Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie ex vivo wycinka rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach ruchowych podczas stymulacji rdzenia kręgowego

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65385

⸱

8 września 2023

 ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Neuromodulation, School of Aerospace Engineering, Tsinghua University, 2IDG/McGovern Institute for Brain Research, Tsinghua University, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę wykorzystującą patch-clamp do badania elektrycznych reakcji neuronów ruchowych na stymulację rdzenia kręgowego (SCS) z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, co może pomóc badaczom poprawić ich umiejętności w rozdzielaniu rdzenia kręgowego i jednoczesnym utrzymywaniu żywotności komórek.

Streszczenie

Stymulacja rdzenia kręgowego (SCS) może skutecznie przywrócić funkcje lokomotoryczne po urazie rdzenia kręgowego (SCI). Ponieważ neurony ruchowe są ostatnią jednostką do wykonywania zachowań sensomotorycznych, bezpośrednie badanie reakcji elektrycznych neuronów ruchowych za pomocą SCS może pomóc nam zrozumieć logikę leżącą u podstaw rdzeniowej modulacji ruchowej. Aby jednocześnie rejestrować różne charakterystyki bodźców i odpowiedzi komórkowych, dobrym sposobem badania cech elektrofizjologicznych w skali pojedynczej komórki jest patch-clamp. Jednak nadal istnieją pewne złożone trudności w osiągnięciu tego celu, w tym utrzymanie żywotności komórek, szybkie oddzielenie rdzenia kręgowego od struktury kostnej i wykorzystanie SCS do skutecznej indukcji potencjałów czynnościowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystujący patch-clamp do badania odpowiedzi elektrycznych neuronów ruchowych na SCS z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, co może pomóc badaczowi poprawić swoje umiejętności w zakresie oddzielania rdzenia kręgowego i utrzymania żywotności komórki w tym samym czasie, aby płynnie badać mechanizm elektryczny SCS na neuronach ruchowych i uniknąć niepotrzebnych prób i błędów.

Wprowadzenie

Stymulacja rdzenia kręgowego (SCS) może skutecznie przywrócić funkcje lokomotoryczne po urazie rdzenia kręgowego (SCI). Andreas Rowald i wsp. stwierdzili, że SCS umożliwia funkcjonowanie lokomotoryczne i tułowia kończyn dolnych w ciągu jednego dnia1. Badanie biologicznego mechanizmu SCS w celu odzyskania zdolności lokomotorycznych jest kluczowym i trendowym obszarem badawczym dla opracowania bardziej precyzyjnej strategii SCS. Na przykład zespół Grégoire'a Courtine'a wykazał, że pobudzające interneurony Vsx2 i neurony Hoxa10 w rdzeniu kręgowym są kluczowymi neuronami reagującymi na SCS, a neuromodulacja specyficzna dla komórek jest możliwa do przywrócenia zdolności chodzenia szczura po SCI2. Jednak niewiele badań koncentruje się na mechanizmie elektrycznym SCS w skali pojedynczej komórki. Chociaż powszechnie wiadomo, że ponadprogowy bodziec prądu stałego może wywołać potencjały czynnościowe (AP) w klasycznym eksperymencie z kałamarnicami3,4,5, nadal nie jest jasne, w jaki sposób impulsowa naprzemienna stymulacja elektryczna, taka jak SCS, wpływa na generowanie sygnału motorycznego.

Biorąc pod uwagę złożoność wewnątrzrdzeniowych obwodów neuronowych, odpowiedni wybór populacji komórek jest ważny dla zbadania elektrycznego mechanizmu SCS. Chociaż SCS przywraca funkcje motoryczne poprzez aktywację szlaku proprioceptywnego6, neurony ruchowe są ostatnią jednostką, która wykonuje polecenie motoryczne, pochodzące z integracji informacji propriocepcyjnych aferentnych wejściowych7. Dlatego bezpośrednie badanie charakterystyki elektrycznej neuronów ruchowych za pomocą SCS może pomóc nam zrozumieć logikę leżącą u podstaw rdzeniowej modulacji motorycznej.

