Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.
Artykuł metodologiczny
Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wraz z postępem mikroskopii wielofotonowej i technologii molekularnych, obrazowanie fluorescencyjne szybko się rozwija, stając się potężnym podejściem do badania struktury, funkcji i plastyczności żywych tkanek mózgu. W porównaniu z konwencjonalną elektrofizjologią, mikroskopia fluorescencyjna może uchwycić aktywność neuronalną, a także morfologię komórek, umożliwiając długoterminowe zapisy zidentyfikowanych populacji neuronów w rozdzielczości jednokomórkowej lub subkomórkowej. Jednak obrazowanie w wysokiej rozdzielczości zazwyczaj wymaga stabilnego, stałego ustawienia głowy, które ogranicza ruchy zwierzęcia, a przygotowanie płaskiej powierzchni z przezroczystego szkła umożliwia wizualizację neuronów w jednej lub więcej płaszczyznach poziomych, ale jest ograniczone w badaniu procesów pionowych przebiegających na różnych głębokościach. W tym miejscu opisujemy procedurę łączenia mocowania płyty czołowej i mikropryzmatu, która daje obrazowanie wielowarstwowe i multimodalne. To chirurgiczne przygotowanie nie tylko daje dostęp do całej kolumny kory wzrokowej myszy, ale umożliwia obrazowanie dwufotonowe w pozycji unieruchomionej głowy i obrazowanie jednofotonowe w swobodnie poruszającym się paradygmacie. Korzystając z tego podejścia, można pobierać próbki zidentyfikowanych populacji komórek w różnych warstwach kory mózgowej, rejestrować ich reakcje w stanach stacjonarnych i swobodnie poruszających się oraz śledzić długoterminowe zmiany na przestrzeni miesięcy. W ten sposób metoda ta zapewnia kompleksowe badanie mikroobwodów, umożliwiając bezpośrednie porównanie aktywności neuronalnej wywołanej przez dobrze kontrolowane bodźce i w naturalnym paradygmacie behawioralnym.
Wprowadzenie
Pojawienie się dwufotonowego obrazowania fluorescencyjnego in vivo1,2, łączące nowe technologie w systemach optycznych i genetycznie modyfikowane wskaźniki fluorescencji, stało się potężną techniką w neurobiologii do badania skomplikowanej struktury, funkcji i plastyczności w żywym mózgu3,4. W szczególności ta metoda obrazowania oferuje niezrównaną przewagę nad tradycyjną elektrofizjologią, rejestrując zarówno morfologię, jak i dynamiczną aktywność neuronów, ułatwiając w ten sposób długoterminowe śledzenie zidentyfikowanych neuronów5,6,7,8.
Pomimo swoich godnych uwagi zalet, zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości często wymaga statycznego, stałego ustawienia głowy, które ogranicza mobilność zwierzęcia9,10,11. Dodatkowo, użycie przezroczystej szklanej powierzchni do wizualizacji neuronów ogranicza obserwacje do jednej lub więcej płaszczyzn poziomych, ograniczając eksplorację dynamiki procesów pionowych, które rozciągają się na różnych głębokościach kory mózgowej12.
Odnosząc się do tych ograniczeń, niniejsze badanie przedstawia innowacyjną procedurę chirurgiczną, która integruje stabilizację płytki głowy, mikropryzmat i miniskop, aby stworzyć modalność obrazowania z wielowarstwowymi i multimodalnymi możliwościami. Mikropryzmat umożliwia obserwację przetwarzania pionowego wzdłuż kolumny korowej13,14,15,16, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób informacja jest przetwarzana i przekształcana podczas przemieszczania się przez różne warstwy kory mózgowej oraz jak zmienia się przetwarzanie pionowe podczas zmian plastycznych. Co więcej, umożliwia obrazowanie tych samych populacji neuronalnych w paradygmacie ustalonym na głowę i w swobodnie poruszającym się otoczeniu, obejmując wszechstronne ustawienia eksperymentalne17,18,19: na przykład fiksacja głowy jest często wymagana w przypadku dobrze kontrolowanych paradygmatów, takich jak ocena percepcji sensorycznej i stabilne nagrania w paradygmacie 2-fotonowym, podczas gdy swobodne poruszanie się oferuje bardziej naturalne, elastyczne środowisko dla badania behawioralne. Dlatego możliwość przeprowadzenia bezpośredniego porównania w obu trybach ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszego zrozumienia mikroukładów, które umożliwiają elastyczne, funkcjonalne reakcje.
