °C przez 30 s, 68 °C przez 5 min); 68 °C przez 7 min. Użyć gotowanej kolonii A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) jako kontroli pozytywnej i gotowanej kolonii C. vulgaris typu dzikiego jako kontroli ujemnej.
  3. Aby potwierdzić, że w próbce nie ma zanieczyszczenia A. tumerfaciens, należy użyć PCR kolonii. Dodać niewielką ilość komórek transformacyjnych do 10 μl sterylnej wody i gotować w temperaturze 98 °C przez 15 minut. Użyj tego jako szablonu do PCR.
    1. Projektowanie starterów dla genu virE2 zawartego w plazmidzie wirulencji AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' i virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano następujące warunki: 94 °C przez 3 min; 30 cykli (94 °C przez 30 s, 53 °C przez 30 s, 68 °C przez 3 min); 68 °C przez 7 min. Użyć gotowanej kolonii A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) jako kontroli pozytywnej i gotowanej kolonii C. vulgaris typu dzikiego jako kontroli ujemnej.
  4. Uruchom próbki PCR na żelu agarozowym DNA wraz z drabinką (drabinka DNA 1 Kbp, patrz Tabela materiałów), aby potwierdzić rozmiar otrzymanych fragmentów16.

5. Pomiar fluorescencji transformantów

  1. Inokulować każdy transformant z kultury podtrzymującej w fazie logarytmicznej lub skosie agaru TAP w 50 ml TAP uzupełnionego cefotaksymem 200 mg/L-1 i higromycyną B 25 mg/L-1 tak, aby początkowy ODwynosił 600 = 0,1. Zaszczepić jedną kulturę C. vulgaris typu dzikiego i tylko 200 mg/L-1 cefotaksymem jako kontrolę negatywną. Inkubować w temperaturze 25 °C przy 150 obr./min przy 150 μmol/m2s światła aktywnego fotosyntetycznie (patrz tabela materiałów).
  2. Co 24 godziny pobierać próbkę o objętości 300 μl i mierzyć absorbancję i fluorescencję (wzbudzenie 488 nm, emisja 526 nm) w 96-dołkowym czytniku płytek lub spektrometrze UV/Vis i fluorometrze (patrz tabela materiałów). Do jednoczesnych pomiarów należy użyć czarnej płytki z przezroczystym dnem.