Jak wiemy, patch-clamp to złoty standard dla komórkowego zapisu elektrofizjologicznego z niezwykle wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną8. Dlatego w niniejszym badaniu opisano metodę wykorzystującą zacisk krosowy do badania odpowiedzi elektrycznych neuronów ruchowych na SCS. W porównaniu z klamrą mózgową9, zacisk do rdzenia kręgowego jest trudniejszy z następujących powodów: (1) Rdzeń kręgowy jest chroniony przez kanał kręgowy o małej objętości, który wymaga bardzo drobnej mikromanipulacji i rygorystycznej konserwacji w lodowatym stanie, aby uzyskać lepszą żywotność komórek. (2) Ponieważ rdzeń kręgowy jest zbyt cienki, aby można go było zamocować na tacy do cięcia, należy go zanurzyć w agarozie o niskiej temperaturze topnienia i przyciąć po zestaleniu.

Stąd, ta metoda dostarcza szczegółów technicznych w zakresie preparowania rdzenia kręgowego i jednoczesnego utrzymania żywotności komórek, tak aby płynnie badać mechanizm elektryczny SCS na neuronach ruchowych i uniknąć niepotrzebnych prób i błędów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania zatwierdził wszystkie eksperymenty na zwierzętach, a badania zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. zwierzęta
    1. Informacje o pomieszczeniach: Samiec szczura Sprague-Dawley (po urodzeniu 10-14 dni, P10-P14) w specyficznym środowisku wolnym od patogenów.
      UWAGA: Warunki pokojowe utrzymywano na poziomie 20 °C ± 2 °C, wilgotność: 50%-60%, przy 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Zwierzęta miały swobodny dostęp do pożywienia i wody.
    2. Oznacz neurony ruchowe wstecz: Wstrzyknij fluoro-złoto (FG) do obustronnego mięśnia piszczelowego przedniego i brzuchatego łydki (2% w sterylnej soli fizjologicznej, 50 μl na mięsień), aby wstecznie oznaczyć neurony ruchowe 2 dni przed ofiarą.
  2. Rozwiązania
    1. Przygotuj roztwór do cięcia: Wymieszaj 120 mM chlorku choliny, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 0,5 mM CaCl2, 7 mM MgCl2, 1,3 mM kwasu askorbinowego, 15 mM glukozy. Wstępnie bąbelkować roztwór 95%O2 i 5% CO2 (dostosować do pH 7,4 za pomocą KOH) przez 30 minut przed rozbieraniem i krojeniem. Ostudzić roztwór kruszonym lodem.
    2. Przygotuj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF): Wymieszaj 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4; 1,3 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mMNaHCO3 i 10 mM glukozy. Wstępnie bąbelkować roztwór z 95%O2 i 5% CO2 przez 30 minut przed inkubacją.
    3. Przygotuj roztwór wewnątrzkomórkowy: Wymieszaj 126 mM K-glukonianu, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na2ATP, 0,4 mM Na2GTP, 10 mM K-fosfokreatyny i 0,5% neurobiotyny (pH 7,25 i 305 mOsm/kg). Ostudzić roztwór kruszonym lodem.
    4. Przygotuj niskotopliwy żel agarozowy: Rozpuść 4 g agarozy w 100 ml roztworu tnącego i użyj magnetycznego wirnika mieszającego, aby całkowicie go rozpuścić. W 30 minut przed zatopieniem podgrzej niskotemperaturową agarozę w kuchence mikrofalowej z dużą mocą przez 1 minutę, a następnie przenieś ją do łaźni wodnej o temperaturze 39 °C, aby utrzymać stan ciekły.
  3. Przygotowanie instrumentu
    1. Umieść kruszony lód na tacy perfuzyjnej (rysunek uzupełniający 1A) na 10 minut przed perfuzją. Umieścić wcześniej na noc tacę anatomiczną (rysunek uzupełniający 1B) i tacę do cięcia (rysunek uzupełniający 1C) z opaską wodną w temperaturze -80 °C.
