Artykuł metodologiczny

Hodowla białego motyla kapuścianego (Pieris rapae) w kontrolowanych warunkach: studium przypadku z tolerancją na metale ciężkie

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65383

⸱

18 sierpnia 2023

 , 
1Deptartment of Ecology, Evolution and Behavior, University of Minnesota, 2Biology, Sweet Briar College

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół hodowli białego motyla kapuścianego w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych z zastosowaniem sztucznej diety, co pozwala na precyzyjne manipulacje odżywiania we wczesnym okresie życia i ekspozycji na toksyny. Reprezentatywne wyniki pokazują, w jaki sposób można oznaczyć toksyczność metali ciężkich za pomocą tego protokołu.

Streszczenie

Biały motyl kapuściany (Pieris rapae) jest ważnym systemem dla stosowanych badań nad zwalczaniem szkodników i podstawowych badań w zakresie ekologii behawioralnej i żywieniowej. Białka kapusty mogą być łatwo hodowane w kontrolowanych warunkach na sztucznej diecie, co czyni je modelowym organizmem świata motyli. W niniejszej pracy wykorzystano manipulację narażeniem na metale ciężkie w celu zilustrowania podstawowych metod hodowli tego gatunku. Ogólny protokół ilustruje, w jaki sposób motyle mogą być łapane na polu, nakłaniane do składania jaj w klatkach szklarniowych i przenoszone jako larwy na sztuczną dietę. Metody pokazują, w jaki sposób motyle mogą być oznaczane, mierzone i badane pod kątem różnych pytań badawczych. Reprezentatywne wyniki dają wyobrażenie o tym, w jaki sposób sztuczne diety, które różnią się składnikami, mogą być wykorzystywane do oceny wydajności motyli w porównaniu z dietą kontrolną. Mówiąc dokładniej, motyle były najbardziej tolerancyjne na nikiel i najmniej tolerancyjne na miedź, z tolerancją gdzieś pośrodku. Omówiono możliwe wyjaśnienia tych wyników, w tym nadmierną akumulację niklu w niektórych roślinach żywicielskich gorczycy oraz niedawne dowody u owadów, że miedź może być bardziej toksyczna, niż wcześniej sądzono. Wreszcie, dyskusja najpierw omawia zmiany w protokole i wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów z tymi metodami, a następnie rozważa, w jaki sposób przyszłe badania mogą jeszcze bardziej zoptymalizować sztuczną dietę zastosowaną w tym badaniu. Ogólnie rzecz biorąc, zapewniając szczegółowy przegląd wideo hodowli i pomiaru białek kapusty na sztucznych dietach, protokół ten stanowi źródło informacji na temat wykorzystania tego systemu w szerokim zakresie badań.

Wprowadzenie

Mały biały motyl kapusty (Pieris rapae, dalej "kapusta biała") to kosmopolityczny gatunek szkodnika upraw gorczycy, takich jak kapusta, brokuły i rzepak1,2,3. Jednocześnie biała kapusta jest potężnym systemem do badań w biologii i powszechnie używanym modelem motyla, ponieważ można je łatwo hodować i manipulować nimi w kontrolowanych eksperymentach laboratoryjnych4,5. Badania nad białymi motylami kapusty dostarczyły krytycznych informacji na temat wyszukiwania gospodarzy6,7,8, wykorzystanie zasobów nektarowych9,10,11, wybór partnera i selekcja płciowa12,13,14, wzór skrzydła Rozwój i ewolucja15,16,17, oraz odpowiedzi na nowe i zmieniające się środowiska18,19. Wiele z tych spostrzeżeń opiera się na fakcie, że białka kapusty mogą być hodowane na sztucznych dietach4,20,21, które można precyzyjnie zmanipulować, aby odzwierciedlić złe warunki żywieniowe22,23, ekologicznie istotne poziomy zanieczyszczeń24,25,26,27, lub przejście do nowych roślin żywicielskich28,29. W niniejszym badaniu wykorzystano eksperyment dotyczący narażenia na metale ciężkie w celu zilustrowania podstawowych metod hodowli białych motyli kapuścianych na sztucznej diecie w laboratorium oraz kluczowych wskaźników wydajności larw i osobników dorosłych. Wiele aspektów tych metod odnosi się do innych motyli30,31 i moths32,33,34, które mogą być hodowane na sztucznej diecie.

W tym artykule, eksperyment dotyczący tolerancji metalu jest używany do zilustrowania ogólnych metod hodowli białych motyli kapuścianych. Metale ciężkie są powszechnym zanieczyszczeniem antropogenicznym wynikającym z degradacji produktów stosowanych przez ludzi, procesów przemysłowych i zanieczyszczeń powstałych w wyniku historycznego stosowania w pestycydach, farbach i innych produktach35,36,37,38. Wiele metali ciężkich, w tym ołów, miedź, i nikiel, może przedostać się z gleby i wody do tkanki roślinnej39,40,41,42, a metale w pyle mogą osadzać się na liściach roślin43,44,45, co skutkuje wieloma drogami narażenia na larwy owadów fitofagowych. Narażenie na metale ciężkie we wczesnym okresie życia może mieć negatywny wpływ na rozwój zwierząt, zwłaszcza na tkankę nerwową, a wysoki poziom może być śmiertelny35,36,46,47,48. Liczne badania wykazały negatywny wpływ narażenia na metale na rozwijające się owady, w tym zarówno szkodniki, jak i owady pożyteczne49,50,51. Duża liczba zanieczyszczeń metalami ciężkimi oraz fakt, że często współwystępują one w środowisku ludzkim 52, oznacza, że potrzebne są precyzyjne metody laboratoryjne, w których naukowcy mogą wystawić rozwijające się owady na różne poziomy i kombinacje różnych metali, aby zrozumieć i złagodzić ich wpływ na środowisko.

Niniejsza praca porównuje wpływ zwykłych metali na przetrwanie i rozwój białej kapusty, skupiając się na miedzi (Cu), (Zn) i niklu (Ni), trzech powszechnych zanieczyszczeniach w środowisku ludzkim. Na przykład materiały z wiejskich poboczy dróg w Minnesocie zawierają do 71 ppm Zn, 28 ppm Cu i 5 ppm Ni53. W tym eksperymencie manipuluje się poziomami tych metali w sztucznej diecie białych motyli kapusty na poziomach odpowiadających i przekraczających poziomy obserwowane w środowisku. Sztuczna dieta jest stosowana w celu skontrastowania względnej toksyczności tych metali, przewidując, że białka kapusty będą bardziej wrażliwe na zanieczyszczenia metalami, które nie są integralną częścią ich fizjologii (nikiel) w porównaniu z tymi, które występują, choć w niewielkich stężeniach, w enzymach i tkankach (miedź i; Rysunek 1). W całym tekście tym przedstawiono szczegóły metodologiczne i towarzyszące im wizualizacje wideo, aby zilustrować metody hodowli i badań tego ważnego systemu modeli motyli.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone na podstawie zezwolenia USDA APHIS P526P-13-02979.

1. Kolekcja eksperymentalnych motyli

  1. Złap dorosłe samice motyli za pomocą powietrznej siatki na owady. Białka kapusty występują na ogół w otwartych, zakłóconych siedliskach, w których obecne są rośliny nektarowe i rośliny żywicielskie (z rodziny Brassicaceae).
    1. Szukaj, gdy świeci słońce i jest ciepło. Aby celować w samice, szukaj osobników trzepoczących powoli, blisko ziemi i lądujących na roślinach, aby "bębnić" (smakować) liście przedstopiem.
  2. Ustaw samice w klatkach do zbierania jaj.
    UWAGA: Samice zebrane w terenie średnio kojarzyły się z jednym lub dwoma samcami12 i powinny zacząć składać płodne jaja wkrótce po schwytaniu. Dziko żyjące samice potrzebują naturalnego światła do składania jaj i łączenia się w pary, więc umieść klatkę w szklarni lub parapecie.
  3. Samice domowe z rośliną żywicielską do zbierania jaj.
    UWAGA: Samice zaakceptują różne rośliny żywicielskie, w tym zieloną kapustę, rzodkiewkę, jarmuż, kapustę i rzodkiewnik, ale upewnij się, że rośliny nie zostały potraktowane żadnymi pestycydami.
    1. Rośliny żywicielskie należy umieszczać w doniczkach lub pojemnikach z wodą, aby utrzymać ciśnienie liści, takie jak łodygi jarmużu w rurkach z wodą kwiatową.
    2. Jeśli badacz chce zebrać jaja i przenieść je bezpośrednio do diety, najpierw użyj gumki, aby przymocować liść rośliny żywicielskiej do plastikowego kubka z wodą, a następnie rozciągnij kawałek parafilmu wokół krawędzi - samice dotykające liścia złożą jaja na parafilmie (patrz5).
  4. Upewnij się, że w klatce znajduje się również coś, co utrzymuje wysoką wilgotność względną, na przykład poprzez codzienne podlewanie rośliny doniczkowej lub moczenie ręcznika, szczególnie w suchych warunkach. Jeśli rośliny doniczkowe są podlewane w klatce, upewnij się, że ręcznik znajduje się pod doniczką, ponieważ motyle mogą utknąć w kałużującej się wodzie.
  5. Nakarm motyle 10% rozcieńczonym roztworem wody miodowej umieszczonym na żółtej gąbce, której motyle szybko uczą się używać, zwłaszcza jeśli są trzymane z doświadczonymi osobnikami.
    1. Aby zachęcić motyle do żerowania z gąbek, umieść je bezpośrednio na karmniku, zwłaszcza po lekkim spryskaniu butelką z wodą, co często powoduje wystawianie przez nie trąbki.
    2. Aby ustawić podajnik, najpierw dokładnie opłucz żółte lub pomarańczowe gąbki, a następnie pokrój je w małe kwadraty, które mieszczą się w plastikowych szalkach Petriego o średnicy 60 mm. Codziennie zmieniaj karmniki i czyść gąbki w łagodnym roztworze wybielacza, a następnie dokładnie spłucz, aby zapobiec rozwojowi pleśni.

