Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową

Podsumowanie

Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.

Streszczenie

Wraz z postępem mikroskopii wielofotonowej i technologii molekularnych, obrazowanie fluorescencyjne szybko się rozwija, stając się potężnym podejściem do badania struktury, funkcji i plastyczności żywych tkanek mózgu. W porównaniu z konwencjonalną elektrofizjologią, mikroskopia fluorescencyjna może uchwycić aktywność neuronalną, a także morfologię komórek, umożliwiając długoterminowe zapisy zidentyfikowanych populacji neuronów w rozdzielczości jednokomórkowej lub subkomórkowej. Jednak obrazowanie w wysokiej rozdzielczości zazwyczaj wymaga stabilnego, stałego ustawienia głowy, które ogranicza ruchy zwierzęcia, a przygotowanie płaskiej powierzchni z przezroczystego szkła umożliwia wizualizację neuronów w jednej lub więcej płaszczyznach poziomych, ale jest ograniczone w badaniu procesów pionowych przebiegających na różnych głębokościach. W tym miejscu opisujemy procedurę łączenia mocowania płyty czołowej i mikropryzmatu, która daje obrazowanie wielowarstwowe i multimodalne. To chirurgiczne przygotowanie nie tylko daje dostęp do całej kolumny kory wzrokowej myszy, ale umożliwia obrazowanie dwufotonowe w pozycji unieruchomionej głowy i obrazowanie jednofotonowe w swobodnie poruszającym się paradygmacie. Korzystając z tego podejścia, można pobierać próbki zidentyfikowanych populacji komórek w różnych warstwach kory mózgowej, rejestrować ich reakcje w stanach stacjonarnych i swobodnie poruszających się oraz śledzić długoterminowe zmiany na przestrzeni miesięcy. W ten sposób metoda ta zapewnia kompleksowe badanie mikroobwodów, umożliwiając bezpośrednie porównanie aktywności neuronalnej wywołanej przez dobrze kontrolowane bodźce i w naturalnym paradygmacie behawioralnym.

Wprowadzenie

Pojawienie się dwufotonowego obrazowania fluorescencyjnego in vivo^1,2, łączące nowe technologie w systemach optycznych i genetycznie modyfikowane wskaźniki fluorescencji, stało się potężną techniką w neurobiologii do badania skomplikowanej struktury, funkcji i plastyczności w żywym mózgu^3,4. W szczególności ta metoda obrazowania oferuje niezrównaną przewagę nad tradycyjną elektrofizjologią, rejestrując zarówno morfologię, jak i dynamiczną aktywność neuronów, ułatwiając w ten sposób długoterminowe śledzenie zidentyfikowanych neuronów5^,6,7,8.

Pomimo swoich godnych uwagi zalet, zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości często wymaga statycznego, stałego ustawienia głowy, które ogranicza mobilność zwierzęcia^9,10,11. Dodatkowo, użycie przezroczystej szklanej powierzchni do wizualizacji neuronów ogranicza obserwacje do jednej lub więcej płaszczyzn poziomych, ograniczając eksplorację dynamiki procesów pionowych, które rozciągają się na różnych głębokościach kory mózgowej¹².

Odnosząc się do tych ograniczeń, niniejsze badanie przedstawia innowacyjną procedurę chirurgiczną, która integruje stabilizację płytki głowy, mikropryzmat i miniskop, aby stworzyć modalność obrazowania z wielowarstwowymi i multimodalnymi możliwościami. Mikropryzmat umożliwia obserwację przetwarzania pionowego wzdłuż kolumny korowej^13,14,15,16, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób informacja jest przetwarzana i przekształcana podczas przemieszczania się przez różne warstwy kory mózgowej oraz jak zmienia się przetwarzanie pionowe podczas zmian plastycznych. Co więcej, umożliwia obrazowanie tych samych populacji neuronalnych w paradygmacie ustalonym na głowę i w swobodnie poruszającym się otoczeniu, obejmując wszechstronne ustawienia eksperymentalne^17,18,19: na przykład fiksacja głowy jest często wymagana w przypadku dobrze kontrolowanych paradygmatów, takich jak ocena percepcji sensorycznej i stabilne nagrania w paradygmacie 2-fotonowym, podczas gdy swobodne poruszanie się oferuje bardziej naturalne, elastyczne środowisko dla badania behawioralne. Dlatego możliwość przeprowadzenia bezpośredniego porównania w obu trybach ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszego zrozumienia mikroukładów, które umożliwiają elastyczne, funkcjonalne reakcje.

W istocie, integracja mocowania płytki głowy, mikropryzmatu i miniskopu w obrazowaniu fluorescencyjnym stanowi obiecującą platformę do badania zawiłości struktury i funkcjonalności mózgu. Naukowcy mogą pobierać próbki zidentyfikowanych populacji komórek na różnych głębokościach obejmujących wszystkie warstwy kory mózgowej, bezpośrednio porównywać ich odpowiedzi zarówno w dobrze kontrolowanych, jak i naturalnych paradygmatach oraz monitorować ich długoterminowe zmiany na przestrzeni miesięcy²⁰. Podejście to dostarcza cennych informacji na temat tego, w jaki sposób te populacje neuronów oddziałują na siebie i zmieniają się w czasie w różnych warunkach eksperymentalnych, zapewniając wgląd w dynamiczną naturę obwodów neuronalnych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Zwierzętach (Procedurach Naukowych) w Wielkiej Brytanii z 1986 roku na podstawie licencji osobistych i projektowych zatwierdzonych i wydanych przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych po odpowiednim przeglądzie etycznym. Dorosłe linie transgeniczne CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE²¹ zostały wyhodowane, a ich potomstwo wykorzystane w eksperymencie. Ze względu na bezpieczeństwo eksperymentatorów i utrzymanie sterylnych warunków, wszystkie procedury były wykonywane w warunkach aseptycznych i przy użyciu pełnego wyposażenia ochrony osobistej.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

1. W celu zminimalizowania obrzęku należy podawać deksametazon (0,2 mg/kg) podskórnie, 12-24 godziny przed zabiegiem.
2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie i wysterylizuj obszar operacyjny stabilizowanym kwasem podchlorawym z wodą destylowaną i 70% etanolem przed zabiegiem. Upewnij się, że cały sprzęt chirurgiczny jest włączony.
3. Znieczulenie zwierzęcia (24 tygodnie, samiec o masie ciała 31 g) za pomocą izofluranu w dawce indukcyjnej 5%, która zmniejsza się do 1%-2%, gdy mysz znajdzie się na ramce stereotaktycznej, przy O₂ utrzymywanym między 1-2 l / min. Wstrzyknąć NLPZ (karprofen, 2,5 mg / kg) podskórnie.
4. Sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania palców u stóp, aby ocenić głębokość znieczulenia (zwiększać stężenie izofluranu w krokach co 0,5%, jeśli zaobserwowano odruch).
5. Ogol głowę zwierzęcia za pomocą trymera, od tyłu uszu do nieco powyżej oczu. Oczyść ten obszar chusteczką nasączoną alkoholem i roztworem jodu powidonu, upewniając się, że nie ma kontaktu z oczami zwierzęcia.
6. Zamontuj zwierzę na homeotermicznej poduszce grzewczej i ramie stereotaktycznej wyposażonej w pręty do uszu i zębów i zabezpiecz głowę. Upewnij się, że głowa jest stabilna, ponieważ ma to kluczowe znaczenie dla powodzenia poniższej procedury (Rysunek 1).
7. Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas operacji i przykryj je folią, aby chronić je przed światłem. Przykryj zwierzę sterylnym pokrowcem chirurgicznym.