W istocie, integracja mocowania płytki głowy, mikropryzmatu i miniskopu w obrazowaniu fluorescencyjnym stanowi obiecującą platformę do badania zawiłości struktury i funkcjonalności mózgu. Naukowcy mogą pobierać próbki zidentyfikowanych populacji komórek na różnych głębokościach obejmujących wszystkie warstwy kory mózgowej, bezpośrednio porównywać ich odpowiedzi zarówno w dobrze kontrolowanych, jak i naturalnych paradygmatach oraz monitorować ich długoterminowe zmiany na przestrzeni miesięcy20. Podejście to dostarcza cennych informacji na temat tego, w jaki sposób te populacje neuronów oddziałują na siebie i zmieniają się w czasie w różnych warunkach eksperymentalnych, zapewniając wgląd w dynamiczną naturę obwodów neuronalnych.
Protokół
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z brytyjską ustawą Animals (Scientific Procedures) Act 1986 na podstawie osobistych i projektowych licencji zatwierdzonych i wydanych przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych (Home Office) po odpowiedniej ocenie etycznej. Hodowano dorosłe linie transgeniczne CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21, a ich potomstwo wykorzystano w eksperymencie. Dla zapewnienia bezpieczeństwa badaczy oraz utrzymania warunków sterylnych wszystkie procedury wykonywano w warunkach aseptycznych, stosując pełne środki ochrony osobistej.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
- Aby zminimalizować obrzęk, podaj Dexamethasone (0,2 mg/kg) podskórnie na 12–24 h przed operacją.
- Wszystkie narzędzia chirurgiczne wysterylizuj w autoklawie, a obszar operacyjny przed zabiegiem zdezynfekuj stabilizowanym kwasem podchlorowym z wodą destylowaną oraz 70% etanolem. Upewnij się, że cała aparatura chirurgiczna jest włączona.
- Zanestezjuj zwierzę (samiec w wieku 24 tygodni o masie 31 g) przy użyciu izofluranu z dawką indukcyjną 5%, którą należy zmniejszyć do 1%–2% po umieszczeniu myszy w aparacie stereotaksycznym, utrzymując przepływ O2 na poziomie 1–2 L/min. Wstrzyknij podskórnie niesteroidowe leki przeciwzapalne (Carprofen, 2,5 mg/kg).
- Sprawdź brak odruchu na uciśnięcie palca, aby ocenić głębokość znieczulenia (w przypadku wystąpienia odruchu zwiększ stężenie izofluranu w przyrostach o 0,5%).
- Wygol głowę zwierzęcia trymerem, od okolic za uszami do miejsca nieco powyżej oczu. Oczyść ten obszar gazikiem nasączonym alkoholem oraz roztworem powidon-jodu, dbając o to, aby uniknąć kontaktu z oczami zwierzęcia.
- Umieść zwierzę na homeotermicznej macie grzewczej oraz w aparacie stereotaksycznym wyposażonym w pręty uszne i zębowe, a następnie unieruchom głowę. Upewnij się, że głowa jest stabilna, ponieważ jest to kluczowe dla powodzenia dalszej procedury (Rysunek 1).
- Nałóż maść oftalmiczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec ich wysychaniu podczas operacji, i przykryj je folią, aby chronić przed światłem. Przykryj zwierzę sterylną ściereczką chirurgiczną.
Rycina 1: Przygotowanie przedoperacyjne. Myszy umieszcza się w aparacie stereotaksycznym, zabezpieczając ją za pomocą uchwytu nosowego i prętów usznych. Myszy umieszcza się na podkładce grzewczej z regulacją temperatury. Na oczy nakłada się maść oftalmiczną, a następnie przykrywa je folią aluminiową. Głowę ogala się, a czaszkę odsłania. Zwierzę przykrywa się sterylną osłoną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
2. Kraniotomia
- Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej ogolonego obszaru głowy, aby odsłonić czaszkę.