    2. Komorę inkubacyjną z siatką nylonową umieścić wcześniej na noc w piekarniku w temperaturze 45 °C.
    3. Użyj agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aby prefabrykować nachylenie 35° i platformę o grubości 2 mm (rysunek uzupełniający 1D). Po zestaleniu żelu umieść je na środku 35-milimetrowej szalki Petriego, aby podeprzeć rdzeń kręgowy w kolejnych nadchodzących zabiegach.
  4. Perfuzja śródsercowa
    1. Znieczulić szczury 2,5% tribromoetanolem (160 μl/10 g) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Upewnij się, że szczury są w pełni znieczulone, sprawdzając brak reakcji na bodźce zewnętrzne, takie jak delikatne szczypanie palca u nogi.
    2. Gdy prawidłowe znieczulenie zostanie potwierdzone, ułóż szczury na wznak i unieruchom je na szalce Petriego wypełnionej żelem krzemionkowym.
    3. Wytnij 5-milimetrowe podłużne nacięcie skóry doogonowo do wyrostka mieczykowatego, a następnie całkowicie rozszerz przestrzeń podskórną. Wytnij 2-centymetrowe podłużne nacięcie skóry wzdłuż brzusznej linii środkowej, aby całkowicie odsłonić zewnętrzną ścianę klatki piersiowej, zaczynając od wyżej wymienionego nacięcia, a kończąc na górnej części klatki piersiowej.
    4. Użyj pęsety zębatej, aby podnieść mieczyk mieczykowaty (rysunek uzupełniający 2A), a następnie użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć membranę. Przeciąć mostek po obu stronach wyrostka mieczykowatego, aby otworzyć klatkę piersiową i odsłonić serce (rysunek uzupełniający 2B).
      UWAGA: Uważaj, aby zachować wewnętrzne naczynia piersiowe po obu stronach; W przeciwnym razie może spowodować masywne krwawienie.
    5. Użyj bezzębnej pęsety, aby podnieść lewą komorę. Wprowadzić igłę 22 G do wierzchołka lewej komory wzdłuż osi podłużnej lewej komory (rysunek uzupełniający 2C). W międzyczasie obserwuj rytmiczne pulsowanie krwi w rurce perfuzyjnej, w przeciwnym razie igła może wbić się w prawą komorę, co może prowadzić do słabego efektu perfuzji.
      UWAGA: Nie należy używać pęsety zębatej; W przeciwnym razie może to spowodować dodatkowy wyciek krwi z miejsca, w którym trzyma się pęseta.
    6. Użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć prawy przedsionek (rysunek uzupełniający 2C), a następnie ręcznie wstrzyknij 100 ml lodowatego płynu perfuzującego z szybkością około 2 ml / s w ciągu 1 minuty
      UWAGA: Kiedy wątroba i łapy szczurów bledną, a krew nie wypływa z prawego przedsionka, można osiągnąć dobrą perfuzję.
  5. Rozwarstwienie rdzenia kręgowego (Rysunek 1)
    1. Umieść szczura w pozycji leżącej i przetnij kręgosłup odpowiednio w przedniej górnej części kręgosłupa biodrowego (około poziomu kręgów L4) i punkcie zmiany krzywizny kręgosłupa piersiowego (około poziomu kręgów T6) (Rysunek 1A). Następnie natychmiast umieść izolowany kręgosłup w natlenionym, lodowatym roztworze perfuzyjnym, aby zmyć resztki krwi i tkanki tłuszczowej; Procedura ta jest korzystna dla utrzymania czystości pola operacyjnego w kolejnych zabiegach.
      UWAGA: Mięśnie przykręgosłupowe powinny być zarezerwowane, co sprzyja późniejszemu unieruchomieniu kręgosłupa za pomocą szpilki przeciw owadom.
    2. Natychmiast przenieś izolowany kręgosłup do anatomicznej tacy (Ryc. 1B) grzbietem do góry i końcem rostralnym blisko operatora. Napełnij anatomiczną tacę 50 ml stale natlenionego roztworu do cięcia na zimno (Rysunek 1B).
    3. Użyj czterech szpilek do owadów, aby przymocować kręgosłup, penetrując mięśnie przykręgosłupowe (Rysunek 1B).
