Ten protokół opisuje metodę wykorzystującą patch-clamp do badania elektrycznych reakcji neuronów ruchowych na stymulację rdzenia kręgowego (SCS) z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, co może pomóc badaczom poprawić ich umiejętności w rozdzielaniu rdzenia kręgowego i jednoczesnym utrzymywaniu żywotności komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie ex vivo wycinka rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach ruchowych podczas stymulacji rdzenia kręgowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Stymulacja rdzenia kręgowego (SCS) może skutecznie przywrócić funkcje lokomotoryczne po urazie rdzenia kręgowego (SCI). Ponieważ neurony ruchowe są ostatnią jednostką do wykonywania zachowań sensomotorycznych, bezpośrednie badanie reakcji elektrycznych neuronów ruchowych za pomocą SCS może pomóc nam zrozumieć logikę leżącą u podstaw rdzeniowej modulacji ruchowej. Aby jednocześnie rejestrować różne charakterystyki bodźców i odpowiedzi komórkowych, dobrym sposobem badania cech elektrofizjologicznych w skali pojedynczej komórki jest patch-clamp. Jednak nadal istnieją pewne złożone trudności w osiągnięciu tego celu, w tym utrzymanie żywotności komórek, szybkie oddzielenie rdzenia kręgowego od struktury kostnej i wykorzystanie SCS do skutecznej indukcji potencjałów czynnościowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystujący patch-clamp do badania odpowiedzi elektrycznych neuronów ruchowych na SCS z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, co może pomóc badaczowi poprawić swoje umiejętności w zakresie oddzielania rdzenia kręgowego i utrzymania żywotności komórki w tym samym czasie, aby płynnie badać mechanizm elektryczny SCS na neuronach ruchowych i uniknąć niepotrzebnych prób i błędów.
Wprowadzenie
Stymulacja rdzenia kręgowego (SCS) może skutecznie przywrócić funkcje lokomotoryczne po urazie rdzenia kręgowego (SCI). Andreas Rowald i wsp. stwierdzili, że SCS umożliwia funkcjonowanie lokomotoryczne i tułowia kończyn dolnych w ciągu jednego dnia1. Badanie biologicznego mechanizmu SCS w celu odzyskania zdolności lokomotorycznych jest kluczowym i trendowym obszarem badawczym dla opracowania bardziej precyzyjnej strategii SCS. Na przykład zespół Grégoire'a Courtine'a wykazał, że pobudzające interneurony Vsx2 i neurony Hoxa10 w rdzeniu kręgowym są kluczowymi neuronami reagującymi na SCS, a neuromodulacja specyficzna dla komórek jest możliwa do p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania zatwierdził wszystkie eksperymenty na zwierzętach, a badania zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt.
1. Przygotowanie zwierząt
- zwierzęta
- Informacje o pomieszczeniach: Samiec szczura Sprague-Dawley (po urodzeniu 10-14 dni, P10-P14) w specyficznym środowisku wolnym od patogenów.
UWAGA: Warunki pokojowe utrzymywano na poziomie 20 °C ± 2 °C, wilgotność: 50%-60%, przy 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Zwierzęta miały swobodny dostęp do pożywienia i wody. - Oznacz neurony ....
- Informacje o pomieszczeniach: Samiec szczura Sprague-Dawley (po urodzeniu 10-14 dni, P10-P14) w specyficznym środowisku wolnym od patogenów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Dzięki rygorystycznemu utrzymywaniu niskiej temperatury podczas precyzyjnych operacji (Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2 oraz Figure 1), żywotność komórek była wystarczająca do przeprowadzenia kolejnych rejestracji elektrofizjologicznych. Aby w jak największym stopniu zasymulować scenariusz kliniczny, zastosowano mikromanipulację w celu umieszczenia katody i anody SCS odpowiednio w pobliżu linii środkowej grzbietowej i DREZ (Figure 2
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Informacja ruchowa modulowana przez SCS jest ostatecznie zbieżna z neuronami ruchowymi. W związku z tym, przyjęcie neuronów ruchowych jako celu badawczego może uprościć projekt badania i ujawnić mechanizm neuromodulacji SCS w bardziej bezpośredni sposób. Aby jednocześnie rejestrować różne charakterystyki bodźców i odpowiedzi komórkowych, dobrym sposobem badania cech elektrofizjologicznych w skali pojedynczej komórki jest patch-clamp. Jednak nadal istnieją pewne trudności, w tym jak utrzymać żywotność komórek, jak szybko .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 and 82301657) oraz China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sól magnezowa adenozyno5'-trifosforanu | Sigma | A9187 | |
| Kwas askorbinowy | Sigma | A4034 | |
| CaCl2· 2H2O | Sigma | C5080 | |
| Chlorek choliny | Sigma | C7527 | |
| Pęseta do prowadnic do pokryw | VETUS | 36A-SA | Przytnij plasterek |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Cienkie nożyczki | RWD Life Science | S12006-10 | Wytnij membranę |
| Fluorescencyjne źródło światła | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Oznacz neuron ruchowy |
| Guanozyna 5 i trifosforan soli sodowej hydrat Sigma | G8877 | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| CCD na podczerwień | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-glukonian | Sigma | P1847 | |
| Agaroza o niskiej temperaturze topnienia | Sigma | A9414 | |
| MgSO4· 7H2O | Mikromanipulator Sigma | M2773 | |
| Instrument Suttera | MP-200 | ||
| Ściągacz do mikropipet | Instrument Sutter | P1000 | |
| Mikronożyczki | Jinzhong | wa1020 | laminektomii |
| do anatomii | Olympus | Mikroskop SZX10 | |
| do ekletrozjologii | Olympus | BX51WI | |
| Pęseta mikrozębna | RWD Life Science | F11008-09 | Podnoszenie przeciętego trzonu kręgu |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Soczewka obiektywowa do ekletrozjologii | Olympus | LUMPLFLN60XW | odległość robocza 2 mm |
| Osmometr | Zaawansowane | FISKE 210 | |
| Wzmacniacz krosowo-cęgowy | Axon | Multiclamp 700B | |
| Digitizer z zaciskiem krosowym | Axon | Digidata 1550B | |
| METTLER TOLEDO | FE28 | ||
| Slice Anchor | System wielokanałowy | SHD-27H | |
| Stymulator rdzenia kręgowego | PINS | T901 | |
| Pęseta zębata | RWD Life Science | F13030-10 | Podnieś |
| wibratom | Leica | VT1200S | |
| Szerokopasmowy filtr wzbudzenia ultrafioletowego | Olympus | U-MF2 |
Bibliografia
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