- Oczyść czaszkę za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego i rozcieńczonego nadtlenku wodoru (3% w/v 35% H2O2 w 97% dH2O) przez 1-3 s, aby usunąć wszelką tkankę łączną (Rycina 2A). Osusz czaszkę, używając kropli 70% etanolu i nowego sterylnego patyczka bawełnianego.
- Wyrównaj czaszkę w osi przedniej/tylnej (AP) oraz przyśrodkowej/bocznej (ML), aby zapewnić dokładne miejsce implantacji. W tym celu zmierz głębokość grzbietowo-brzuszną (DV) czaszki w punktach bregma i lambda i upewnij się, że różnica między nimi wynosi <0.03 mm. W celu wyrównania przyśrodkowo-bocznego zmierz punkty w jednakowej odległości od linii środkowej na obu kościach ciemieniowych i ponownie upewnij się, że różnica DV wynosi <0.03 mm.
- Przyjmując punkt bregma jako punkt odniesienia, zlokalizuj i zaznacz pożądany obszar kory; w tym przypadku jest to monokularna pierwotna kora wzrokowa (V1), AP: -3.5 mm, ML: -2.5 mm.
- Użyj wiertła trepanacyjnego (średnica 1.8 mm) i wiertarki stomatologicznej (prędkość 10 000 obr./min), aby odsłonić korę, upewniając się, że znacznik pożądanego obszaru kory (monokularne V1) znajduje się w dolnej jednej trzeciej otworu wywierconego wiertłem.
- Upewnij się, że kąt wiertła jest prostopadły do krzywizny czaszki. Zapewni to równomierną kraniotomię i zapobiegnie uszkodzeniu opony twardej lub kory.
- Wierć do momentu zmniejszenia oporu, a następnie przestań (Rycina 2B). Ostrożnie usuń oddzielony fragment kości za pomocą końcówki igły 23G (Rycina 2C).
- Oczyść odsłoniętą korę za pomocą gąbki chirurgicznej nasyconej zimnym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF), aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i zatamować ewentualne krwawienie.
- Przez cały czas trwania operacji utrzymuj odsłoniętą korę w stanie nawilżenia, używając zimnego ACSF.
Rysunek 2: Kraniektomia. (A) Przedstawiono nacięcie skóry między bregma a lambda. Tkanka łączna została usunięta z odsłoniętej powierzchni. (B) Kraniektomia za pomocą trepanatora przed usunięciem fragmentu kości. (C) Kraniektomia po usunięciu fragmentu kości, ukazująca nienaruszoną oponę twardą i korę (pasek skali reprezentuje 0,5 mm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
3. Wykonanie wstępnego nacięcia
UWAGA: Przy wykonywaniu nacięcia wstępnego należy pamiętać, że nacięcie oraz implantacja mikropryzmatu muszą znajdować się przed obszarem obrazowania (ROI). Pozwoli to na uzyskanie pełnego i dokładnego pola widzenia. W ramach niniejszego protokołu nacięcie zostanie wykonane wzdłuż osi mediolateralnej, a mikropryzmat zostanie zorientowany przodem w stronę tylną (Rysunek 3B).
- Aby ułatwić wprowadzenie i zmniejszyć ucisk w korze podczas implantacji mikropryzmatu, wykonaj nacięcie.
- Przymocuj skalpel chirurgiczny do uchwytu ramienia stereotaksycznego i ustaw ostrze lub ramię stereotaksyczne tak, aby cięcie odbywało się wzdłuż osi ML.
- Przesuń skalpel do pożądanej współrzędnej AP (AP: -3.4mm); pryzmat musi znajdować się przed ROI, dlatego wykonaj nacięcie 100 µm przed współrzędną AP obrazowanego ROI (-3.5mm).
- Przesuwając teraz skalpel do przyśrodkowej krawędzi kraniotomii, w miejscu styku z czaszką, powoli opuść go, aż dotrze do kości, a następnie zatrzymaj. Ponieważ grubość kości wynosi 200 µm, uwzględnij tę wartość w całkowitej głębokości wprowadzenia (patrz obliczenia w kroku 5.1).