Rysunek 1: Przygotowanie do operacji. Mysz jest umieszczona na ramie stereotaktycznej, zabezpieczonej nosem i nausznikami. Mysz umieszczona jest na podgrzewanej podkładce o regulowanej temperaturze. Oczy mają na sobie maść okulistyczną i są pokryte folią aluminiową. Głowa jest ogolona, a czaszka odsłonięta. Na zwierzę nakłada się sterylną osłonę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Kraniotomia

1. Za pomocą nożyczek chirurgicznych naciąć skórę wzdłuż linii środkowej ogolonego obszaru głowy, aby odsłonić czaszkę.
2. Oczyść czaszkę za pomocą sterylnego bawełnianego wacika i rozcieńczonego nadtlenku wodoru (3% w/v z 35% H₂O₂ w 97% dH₂O) przez 1-3 sekundy, aby usunąć tkankę łączną (Rysunek 2A). Osusz czaszkę za pomocą kropli 70% etanolu i nowego sterylnego wacika.
3. Ustaw czaszkę przód/tył (AP) i przyśrodkowo/bocznie (ML), aby zapewnić dokładne miejsce implantacji. Aby to zrobić, zmierz głębokość grzbietowo-brzuszną (DV) czaszki zarówno przy bregmie, jak i lambdzie i upewnij się, że różnica między nimi wynosi <0,03 mm. Aby uzyskać wyrównanie przyśrodkowo-boczne, zmierz jednakowo odległe punkty na obu kościach ciemieniowych od linii środkowej i ponownie upewnij się, że różnica DV wynosi <0,03 mm.
4. Używając bregmy jako początku, znajdź i zaznacz żądany obszar kory mózgowej; tutaj są to jednooczna pierwszorzędowa kora wzrokowa (V1), AP: -3,5 mm, ML: -2,5 mm.
5. Użyj wiertła trepanacyjnego (średnica 1,8 mm) i wiertła dentystycznego (prędkość 10 000 obr./min), aby odsłonić korę, upewniając się, że znacznik żądanego obszaru kory mózgowej (monokular V1) znajduje się w dolnej jednej trzeciej okienka wiertła.
   1. Upewnij się, że kąt wiertła jest prostopadły do krzywizny czaszki. Zapewni to równomierną kraniotomię i zapobiegnie uszkodzeniu opony twardej lub kory.
   2. Wiercić, aż nastąpi spadek oporu, a następnie zatrzymać się (Rysunek 2B). Ostrożnie usunąć oderwany fragment kości za pomocą końcówki igły 23G (Rysunek 2C).
   3. Oczyść odsłoniętą korę pianką chirurgiczną nasączoną zimnym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF), aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i zatrzymać krwawienie, które może wystąpić.
   4. Zawsze utrzymuj odsłoniętą korę nawodnioną, używając zimnego ACSF, przez cały czas trwania operacji.

Rysunek 2: Kraniotomia. (A) Pokazane jest nacięcie skóry między bregmą a lambdą. Tkanka łączna została usunięta z odsłoniętej powierzchni. (B) Kraniotomia za pomocą wiertła trepanacyjnego przed usunięciem fragmentu kości. (C) Kraniotomia po usunięciu fragmentu kości, pokazującego nienaruszoną oponę twardą i korę (podziałka skali reprezentuje 0,5 mm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Wstępnie wycięte nacięcie

UWAGA: Aby być branym pod uwagę podczas wykonywania nacięcia przed nacięciem, nacięcie i implantacja mikropryzmatu będą musiały znajdować się przed obszarem obrazowania (ROI). Ma to na celu zapewnienie pełnego i dokładnego pola widzenia. W kontekście tego protokołu nacięcie zostanie wykonane wzdłuż osi przyśrodkowo-bocznej, a mikropryzmat jest zorientowany przodem do tyłu (ryc. 3B).

1. Aby pomóc w wprowadzeniu i złagodzić nacisk w korze podczas wprowadzania mikropryzmatu, wykonaj nacięcie.
2. Przymocuj nóż chirurgiczny do stereotaktycznego uchwytu ramienia i ustaw ostrze lub ramię stereotaktyczne tak, aby cięło wzdłuż osi ML.
3. Przesuń nóż do żądanej współrzędnej AP (AP: -3.4 mm); pryzmat musi znajdować się przed ROI, więc wykonaj nacięcie 100 μm przed współrzędną obrazowania ROI AP (-3.5 mm).
4. Teraz przesuwając nóż do przyśrodkowej krawędzi kraniotomii, gdzie styka się z czaszką, powoli opuść nóż, aż dotrze do kości, a następnie zatrzymaj się. Ponieważ grubość kości wynosi 200 μm, należy uwzględnić tę wartość w całkowitej głębokości wprowadzenia (patrz obliczenia w kroku 5.1).
5. Optymalne obrazowanie znajduje się w środku pryzmatu, tj. 500 μm, dlatego upewnij się, że ta głębokość pokrywa się z głębokością kolumny korowej (ROI DV: - 0,35 mm).
   1. Uwzględniając grubość czaszki w obliczeniach głębokości, skorzystaj z poniższego równania, które określa, jak głębokie musi być wstępnie wycięte nacięcie od powierzchni czaszki. W przypadku tego protokołu głębokość implantacji oblicza się jako:
      Grubość kości (200 μm) + ROI obrazowania (np. 350 μm) + pozostała głębokość mikropryzmatu (500 μm) = 1,050 μm
6. Upewnij się, że długość nacięcia jest większa niż 1 mm, ale nie nadmierna; dlatego idealna jest odległość 1,2 mm, przy czym jednooczna współrzędna ML znajduje się w środku tej odległości.
7. Gdy będziesz gotowy do wykonania nacięcia, usuń nadmiar ACSF, aby nie zasłaniać widzenia (ryc. 3A).
   1. Przesuń nóż od przyśrodkowej krawędzi kraniotomii do początkowej współrzędnej przyśrodkowej nacięcia. Powoli (10 μm/s) opuść nóż do kory.
   2. Gdy opona twarda zostanie przebita, a nóż wejdzie w korę, nałóż kroplę zimnego ACSF na korę, aby utrzymać tkankę nasmarowaną i nawilżoną podczas nacięcia.
8. Po osiągnięciu ostatecznej głębokości rozpocznij przesuwanie noża wzdłuż osi ML (z prędkością 10 μm/s).
   1. Obserwuj otaczającą tkankę podczas wykonywania nacięcia. Jeśli tkanka ciągnie się wraz z nożem, przesuń nóż kilka razy w górę i w dół, aby upewnić się, że tkanka jest cięta, a następnie kontynuuj w bok, pamiętając o włożeniu noża z powrotem na ostateczną głębokość.
9. Po zakończeniu powoli podnieś nóż. Jeśli podczas nacięcia pojawi się krew, wykorzystaj ten czas na oczyszczenie miejsca nacięcia pianką chirurgiczną nasączoną ACSF, aby rozcieńczyć krew i wypchnąć krew z nacięcia. Pamiętaj, aby pozostawić świeżą, nasyconą piankę chirurgiczną na odsłoniętej korze do momentu, aż będzie gotowa do wprowadzenia mikropryzmatu.