    4. Pod mikroskopem preparacyjnym przeciąć szypułki kręgów po obu stronach od końca rostralnego za pomocą mikronożyczek, które można nazwać "laminektomią" (Ryc. 1C). Uważaj, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego. W międzyczasie użyj pęsety z mikrozębami, aby podnieść przecięty trzon kręgu.
    5. Po laminektomii nie należy od razu oddzielać rdzenia kręgowego od kanału kręgowego. Zamiast tego użyj mikronożyczek, aby przeciąć oponę twardą wzdłuż grzbietowej linii środkowej, co sprzyja pobieraniu składników odżywczych między komórkami i natlenionemu ACSF (Rysunek 1D).
      UWAGA: Nigdy nie rozrywaj opony twardej. Dozwolone jest tylko cięcie opony twardej mikronożyczkami; W przeciwnym razie korzeń nerwowy i miąższ rdzeniowy zostaną poważnie uszkodzone!
    6. Podnieś rostralną część rdzenia kręgowego, a następnie ostrożnie odetnij korzeń nerwowy z zachowaniem około 1 mm (Rysunek 1E). Po oddzieleniu rdzenia kręgowego od kanału kręgowego, użyj 2 szpilek przeciw owadom, aby przymocować rdzeń kręgowy brzuszną stroną do góry (Rysunek 1F).
    7. Użyj mikronożyczek, aby przeciąć oponę twardą wzdłuż brzusznej linii środkowej (Rysunek 1F). Odetnij zbędne korzenie nerwowe z zapasem około 1 mm.
      UWAGA: Nerw jest znacznie bardziej wytrzymały niż rdzeń kręgowy. Jeśli zarezerwowany korzeń nerwowy jest zbyt długi (>1 mm), wibratomizm nie może odciąć korzenia nerwowego, co może prowadzić do poważnego zerwania miąższu kręgosłupa.
    8. Za pomocą mikronożyczek oddzielić powiększenie odcinka lędźwiowego na długość 6-7 mm (Rysunek 1G).
  6. Osadzanie w niskotopliwej agarozie
    1. Umieść powiększenie odcinka lędźwiowego na nachyleniu 35 ° (Rysunek 1H) stroną grzbietową do góry i końcem ogonowym do dołu. Użyj chłonnej bibuły filtracyjnej, aby usunąć obfitą ilość wody z powierzchni tkanki (Rysunek 1H).
    2. Powoli wlej stopiony żel agarozowy na szalkę Petriego zawierającą powiększenie odcinka lędźwiowego (Rysunek 1I).
      UWAGA: Nie nalewaj zbyt szybko, ponieważ w żelu będą gromadzić się bąbelki.
    3. Umieść powyższą szalkę Petriego w mieszaninie lodowatej wody i wody, aby jak najszybciej schłodzić żel, co sprzyja utrzymaniu aktywności komórek.
    4. Przytnij żel do kostki o wymiarach 15 mm x 10 mm x 10 mm i zamontuj go na krążku próbki za pomocą kleju superglue (Rysunek 1J).
  7. Krojenie
    1. Umieść krążek próbki w wstępnie zamrożonej tacce do cięcia, a następnie wlej lodowaty roztwór do cięcia (Rysunek 1K). Ciągle bąbelkować z 95% CO2 i 5% O2 do tacy do cięcia.
    2. Ustaw parametry wibratomu: grubość: 350 μm, prędkość: 0,14-0,16 mm/s, amplituda: 1,0 mm, częstotliwość drgań: 85 Hz.
    3. Zbierz 2-3 odpowiednie plastry na zwierzę. Rejestruj 1-2 zdrowe neurony ruchowe FG+ na plasterek, w zakresie 5-6 komórek na zwierzę.
  8. Inkubacja
    1. Użyj pęsety do szkiełka do pokrywy, aby przyciąć plasterek (Rysunek 1L) i umieść go w komorze inkubacyjnej wypełnionej stale natlenionym ACSF. Umieścić komorę inkubacyjną w łaźni wodnej o temperaturze 32 °C na 30 minut, a następnie kontynuować inkubację w temperaturze pokojowej (RT) przez kolejne 30 minut przed rejestracją.
      UWAGA: Powyższe procedury, od znieczulenia do uzyskania pierwszego wycinka, powinny być zakończone w ciągu 20-30 minut, aby w jak największym stopniu zachować żywotność komórek. Neurony ruchowe w każdym wycinku mogą utrzymać swoją żywotność przez około 6-7 godzin.