2. Tworzenie sztucznych diet

  1. Najpierw skorzystaj z przepisu z Tabeli 1 lub innych odpowiednich źródeł, aby określić odpowiedni przepis do eksperymentu. Dokonać niezbędnych modyfikacji specyficznych dla gatunku głównego lub eksperymentu. Wydrukuj przepis, którego będziesz przestrzegać podczas ważenia składników.
  2. Zważ wszystkie suche składniki, z wyjątkiem agaru, do jednego pojemnika. Upewnij się, że składniki zostały umieszczone z powrotem w odpowiednim miejscu przechowywania, zwracając uwagę, że kilka składników jest przechowywanych w temperaturze 4°C. Umieść wstępnie zważoną, suchą mieszaninę składników w blenderze z 5 ml oleju lnianego.
  3. Dla każdej partii diety postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
    1. Zmieszać 15 g agaru o drobnych oczkach z 400 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności co najmniej 1 l. Kuchenkę mikrofalową, aż agar zbliży się do wrzenia, z drobnymi bąbelkami w całej mieszaninie, mieszając mieszaninę co 30-60 s, aby zapobiec wykipieniu.
    2. Do tej gorącej mieszanki agarowej dodaj 400 ml wody destylowanej o temperaturze kranu, aby doprowadzić ją do odpowiedniej temperatury do wymieszania z suchymi składnikami, ponieważ mieszanina witamin jest wrażliwa na ciepło.
    3. Dodaj mieszaninę agarową do blendera i dokładnie wymieszaj, w razie potrzeby zeskrobując krawędzie blendera.
  4. Gdy agar się nagrzewa, umieść na blacie co najmniej siedemdziesiąt czterouncjowych kubków dietetycznych tak, aby krawędzie się stykały. Po dokładnym wymieszaniu diety przelej mieszaninę z blendera do kubków dietetycznych, upewniając się, że dieta zakrywa dno każdej filiżanki.
  5. Po ostygnięciu diety umieść pokrywki na kubkach, oznacz kubki dietetyczne rodzajem diety, ułóż je na tacach i przechowuj do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

3. Transfer i hodowla na sztucznych dietach

  1. Liście rośliny żywicielskiej domu z jajami motyla w kubkach delikatesowych o pojemności 30 uncji z siatkową osłoną w komorze klimatycznej o temperaturze 24 °C. Po 1 tygodniu sprawdź kubki, upewniając się, że larwy się wykluły i pod koniec pierwszego lub na początku drugiego stadium rozwojowego, dobry czas na przejście na sztuczną dietę.
  2. Przenieś larwy na sztuczną dietę za pomocą pędzla, dezynfekując je wybielaczem w sprayu i spłukując wodą między pojemnikami z larwami. Przenieś trzy larwy do każdego kubka o pojemności 4 uncji. Chociaż sztuczna dieta jest gęsta energetycznie i może podtrzymywać duże zagęszczenie larw, unikaj pakowania larw do kubków, ponieważ choroby i pleśń mogą rozprzestrzeniać się w kubkach o dużej gęstości larw.
  3. Umieść kubki w plastikowym pojemniku po bokach, tak aby frass spadł na dno kubków i z dala od diety, zmniejszając ryzyko pleśni i chorób.
    1. Przechowuj kubki dietetyczne w kontrolowanych warunkach temperaturowych przy niskim lub umiarkowanym poziomie światła. Monitoruj kubki pod kątem pleśni i chorób co 1-2 dni, zaglądając przez przezroczyste pokrywki kubków.
    2. Kubki z pleśnią lub chorobą można poddać kwarantannie lub zamrozić, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się na inne kubki.

4. Pojawienie się i postępowanie z dorosłymi osobnikami

  1. Pozwól larwom przepoczwarzyć się i wyłonić w kubkach dietetycznych. Kiedy pojawią się dorosłe osobniki, daj im kilka godzin, aby ich skrzydła stwardniały, zanim usuniesz je w celu znakowania. Usuń dorosłe motyle z miseczek czystymi rękami, delikatnie chwytając ich skrzydła, zauważając, że złapanie wszystkich czterech skrzydeł bliżej ich ciała jest bardziej stabilnym chwytem.
  2. Aby oznaczyć motyle, trzymaj suche osobniki za głowę i klatkę piersiową i użyj ostropestki z cienką końcówką, aby delikatnie zaznaczyć liczbę na ich tylnym skrzydle.
    1. Samice zazwyczaj mają dwie czarne plamki na grzbietowym przednim skrzydle i ciemniejsze, bardziej żółtawe tylne, podczas gdy samce mają na ogół jedną mniejszą czarną plamkę na grzbietowym przednim skrzydle na jaśniejszym białym tle54.
    2. Biorąc pod uwagę, że to ubarwienie wykazuje zmienność indywidualną i sezonową, potwierdź płeć za pomocą cech brzusznych - samce mają dwa klamry na dystalnym końcu brzucha i ogólnie węższy brzuch, podczas gdy samice mają pojedynczy otwór na narządy płciowe.
  3. Przenieś dorosłe osoby do woskowych kopert pergaminowych, otwierając kopertę jedną ręką, trzymając motyla za głowę i klatkę piersiową, wsuwając go do koperty i chwytając skrzydełka przez kopertę drugą ręką.
    1. Upewnij się, że wszystkie cztery skrzydełka są normalnie zamknięte w kopercie.
    2. Trzymaj motyle w niskich temperaturach (5-6 °C) przez okres do 1 tygodnia przed eksperymentami, ale po wyjęciu z lodówki odczekaj co najmniej 1 dzień na aklimatyzację.

5. Miary wydajności

  1. Aby zmierzyć cechy skrzydeł u martwych osobników, usuń skrzydła motyla, trzymając klatkę piersiową w jednej ręce i używając kleszczy, aby usunąć każde skrzydło u podstawy. Umieść skrzydła płasko w lightboxie i zrób zdjęcia do późniejszych pomiarów.
  2. Aby uzyskać szacunkową wartość płodności, należy umieścić dorosłe osobniki w klatkach godowych, pozostawiając co najmniej 1 dzień na dojrzewanie reprodukcyjne samców i 1 dzień na krycie. Składaj w ofierze samice w określonych punktach czasowych w celu zliczenia jaj poprzez sekcję lub zbieraj jaja każdego dnia na roślinach żywicielskich.
  3. Aby oszacować obciążenie jajami, usuń brzuch samicy, umieść go w buforze 1x PBS i wytnij szczelinę wzdłuż strony brzusznej.
    1. Użyj kleszczy, aby oddzielić wnętrzności od naskórka, a następnie odciągnij jajniki od jelita, tchawicy i innej zawartości brzucha.
    2. Rozwiń cztery zwinięte jajniki w każdym z dwóch jajników, zwracając uwagę na to, gdzie dojrzałe, żółtkowe i oskorupione jaja przechodzą w niedojrzałe pęcherzyki. Użyj licznika, aby pomóc zliczyć całkowite dojrzałe jaja, zwykle w zakresie od 0 do 200 jaj.
  4. Aby określić stan krycia wypreparowanej samicy, otwórz kopulatrix kaletki i oddziel w niej spermatofory. Gdy spermatofory są trawione, na ogół rozwijają "ogon" i są zagnieżdżone w sobie.

6. Studium przypadku

UWAGA: Dorosłe samice białych motyli kapuścianych zostały zebrane z natury w 2014 roku, aby stworzyć eksperymentalne populacje. Dorosłe samice pochodziły z okolic Davis w Kalifornii (N = 8 samic założycielskich).