Rysunek 3: Implantacja mikropryzmatów. (A) Wstępnie wycięte nacięcie. (B) Schemat zintegrowanej soczewki mikropryzmatycznej pokazujący jej położenie w korze (C) Zintegrowana soczewka mikropryzmatyczna w odpowiedniej orientacji do wstępnego nacięcia przed włożeniem do kory (podziałka skali reprezentuje 0,5 mm). (D) Przykład nagromadzenia cementu wokół zintegrowanej soczewki w celu zabezpieczenia jej przyczepienia do czaszki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Wprowadzenie mikropryzmatu i implantacja płytki głowy

1. Soczewka mikropryzmatyczna składa się z soczewki o indeksie gradientowym przymocowanej do pryzmatu na dystalnym końcu soczewki, która jest zintegrowana z płytą podstawową. Przymocuj mikropryzmat do zestawu implantów.
2. Upewnij się, że strona obrazowania pryzmatu jest przeciwna do płyty podstawy. Aby pomóc w włożeniu i umieszczeniu mikropryzmatu, przymocuj go do ramy stereotaktycznej i ustaw pryzmat tak, aby wyrównał się z nacięciem (Rysunek 3C).
3. Powoli opuść mikropryzmat w miejsce nacięcia (10 μm/s). Pamiętaj, aby usunąć ACSF podczas początkowego wkładania pryzmatu, ale po wejściu do kory przepłukać zimnym ACSF, aby nasmarować wprowadzenie.
   1. Kora powinna pozostać stabilna, podczas gdy pryzmat jest opuszczany do nacięcia; jeśli nie, dodaj dodatkowy ACSF i porusz korę, przesuwając pryzmat w górę iw dół, aby rozluźnić korę od pryzmatu.
4. Po osiągnięciu ostatecznej głębokości osusz odsłoniętą powierzchnię kory mózgowej za pomocą sterylnej tkanki, uważając, aby nie dotknąć pryzmatu.
5. Pokryj odsłonięty obszar korowy otaczający pryzmat, a także soczewkę, ochronną warstwą kleju silikonowego, minimalizując nadmiar kleju na otaczającej czaszce i atrapie lunety.
6. Po utwardzeniu (5-10 min) przymocuj płytkę do czaszki, aby ustabilizować głowę podczas obrazowania z mocowaniem głowy.
   1. Upewnij się, że płyta główna jest wystarczająco wysunięta do tyłu, aby nie przeszkadzać w umieszczeniu implantu i umożliwić odpowiednie nałożenie cementu w celu prawidłowego zabezpieczenia implantu.
   2. Upewnij się, że linia środkowa płyty głowy leży nieco na prawo od wszczepionej soczewki, aby upewnić się, że obie strony płyty głowy można przymocować do podstawy głowy podczas wykonywania eksperymentów z mocowaniem głowy
7. Nałóż cement klejący na głowę i czaszkę.
   1. Przygotuj adhezyjny cement dentystyczny, mieszając 1 miarkę nieprzezroczystego proszku cementowego z 4 kroplami pożywki mieszającej i nakładając jedną kroplę katalizatora.
   2. Umieść cement zarówno na głowie, jak i na czaszce i przytrzymaj nagłówek na miejscu, aż się utwardzi, upewniając się, że jest równoległy do nauszników (poprzez badanie wzrokowe sprawdź zarówno z góry, jak i z tyłu głowy zwierzęcia).
8. Nałóż cement adhezyjny, aby pokryć resztę odsłoniętej czaszki i tkanki, włączając mikropryzmat (do podstawy płytki podstawy) i płytę główną.
9. Nie dopuść do osadzenia cementu na płycie podstawy, atrapie mikroskopu ani na żadnym z jego elementów. Kontynuuj nakładanie cementu adhezyjnego, aż mikropryzmat i płyta głowicy zostaną pokryte i będą stabilne (Rysunek 3D).
10. Gdy cement się utwardzi, odłącz atrapę mikroskopu, przesuwając powoli ramię stereotaktyczne w górę, jednocześnie stabilizując mikropryzmat za pomocą kleszczy (są one połączone za pomocą magnesów, dlatego może być odczuwalny pewien opór podczas separacji).
11. Włóż osłonę ochronną na obiektyw i dokręć, aby zamocować ją na miejscu.
12. Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej, pozwól mu dojść do siebie w ciepłym pudełku do rekonwalescencji i podaj podskórnie podgrzaną sterylną sól fizjologiczną o sile fizjologicznej 0,9% (3% masy ciała).
13. Gdy zwierzę się obudzi i zacznie się poruszać, umieść je z powrotem w czystej, jednoosobowej klatce. Monitoruj zwierzę i podawaj dodatkowe znieczulenia pooperacyjne zgodnie z polityką lokalnej instytucji dotyczącą analgezji.
14. Odczekaj 4 tygodnie po zabiegu, zwierzę powinno być gotowe do obrazowania.

5. Jednofotonowe obrazowanie warstw korowych u swobodnie poruszających się myszy

UWAGA: Konieczne jest wykorzystanie obrazów wykonanych podczas oryginalnej sesji obrazowania za każdym razem, aby zapewnić dokładne uzyskanie zamierzonej płaszczyzny obrazowania. Te zidentyfikowane punkty orientacyjne, wraz z neuronami, odgrywają kluczową rolę w procesie dopasowania opisanym szczegółowo w kroku 9 protokołu. Podczas pozyskiwania danych jednofotonowych miniskop jest zarówno systemem obrazowania, jak i źródłem lasera. Wzbudzenie wykorzystuje diodę LED o zakresie mocy 0-2 mW/^mm2 na przedniej powierzchni obiektywu. Laser wykorzystuje długość fali wzbudzenia 455 ± 8 nm (światło niebieskie) do sygnalizacji GCaMP. Suwak ostrości obiektywu może być używany do regulacji ostrości (oś Z), która jest reprezentowana w interfejsie jako 0-1000, gdzie 0 oznacza odległość roboczą 0 μm, a 1000 oznacza maksymalną odległość roboczą 300 μm.