6. Ekstrakcja białka surowego, oczyszczanie białek i elektroforeza SDS-PAGE

  1. Zaszczepić transformant (#50) z kultury podtrzymującej w fazie logarytmicznej do 300 ml TAP uzupełnionego cefotaksymem 200 mg/L-1 i 25 mg/L-1 higromycyną B, aby osiągnąć OD680 = 0,1. Zaszczepić jedną kulturę C. vulgaris typu dzikiego i tylko 200 mg/L-1 cefotaksymem jako kontrolę negatywną. Inkubować w temperaturze 25 °C przy 150 obr./min przy 150 μmol/m2s światła aktywnego fotosyntetycznie.
  2. Ekstrahować surową próbkę białka z transformantu (#50) i szczepów typu dzikiego za pomocą 5 ml buforu do lizy (patrz Tabela 1), a następnie przeprowadzić sonikację przez 4 minuty.
  3. Oczyść surową próbkę białka żywicą Ni-NTA przez kolumny polipropylenowe o pojemności 5 ml (patrz tabela materiałów).
  4. Liofilizuj 15 ml oczyszczonych próbek białka i zawieś je ponownie w 1 ml buforze do lizy do analizy SDS-PAGE17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby pokazać udaną transformację za pomocą powyższej metody, C. vulgaris był hodowany z AGL-1 zawierającym plazmid pCAMBIA1302 lub bez plazmidu (typu dzikiego i posiażdżonego na agarze TAP uzupełnionym higromycyną B i cefotaksymem (Rysunek 1A). Skrajna lewa płytka pokazuje przekształcone kolonie zdolne do wzrostu na płytkach higromycyny B / cefotaksymu, a środkowa płytka pokazuje, że AGL-1 typu dzikiego nie może rosnąć na płytkach higromycyny B / cefotaksymu. Skrajna prawa tabliczka pokazuje, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Efektywność transformacji wiąże się z kilkoma różnymi parametrami. Wybór szczepów A. tumefaciens stosowanych w AMT ma kluczowe znaczenie. AGL-1 jest jednym z najbardziej inwazyjnych odkrytych szczepów i z tego powodu jest rutynowo stosowany w roślinnym AMT. Uzupełnienie pożywki indukcyjnej glukozą (15-20 mM) jest również ważne dla skuteczności AMT. Biorąc pod uwagę, że C. vulgaris może rosnąć zarówno w warunkach fototroficznych, jak i heterotroficznych, glukoza lub inne źródła węgla są często pomijane w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Prof. Paulowi Hooykaasowi za uprzejme dostarczenie wektora pCAMBIA1302 i Agrobacterium tumefaciens AGL1 z Instytutu Biologii w Lejdzie, Uniwersytetu w Lejdzie, Holandia. Autorzy chcieliby również podziękować Evie Colic za pomoc w uprawie transformantów fluorescencyjnych. Praca ta została sfinansowana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych oraz program Mitacs Accelerate.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 Kb Plus drabinka DNAFroggaBioDM015
AcetosyringoneFisher ScientificD26665G
Agrobacterium tumefaciensGold BiotechnologiesSzczep: AGL-1; Prezent od prof. Paula HooykaasaGenotyp: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
BiotynaEnzo Life Sciences89151-400
CaCl2· 2H2OVWRBDH9224-1KG
CefotaximeAK ScientificJ90010
Chlorella vulgarisUniversity of Texas at Austin Culture Collection of Algae Szczep:UTEX 395Wildtype
szczep CoCl2· 6H2OSigma AldrichC8661-25G
CuSO4· 5H2OEMD MilliporeCX2185-1
FeCl3· 6H2OVWRBDH9234-500G
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652662Jednostka główna wyposażona w moduł PC.
GeneJET Zestaw do oczyszczania genomu roślinnegoThermo ScientificK0791
Lodowaty kwas octowyVWRCABDH3093-2,2P
GlicerolBioBasicGB0232
Bufor HEPESSigma AldrichH-3375
Hygromycyna BFisher ScientificAAJ6068103
K2HPO4VWRBDH9266-500G
KanamycinGold BiotechnologiesK-250-25
KH2PO4VWRBDH9268-500G
MgSO4· 7H2OVWR97062-134
MnCl2· 4H2OJT BakerBAKR2540-01
Na2CO3VWRBDH7971-1
Na2EDTA· 2H2OJT Baker8993-01
Na2MoO4· 2H2OJT BakerBAKR3764-01
NaClVWRBDH7257-7
NaH2PO4 H2OMillipore SigmaCA80058-650
NaNO3  VWRBDH4574-500G
NEBExpress Ni ResinNewEngland BioLabsNEB #S1427
NH4ClVWRBDH9208-500G
pCAMBIA1302Leiden UniversityPrezent od prof. Paula HooykaasapBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, promotor CaMV 35S/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Kolumny polipropylenowe (5 ml)QIAGEN34964
Precision Plus Protein Niebarwione wzorce białkowe, rekombinowane ze znacznikami Strep, 1 mlBio-Rad1610363
RifampicinMillipore SigmaR3501-1G
Taśma LED SunBlaster 48 cali SunBlaster
Synergy 4 Microplate BioTEKS4MLFPTA
TetracyklinaThermo Scientific ChemicalsCAAAJ61714-14
TGX Zestaw do usuwania plam z akrylamidu FastCast, 12%Bio-Rad1610185
TiaminaTCI AmericaT0181-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
TryptonBioBasicTG217(G211)
Witamina B12 (cyjanokobalamina)Enzo Life Sciences89151-436
Ekstrakt drożdżowyBioBasicG0961
ZnSO4· 7H2OJT Baker4382-01
Spektrometr UV/Vis 210000000906

Bibliografia

  1. Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
  2. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  3. De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
  4. Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
  5. Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
  6. Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
  7. Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
  8. de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
  9. Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
  10. Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
  11. Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, e0257089(2021).
  12. Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239(2021).
  13. Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
  14. Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36(2018).
  15. Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).
  17. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. , Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed March (2023).
  18. NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. , New England Biolabs Inc. Accessed March https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
  19. Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262(2019).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. Chapter 1: Unit 3D.1. , (2012).
  21. Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
  22. Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
  23. Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transformacja mikroalgprotok AMTzielone bia ko fluorescencyjneselekcja higromycyn Bwektor ekspresyjny ro linstabilna transformacjabiotechnologia mikroalg

Powiązane artykuły