  1. Schronienie dla motyli
    1. Samice trzyma się w siatkowych klatkach "BugDorm" (61 cm x 61 cm x 61 cm) w naturalnym świetle w szklarni. Zapewnij organiczny liść kapusty rośliny żywicielskiej (Brassica oleracea) do składania jaj.
    2. Aby utrzymać wilgotność w klatkach, dołącz małą roślinę doniczkową (Cosmos), podlewaną codziennie, umieszczoną na ręczniku w każdej klatce.
    3. Zbieraj jaja codziennie, przenosząc liście z nowymi jajami do plastikowych kubków o pojemności 473 ml z otworami w pokrywie i umieść w komorze klimatycznej.
    4. Zapewnij motylom ad libitum dostęp do 10% roztworu wody z miodem (sporządzonego przez rozcieńczenie organicznego miodu wodą destylowaną), dostępnego przez żółtą gąbkę na małej szalce Petriego, która jest codziennie zmieniana.
  2. Przygotowywanie sztucznych diet
    1. Przygotuj sztuczne diety dla larw białej kapusty, korzystając z modyfikacji wcześniej opracowanych diet Lepidoptera4. Jedna partia diety zawierała 50 g kiełków pszenicy, 27 g kazeiny, 10 g celulozy, 24 g sacharozy, 15 g mąki kapuścianej, 9 g mieszanki soli Wesson, 12 g drożdży Torula, 3,6 g cholesterolu, 10,5 g mieszanki witamin Vanderzant, 1,1 g metyloparabenu, 1,5 g kwasu sorbinowego, 3 g kwasu askorbinowego i 0,175 g streptomycyny (patrz tabela materiałów).
    2. Wstępnie zważ suche składniki dla wielu partii diety (Tabela 1) i dokładnie wymieszaj, aby zwiększyć jednorodność wszystkich rodzajów diety, zanim zostaną podzielone na oddzielne partie w celu zmieszania z roztworami metali.
    3. Umieść suche składniki w blenderze z olejem lnianym i odpowiednią mieszanką metali.
      UWAGA: Olej lniany został użyty w obecnym eksperymencie, ponieważ był sprzedawany przez byłego dostawcę diet dla owadów. Obecnie stosuje się wyłącznie organiczny olej lniany, który jest wytwarzany z tej samej rośliny, ale jest mniej prawdopodobne, że zawiera jakiekolwiek dodatki, jak komercyjni dostawcy oleju lnianego.
    4. Wlej przygotowaną dietę do 118 ml (4 uncje) plastikowych kubków delikatesowych. Używaj rozpuszczalnych soli metali, aby dodać metale ogniskowe do sztucznej diety. Dąż do koncentracji metali w oparciu o wcześniejsze obserwacje zawartości metalu w roślinach (np. akumulacja niklu55,56,57 lub zanieczyszczenie roślin na poboczu drogi58,59,60) oraz tolerancja metali w innych Lepidoptera49,50,51.
    5. Rozpuść sole metali w 500-1000 ml wody destylowanej przed przyjęciem odpowiednich ilości, które zostaną dodane do sztucznej diety. Na przykład, aby przygotować dietę 100 ppm niklu, dodaj 317,6 ml 1 M roztworu NiCl2 do sztucznej diety przed zmiksowaniem, aby uzyskać końcowe stężenie w diecie 100 mg / g suchej masy Ni (około 53 mg / g mokrej masy). Ilość ta przekłada się na średnie zmierzone stężenie 109,6 ppm (Tabela 2) w oparciu o atomową spektroskopię emisyjną ze wzbudzeniem w plazmie sprzężonej indukcyjnie.
      UWAGA: Poziomy metali zostały oszacowane przez Laboratoria Analityczne Uniwersytetu Minnesoty na podstawie sześciu próbek.
  3. konserwacja
    1. Jaja zebrane na roślinach żywicielskich należy utrzymywać w komorze klimatycznej w temperaturze 23 °C w fotoperiodach o godzinie 14:10 przez 7 dni. Następnie przenieś wczesne larwy drugiego stadium do sztucznej diety.
    2. Podczas przenoszenia należy równomiernie podzielić larwy z danej rośliny na cztery rodzaje diety, aby uniknąć pomylenia partii larw z typem diety. Przenieś larwy (N = łącznie 346) jako dwa osobniki na kubek diety o pojemności 118 ml, aby zmniejszyć częstość występowania choroby z powodu przeludnienia i zapewnić wystarczającą ilość miejsca dla dorosłych, aby ostatecznie się zamknęły.
    3. Przebij otwory (po trzy na pokrywkę) w pokrywkach kubków hodowlanych. Umieść kubki w plastikowych pojemnikach wielkości pudełka po butach do hodowli, z różnymi dietami przeplatanymi w celu uniknięcia systematycznych skutków lokalizacji w komorze hodowlanej.
    4. Umieść kubki larw w komorach klimatycznych w temperaturze 23 °C w godzinach 14:10 (z pojemnikami na wodę na dnie komory, aby utrzymać wilgotność na poziomie około 50%-60%, monitorowanymi za pomocą domowego czujnika wilgotności). W przypadku, gdy kubki spleśniały (łącznie około ośmiu kubków w tym studium przypadku), wyjmij kubki z komory i usuń te osoby z eksperymentu.
    5. Pozwolić larwom przepoczwarzyć się i wyłonić w kubkach hodowlanych (N = 162 ogółem).
      UWAGA: W przypadku warunków chowu w tym badaniu, czas rozwoju od zebrania jaj do pojawienia się dorosłego osobnika wynosił średnio około 25-30 dni (w zakresie od 20 do 40 dni, np. 25,28).
    6. Gdy poczwarki zbliżają się do pojawienia się dorosłego osobnika, codziennie sprawdzaj kubki pod kątem nowo zamkniętych osobników i usuwaj dorosłe osobniki z wysuszonymi skrzydłami. Oznacz dorosłe osobniki na ich tylnych skrzydłach odpowiednim indywidualnym numerem (przypisanym przy przenoszeniu larw) za pomocą czarnego sharpie z cienką końcówką. Określ płeć każdego osobnika i zaznacz na kopercie szklanej wraz z ich liczbą i datą pojawienia się. Dorosłe motyle umieścić w szklanych kopertach i przechowywać w temperaturze -20°C do czasu dalszej obróbki.
      UWAGA: Niewielka część wyłaniających się dorosłych osobników wykazuje deformacje skrzydeł, które zakłócają lot i przeżycie dorosłego osobnika (5%-8%); Osoby te są wykluczone z analiz przeżycia w tych eksperymentach.
  4. Pomiar i analiza danych
    1. Zmierz przeżywalność jako przeżycie od drugiego stadium rozwoju (kiedy gąsienice zostały poddane diecie) do pojawienia się dorosłego osobnika.
      UWAGA: Niniejsze badanie koncentrowało się na czasie przeżycia i rozwoju jako miarach wydajności na różnych dietach.
    2. Zmierz czas rozwoju jako liczbę dni między przejściem na dietę a pojawieniem się dorosłego osobnika w komorze klimatycznej.
    3. Na potrzeby analizy danych uruchom dwa zestawy modeli, które obejmowały interakcje między metalem a stężeniem.
      UWAGA: Ponieważ obie interakcje były istotne (F2,194 = 4,56, p = 0,01 dla czasu rozwoju i X2 = 12,1, p = 0,002 dla przeżycia), badanie kontynuowano oddzielną analizą każdego metalu.
    4. Aby przeanalizować przeżywalność, przeprowadź testy chi-kwadrat dla każdego metalu, aby przetestować wpływ dawki metalu (traktowanej jako cztery kategorie) na przeżycie do dorosłości z całkowicie nienaruszonymi skrzydłami.
    5. Po wykryciu znaczącego wpływu dawki należy wykonać kontrolne badanie chi-kwadrat, aby porównać każdy poziom z dietą kontrolną. Aby przeanalizować czas rozwoju (od momentu przeniesienia do pojawienia się jako osoba dorosła), przetestuj wpływ płci na czas rozwoju.
      UWAGA: Ponieważ nie stwierdzono wpływu płci na czas rozwoju (p > 0,10) dla żadnego metalu w tym eksperymencie, pominęliśmy go z rozważań w modelu.
    6. Uruchom oddzielną ANOVA dla każdego metalu, aby przetestować wpływ czterech stężeń na czas rozwoju. Dodatkowo należy przeprowadzić testy t dla każdego stężenia w stosunku do kontroli, aby określić minimalne stężenie, w którym obserwuje się wpływ na wydajność.
      UWAGA: W tym badaniu do wszystkich analiz użyto JMP v16. Wszystkie surowe dane są dostępne na stronie Mendeley61.

Wyniki

Przegląd
Sztuczna dieta może być wykorzystana do hodowli bielinka kapustnika w standardowych warunkach w celu przetestowania wpływu poszczególnych składników diety na kondycję motyli. W niniejszej pracy zastosowano sztuczne diety do badania toksyczności różnych metali występujących w roślinach żywicielskich rosnących na terenach zanieczyszczonych (Rycina 1). Larwy hodowano na dietach zawierających zwiększające się stężenia trzech różnych metali (Rycina 2; szczegółowe informacje metodologiczne przedstawiono w sekcji 6 protokołu). Przeżywalność i rozwój motyli były w największym stopniu zaburzone przez miedź i cynk, a w najmniejszym przez nikiel (Rycina 3 i Rycina 4), przy wrażliwości porównywalnej z innymi badaniami nad motylami i ćmami hodowanymi na sztucznych dietach (Rycina 5).