1. Przed pozyskaniem danych pozwól zwierzęciu zaaklimatyzować się w pomieszczeniu i na otwartej arenie przez 1 godzinę przed sesją nagraniową.
2. Przed obrazowaniem należy wszystko zdezynfekować i oczyścić odpowiednimi środkami dezynfekującymi (np. stabilizowanym kwasem podchlorawym z wodą destylowaną i 70% etanolem).
3. Skonfiguruj skrzynkę DAQ, podłączając ją do komputera i uruchamiając oprogramowanie do akwizycji danych. Nawiąż bezpośrednie połączenie za pomocą Ethernet, aby zminimalizować gubione ramki; Jednak tryb połączenia bezprzewodowego może być wystarczający w zależności od siły połączenia bezprzewodowego.
4. Przymocuj miniskop do płytki podstawy zwierzęcia pod delikatnym karkiem.
   1. Najpierw zdejmij osłonę ochronną z płyty podstawy, odkręcając dociskową. Chwyć pokrywę za otwór za pomocą kleszczy. Następnie przymocuj miniskop do płyty podstawy, w miejscu, w którym znajduje się osłona.
   2. Przed montażem sprawdź orientację miniskopu w stosunku do płyty podstawy, tak aby strona z oznaczeniem była skierowana w stronę.
   3. Po zamocowaniu miniskopu dokręć ustalającą, aby go ustabilizować. Przesuwaj ustalającą tylko do momentu, gdy będzie można wyczuć pewien opór. Zbyt mocne dokręcenie ustalającej mogłoby spowodować uszkodzenie miniskopu i dlatego należy tego unikać.
5. Podłącz miniskop do skrzynki DAQ i przygotuj oprogramowanie do nagrywania.
   1. W oprogramowaniu do akwizycji danych włącz strumień dla miniskopu i dostosuj parametry nagrywania (liczba klatek na sekundę obrazu, wzmocnienie, moc diody LED, wartość efocus), aby uzyskać wyraźne pole widzenia (Rysunek 4A).
   2. Włącz okno histogramu i dostosuj wzmocnienie i moc diody LED tak, aby nagrywana intensywność mieściła się w przedziale od 35% do 70% .
   3. W przypadku przeprowadzania badania podłużnego należy zapoznać się z nagraniami lub migawkami wykonanymi podczas poprzedniej sesji i dostosować wartość efocus, tak aby ta sama płaszczyzna obrazowania była wyraźnie widoczna.
6. Rozpocznij eksperyment i pobieranie danych.
7. Po zakończeniu eksperymentu należy usunąć zwierzę z aparatu behawioralnego.
   1. Pod delikatnym karkiem poluzuj dociskową i zdejmij miniskop z płytki podstawy zwierzęcia.
   2. Umieść osłonę ochronną z powrotem na płycie podstawy i ustabilizuj ją za pomocą ustalającej.
8. Wróć zwierzę do jego domowej klatki (przejdź do kroku 7, jeśli chcesz przetworzyć dane jednofotonowe).

Rysunek 4: Akwizycja i przetwarzanie danych za pomocą oprogramowania. (A) Obraz pokazujący strumień w czasie rzeczywistym z miniskopu. Zaleca się dostosowanie wartości ostrości obiektywu tak, aby w oknie przesyłania strumieniowego był wyraźny widok, wraz z wzmocnieniem i mocą lasera obrazowania (B) Wykres schematyczny ilustrujący zalecany przebieg pracy wyrównywania dla sesji nagranych w różnych punktach czasowych. Zaleca się wygenerowanie średniego obrazu z pierwszej sesji, postępując zgodnie z instrukcjami oprogramowania do przetwarzania danych. Ten obraz powinien być używany jako obraz referencyjny podczas korekcji ruchu w kolejnych sesjach. (C) Przykłady czterech komórek z tego samego obrazu ΔF/F rzutowanego maksymalnie. W poprzek każdej komórki rysowana jest pomarańczowa linia, aby zmierzyć jej średnicę w pikselach, której średnia jest traktowana jako argument wejściowy dla algorytmu identyfikacji komórki (lewy górny róg: 13, prawy górny róg: 11, lewy dolny róg: 12, prawy dolny róg: 13). (D) Dane wyjściowe algorytmu identyfikacji komórek po ręcznym kuratorstwie (przycięty obraz). Białe kontury reprezentują zidentyfikowane komórki (podziałka skali reprezentuje 100 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Dwufotonowe obrazowanie wapniowe warstw korowych u myszy z głową

UWAGA: Dla dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, źródłem światła jest przestrajalny ultraszybki laser o długości fali wzbudzenia 920 nm. Moc wzbudzenia, mierzona w obiektywie, wynosiła zwykle od 100 do 150 mW i była dostosowywana w każdej sesji, aby osiągnąć podobny poziom fluorescencji. Światło emisyjne było filtrowane przez filtr emisyjny (525/70 nm) i mierzone przez niezależną lampę fotopowielacza (PMT), określaną jako kanał zielony. Obrazy uzyskano za pomocą obiektywu z 20-krotnym zanurzeniem w powietrzu (NA = 0,45, odległość robocza 6,9-8,2 mm).