2. Nagrywanie patch-clamp za pomocą SCS (Rysunek 2)

  1. Preparaty
    1. Napełniać komorę rejestracyjną ciągłym bąbelkowym ACSF z szybkością około 1-2 ml/min. Natężenie przepływu należy regulować indywidualnie za pomocą panelu sterowania na pompie perystaltycznej.
    2. Umieść plasterek w komorze nagrywania. Użyj platynowego drutu w kształcie litery U z nylonowymi nitkami, aby mocno ustabilizować plasterek na miejscu.
    3. Użyj mikroskopu kontrastowego z interferencją różnicową w podczerwieni (IR-DIC), aby obserwować wycinek. Pod soczewką obiektywu 4x upewnij się, że długość korzenia grzbietowego wynosi około 1 mm. Znajdź obszar, w którym korzeń grzbietowy wchodzi w miąższ, a następnie przenieś centralne pole widzenia do tego obszaru.
    4. Podłącz generator impulsów do specjalnie wykonanych elektrod (Rysunek 2A).
  2. Konfiguracja SCS
    1. Umieść anodę SCS w pobliżu grzbietowej linii środkowej za pomocą systemu mikromanipulacji (Rysunek 2B).
    2. Umieść katodę SCS w pobliżu strefy wejścia korzenia grzbietowego (DREZ) za pomocą systemu mikromanipulacji (Rysunek 2B).
  3. Celowanie w komórki i obrazowanie
    1. Użyj IR-DIC z soczewką obiektywową 10x, z grubsza znajdź grzbietowo-boczny obszar kolumny ruchowej, gdzie znajduje się większość neuronów ruchowych. Następnie przenieś centralne pole widzenia do tego obszaru.
    2. Przełącz się na soczewkę obiektywową 60x, aby znaleźć zdrowy neuron o gładkiej i jasnej powierzchni oraz niewidocznych jądrach (Rysunek 2C, F).
    3. Nieznacznie zmniejsz intensywność podczerwieni i włącz fluorescencyjne źródło światła. Przełącz filtr światła na szerokopasmowy filtr wzbudzenia ultrafioletowego ( Rysunek 2D, G), aby wybrać odpowiedni neuron ruchowy FG dodatni (FG+) ( Rysunek 2E, H).
    4. Użyj elektrod ssących, aby zastosować 1x stymulację progu motorycznego do korzenia grzbietowego. Jeśli w neuronach ruchowych zostanie wykryty wywołany potencjał czynnościowy (ryc. uzupełniający 3), potwierdza to, że aktywność korzenia grzbietowego jest nienaruszona. Jeśli nie, ten plasterek należy wyrzucić.
  4. Nagrywanie z zaciskiem krosowym
    1. Napełnij mikropipetę roztworem wewnątrzkomórkowym i włóż ją do uchwytu elektrody. Użyj systemu do mikromanipulacji, aby opuścić pipetę do kąpieli ACSF. Rezystancja pipety waha się w zakresie 5-8 MΩ.
    2. Zastosuj niewielką ilość nadciśnienia do pipety, aby zdmuchnąć kurz i resztki komórek.
      1. Opuść elektrodę, aby zbliżyć się do ogniwa. Gdy pipeta dotknie powierzchni neuronu FG+, na poziomie końcówki widoczne staje się małe wgłębienie błony. Zwolnij nadciśnienie.
      2. Następnie nanieść niewielką ilość podciśnienia na pipetę za pomocą strzykawki. W ten sposób powstaje niewielka ilość ssania, która przyciąga błonę komórkową do kontaktu ze szklaną pipetą. Zawsze zwracaj uwagę na całkowitą rezystancję interfejsu oprogramowania, dopóki wartość rezystancji nie wzrośnie do gigaomów (>1 GΩ). Następnie formuje się gigaseal.
    3. Zacisnąć potencjał membrany przy -70 mV, a następnie nacisnąć przycisk szybkiej kompensacji pojemności na interfejsie oprogramowania wzmacniacza. Delikatnie zastosuj przejściowo ujemne ciśnienie, aby pęknąć błonę komórkową, a następnie naciśnij przycisk kompensacji powolnej pojemności na interfejsie oprogramowania amplifier. W tym momencie uzyskuje się dobrą konfigurację całych komórek.
    4. Przełącz się w tryb cęgów prądowych, klikając przycisk IC w interfejsie oprogramowania i zarejestruj spoczynkowy potencjał membranowy (RMP).
    5. Zastosuj SCS przez 1-2 s o amplitudzie 1-10 mA, podczas gdy szerokość i częstotliwość impulsu są ustalone odpowiednio na 210 μs i 40 Hz. Określ próg motoryczny, powoli zwiększając amplitudę stymulacji, aż do zaobserwowania pierwszego AP.
    6. Rozróżnij opóźnione i natychmiastowe odpalanie neuronów ruchowych za pomocą 5-sekundowego wstrzykiwania prądu depolaryzującego wokół reozasady w trybie cęgów prądowych10,11,12. Natychmiastowe wystrzeliwanie neuronów ruchowych: Niska reozasada może indukować natychmiastowe i powtarzalne odpalanie ze stabilną częstotliwością wypalania; Opóźnione uruchamianie neuronów ruchowych: Wysoka reozasada może wywołać opóźniony początek powtarzalnego odpalania z przyspieszającą szybkością wypalania (Rysunek 3).
    7. Gdy SCS jest wyłączony, kontynuuj rejestrowanie potencjału membrany do przechwytywania spontanicznych odpalania punktów dostępowych.