Przeżywalność
Larwy motyli przeniesiono na sztuczne pożywki zawierające miedź, nikiel, cynk lub pożywkę kontrolną, przy czym stężenie każdego metalu zróżnicowano na trzech poziomach (Tabela 3). Reprezentatywny obraz larw przy zwiększającej się dawce toksyny przedstawiono na Rysunku 2. W przypadku niklu nie stwierdzono wpływu stężenia metalu na przeżywalność, natomiast w przypadku miedzi i cynku efekt ten był istotny (Tabela 3 i Rysunek 3). Porównania post-hoc z użyciem testu chi-kwadrat wykazały, że w przypadku cynku spadek przeżywalności względem pożywki kontrolnej nastąpił jedynie przy najwyższym poziomie cynku (1,000 ppm, porównanie post-hoc X12 = 8.41, p = 0.004; Rysunek 1). Miedź również wykazała istotny spadek przeżywalności tylko przy najwyższych zastosowanych poziomach (500 ppm, X12 = 7.00, p = 0.008), choć przy dwóch najniższych poziomach (50 ppm i 100 ppm) zaobserwowano nieistotny statystycznie wzrost przeżywalności (Rysunek 3).

Czas rozwoju
Stwierdzono istotny wpływ stężenia miedzi i cynku na czas rozwoju (Tabela 4 i Rycina 4). Wraz ze wzrostem stężenia miedzi obserwowano wydłużenie czasu rozwoju, przy czym istotne odchylenie od grupy kontrolnej zaczynało się od 50 ppm (p = 0.027; Rycina 3). Wraz ze wzrostem stężenia cynku również odnotowano wydłużenie czasu rozwoju, a istotne odchylenie od kontroli występowało od 100 ppm (p = 0.03; Rycina 4). Zaobserwowano tendencję, zgodnie z którą zwiększenie zawartości niklu prowadziło do dłuższego czasu rozwoju (p = 0.08; Tabela 4), a porównania każdej diety z grupą kontrolną wykazały istotne efekty począwszy od 100 ppm (p = 0.022; Rycina 4).

Analiza stężenia metali, wykres słupkowy; miedź, nikiel, cynk; wyniki badania wpływu na środowisko.
Rysunek 1: Obserwowane poziomy wybranych metali w tkankach motyli i roślinach żywicielskich. (Dane z62.) Przedstawiono poziomy miedzi, niklu i cynku w tkankach motyli z rodzaju Pieris (hodowanych w laboratorium na kapuście pak choi) oraz w dziko rosnących gorczycach (Bertorea sp.). Ikony samochodów wskazują poziomy zaobserwowane w liściach roślin wzdłuż dróg o dużym natężeniu ruchu53. Poziomy metali w dietach sztucznych stosowanych w niniejszym badaniu przedstawiono w Tabeli 1; punkty reprezentują wartości średnie, a słupki błędu reprezentują błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wzrost gąsienic na dietach o różnym stężeniu; wyniki eksperymentu; analiza wpływu żywienia.
Rysunek 2: Zdjęcie larw bielinka kapustnika przeniesionych w tym samym dniu na sztuczne diety o zwiększającym się stężeniu toksyny. Zdjęcie przedstawia larwy z badania zależności dawka-odpowiedź (opisanego w 28 z wykorzystaniem wysuszonego materiału roślinnego toksycznej rośliny Aristolochia). Zdjęcie wykonane przez ESR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Współczynniki przeżywalności w zależności od stężeń miedzi, niklu i cynku; wykres słupkowy; analiza toksyczności; wpływ biologiczny.
Rycina 3: Zmienność przeżywalności w zależności od diet z metalami o rosnących stężeniach. Gwiazdki oznaczają istotne odchylenie przeżywalności w stosunku do diety kontrolnej. Dokładne stężenia metali w dietach wymieniono w Tabeli 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres czasu rozwoju w funkcji stężenia; miedź, nikiel, cynk; słupki błędów; ppm; wyniki eksperymentalne.
Rysunek 4: Wpływ stężenia metali na czas rozwoju. Gwiazdki wskazują najniższe stężenie metalu, dla którego występuje istotna różnica w stosunku do kontroli (przy użyciu testu t). Dokładne stężenia metali w dietach wymieniono w Tabeli 2. Punkty reprezentują średnie, a słupki błędów reprezentują błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres przeżywalności w obecności toksycznych metali; poziomy Cd, Cu, Ni, Pb, Zn a efekt przeżywalności, wykres słupkowy ppm.
Rysunek 5: Podsumowanie tolerancji metali u innych Lepidoptera. Przedstawiono złożone dane dotyczące przeżywalności wykreślone na podstawie 11 istniejących badań49,50,51,56,63,64,65,66,67,68. Zmienną odpowiedzią jest poziom (w ppm) stężenia metalu, przy którym po raz pierwszy zaobserwowano negatywne efekty dla przeżywalności. Motyle wskazują wyniki z niniejszego badania, przy czym zauważono, że wartości tolerancji dla niklu były wyższe niż te zmierzone w tym badaniu. Punkty reprezentują średnie, a słupki błędów reprezentują błąd standardowy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

SkładnikOdważićgml
Zarodek pszenicyskładniki sypkie50
Celulozaskładniki sypkie10
Mąka z kapustyskładniki sypkie15
Kazeinaskładniki sypkie27
Sacharozaskładniki sypkie24
Mieszanka soli Wessonaskładniki sypkie9
Drożdże Torulaskładniki sypkie12
Cholesterolskładniki suche3.6
Mieszanka witaminowaskładniki sypkie10.5
Metyloparabenskładniki sypkie0.75
Kwas sorbowyskładniki sypkie1.5
Kwas askorbinowyskładniki sypkie3
Streptomycynaskładniki sypkie0.175
Olej lnianyskładniki mokre5
Agar agar15

Tabela 1: Receptura pożywki sztucznej. Przedstawiono masy (i objętości) składników dla jednej partii pożywki dla bielaka kapustnika. Składniki suche (oraz olej lniany) przygotowuje się oddzielnie od mieszaniny agaru (rozpuszczonego w 400 mL wrzącej wody, a następnie schłodzonego poprzez dodanie 400 mL wody o temperaturze pokojowej).

Typ dietyMiedź (ppm)Nikiel (ppm)Cynk (ppm)
Miedź-„100 ppm”96.11.7569.9
Nikiel-„100 ppm”7.29109.668.9
Cynk-„100 ppm”7.961.06186.2
Cynk-„500 ppm”6.511.16708
Kontrola5.890.5959.3

Tabela 2: Pomiary zawartości metali w dietach. Przedstawiono średnie poziomy miedzi, niklu i cynku w podzbiorze diet sztucznych wykorzystanych w badaniu. Nazwa diety („typ” w analizie) znajduje się po lewej stronie, a wartości w cudzysłowie to poziomy obliczone. Docelowe stężenie wskazano w cudzysłowie. Przeanalizowano podzbiór diet stosowanych w badaniu, aby upewnić się, że wartości obliczone są zgodne z wartościami faktycznymi; należy zaznaczyć, że często występuje niewielki stopień zmienności w składzie komponentów diety, a każda raportowana linia reprezentuje tylko jeden powtórz).

JatSztuczna inteligencjaPearson X32P
Miedź (N = 118)17.820.0005
Nikiel (N = 152)3.450.33
Cynk (N = 152)12.520.006

Tabela 3: Wpływ stężenia metali na przeżywalność.Przedstawiono wyniki testu chi-kwadrat dla każdego metalu, porównując trzy stężenia metalu z dietą kontrolną.

MetalFP
Miedź (N = 61)F3,57 = 9.84<0.0001
Nikiel (N = 75)F3,71 = 2.350.079
Cynk (N = 64)F3,60 = 3.790.015

Tabela 4: Wpływ stężenia metali na czas rozwoju. Przedstawiono wyniki poszczególnych analiz ANOVA dla każdego metalu.

Dostępność danych:

Wszystkie dane są dostępne w serwisie Mendeley61.

Dyskusja

W tym badaniu białe motyle kapuściane (Pieris rapae) były hodowane na sztucznej diecie w celu zbadania różnic w toksyczności metali ciężkich. W ten sposób badanie to dostarcza ogólnych metod hodowli i badań laboratoryjnych tego łatwego do manipulowania systemu motyli. W tej dyskusji najpierw rozważa się bardziej ogólne pytania dotyczące recenzowanych tutaj metod, następnie dokonuje się przeglądu naszych ustaleń naukowych, a kończy się refleksjami na temat składników sztucznej diety.