- Optymalne obrazowanie uzyskuje się w centrum pryzmatu, tj. przy 500 µm; upewnij się zatem, że głębokość ta jest zgodna z głębokością kolumny korowej (ROI DV: - 0.35 mm).
- Uwzględniając grubość czaszki w obliczeniach głębokości, skorzystaj z poniższego równania, które określa, jak głębokie musi być wstępne nacięcie od powierzchni czaszki. W tym protokole głębokość implantacji oblicza się następująco:
Grubość kości (200 µm) + ROI obrazowania (np. 350 µm) + pozostała głębokość mikropryzmatu (500 µm) = 1,050 µm
- Uwzględniając grubość czaszki w obliczeniach głębokości, skorzystaj z poniższego równania, które określa, jak głębokie musi być wstępne nacięcie od powierzchni czaszki. W tym protokole głębokość implantacji oblicza się następująco:
- Upewnij się, że długość nacięcia przekracza 1 mm, ale nie jest nadmierna; optymalna odległość to 1,2 mm, przy czym monokularna współrzędna ML powinna znajdować się w połowie tego dystansu.
- Przed wykonaniem nacięcia usuń nadmiar ACSF, aby pole widzenia nie było zasłonięte (Ryc. 3A).
- Przesuń skalpel z przyśrodkowej krawędzi kraniotomii do początkowej przyśrodkowej współrzędnej nacięcia. Powoli (10 µm/s) opuszczaj skalpel do kory.
- Po przebiciu opony twardej i wprowadzeniu skalpela do kory, nanieś kroplę zimnego ACSF na korę, aby utrzymać tkankę nawilżoną i nawodnioną podczas nacinania.
- Po osiągnięciu końcowej głębokości zacznij przesuwać skalpel wzdłuż osi ML (z prędkością 10 µm/s).
- Obserwuj tkanki otaczające podczas wykonywania nacięcia. Jeśli tkanka przesuwa się wraz ze skalpelem, poruszaj nim kilka razy w górę i w dół, aby upewnić się, że tkanka jest przecinana, a następnie kontynuuj ruch boczny, pamiętając o powrocie skalpela do końcowej głębokości.
- Po zakończeniu powoli unieś skalpel. Jeśli podczas nacinania pojawi się krew, wykorzystaj ten czas, aby oczyścić miejsce nacięcia gąbką chirurgiczną nasączoną ACSF w celu rozcieńczenia krwi i usunięcia jej z nacięcia. Pamiętaj, aby pozostawić świeżą, nasyconą gąbkę chirurgiczną na odsłoniętej korze do momentu wprowadzenia mikropryzmatu.
Rycina 3: Implantacja mikropryzmatu. (A) Wstępnie wykonane nacięcie. (B) Schemat zintegrowanej soczewki mikropryzmatycznej przedstawiający jej położenie w obrębie kory (C) Zintegrowana soczewka mikropryzmatyczna w prawidłowej orientacji względem wstępnego nacięcia przed wprowadzeniem do kory (pasek skali oznacza 0.5 mm). (D) Przykład nakładania cementu wokół zintegrowanej soczewki w celu zabezpieczenia jej mocowania do czaszki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
4. Wprowadzenie mikropryzmatu i implantacja płytki głowowej
- Soczewka mikropryzmatyczna składa się z soczewki gradientowej (GRIN) przytwierdzonej do pryzmatu na dystalnym końcu soczewki, która jest zintegrowana z płytką podstawy. Przymocuj mikropryzmat do zestawu implantacyjnego.
- Upewnij się, że strona obrazująca pryzmatu znajduje się naprzeciwko śruby płytki podstawy. Aby ułatwić wkładanie i pozycjonowanie mikropryzmatu, przymocuj go do ramki stereotaktycznej i zorientuj pryzmat tak, aby był wyrównany z nacięciem (Rysunek 3C).