1. Przed uzyskaniem danych przyzwyczaj zwierzę do aparatury w poprzednich dniach (aby zwierzę poczuło się komfortowo z konfiguracją behawioralną). Pozwól zwierzęciu spędzić 15-30 minut dziennie, przez 2-3 dni, badając konfigurację lub do momentu, gdy wykaże naturalistyczne zachowanie przed rozpoczęciem zbierania danych.
2. Włącz system obrazowania dwufotonowego, uruchom oprogramowanie do akwizycji i włącz laser. Przed kontynuowaniem upewnij się, że lasery są zamknięte, a PMT wyłączone.
3. Czysty aparat do obrazowania dwufotonowego ustabilizowanym kwasem podchlorawym z wodą destylowaną i 70% etanolem.
4. Upewnij się, że urządzenie jest dopasowane do wielkości zwierzęcia. Delikatnie przymocuj mysz i jej główkę do konfiguracji head-stage i przykręć ją na miejscu, aby ustabilizować głowę myszy.
5. Po założeniu zdejmij osłonę obiektywu (patrz krok 5.4.1) i ustaw obiektyw tak, aby znajdował się nad płytą podstawy.
6. Użyj kontrolek epifluorescencji i etapu XYZ, aby skupić się na tkance korowej.
7. Gdy warstwy korowe są widoczne, przełącz mikroskop, aby umożliwić obrazowanie dwufotonowe (zamień lustro na zwierciadło dichroiczne, zamknij migawkę fluorescencyjną i wyłącz laser epifluorescencyjny i monitor). Upewnij się, że wyłączyłeś główne światła, aby chronić PMT podczas obrazowania.
8. Skonfiguruj parametry, aby zoptymalizować pozyskane pliki obrazów.
   1. Użyj trybu akwizycji rezonansowej do obrazowania wapnia, ponieważ może on uchwycić szybkie wyzwalanie sygnałów GCaMP.
   2. Dostosuj moc lasera, wzmocnienie PMT, powiększenie i tabele przeglądowe (LUT), aby uzyskać optymalny obraz i odnieś się do obrazu jednofotonowego, aby upewnić się, że obrazowana jest właściwa płaszczyzna ogniskowej.
   3. Rozpocznij obrazowanie warstw korowych za pomocą systemu dwufotonowego ze zsynchronizowanym monitorowaniem behawioralnym i bodźcami wejściowymi (jeśli dotyczy).
   4. Pamiętaj, aby zapisać te parametry akwizycji i odległości XYZ, jeśli chcesz odtworzyć identyczne obrazy w czasie.
9. Aby przechwycić stos z warstw korowych, wykonaj czynności opisane poniżej.
   1. Znajdź płaszczyznę, od której chcesz rozpocząć stos z, dostosuj parametry akwizycji, aby zoptymalizować obraz, i zaznacz ją jako punkt początkowy w oprogramowaniu.
   2. Następnie, za pomocą kontrolki Z, przesuń się w dół stosu, dostosowując tylko moc lasera, aby utrzymać stałą luminancję stosu, i zaznacz koniec stosu w oprogramowaniu.
   3. Krok krytyczny: korzystając z opcji Względny gradient wykładniczy na karcie Gradient mocy lasera, pozwól oprogramowaniu obliczyć wzrost mocy lasera w miarę jego przemieszczania się przez stos z. Pamiętaj, aby zaznaczyć wartości mocy lasera w punkcie końcowym w tabeli dostarczonej przez oprogramowanie, aby umożliwić mu obliczenie gradientu.
   4. Po ustawieniu parametrów z-stack dostosuj rozmiar kroku (μm).
      UWAGA: Rozmiar kroku określi czas potrzebny na wykonanie plastrów, liczbę plasterków i jakość szczegółów stosu. Mniejsze rozmiary kroków spowodują dłuższy czas przyswajania, zwiększenie liczby plasterków i lepszą szczegółowość w porównaniu z większymi rozmiarami kroków. Stosy Z służą do pomocy w rejestracji obrazów jedno- i dwufotonowych, ponieważ podkreślają wszelkie anatomiczne punkty orientacyjne lub cechy.
10. Aby uzyskać szereg czasowy (szereg T) zmian wapnia w neuronach, znajdź optymalną płaszczyznę ogniskowej za pomocą elementów sterujących stolika XYZ i dostosuj moc lasera, wzmocnienie PMT, powiększenie i LUT.
    1. Na karcie T-series (Seria T) w oprogramowaniu do akwizycji zdefiniuj parametry częstotliwości akwizycji, aby dopasować je do danych uzyskanych za pomocą systemu obrazowania jednofotonowego.
       UWAGA: Dopasowanie częstotliwości sprawi, że dane 1P i 2P będą porównywalne i lepiej nadają się do algorytmu identyfikacji komórek używanego na etapach przetwarzania danych. Wiele wyzwalaczy i innych trybów akwizycji można włączyć do akwizycji serii T.
11. Rozpocznij nabywanie serii T.

7. Przetwarzanie danych obrazowania wapnia z jednym fotonem

1. Do nagrywania filmów jednofotonowych należy użyć oprogramowania do przetwarzania danych dołączonego do systemu miniskopu.
   1. Najpierw należy wstępnie przetworzyć film poprzez przestrzenne i czasowe próbkowanie w dół. Ogólnie rzecz biorąc, przestrzenne próbkowanie filmu w dół o współczynnik dwukrotnie znacznie skróciłoby czas przetwarzania bez poważnego uszczerbku dla dokładności identyfikacji komórek.
   2. Ustaw czasowy współczynnik próbkowania w dół, tak aby częstotliwość odtwarzania filmu została zmniejszona do około 10 Hz, co jest bardziej odpowiednie dla algorytmu identyfikacji komórek używanego w poniższych krokach.
   3. W przypadku pobierania wielu filmów w tym samym dniu obrazowania należy połączyć filmy w jeden szereg czasowy przed etapem przetwarzania wstępnego, aby przetworzyć je razem.
   4. Opcjonalnie: Zastosuj do filmu przestrzenny filtr pasmowo-przepustowy, aby usunąć niższe i wyższe częstotliwości przestrzenne, co spowoduje płynniejszy film o wyższym kontraście.
2. Zarejestruj film, korzystając z funkcji korekcji ruchu w oprogramowaniu. Rejestruje to film i koryguje artefakty ruchu spowodowane ruchem miniskopu względem powierzchni obrazu.
   1. Krok krytyczny: Jeśli przeprowadzasz badanie podłużne, zarejestruj filmy w tym samym polu widzenia, na przykład średni obraz filmu wykonany w pierwszym dniu obrazowania (Rysunek 4B).
   2. Oblicz ΔF/F filmu za pomocą odpowiedniej zakładki i wyświetl film, aby wygenerować maksymalny obraz projekcyjny filmu ΔF/F. Ten obraz pokaże obszary, które wykazują zmiany w poziomach fluorescencji, potencjalnie pojedyncze neurony, i może być wykorzystany do pomiaru średniej średnicy neuronów (Rysunek 4C).
   3. Alternatywnie, zmierz średnicę komórki na filmie z korekcją ruchu, gdzie neurony wykazują wyraźną fluorescencję.
3. Zidentyfikuj komórki za pomocą algorytmów w oprogramowaniu.
   1. Chociaż na tym etapie dostępne są dwie opcje (PCA-ICA i CNMF-E), w tym badaniu należy użyć CNMF-E. Wprowadź średnią średnicę komórki w pikselach i uruchom algorytm, aby wygenerować zestaw komórek zawierający obszary zainteresowania (ROI), które demonstrują aktywność podobną do komórki.
   2. Ręcznie wybierz ROI, które są komórkami (mają morfologię podobną do komórki i aktywność^22,23 i leżą w polu widzenia) od tych, które nie są, i zweryfikuj wyselekcjonowany zestaw komórek (Rysunek 4D).
4. Eksportuj ślady wapnia dla każdego ROI w celu dalszej analizy.