Recenzowany tutaj protokół zawiera kroki ogólnej metody hodowli białych motyli kapuścianych, ale jest wiele punktów w tym protokole, które można dostosować. Na przykład, podczas gdy przedstawione tutaj studium przypadku wykorzystuje gąbki do karmienia, inni badacze mieli szczęście z dentystycznymi i jedwabnymi kwiatami wypełnionymi wodą z miodem5. Podczas gdy obecne badanie wykorzystuje wodę miodową jako pożywienie, inni badacze używali roztworów cukru, a nawet Gatorade. Jeśli poczwarki muszą zostać zważone lub przeniesione do innych warunków do pojawienia się (np. wywołanie diapauzy i konieczność przechowywania w chłodni przez 1 miesiąc), badacz może łatwo usunąć je z kubków, spryskując je wodą, aby zwilżyć ich jedwabne nasadki i chwycić je kleszczami do piór, a następnie ponownie zawiesić je za pomocą taśmy dwustronnej. Jeśli naukowcy potrzebują większej elastyczności w kwestii tego, kiedy dorosłe motyle są przenoszone do klatek w celu zachowania dorosłych, mogą być trzymane w lodówce przez kilka tygodni, ale muszą być karmione. Co kilka dni motyle należy wyjmować, aby karmić je rozcieńczonym roztworem wody z miodem. Przy oświetleniu wewnętrznym można to zrobić za pomocą szpilki do rozwinięcia trąbki do żywności. Jeśli chodzi o wydajność dorosłych, można podjąć szeroki zakres działań fitness na białych motylach kapustnych. Wielkość ciała może być mierzona jako mokra lub sucha masa larw w pewnych stadiach, poczwarek lub dorosłych osobników (ofiarowanych lub trzymanych w szklanych otoczkach) lub poprzez pomiar długości skrzydeł w programie ImageJ (patrz 12,24,25,28). Płodność samic w ciągu całego życia można zmierzyć za pomocą codziennych zbiorów jaj na roślinach żywicielskich 25,69,70, a wielkość określonych cech można zmierzyć jako miarę wydajności; Na przykład masa lub objętość mózgu lub poszczególnych obszarów mózgu 62,71,72 lub masa lub zawartość białka w klatce piersiowej lub mięśniu lotu 62,70. Wreszcie, dorośli mogą być wykorzystywani w badaniach behawioralnych do testowania dowolnej liczby pytań badających wpływ manipulacji dietą na wybór żerowania lub składania jaj 27,73.

Jeśli protokół hodowli nie działa zgodnie z oczekiwaniami, istnieje kilka aspektów, które należy rozwiązać. Po pierwsze, można zapytać, czy poziom światła jest wystarczająco wysoki, aby wywołać normalne zachowanie dorosłych. Podczas gdy przystosowane do laboratorium linie Pieris będą składać jaja w świetle fluorescencyjnym, jedynym sztucznym światłem, które działa w przypadku linii typu dzikiego, są potężne światła szklarniowe o szerokim spektrum. Naturalne światło w szklarniach, na parapetach lub na zewnątrz najlepiej sprawdza się w wywoływaniu zachowań godowych i składania jaj. Po drugie, jeśli jaja się nie wykluwają lub jeśli larwy umierają na wczesnym etapie rozwoju, należy wziąć pod uwagę kilka rzeczy. Materiał roślinny żywiciela musi być organiczny, zauważając, że "organiczne" rośliny ze sklepów są czasami traktowane chemikaliami, które mogą zabijać larwy, więc hodowla własnych roślin żywicielskich jest często najlepsza. Jeśli wskaźnik akceptacji żywiciela jest niższy, można spróbować wyhodować młodsze liście o wyższej zawartości azotu, prezentując rośliny doniczkowe zamiast pojedynczych liści i zapewniając krycie samic. Samice zaakceptują wysiew kapustnych, nawet małych kiełków w wieku 2 tygodni. Metoda parafinowa dobrze sprawdza się w przenoszeniu jaj do różnych warunków, ale należy zauważyć, że wskaźnik akceptacji jest zwykle niższy niż w przypadku całych roślin. Po trzecie, wszystkie składniki diety muszą być wysokiej jakości i nie mogą być przeterminowane. Olej lniany należy wymieniać co roku i przechowywać w lodówce24,25. Kiełki pszenicy, mieszanka witamin i antybiotyki również powinny być przechowywane w chłodzie. Po czwarte, można rozważyć dostosowanie konfiguracji kubka dietetycznego. Do hodowli można użyć dowolnej liczby jednorazowych plastikowych kubków, od 1 uncji do 15 uncji. Odkryliśmy, że 4 uncje to dobry rozmiar, aby umożliwić pojawienie się dorosłego osobnika i ładnie pakuje się do naszych komór klimatycznych. Otwory wbite w pokrywki umożliwiają przepływ powietrza, ale zbyt wiele otworów może wysuszyć dietę w warunkach niskiej wilgotności, więc liczba ta może wymagać dostosowania. Po piąte, może zaistnieć potrzeba dostosowania warunków panujących w komorze klimatycznej w połączeniu z warunkami panującymi w miseczce. Jeśli warunki są zbyt suche, rośliny żywicielskie z jajami mogą wyschnąć, zanim larwy będą mogły zostać przeniesione, a kubki z dietą mogą wyschnąć przed pojawieniem się motyli. Z drugiej strony, jeśli warunki są zbyt mokre, kubki mogą być siedliskiem pleśni i chorób. Naukowcy mogą być zmuszeni do dostosowania przepływu powietrza w kubkach za pomocą siateczkowych pokrywek lub mniej lub bardziej otworów w pokrywkach. Innym częstym problemem są światła komór, które są wystarczająco jasne, aby powodować wahania temperatury w kubkach i gromadzenie się kondensacji; Używanie przyciemnianych świateł jest łatwą opcją do hodowli larw.

W odniesieniu do pytań badawczych zawartych w tym artykule, badanie to wykazało, że białka kapusty były stosunkowo bardziej wrażliwe na miedź niż na nikiel czy. Miedź miała znaczący negatywny wpływ na czas rozwoju w stężeniach tak niskich jak 50 ppm (Rysunek 3 i Tabela 3) oraz na przeżycie przy 500 ppm (Rysunek 4, Tabela 4). Nie stwierdzono natomiast negatywnego wpływu niklu na przeżywalność (do 500 ppm; Rysunek 3) lub negatywny wpływ na czas wywoływania przy 100 ppm (rysunek 4). Białka kapusty były dość tolerancyjne na, z efektami przeżycia obserwowanymi tylko przy 1000 ppm (ryc. 3) i negatywnym wpływem na czas rozwoju zaczynającym się od 100 ppm (ryc. 4). Na podstawie stosunkowo większych stężeń w tkance motyla i gorczycy (ich roślinie żywicielskiej; Rysunek 1) spodziewano się, że zaobserwuje się stosunkowo większą tolerancję na. Jednak wrażliwość na miedź i tolerancja niklu były nieco nieoczekiwane, biorąc pod uwagę bardzo niski poziom niklu w tkance motyla (ryc. 1) i konieczność stosowania miedzi jako mikroelementu. Te nieoczekiwane odkrycia zostały omówione poniżej po rozważeniu tolerancji tych metali u innych motyli i ciem.

Aby porównać obecne dane z wrażliwością metalu mierzoną u innych Lepidoptera, zestawiono dane z istniejących badań dotyczących minimalnego stężenia, w którym metale ciężkie negatywnie wpływały na przeżycie 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; badania te koncentrowały się na, zwłaszcza gatunkach szkodników (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Wszystkie zmierzone wartości czułości w tym badaniu mieszczą się w zakresie zbliżonym do zakresu zmierzonego dla tych innych gatunków (ryc. 5). Jednak miara tolerancji niklu w tym badaniu wydaje się być wyższa niż oczekiwano - podczas gdy nie było znaczącego wpływu na przeżycie przy 500 ppm, poprzednie badanie na Pieris rapae wykazało również bardzo wysoką tolerancję na nikiel (znaczące efekty rozpoczynające się od 1000 ppm56), pomimo niskich poziomów w ich tkance naturalnie (ryc. 1). Miara wrażliwości miedzi w tym badaniu również wydaje się być na niskim poziomie w badaniach nad Lepidoptera. Podczas gdy stosowanie sztucznej diety pozwala na wygodne i kontrolowane porównanie względnej wrażliwości na metale, ważne jest, aby pamiętać, że składniki diety mogą zmienić pomiar bezwzględnej wrażliwości na metale. Na przykład witamina C w diecie może zrównoważyćstres oksydacyjny wywołany przez metale, a antybiotyki w diecie mogą zmienić wpływ drobnoustrojów na przetwarzanie metali75. Interesującym kierunkiem przyszłych badań byłoby systematyczne manipulowanie takimi składnikami diety w celu zbadania wpływu na toksyczność metali, zwłaszcza biorąc pod uwagę pytania o funkcjonalną rolę mikroorganizmów jelitowych lepidoptera76,77 i składników nektaru, które mogą mieć właściwości przeciwutleniające78. Ponadto różnice w wymaganiach żywieniowych różnych gatunków mogą utrudniać porównania międzygatunkowe, a metody oparte na sztucznej diecie powinny być uzupełnione manipulacjami roślinami żywicielskimi.

Motyle te są szczególnie tolerancyjne na nikiel i wrażliwe na miedź. Wcześniejsze badania wykazały, że wiele roślin z rodziny gorczycowatych, do której należą rośliny preferowane przez Pieridae, nadmiernie akumuluje nikiel jako mechanizm obronny przeciwko roślinożercom 55,56,63,79,80,81. Ta hiperakumulacja wynosi ponad 1000 ppm w tkance roślinnej, czyli o rzędy wielkości więcej niż to, co obserwuje się w większości roślin (ryc. 1). Możliwe, że Pieris mają szczególnie wysoką tolerancję na nikiel ze względu na wcześniejszą selekcję przez takie akumulatory niklu, jak wcześniej spekulowano26. Chociaż miedź była rzadziej badana jako mikroelement w diecie owadów, istnieją pewne dowody na to, że odgrywa ona niewielką rolę w reprodukcji i odporności, chociaż głównie u owadów żywiących się krwią (np. 82,83). Możliwe, że miedź odgrywa mniej ważną rolę fizjologiczną u motyli niż u innych zwierząt 84,85,86, co jest zgodne z ostatnimi pracami podkreślającymi, że miedź może być tak samo niepokojącym zanieczyszczeniem dla owadów jak ołów, kadm i rtęć (np. 87,88,89). Podczas gdy wykazano, że Pieris unika zanieczyszczenia miedzią na niskich poziomach90, mobilność miedzi w roślinach (np. przemieszczanie się do liści i kwiatów) również oznaczyła ją jako zanieczyszczenie metalami budzące obawy91.