    8. Wykonuj zapisy cęgów napięciowych Zapisy cęgów napięcia dla pobudzającego prądu postsynaptycznego (EPSC), gdy SCS jest włączony i wyłączony. Parametr stymulacji to 1x próg silnika, 210 μs, 2 Hz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dzięki rygorystycznemu utrzymywaniu niskiej temperatury podczas precyzyjnych operacji (Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2 oraz Figure 1), żywotność komórek była wystarczająca do przeprowadzenia kolejnych rejestracji elektrofizjologicznych. Aby w jak największym stopniu zasymulować scenariusz kliniczny, zastosowano mikromanipulację w celu umieszczenia katody i anody SCS odpowiednio w pobliżu linii środkowej grzbietowej i DREZ (Figure 2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Informacja ruchowa modulowana przez SCS jest ostatecznie zbieżna z neuronami ruchowymi. W związku z tym, przyjęcie neuronów ruchowych jako celu badawczego może uprościć projekt badania i ujawnić mechanizm neuromodulacji SCS w bardziej bezpośredni sposób. Aby jednocześnie rejestrować różne charakterystyki bodźców i odpowiedzi komórkowych, dobrym sposobem badania cech elektrofizjologicznych w skali pojedynczej komórki jest patch-clamp. Jednak nadal istnieją pewne trudności, w tym jak utrzymać żywotność komórek, jak szybko ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 and 82301657) oraz China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól magnezowa adenozyno5'-trifosforanuSigmaA9187
Kwas askorbinowySigmaA4034
CaCl2· 2H2OSigmaC5080
Chlorek cholinySigmaC7527
Pęseta do prowadnic do pokrywVETUS36A-SAPrzytnij plasterek
D-GlucoseSigmaG8270
Cienkie nożyczkiRWD Life ScienceS12006-10Wytnij membranę
Fluorescencyjne źródło światłaOlympus U-HGLGPS
Fluoro-GoldFluorochromeFluorochromeOznacz neuron ruchowy
Guanozyna 5 i trifosforan soli sodowej hydrat SigmaG8877
HEPESSigmaH3375
CCD na podczerwieńDage-MTIIR-1000E
KClSigmaP5405
K-glukonianSigmaP1847
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaSigmaA9414
MgSO4· 7H2OMikromanipulator SigmaM2773
 Instrument Suttera MP-200
Ściągacz do mikropipetInstrument SutterP1000
Mikronożyczki Jinzhongwa1020laminektomii
do anatomiiOlympus Mikroskop SZX10
do ekletrozjologiiOlympus BX51WI
Pęseta mikrozębnaRWD Life ScienceF11008-09Podnoszenie przeciętego trzonu kręgu
NaClSigmaS5886
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaV900182
Na-PhosphocreatineSigmaP7936
Soczewka obiektywowa do ekletrozjologiiOlympus LUMPLFLN60XWodległość robocza 2 mm 
Osmometr Zaawansowane FISKE 210
Wzmacniacz krosowo-cęgowy Axon Multiclamp 700B
Digitizer z zaciskiem krosowymAxon Digidata 1550B
 METTLER TOLEDO FE28
Slice AnchorSystem wielokanałowySHD-27H
Stymulator rdzenia kręgowegoPINST901
Pęseta zębataRWD Life ScienceF13030-10Podnieś
wibratomLeicaVT1200S
Szerokopasmowy filtr wzbudzenia ultrafioletowegoOlympus U-MF2
EGTA Sigma E4378 kamera Mikroskop pH-metr mieczykowaty

Bibliografia

  1. Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
  2. Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
  3. Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
  4. Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
  5. Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
  6. Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
  7. Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  9. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525(2016).
  10. Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385(2021).
  11. Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586(2018).
  12. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046(2014).
  13. Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
  14. Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696(2020).
  15. Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
  16. Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
  17. Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917(2022).
  18. Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
  19. Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358(2022).
  20. Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
  21. Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312(2012).
  22. Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
  23. Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
  24. Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
  25. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  26. Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
  27. Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
  28. Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rejestracja elektrofizjologicznaywotno kom rekpotencja y czynno cioweuraz rdzenia kr gowegokrojenie w wibratomie
Przygotowanie ex vivo wycinka rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach ruchowych podczas stymulacji rdzenia kręgowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.