8. Przetwarzanie danych obrazowania wapiennego z dwoma fotonami

1. W przypadku filmów nagrywanych z dwoma fotonami należy użyć pakietu Pythona przeznaczonego do przetwarzania danych analizy wapienia dwufotonowego.
2. Najpierw połącz zdjęcia wykonane w serii T w stos .tiff, jak opisano poniżej.
   1. W interfejsie opcji uruchamiania dostosuj parametry, w tym wartość tau i liczbę klatek na sekundę, tak aby odpowiadały używanemu GCaMP i liczbie klatek na sekundę nagrania.
   2. Opcjonalnie: Ustaw parametr do_registration na wartość 1, aby zarejestrować film. Jest to równoznaczne z krokiem korekcji ruchu opisanym powyżej.
   3. Opcjonalnie: Ustaw parametr anatomical_only na 1, aby wykrywać ROI na podstawie cech anatomicznych oprócz dynamiki fluorescencji. Wymaga to wprowadzenia średnicy komórki, więc wykonuj pomiary za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu. Jest to ogólnie zalecane, ponieważ generuje zwrot z inwestycji o bardziej naturalnych kształtach (Rysunek 5A-C).
   4. Po ustawieniu wszystkich parametrów uruchom algorytm, aby wykonał wszystkie obliczenia razem. Zapoznaj się z graficznym interfejsem użytkownika (GUI), aby sprawdzić postęp.
   5. Po zakończeniu wróć do interfejsu wyboru komórek, aby ręcznie wybrać wyniki identyfikacji komórek.
3. Zapisz obraz wyselekcjonowanej komórki ustawiony na maksymalnej projekcji filmu. Zostanie on później wykorzystany jako obraz referencyjny do rejestracji danych zapisu jednofotonowego.
4. Następnie algorytm automatycznie zapisuje wyniki w formacie npy, do którego można uzyskać dostęp później za pomocą Pythona. Alternatywnie zapisz wyniki w innych sformatowanych plikach w celu dalszej analizy w innym oprogramowaniu.

Rysunek 5: Identyfikacja komórek za pomocą oprogramowania do przetwarzania dwóch fotonów. (A) Reprezentatywny obraz identyfikacji komórki wykonany za pomocą oprogramowania do przetwarzania dwóch fotonów. Ustawienie parametru Anatomical_only na wartość 0, ale zachowanie wszystkich innych parametrów bez zmian, spowoduje, że w obszarze między liniami przerywanymi znajduje się wiele komórek niebędących komórkami, które zakłócają ręczne selekcjonowanie rzeczywistych komórek. (B) Przykłady pomiarów średnicy komórki wykonanych z (A), przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazu (u góry po lewej; 7,5 pikseli, u góry po prawej; 9, u dołu po lewej; 6,5, u dołu po prawej; 7,5). (C) Reprezentatywny obraz identyfikacji komórki. Po ustawieniu parametru Anatomical_only na 1 i wprowadzeniu średniej średnicy komórki pobranej z (B) do algorytmu średnicy komórki, w obszarze między liniami przerywanymi nie ma żadnych komórek (paski skali reprezentują 200 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

9. Rejestracja zidentyfikowanych zestawów komórek w różnych modalnościach obrazowania

1. Przeprowadzaj rejestrację komórek zidentyfikowanych na podstawie zapisów jedno- i dwufotonowych za pomocą multimodalnego algorytmu rejestracji i analizy obrazów (MIRA), który jest dostępny za pośrednictwem interfejsu Python oprogramowania do obrazowania jednofotonowego.
   1. Algorytm ten wyrównuje dane jedno- i dwufotonowe za pomocą niesztywnej rejestracji. Zapoznaj się z zestawem demonstracyjnych notatników online, które znajdują się na stronie internetowej i są używane w tym badaniu.
      UWAGA: Notatniki zostały napisane w taki sposób, aby całe przetwarzanie zostało zakończone w oprogramowaniu 1P i dlatego nie są kompatybilne z oprogramowaniem do przetwarzania 2P. W związku z tym wykonaj tylko niektóre kroki opisane w zeszytach dla tego badania.
2. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w notatnikach demonstracyjnych, które obejmują wygenerowanie obrazu strukturalnego dla każdej metody obrazowania. Domyślnie polega to na wygenerowaniu maksymalnej projekcji dwufotonowego stosu z i średniego obrazu zapisu jednofotonowego. Alternatywnie można użyć średniego obrazu zapisu dwufotonowego.
   1. Tam, gdzie zostanie wyświetlony monit, przestrzenne filtrowanie pasmowoprzepustowe obrazów, aby lepiej zwizualizować punkty orientacyjne i zmienić ich orientację, tak aby pasowały.
3. Wybierz pasujące punkty orientacyjne na dwóch obrazach (Rysunek 6A).
   1. Użyj ich, aby obliczyć wypaczenie potrzebne do wyrównania dwóch obrazów. Ogólnie rzecz biorąc, 3 do 5 punktów orientacyjnych powinno wystarczyć.
   2. Algorytm oblicza wypaczenie na podstawie kombinacji punktów orientacyjnych i podobieństwa obrazu. Optymalizuj pod kątem względnej wagi przypisanej tym dwóm czynnikom, aż do osiągnięcia zadowalających wyników.
4. Zniekształc mapę komórki uzyskaną w sesji jednofotonowej, aby wygenerować nową mapę komórki, która jest wyrównana do danych z dwoma fotonami.
   1. Następnie zaimportuj tę zniekształconą mapę komórek do oprogramowania do przetwarzania 1P, aby wygenerować obraz z maksymalnym obrazem projekcji z filmu dwufotonowego w tle.
   2. Wyeksportuj ten obraz w celu rejestracji.
5. W oprogramowaniu do programowania wyrównaj dwa wygenerowane do tej pory obrazy (mapa komórek dwufotonowych na obrazie maksymalnej projekcji dwufotonowej) i wypacz mapę komórek jednofotonowych na obraz projekcji maksymalnej dwufotonowej (Rysunek 6B,C).
   1. W tym celu w tym badaniu należy użyć aplikacji do estymacji rejestracji, która pozwala użytkownikowi porównać wyniki różnych technik rejestracji. Biorąc pod uwagę, że oba obrazy mają to samo tło, technika korelacji fazowej, ze sztywną rejestracją, była wystarczająca.
6. Po zakończeniu rejestracji zeskanuj teraz zarejestrowany obraz w poszukiwaniu nakładających się zwrotów akcji. Są to ROI, które są aktywne w obu sesjach nagraniowych, które można wykorzystać w dalszej analizie.