Chociaż wyniki te dostarczają interesujących danych na temat względnej toksyczności tych metali dla białych motyli kapusty, niniejszy artykuł ma również na celu ogólne zastosowanie jako szczegółowa ilustracja wizualna metod hodowli tego potężnego systemu. Białka kapusty są łatwe do hodowli i manipulowania nimi w kontrolowanych eksperymentach laboratoryjnych 4,5 ułatwiając badania nad poszukiwaniem żywiciela 6,7,8, żerowaniem 9,10,11 i doborem płciowym 12,13,14. Zdolność do hodowania tych motyli na sztucznej diecie jest kluczem do tworzenia wspólnych warunków ogrodowych do porównań i manipulowania składnikami odżywczymi, toksynami, a nawet nowymi roślinami żywicielskimi. Należy jednak zauważyć, że ta sztuczna dieta niekoniecznie jest optymalną sztuczną dietą dla tego gatunku i prawdopodobnie może zostać ulepszona za pomocą przyszłych manipulacji. Na przykład mieszanka soli w tej diecie (i innych dietach lepidoptera) została pierwotnie opracowana dla kręgowców i ma wyższy poziom wapnia niż to, czego potrzebuje większość owadów92,93. W związku z tym niektóre z naszych wysiłków hodowlanych stworzyły niestandardowe mieszanki soli o niższym poziomie wapnia (np. 62), a inne wykorzystują "mieszankę soli Becka", która może być bardziej odpowiednia dla wielu gatunków owadów94. W naszych własnych manipulacjach odkryliśmy również, że motyle radziły sobie lepiej ze stosunkowo mniejszą ilością kiełków pszenicy i stosunkowo większą ilością celulozy w porównaniu z pierwotnymi stężeniami4. Jednym z obszarów wymagających dalszej uwagi jest źródło i stężenie lipidów w diecie. Na przykład wcześniejsze prace wykazały, że przejście z oleju lnianego (używanego w tym badaniu) na fosfolipidy zwiększyło tempo krycia i tempo wzrostu Pieris na sztucznej diecie95. Suplementacja określonych kwasów tłuszczowych w dietach sztucznych może mieć dodatkowe pozytywne efekty 96,97. Optymalizacja sztucznej diety Pieris98,99 stwarza możliwości odpowiedzi na interesujące pytania dotyczące ekologii żywieniowej 100,101,102, ekologii ewolucyjnej i ekotoksykologii. Te podejścia do sztucznej diety pozwalają naukowcom odpowiedzieć na pytania dotyczące roli określonych lipidów w ewolucji poznawczej103, wstępnej adaptacji do toksyn28, składników diety, które zmniejszają toksyczność zanieczyszczeń104 lub interakcji stechiometrycznych między składnikami odżywczymi105.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony asystentów podczas wychowania do tej pracy, w szczególności Reginy Kurandiny i Rhei Smykalski. Carolyn Kalinowski pomogła opracować literaturę na temat toksyczności metali u innych Lepidoptera. Praca ta była możliwa dzięki letniemu grantowi badawczemu Wydziału Ekologii, Ewolucji i Zachowania Uniwersytetu Minnesoty.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zlewka Pyrex 1 lFisher Scientific07-250-059
Butla z podziałką 500 mlFisher Scientific03-007-43
60-milimetrowa plastikowa pokrywka na szalkę PetriegoFisher Scientific08-757-100B
Kwas askorbinowyFrontier6015
BlenderAmazon - Sklep NinjaBL610 Professional
Mąka kapuścianaFrontier1086
KazeinaFrontier1100
CelluoseFrontier3425
CholsterolSigmaC3045
Kubki do hodowli (4 uncje)Wasserstrom6094583zakupu z pasującymi pokrywkami
Agar o drobnych oczkachOlej
amazonB004R63VI6
Rurki wodne z kwiatami, 2.8 x 0.8 calaAmazon - Yimaa BezpośrednieB08BZ969DK
Koperty pergaminowe (1 3/4 x 2 7/8 cala)Amazon - Czarodziejskie klatki
(15.7 x 15.7 x 23.6")Przenośna waga AmazonB07SK6P94S
Methyl ParabenFrontier7685
OhausFisher Scientific02-112-228
Organiczny miódAmazonB07DHQQFGM
Przenośny lightbox do studia fotograficznegoAmazonB07T6TNYJ1
Plastikowy kosz, rozmiar pudełka po butachAmazonB09L3B3V1R
Plastikowe jednorazowe pipety transferoweFisher Scientific13-680-50
Kwas sorbowySigmaS1626
SzpatułkiFisher Scientific14-357Q
StreptomycynaSigmaS9137
SacharozaTarget
Torula DrożdżeFrontier1720
Mieszanka witamin VanderzantFrontierF8045
Łodzie do ważeniaFisher Scientific01-549-750
Wesson Salt MixFrontierF8680
Kiełki pszenicyFrontierG1659
Siatka na motyle z drewnianą rączką, obręcz 12"Amazon - NaukaB00O5JDLVC
Żółte gąbkiAmazon-CeloxB0B8HTHY5B
lniany Sigma o drobnych oczkach siatkowe B0045FG90G monet edukacyjna