- Powoli opuść mikropryzmat do miejsca nacięcia (10 µm/s). Pamiętaj o usunięciu ACSF podczas początkowego wkładania pryzmatu, ale po wprowadzeniu do kory przepłucz go zimnym ACSF, aby zlubrykować proces wkładania.
- Kora powinna pozostać stabilna podczas opuszczania pryzmatu do nacięcia; jeśli tak nie jest, dodaj dodatkowy ACSF i poruszaj korą, przesuwając pryzmat w górę i w dół, aby oddzielić korę od pryzmatu.
- Po osiągnięciu docelowej głębokości osusz odsłoniętą powierzchnię kory za pomocą sterylnej chusteczki, uważając, aby nie dotknąć pryzmatu.
- Przykryj odsłonięty obszar kory wokół pryzmatu, a także soczewkę, ochronną warstwą silikonowego kleju, minimalizując nadmiar kleju na otaczającej czaszce i atrapią mikroskopu.
- Po utwardzeniu (5-10 min) przymocuj płytkę głowy do czaszki, aby ustabilizować głowę podczas obrazowania z unieruchomioną głową.
- Upewnij się, że płytka głowy znajduje się wystarczająco z tyłu, aby nie przeszkadzać w rozmieszczeniu implantu i umożliwić odpowiednie nałożenie cementu w celu właściwego zabezpieczenia implantu.
- Upewnij się, że linia środkowa płytki głowy znajduje się nieco na prawo od wszczepionej soczewki, aby obie strony płytki głowy mogły zostać przymocowane do uchwytu głowy podczas przeprowadzania eksperymentów z unieruchomioną głową.
- Nałóż cement klejący na płytkę głowy i czaszkę.
- Przygotuj stomatologiczny cement klejący, mieszając 1 miarkę nieprzezroczystego proszku cementowego z 4 kroplami medium do mieszania i dodając jedną kroplę katalizatora.
- Nałóż cement zarówno na płytkę głowy, jak i na czaszkę i przytrzymaj płytkę głowy w miejscu do czasu utwardzenia, upewniając się, że jest ona równoległa do prętów usznych (poprzez badanie wizualne, sprawdzając oba elementy z góry i z tyłu głowy zwierzęcia).
- Nałóż cement klejący, aby pokryć resztę odsłoniętej czaszki i tkanki, obejmując mikropryzmat (do podstawy płytki podstawy) oraz płytkę głowy.
- Nie dopuść do dostania się cementu na płytkę podstawy, atrapę mikroskopu ani na żaden z jego elementów. Nakładaj cement klejący do momentu, aż mikropryzmat i płytka głowy zostaną pokryte i ustabilizowane (Rysunek 3D).
- Po utwardzeniu cementu odłącz atrapę mikroskopu, powoli przesuwając ramię stereotaktyczne w górę, jednocześnie stabilizując mikropryzmat pincetą (są one połączone za pomocą magnesów, dlatego podczas rozdzielania może być odczuwalny pewien opór).
- Nałóż osłonę ochronną na soczewkę i dokręć śrubę, aby zabezpieczyć ją na miejscu.
- Zdejmij zwierzę z ramki stereotaktycznej, pozwól mu dojść do siebie w ciepłym boksie regeneracyjnym i podaj podskórnie ogrzaną sterylną 0,9% sól fizjologiczną (3% masy ciała).
- Gdy zwierzę się obudzi i zacznie się poruszać, umieść je z powrotem w czystej klatce dla pojedynczego osobnika. Monitoruj zwierzę i podaj dodatkowe leki przeciwbólowe po operacji zgodnie z lokalną polityką instytucji w zakresie analgezji.
- Odczekaj 4 tygodnie po operacji; zwierzę powinno być wtedy gotowe do obrazowania.