Rysunek 6: Rejestracja komórek w różnych modalnościach za pomocą przepływu pracy MIRA. (A) Reprezentatywny obraz z procesu wyrównywania komórek. Średni obraz z danych jednofotonowych jest pokazany po lewej stronie, a obraz z danych dwufotonowych jest pokazany po prawej. Pasujące punkty orientacyjne z obu obrazów są wybierane i oznaczane w oprogramowaniu losowym schematem kolorów (czerwone kółka). (B) Przykładowe obrazy przedstawiające dwa zidentyfikowane zestawy komórek, jednofotonowe (fioletowe) i dwufotonowe (zielone), są nakładane na średni obraz danych dwufotonowych. (C) Obraz obszaru zaznaczony białą ramką w (B), wyrównane komórki są tutaj reprezentowane jako nakładające się na siebie zielone i fioletowe kontury. We wszystkich panelach podziałka reprezentuje 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Pokazano metodę przeprowadzania przewlekłego wielowarstwowego obrazowania wapniowego in vivo tej samej populacji neuronów przez okres kilku tygodni, przy użyciu zarówno jedno-, jak i dwufotonowych metod obrazowania, w warunkach swobodnego ruchu i skupienia głowy. W tym przypadku zademonstrowano zdolność do identyfikacji pasujących populacji neuronów pod kątem obrazowania jednofotonowego, podczas gdy zwierzę eksplorowało otwartą arenę w ciemności (Figura 7A). Ślady wapnia wyekstrahowano ze zidentyfikowanych neuronów i oceniono metodą Z dla porównania (Ryc. 7B). Neurony wykazywały porównywalne poziomy fluorescencji i szybkości wypalania w sesjach oddalonych od siebie o 3 tygodnie.

Rysunek 7: Dynamika wapnia z pierwszorzędowej kory wzrokowej może być stabilnie rejestrowana w sesjach trwających 3 tygodnie. (A) Filtry przestrzenne zidentyfikowanych neuronów nałożone na obrazy maksymalnej projekcji z trzech oddzielnych nagrań tego samego pola widzenia pod jednofotonowym swobodnie poruszającym się obrazowaniem wapnia, obejmującym okres 3 tygodni. Zwroty z inwestycji są oznaczone w kolejności, w jakiej są przedstawione (B). Ciemne obszary w drugiej (środkowej) i trzeciej (prawej) sesji są wynikiem rejestracji obrazu, przy użyciu pierwszej (lewej) sesji jako odniesienia (pasek skali reprezentuje 0,5 mm). (B) Aktywność wapnia z wynikiem Z zarejestrowanych ROI w pierwszej (lewej), drugiej (środkowej) i trzeciej (prawej) sesji pokazanej w (A). Pozioma skala ma 10 s, a pionowa skala ma 10 sd. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Następnie zademonstrowano rejestrację populacji neuronów w różnych modalnościach obrazowania. Tego samego dnia przeprowadzono sesje obrazowania jedno- i dwufotonowego. Zwroty akcji zostały zidentyfikowane na podstawie danych jednofotonowych i ręcznie wyselekcjonowane w celu wygenerowania mapy komórek ( Rysunek 8A). Podobnie, dane dwufotonowe zostały przetworzone w celu wygenerowania mapy komórek, dzięki której komórki są automatycznie identyfikowane i ręcznie wybierane do demonstracji. Następnie, średni obraz projekcyjny z sesji jednofotonowej został wyrównany do maksymalnego obrazu projekcyjnego z dwufotonowego stosu z platformą MIRA (Rysunek 8B). Ta zniekształcona mapa komórek została następnie wyeksportowana, nałożona na obraz maksymalnej projekcji dwóch fotonów i wyrównana z mapą komórek dwufotonowych (Rysunek 8C). Pozwoliło to na identyfikację komórek, które wykazały aktywność tych samych komórek w obu modalnościach obrazowania (Rysunek 8D), które można wykorzystać do ilościowej analizy odpowiedzi neuronalnych.

Rysunek 8: Dynamika wapnia z pierwszorzędowej kory wzrokowej zarejestrowana pomiędzy różnymi modalnościami obrazowania. (A) Filtry przestrzenne zidentyfikowanych neuronów nałożone na obraz maksymalnej projekcji z jednofotonowej, swobodnie poruszającej się sesji. Oznaczone neurony to te, które zostały pomyślnie zarejestrowane w danych zapisu dwufotonowego przedstawionych w (C). (B) Te same kontury pokazane w (A) zostały wypaczone tak, aby pasowały do danych z sesji dwufotonowej pokazanych w (C). (C) Filtry przestrzenne ROI pokazane w (A) po wyrównaniu (kolor biały) oraz ROI zidentyfikowane za pomocą oprogramowania do przetwarzania 2P z sesji nagraniowej z dwoma fotonami w tym samym dniu (zielony), nałożone na maksymalny obraz projekcyjny z sesji dwufotonowej. Nakładające się ROI są uważane za zarejestrowane i wybierane do dalszej analizy (podziałka liniowa reprezentuje 0,5 mm). (D) Aktywność wapniowa z punktacją Z zarejestrowanych ROI w sesjach nagrywania jednofotonowych (po lewej) i dwufotonowych (po prawej) (pozioma skala to 10 s, a pionowa skala to 10 sd). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Tutaj wykazaliśmy zdolność do obserwowania i bezpośredniego porównywania neuronów w warunkach skupienia na głowie i swobodnego poruszania się w tych samych populacjach neuronalnych. Podczas gdy zademonstrowaliśmy zastosowanie w korze wzrokowej, protokół ten można dostosować do wielu innych obszarów mózgu, zarówno obszarów korowych, jak i głębokich jąder 24,25,26,27,28, a także innych konfiguracji pozyskiwania danych i zachowań^29,30.

Ważne jest, aby zwrócić uwagę na krytyczne kroki w ramach tego protokołu, ponieważ umożliwiają one optymalne pozyskiwanie danych. Po pierwsze, podczas wykonywania z-stacków ważne jest utrzymanie stałej luminancji przez cały czas. Jak opisano wcześniej, światło rozprasza się, im więcej tkanki musi przeniknąć; w ten sposób, zwiększając wzmocnienie, laser ma większą moc, aby móc dalej wnikać w tkankę i wzbudzać nasze ROI. Nie zaleca się jednak uruchamiania stosu z przyrostem wymaganym do wzbudzenia ROI w tkance głębokiej, ponieważ spowoduje to nadmierną ekspozycję struktur fluorescencyjnych i fototoksyczność oraz może wybielić tkankę na powierzchni kory. W związku z tym wybranie opcji Względny gradient wykładniczy pozwala oprogramowaniu obliczyć stały gradient mocy potrzebnej do tego, aby być optymalnym na każdym kroku stosu z. Po drugie, kolejnym krytycznym krokiem, który ma pomóc w konsekwentnej rejestracji zestawów komórek w czasie, jest zapisanie średniego obrazu filmu wykonanego podczas pierwszej sesji obrazowania jednofotonowego. Dzięki temu użytkownik może porównać wszelkie kolejne sesje obrazowania z oryginalnym obrazem, aby zapewnić ciągłość w zestawach komórek i akwizycji danych.