Bibliografia

  1. Snyder, L. D., Gomez, M. I., Mudrak, E. L., Power, A. G. Landscape-dependent effects of varietal mixtures on insect pest control and implications for farmer profits. Ecological Applications. 31 (2), 2246(2021).
  2. Shelton, A., Andaloro, J. T., Barnards, J. Effects of cabbage looper, imported cabbageworm, and diamondback moth on fresh market and processing cabbage. Journal of Economic Entomology. 75 (4), 742-745 (1982).
  3. Cartea, M. E., Padilla, G., Vilar, M., Velasco, P. Incidence of the major Brassica pests in northwestern Spain. Journal of Economic Entomology. 102 (2), 767-773 (2009).
  4. Troetschler, R. G., Malone, C. M., Bucago, E. R., Johnston, M. R. System for rearing Pieris rapae (Lepidoptera: Pieridae) on a noncruciferous artificial diet developed for Manduca sexta (Lepidoptera: Sphingidae). Journal of Economic Entomology. 78 (6), 1521-1523 (1985).
  5. Webb, S., Shelton, A. Laboratory rearing of the imported cabbageworm. New Yorks Food and Life Sciences Bulletin. 122, 1-6 (1988).
  6. Root, R. B., Kareiva, P. M. The search for resources by cabbage butterflies (Pieris rapae): ecological consequences and adaptive significance of Markovian movements in a patchy environment. Ecology. 65 (1), 147-165 (1984).
  7. Hern, A., Edwards-Jones, G., McKinlay, R. G. A review of the pre-oviposition behaviour of the small cabbage white butterfly, Pieris rapae (Lepidoptera: Pieridae). Annals of Applied Biology. 128 (2), 349-371 (1996).
  8. Renwick, J. A. A., Radke, C. D. Sensory cues in host selection for oviposition by the cabbage butterfly, Pieris-Rapae. Journal of Insect Physiology. 34 (3), 251-257 (1988).
  9. Lewis, A. C. Memory constraints and flower choice in Pieris rapae. Science. 232 (4752), 863-865 (1986).
  10. Kandori, I., Ohsaki, N. The learning abilities of the white cabbage butterfly, Pieris rapae, foraging for flowers. Researches on Population Ecology. 38, 111-117 (1996).
  11. Alm, J., Ohmeiss, T. E., Lanza, J., Vriesenga, L. Preference of cabbage white butterflies and honey-bees for nectar that contains amino-acids. Oecologia. 84 (1), 53-57 (1990).
  12. Espeset, A., et al. Anthropogenic increases in nutrients alter sexual selection dynamics: a case study in butterflies. Behavioral Ecology. 30 (3), 598-608 (2019).
  13. Tigreros, N. Linking nutrition and sexual selection across life stages in a model butterfly system. Functional Ecology. 27 (1), 145-154 (2013).
  14. Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. In the eyes of the beholders: female choice and avian predation risk associated with an exaggerated male butterfly color. American Naturalist. 176 (6), 768-784 (2010).
  15. Stoehr, A. M., Goux, H. Seasonal phenotypic plasticity of wing melanisation in the cabbage white butterfly, Pieris rapae L. (Lepidoptera: Pieridae). Ecological Entomology. 33 (1), 137-143 (2008).
  16. Stoehr, A. M., Walker, J. F., Monteiro, A. Spalt expression and the development of melanic color patterns in pierid butterflies. Evodevo. 4 (1), 6(2013).
  17. Stoehr, A. M., Wojan, E. M. Multiple cues influence multiple traits in the phenotypically plastic melanization of the cabbage white butterfly. Oecologia. 182 (3), 691-701 (2016).
  18. Ryan, S. F., et al. Global invasion history of the agricultural pest butterfly Pieris rapae revealed with genomics and citizen science. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 20015-20024 (2019).
  19. Snell-Rood, E. C., Papaj, D. R. Patterns of phenotypic plasticity in common and rare environments: a study of host use and color learning in the cabbage white butterfly Pieris rapae. American Naturalist. 173 (5), 615-631 (2009).
  20. Kono, Y. Rearing Pieris rapae crucivora Boisduval (Lepidoptera: Pieridae) on artificial diets. Applied Entomology and Zoology. 3 (2), 96-98 (1968).
  21. Parra, J. R. The Evolution of Artificial Diets and their Interactions in Science and Technology. Insect Bioecology and Nutrition for Integrated Pest Management. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2012).
  22. Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. Developmental responses to variable diet composition in a butterfly: the role of nitrogen, carbohydrates and genotype. Oikos. 119 (4), 636-645 (2010).
  23. Rotem, K., Agrawal, A. A., Kott, L. Parental effects in Pieris rapae in response to variation in food quality: adaptive plasticity across generations. Ecological Entomology. 28 (2), 211-218 (2003).
  24. Shephard, A. M., et al. Assessing zinc tolerance in two butterfly species: consequences for conservation in polluted environments. Insect Conservation and Diversity. 13 (2), 201-210 (2020).
  25. Shephard, A. M., Zambre, A. M., Snell-Rood, E. C. Evaluating costs of heavy metal tolerance in a widely distributed, invasive butterfly. Evolutionary Applications. 14 (5), 1390-1402 (2021).
  26. Kobiela, M. E., Snell-Rood, E. C. Nickel exposure has complex transgenerational effects in a butterfly. Integrative and Comparative Biology. 58 (5), 1008-1017 (2018).
  27. Philips, K. H., Kobiela, M. E., Snell-Rood, E. C. Developmental lead exposure has mixed effects on butterfly cognitive processes. Animal Cognition. 20 (1), 87-96 (2017).
  28. Sikkink, K. L., et al. Tolerance of novel toxins through generalized mechanism simulating gradual host shifts of butterflies. American Naturalist. 195 (3), 485-503 (2020).
  29. Pentzold, S., et al. excretion and avoidance of cyanogenic glucosides in insects with different feeding specialisations. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 66, 119-128 (2015).
  30. Lampert, E. C., Dyer, L. A., Bowers, M. D. Dietary specialization and the effects of plant species on potential multitrophic interactions of three species of nymphaline caterpillars. Entomologia Experimentalis et Applicata. 153 (3), 207-216 (2014).
  31. Genc, H., Nation, J. L. An artificial diet for the butterfly Phyciodes phaon (Lepidoptera: Nymphalidae). Florida Entomologist. 87 (2), 194-198 (2004).
  32. Brinton, F., Proverbs, M., Carty, B. Artificial diet for mass production of the codling moth, Carpocapsa Pomonella (Lepidoptera: Olethreutidae)1. The Canadian Entomologist. 101 (6), 577-584 (1969).
  33. Metwally, H. M., et al. Low cost artificial diet for rearing the greater wax moth, Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) as a host for entomopathogenic nematodes. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 22 (1), 15(2012).
  34. Carpenter, J. E., Bloem, S. Interaction between insect strain and artificial diet in diamondback moth development and reproduction. Entomologia Experimentalis et Applicata. 102 (3), 283-294 (2002).
  35. Jaiswal, A., Verma, A., Jaiswal, P. Detrimental effects of heavy metals in soil, plants, and aquatic ecosystems and in humans. Journal of Environmental Pathology Toxicology and Oncology. 37 (3), 183-197 (2018).
  36. Kumar, A., et al. Lead toxicity: Health hazards, influence on food chain, and sustainable remediation approaches. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (7), 2179(2020).
  37. Gall, J. E., Boyd, R. S., Rajakaruna, N. Transfer of heavy metals through terrestrial food webs: a review. Environmental Monitoring and Assessment. 187, 201(2015).
  38. Mohammed, A. S., Kapri, A., Goel, R. Heavy Metal Pollution: Source, Impact, and Remedies. Biomanagement of Metal-Contaminated Soils. , Springer. 1-28 (2011).
  39. Mitra, A., Chatterjee, S., Voronina, A. V., Walther, C., Gupta, D. K. Lead toxicity in plants: a review. Lead in Plants and the Environment. , Springer. 99-116 (2020).
  40. Perugini, M., et al. Heavy metal (Hg, Cr, Cd, and Pb) contamination in urban areas and wildlife reserves: Honeybees as bioindicators. Biological Trace Element Research. 140 (2), 170-176 (2011).
  41. Rycewicz-Borecki, M., McLean, J. E., Dupont, R. R. Bioaccumulation of copper, lead, and zinc in six macrophyte species grown in simulated stormwater bioretention systems. Journal of Environmental Management. 166, 267-275 (2016).
  42. Zulfiqar, U., et al. Lead toxicity in plants: Impacts and remediation. Journal of Environmental Management. 250, 109557(2019).
  43. Spliethoff, H. M., et al. Estimated lead (Pb) exposures for a population of urban community gardeners. Environmental Geochemistry and Health. 38, 955-971 (2016).
  44. Li, C. C., et al. Foliar dust as a reliable environmental monitor of heavy metal pollution in comparison to plant leaves and soil in urban areas. Chemosphere. 287, 132341(2022).
  45. Ram, S. S., et al. Plant canopies: bio-monitor and trap for re-suspended dust particulates contaminated with heavy metals. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change. 19, 499-508 (2014).
  46. Karri, V., Schuhmacher, M., Kumar, V. Heavy metals (Pb, Cd, As and MeHg) as risk factors for cognitive dysfunction: A general review of metal mixture mechanism in brain. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 203-213 (2016).
  47. Tong, S., von Schirnding, Y. E., Prapamontol, T. Environmental lead exposure: a public health problem of global dimensions. Bulletin of the World Health Organization. 78 (9), 1068-1077 (2000).
  48. Liu, J. H., Lewis, G. Environmental toxicity and poor cognitive outcomes in children and adults. Journal of Environmental Health. 76 (6), 130-138 (2014).
  49. Gintenreiter, S., Ortel, J., Nopp, H. J. Effects of different dietary levels of cadmium, lead, copper, and zinc on the vitality of the forest pest insect Lymantria-Dispar L (Lymantriidae, Lepid). Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 25, 62-66 (1993).
  50. Cheruiyot, D. J., Boyd, R. S., Moar, W. Testing the joint effects hypothesis of elemental defense using Spodoptera exigua. Journal of Chemical Ecology. 41 (2), 168-177 (2015).
  51. Coleman, C. M., Boyd, R. S., Eubanks, M. D. Extending the elemental defense hypothesis: Dietary metal concentrations below hyperaccumulator levels could harm herbivores. Journal of Chemical Ecology. 31 (8), 1669-1681 (2005).
  52. Kaushal, S. S., et al. Making 'chemical cocktails'-Evolution of urban geochemical processes across the periodic table of elements. Applied Geochemistry. 119, 104632(2020).