5. Jednofotonowe obrazowanie wapnia w warstwach kory u swobodnie poruszających się myszy
UWAGA: Niezbędne jest każdorazowe wykorzystanie obrazów zarejestrowanych podczas oryginalnej sesji obrazowania, aby zapewnić dokładne uzyskanie zamierzonej płaszczyzny obrazowania. Zidentyfikowane punkty orientacyjne, wraz z neuronami, odgrywają kluczową rolę w procesie dopasowania opisanym szczegółowo w kroku 9 protokołu. Podczas pozyskiwania danych jednofotonowych miniscope służy zarówno jako system obrazowania, jak i źródło laserowe. Wzbudzanie odbywa się za pomocą diody LED o zakresie mocy 0-2 mW/mm2 na przedniej powierzchni obiektywu. Laser wykorzystuje długość fali wzbudzenia 455 ± 8nm (światło niebieskie) dla sygnałów GCaMP. Suwak regulacji ostrości soczewki może być użyty do dostrojenia ostrości (oś Z), co jest reprezentowane w interfejsie jako wartość 0-1000, gdzie 0 oznacza odległość roboczą 0µm, a 1000 oznacza maksymalną odległość roboczą 300µm.
- Przed rozpoczęciem zbierania danych pozwolić zwierzęciu na aklimatyzację w pomieszczeniu i otwartej arenie przez 1 h przed sesją nagrywania.
- Przed obrazowaniem zdezynfekować i wyczyścić wszystkie elementy odpowiednimi środkami dezynfekcyjnymi (np. stabilizowanym kwasem podchlorawym z wodą destylowaną oraz 70% etanolem).
- Skonfigurować moduł DAQ, podłączając go do komputera i uruchamiając oprogramowanie do akwizycji danych. Nawiązać bezpośrednie połączenie za pomocą kabla ethernet, aby zminimalizować utratę klatek; jednak w zależności od siły sygnału bezprzewodowego, tryb połączenia wireless może być wystarczający.
- Zamocować miniscope do płytki bazowej zwierzęcia, delikatnie trzymając je za kark.
- Najpierw zdjąć osłonę ochronną z płytki bazowej, odkręcając śrubę mocującą. Przytrzymać osłonę za otwór za pomocą pęsety. Następnie zamocować miniscope do płytki bazowej w miejscu, w którym znajdowała się osłona.
- Przed instalacją sprawdzić orientację miniscope względem płytki bazowej, tak aby strona z oznaczeniem śruby była skierowana w stronę śruby.
- Po zamocowaniu miniscope dokręcić śrubę mocującą, aby go ustabilizować. Śrubę należy dokręcać tylko do momentu poczucia oporu. Należy unikać zbyt mocnego dokręcania śruby mocującej, ponieważ może to uszkodzić miniscope.
- Podłączyć miniscope do modułu DAQ i przygotować oprogramowanie do nagrywania.
- W oprogramowaniu do akwizycji danych włączyć strumieniowanie dla miniscope i dostosować parametry nagrywania (częstotliwość klatek obrazowania, wzmocnienie, moc LED, wartość efocus), aby uzyskać wyraźne pole widzenia (Rysunek 4A).
- Włączyć okno histogramu i dostosować wzmocnienie oraz moc LED tak, aby rejestrowana intensywność mieściła się w zakresie od 35% do 70%.
- W przypadku prowadzenia badania podłużnego, odnieść się do nagrań lub migawek wykonanych w poprzedniej sesji i dostosować wartość efocus tak, aby wyraźnie widoczna była ta sama płaszczyzna obrazowania.
- Rozpocząć eksperyment i akwizycję danych.
- Po zakończeniu eksperymentu wyjąć zwierzę z aparatury behawioralnej.
- Trzymając zwierzę delikatnie za kark, poluzować śrubę mocującą i zdjąć miniscope z płytki bazowej zwierzęcia.
- Założyć osłonę ochronną z powrotem na płytkę bazową i ustabilizować ją śrubą mocującą.
- Przenieść zwierzę do klatki domowej (przejść do kroku 7 w przypadku chęci przetworzenia danych jednofotonowych).