Warto zauważyć, że niezależnie zaprojektowano lekkie^, zminiaturyzowane mikroskopy dwufotonowe^31,32, które umożliwiają obrazowanie w wysokiej rozdzielczości u swobodnie zachowujących się zwierząt. Chociaż podkreśla ekscytujący postęp w obrazowaniu in vivo w wysokiej rozdzielczości, ograniczone pole widzenia (FOV) i wysoce wyspecjalizowana konstrukcja sprawiają, że jest to wyzwanie dla zwykłych użytkowników końcowych. Opisana przez nas metoda integruje kilka dobrze znanych platform łatwo dostępnych od dostawców komercyjnych, dzięki czemu jest to łatwy wybór. Teoretycznie można go również zastąpić dostosowanym, samodzielnie składanym mikropryzmatem kompatybilnym z miniskopem typu open source i ogólnym mikroskopem dwufotonowym^33,34.

Niemniej jednak protokół ten stoi przed wyzwaniami, takimi jak dokładna implantacja mikropryzmatów, ponieważ błędy mogą prowadzić do nieopłacalnych FOV, a w konsekwencji do naruszenia danych. Utrzymanie spójnych pól widzenia we wszystkich modalnościach jest również wyzwaniem ze względu na różne cele wykorzystywane do pozyskiwania obrazów. Ponieważ jednak osie XY mikropryzmatu pozostają stałe, zmiana pola widzenia występuje wzdłuż osi Z; w związku z tym określone punkty orientacyjne obecne w obu trybach obrazowania (takie jak naczynia krwionośne, artefakty w tkance korowej i identyczne neurony) są wykorzystywane do synchronizacji FOV. Co więcej, ważne jest, aby zastosować rejestrację w celu wyrównania i identyfikacji tych samych neuronów w różnych modalnościach. Kolejnym wyzwaniem, o którym należy pamiętać, jest zminimalizowanie fotowybielania tkanki GCaMP podczas pozyskiwania w obu modalnościach. Dlatego ważne jest, aby skrócić czas spędzony na nagrywaniu, zoptymalizować stosunek sygnału do szumu (poprzez zwiększenie wzmocnienia, a nie mocy diody LED/lasera) i odczekać 24-48 godzin między sesjami obrazowania.

Pomimo tych nieodłącznych złożoności, nasz protokół, gdy jest wykonywany z chirurgiczną precyzją i odpowiednimi technikami przetwarzania obrazu, stanowi solidną platformę do porównywania aktywności neuronalnej. Umożliwia porównanie stanów skupienia na głowie w ściśle kontrolowanych zadaniach i swobodnie poruszających się stanów, które naśladują bardziej naturalne zachowania, rozszerzając w ten sposób potencjalne zastosowania w dziedzinie neuronauki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,9% roztwór chlorku sodu do infuzji (Vetivex 11) 250ml	Dechra	20091607	Sól fizjologiczna do nawodnienia i przygotowania leków
18004-1 Wiertło Trephine o średnicy 1,8 mm	FST	18004-18	Wiertło
1ml strzykawka	Terumo	MDSS01SE	1ml Igła
23G x 5/8 cala 6% LUER Igła
Terumo NN-2316R 23G71000 Zautomatyzowany aparat stereotaktyczny z wbudowanym oprogramowaniem	RWD-RWD
Wchłanialna hemostatyczna gąbka żelatynowa (10x10x10mm)	Surgispon	SSP-101010	żel-pianka
Wkładki nasączone alkoholem 70% alkoholu izopropylowego	Braun	9160612	Poduszki alkoholowe
Folia aluminiowa	Dowolny sprzedawca	-	Folia do zakrywania oczu podczas operacji
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy	Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand	3525/25ML	ACSF
Automatyczna pompa do mikroiniekcji	WPI	8091
Roztwór betadyny (10% jodowany powidon) 500ml	Videne/Ecolab	3030440	Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (dostosowany)		System obrazowania dwufotonowego Bruker
Cardiff Aldasorber	Vet-Tech	AN006	Absorber anestezjologiczny
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC	Nikon	MRH48230	20x soczewka obiektywowa
Kompaktowy system anestezjologiczny - pojedynczy gaz - izofluran K/F, z koncentratorem tlenu model: ZY-5AC i oczyszczaczem	Vet-Tech	AN001	Kompaktowy system anestezjologiczny
Contec Prochlor	Aston Pharma	AP2111L1	Środek dezynfekujący (kwas podchlorawy)
Deksametazon Fosforan sodu do wstrzykiwań, USP, 4 mg / ml, NDC: 0641-6145-25	Hikma	Covetrus: 70789	deksametazonu
, krawędź tnąca 4 mm, grubość 0,5 mm, stal nierdzewna	Fine Science Tools	10055-12	Nóż do siekania kory
Dwustronna, nieprzebijająca mysz & Pręty do uszu noworodków szczurów	Stoelting	51649	Drążek do uszu
Mikroskop atrapy	Inscopix	Mikroskop atrapy	Pomaga w implantacji
Etanol (100%)	VWR	40-1712-25	Służy do produkcji 70% etanolu
Marka rybacka  Jednorazowe rękawiczki nitrylowo-indygo Rękawice PPE Cat III	FischerScientific	17182182
Monitor homeotermiczny 50-7222-F	Aparatura harwardzka	50-7222-F	Hometermiczny system monitorowania/poduszka grzewcza
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu	Oprogramowanie do przetwarzania obrazów	ImageJ-Image
Oprogramowanie do przetwarzania danych Inscopix (IDPS)	Obrazowanie wapnia Inscopix-One-photon		oprogramowanie do przetwarzania
Insight Duals-232, S/N 2043	InSight	Insight Spectra X3	Dwufotonowy laser obrazujący
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalacji	Zoetis	WM 42058/4195	Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive	World Precision Intruments (WPI)	KWIK-SIL	Klej silikonowy
MICROMOT zasilacz sieciowy NG 2/S, z agregatem wiertarskim 60/E	PROXXON	NR 28 515	Wiertarka ręczna
Pakiet zintegrowanego systemu obrazowania i optogenetyki nVoke	System obrazowania Inscopix-One-photon i oprogramowanie
Zestaw implantów ProView Zestaw implantów	Inscopix	ProView Mikroskop	atrapetyczny, ramię stereotaktyczne i nasadka
ProView Sonda pryzmatyczna	Inscopix	1050-002203	Soczewka mikropryzmatyczna
Rimadyl (50mg/ml)	Zoetis	VM 42058/4123	Carprofen
Mikroskop stereotaksyjny na ramieniu przegubowym z zaciskiem stołowym	WPI	PZMTIII-AAC	mikroskop
Zestaw uniwersalny Super-Bond, SUN Medical	Prestige-Dental	K058E	Adhezyjny cement
Dwufotonowe oprogramowanie do obrazowania wapnia	Suite2P-Dwufotonowe		oprogramowanie do obrazowania wapnia
Waporyzator	Vet-Tech-Isoflurane		parownik
Xailin Smarująca maść do oczu 5g	Xailin-Night	MLG/28/1551	Maść okulistyczna