  53. Shephard, A. M., et al. Traffic patterns, more than adjacent land use, influence element content of roadside forbs for insect pollinators. Ecological Solutions and Evidence. 3 (4), 12195(2022).
  54. Scott, J. A. The Butterflies of North America: A Natural History and Field Guide. , Stanford University Press. (1992).
  55. Boyd, R. S. High-nickel insects and nickel hyperaccumulator plants: A review. Insect Science. 16 (1), 19-31 (2009).
  56. Boyd, R. S., Martens, S. N. Nickel hyperaccumulated by thlaspi-montanum var montanum is acutely toxic to an insect herbivore. Oikos. 70 (1), 21-25 (1994).
  57. Cempel, M., Nickel, G. A review of its sources and environmental toxicology. Polish Journal of Environmental Studies. 15 (3), 375-382 (2006).
  58. Aslam, J., Khan, S. A., Khan, S. H. Heavy metals contamination in roadside soil near different traffic signals in Dubai, United Arab Emirates. Journal of Saudi Chemical Society. 17 (3), 315-319 (2013).
  59. Mitchell, T. S., et al. Traffic influences nutritional quality of roadside plants for monarch caterpillars. Science of the Total Environment. 724, 138045(2020).
  60. Voegborlo, R., Chirgawi, M. Heavy metals accumulation in roadside soil and vegetation along a major highway in Libya. Journal of Science and Technology. 27 (3), 86-97 (2007).
  61. Snell-Rood, E., Kobiela, M. Data for: Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance. , Mendeley Data. (2023).
  62. Snell-Rood, E. C., Espeset, A., Boser, C. J., White, W. A., Smykalski, R. Anthropogenic changes in sodium affect neural and muscle development in butterflies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (28), 10221-10226 (2014).
  63. Boyd, R. S., Moar, W. J. The defensive function of Ni in plants: response of the polyphagous herbivore Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) to hyperaccumulator and accumulator species of Streptanthus (Brassicaceae). Oecologia. 118 (2), 218-224 (1999).
  64. Cheruiyot, D. J., Boyd, R. S., Moar, W. J. Exploring lower limits of plant elemental defense by cobalt, copper, nickel, and zinc. Journal of Chemical Ecology. 39 (5), 666-674 (2013).
  65. Davis, M. A., Boyd, R. S., Cane, J. H. Host-switching does not circumvent the Ni-based defence of the Ni hyperaccumulator Streptanthus polygaloides (Brassicaceae). South African Journal of Science. 97 (11-12), 554-557 (2001).
  66. Dubovskiy, I. M., Grizanova, E. V., Ershova, N. S., Rantala, M. J., Glupov, V. V. The effects of dietary nickel on the detoxification enzymes, innate immunity and resistance to the fungus Beauveria bassiana in the larvae of the greater wax moth Galleria mellonella. Chemosphere. 85 (1), 92-96 (2011).
  67. Jhee, E. M., Boyd, R. S., Eubanks, M. D. Nickel hyperaccumulation as an elemental defense of Streptanthus polygaloides (Brassicaceae): influence of herbivore feeding mode. New Phytologist. 168 (2), 331-343 (2005).
  68. Zhou, J. L., Shu, Y. H., Zhang, G. R., Zhou, Q. Lead exposure improves the tolerance of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) to cypermethrin. Chemosphere. 88 (4), 507-513 (2012).
  69. Snell-Rood, E. C., Davidowitz, G., Papaj, D. R. Reproductive tradeoffs of learning in a butterfly. Behavioral Ecology. 22 (2), 291-302 (2011).
  70. Snell-Rood, E. C., Davidowitz, G., Papaj, D. R. Plasticity in learning causes immediate and trans-generational changes in allocation of resources. Integrative and Comparative Biology. 53 (2), 329-339 (2013).
  71. Snell-Rood, E. C., Papaj, D. R., Brain Gronenberg, W. size: A global or induced cost of learning. Brain Behavior and Evolution. 73 (2), 111-128 (2009).
  72. Snell-Rood, E. C., et al. Nutritional constraints on brain evolution: Sodium and nitrogen limit brain size. Evolution. 74 (10), 2304-2319 (2020).
  73. Jaumann, S., Snell-Rood, E. C. Adult nutritional stress decreases oviposition choosiness and fecundity in female butterflies. Behavioral Ecology. 30 (3), 852-863 (2019).
  74. Sahiti, H., Bislimi, K., Bajgora, A., Rexhepi, A., Dalo, E. Protective effect of vitamin C against oxidative stress in common carp (Cyprinus carpio) induced by heavy metals. International Journal of Agriculture and Biosciences. 7 (2), 71-75 (2018).
  75. Rothman, J. A., Leger, L., Graystock, P., Russell, K., McFrederick, Q. S. The bumble bee microbiome increases survival of bees exposed to selenate toxicity. Environmental Microbiology. 21 (9), 3417-3429 (2019).
  76. Hammer, T. J., Janzen, D. H., Hallwachs, W., Jaffe, S. P., Fierer, N. Caterpillars lack a resident gut microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (36), 9641-9646 (2017).
  77. Hammer, T. J., Sanders, J. G., Fierer, N. Not all animals need a microbiome. FEMS Microbiology Letters. 366 (10), (2019).
  78. Baker, H. G., Baker, I. Coevolution of Animals and Plants. , University of Texas Press. 100-140 (1975).
  79. Boyd, R. S., Davis, M. A., Wall, M. A., Balkwill, K. Metal concentrations of insects associated with the South African Ni hyperaccumulator Berkheya coddii (Asteraceae). Insect Science. 13 (2), 85-102 (2006).
  80. Boyd, R. S., Wall, M. A., Jaffre, T. Nickel levels in arthropods associated with Ni hyperaccumulator plants from an ultramafic site in New Caledonia. Insect Science. 13 (4), 271-277 (2006).
  81. Kramer, U. Metal hyperaccumulation in plants. Annual Review of Plant Biology. 61, 517-534 (2010).
  82. Cardoso-Jaime, V., Broderick, N. A., Maya-Maldonado, K. Metal ions in insect reproduction: a crosstalk between reproductive physiology and immunity. Current Opinion in Insect Science. 52, 100924(2022).
  83. Rivera-Perez, C., Clifton, M. E., Noriega, F. G. How micronutrients influence the physiology of mosquitoes. Current Opinion in Insect Science. 23, 112-117 (2017).
  84. Lee, J. H. Micronutrient deficiency syndrome: zinc, copper and selenium. Pediatric Gastroenterology, Hepatology & Nutrition. 15 (3), 145-150 (2012).
  85. Nube, M., Voortman, R. L. Human micronutrient deficiencies: linkages with micronutrient deficiencies in soils, crops and animal nutrition. Combating Micronutrient Deficiencies: Food-Based Approaches. , CABI International. Wallingford, UK. 289-311 (2011).
  86. Wysocka, D., Snarska, A., Sobiech, P. Copper-An essential micronutrient for calves and adult cattle. Journal of Elementology. 24 (1), 101-110 (2019).
  87. Oliveira, C. S., et al. Toxic metals that interact with thiol groups and alteration in insect behavior. Current Opinion in Insect Science. 52, 100923(2022).
  88. Mogren, C. L., Trumble, J. T. The impacts of metals and metalloids on insect behavior. Entomologia Experimentalis et Applicata. 135 (1), 1-17 (2010).
  89. Hladun, K. R., Di, N., Liu, T. X., Trumble, J. T. Metal contaminant accumulation in the hive: Consequences for whole-colony health and brood production in the honey bee (Apis mellifera L.). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (2), 322-329 (2016).
  90. Elbassiouny, S. A. Changes in food-related behavioral-patterns of some phytophagous insect species following exposures to an antifeedant. Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica. 26 (3-4), 483-496 (1991).
  91. Hladun, K. R., Parker, D. R., Trumble, J. T. Cadmium, copper, and lead accumulation and bioconcentration in the vegetative and reproductive organs of Raphanus sativus: Implications for plant performance and pollination. Journal of Chemical Ecology. 41, 386-395 (2015).
  92. Nation, J., Robinson, F. Concentration of some major and trace elements in honeybees, royal jelly and pollens, determined by atomic absorption spectrophotometry. Journal of Apicultural Research. 10 (1), 35-43 (1971).
  93. Herbert Jr, E. W., Shimanuki, H. Mineral requirements for brood-rearing by honeybees fed a synthetic diet. Journal of Apicultural Research. 17 (3), 118-122 (1978).
  94. Beck, S. D., Chippendale, G., Swinton, D. Nutrition of the European corn borer, Ostrinia nubilalis. VI. A larval rearing medium without crude plant fractions. Annals of the Entomological Society of America. 61 (2), 459-462 (1968).
  95. Junnikkala, E. Rearing Pieris-Brassicae (L.) on a phospholipid and vitamin-supplemented semi-artificial diet. Annales Zoologici Fennici. 17 (1), 39-42 (1980).
  96. Hixson, S. M., et al. Long-chain omega-3 polyunsaturated fatty acids have developmental effects on the crop pest, the Cabbage White Butterfly Pieris rapae. PLoS One. 11 (3), e0152264(2016).
  97. Turunen, S. Lipid utilization in adult Pieris brassicae with special reference to the role of linolenic acid. Journal of Insect Physiology. 20 (7), 1257-1269 (1974).
  98. Vanderzant, E. S. Development, significance, and application of artificial diets for insects. Annual Review of Entomology. 19, 139-160 (1974).
  99. Cohen, A. C. Insect Diets: Science and Technology. , CRC Press. (2003).
  100. Balluffi-Fry, J., Leroux, S. J., Champagne, E., Vander Wal, E. In defense of elemental currencies: can ecological stoichiometry stand as a framework for terrestrial herbivore nutritional ecology. Oecologia. 199 (1), 27-38 (2022).
  101. Coogan, S. C. P., Raubenheimer, D., Zantis, S. P., Machovsky-Capuska, G. E. Multidimensional nutritional ecology and urban birds. Ecosphere. 9 (4), 02177(2018).
  102. Raubenheimer, D., Simpson, S. J., Mayntz, D. Nutrition, ecology and nutritional ecology: toward an integrated framework. Functional Ecology. 23 (1), 4-16 (2009).
  103. Arien, Y., Dag, A., Zarchin, S., Masci, T., Shafir, S. Omega-3 deficiency impairs honey bee learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (51), 15761-15766 (2015).
  104. Man, K. Y., et al. Use of biochar as feed supplements for animal farming. Critical Reviews in Environmental Science and Technology. 51 (2), 187-217 (2021).
  105. Shephard, A. M., Knudsen, K., Snell-Rood, E. C. Anthropogenic sodium influences butterfly responses to nitrogen-enriched resources: implications for the nitrogen limitation hypothesis. Oecologia. 201 (4), 941-952 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sztuczna dietakontrolowana hodowlaznakowanie motyliro lina ywicielskaprzenoszenie larwtempo rozwojuzanieczyszczenia miejskie
Hodowla białego motyla kapuścianego (Pieris rapae) w kontrolowanych warunkach: studium przypadku z tolerancją na metale ciężkie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.