Rysunek 4: Pozyskiwanie i przetwarzanie danych za pomocą oprogramowania. (A) Obraz przedstawiający strumień danych w czasie rzeczywistym z miniskopu. Zaleca się dostrojenie wartości ostrości soczewki, aby uzyskać wyraźny obraz w oknie strumieniowania, wraz z regulacją wzmocnienia i mocy lasera obrazującego (B) Schematyczny wykres ilustrujący zalecany proces wyrównywania dla sesji rejestrowanych w różnych punktach czasowych. Zaleca się wygenerowanie obrazu średniego z pierwszej sesji, zgodnie z instrukcjami oprogramowania do przetwarzania danych. Obraz ten powinien służyć jako obraz referencyjny podczas korekcji ruchu w kolejnych sesjach. (C) Przykłady czterech komórek z tego samego obrazu ΔF/F z maksymalną projekcją. Przez każdą komórkę poprowadzono pomarańczową linię w celu pomiaru średnicy komórki w pikselach, której średnia wartość jest przyjmowana jako argument wejściowy dla algorytmu identyfikacji komórek (lewa góra: 13, prawa góra: 11, lewa dół: 12, prawa dół: 13). (D) Wynik działania algorytmu identyfikacji komórek po ręcznej korekcie (obraz przycięty). Białe kontury reprezentują zidentyfikowane komórki (pasek skali odpowiada 100 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
6. Dwufotonowe obrazowanie wapnia w warstwach kory u myszy z unieruchomioną głową
UWAGA: W przypadku dwufotonowej mikroskopii skaningowej źródłem światła jest strojowalny laser ultraszybki o długości fali wzbudzenia 920 nm. Moc wzbudzenia, mierzona na obiektywie, wynosiła zazwyczaj od 100-150 mW i była dostosowywana w każdej sesji, aby uzyskać podobne poziomy fluorescencji. Światło emisji było filtrowane przez filtr emisyjny (525/70 nm) i mierzone przez niezależną lampę fotopowielacza (PMT), określaną jako kanał zielony. Obrazy pozyskano przy użyciu obiektywu z immersją powietrzną 20x (NA = 0.45, odległość robocza 6,9-8,2 mm).
- Przed rozpoczęciem pozyskiwania danych, w dniach poprzedzających badanie, przeprowadź habituację zwierzęcia z aparaturą (aby zwierzę oswoiło się z układem behawioralnym). Pozwól zwierzęciu spędzać od 15-30 min dziennie przez 2-3 dni na eksploracji układu lub do momentu, gdy zacznie wykazywać naturalne zachowania, przed przystąpieniem do zbierania danych.
- Włącz system obrazowania dwufotonowego, uruchom oprogramowanie do akwizycji i włącz laser. Przed kontynuacją upewnij się, że przysłony laserów są zamknięte, a PMT są wyłączone.
- Oczyść aparaturę do obrazowania dwufotonowego za pomocą stabilizowanego kwasu podchlorawego, wody destylowanej i 70% etanolu.
- Upewnij się, że aparatura jest dostosowana do rozmiaru zwierzęcia. Delikatnie przymocuj mysz i jej płytkę głowową do uchwytu głowowego i przykręć ją, aby ustabilizować głowę myszy.
- Po przymocowaniu zdejmij osłonę soczewki (patrz krok 5.4.1) i ustaw obiektyw tak, aby znajdował się nad płytką podstawową.
- Użyj sterowania epifluorescencyjnego oraz sterowników stołu XYZ, aby ustawić ostrość na tkankę korową.
- Gdy warstwy korowe staną się widoczne, przełącz mikroskop w tryb obrazowania dwufotonowego (zamień lustro na lustro dichroiczne, zamknij przysłonę fluorescencyjną oraz wyłącz laser i monitor epifluorescencyjny). Pamiętaj o wyłączeniu głównego oświetlenia w celu ochrony PMT podczas obrazowania.
- Ustaw parametry w celu optymalizacji pozyskiwanych plików obrazów.
- Do obrazowania wapnia używaj trybu akwizycji rezonansowej, ponieważ pozwala on rejestrować szybkie wyładowania sygnałów GCaMP.
- Dostosuj moc lasera, wzmocnienie PMT, zoom oraz tablice LUT (look-up tables), aby uzyskać optymalny obraz; odnieś się do obrazu jedno-fotonowego, aby upewnić się, że obrazowana jest prawidłowa płaszczyzna ogniskowania.
- Rozpocznij obrazowanie warstw korowych systemem dwufotonowym z jednoczesnym monitorowaniem behawioralnym i podawaniem bodźców (jeśli dotyczy).
- Pamiętaj o zapisaniu tych parametrów akwizycji oraz odległości XYZ, jeśli chcesz w przyszłości uzyskać identyczne obrazy.
- Aby zarejestrować stos obrazów z (z-stack) warstw korowych, wykonaj poniższe kroki.
- Znajdź płaszczyznę, od której rozpocznie się z-stack, dostosuj parametry akwizycji w celu optymalizacji obrazu i zaznacz ten punkt jako punkt początkowy w oprogramowaniu.
- Następnie, używając sterowania Z, przemieszczaj się w dół stosu, regulując jedynie moc lasera w celu utrzymania stałej jasności stosu, i zaznacz koniec stosu w oprogramowaniu.
- Krok krytyczny: korzystając z opcji Relative Exponential Gradient w zakładce Laser Power Gradient, pozwól oprogramowaniu obliczyć przyrost mocy lasera podczas przemieszczania się przez z-stack. Koniecznie zanotuj końcowe wartości mocy lasera w tabeli dostarczonej przez oprogramowanie, aby umożliwić obliczenie gradientu.
- Po ustawieniu parametrów z-stacku dostosuj wielkość kroku (µm).
UWAGA: Wielkość kroku determinuje czas trwania, liczbę przekrojów i jakość detali stosu. Mniejsze kroki skutkują dłuższym czasem akwizycji, zwiększoną liczbą przekrojów i lepszą szczegółowością w porównaniu do większych kroków. Z-stacki służą do pomocy w rejestracji obrazów jedno- i dwufotonowych, ponieważ pozwalają wyróżnić punkty orientacyjne lub cechy anatomiczne.
- Aby pozyskać serię czasową (T-series) zmian poziomu wapnia w neuronach, znajdź optymalną płaszczyznę ogniskowania za pomocą sterowników stołu XYZ i dostosuj moc lasera, wzmocnienie PMT, zoom oraz LUT.
- W zakładce T-series w oprogramowaniu do akwizycji zdefiniuj parametry częstotliwości akwizycji tak, aby odpowiadały danym pozyskanym za pomocą systemu obrazowania jedno-fotonowego.
UWAGA: Dopasowanie częstotliwości sprawi, że dane 1P i 2P będą porównywalne, co jest bardziej odpowiednie dla algorytmu identyfikacji komórek stosowanego w etapach przetwarzania danych. W akwizycji T-series można włączyć wiele wyzwalaczy oraz inne tryby akwizycji.
- W zakładce T-series w oprogramowaniu do akwizycji zdefiniuj parametry częstotliwości akwizycji tak, aby odpowiadały danym pozyskanym za pomocą systemu obrazowania jedno-fotonowego.
- Rozpocznij akwizycję T-series.
7. Przetwarzanie danych z jednofotonowego obrazowania wapnia
- W przypadku filmów z rejestracji jednofotonowej należy użyć oprogramowania do przetwarzania danych dołączonego do systemu miniscope.
- Najpierw należy poddać film wstępnemu przetwarzaniu poprzez przestrzenne i czasowe down-sampling. Zazwyczaj przestrzenny down-sampling filmu o czynnik dwa znacząco skraca czas przetwarzania bez poważnego pogorszenia dokładności identyfikacji komórek.
- Ustaw czynnik czasowego down-samplingu tak, aby częstotliwość klatek filmu została obniżona do około 10 Hz, co jest bardziej odpowiednie dla algorytmu identyfikacji komórek używanego w kolejnych krokach.
- W przypadku pozyskiwania wielu filmów w tym samym dniu obrazowania, należy połączyć je w jedną serię czasową przed etapem wstępnego przetwarzania, aby przetwarzać je wspólnie.
- Opcjonalnie: zastosuj filtr pasmowy przestrzenny do filmu, aby usunąć niskie i wysokie częstotliwości przestrzenne, co pozwoli uzyskać bardziej wygładzony obraz o wyższym kontraście.
- Zarejestruj film, korzystając z funkcji korekcji ruchu w oprogramowaniu. Pozwala to na rejestrację filmu i korektę artefaktów ruchu spowodowanych przemieszczaniem się miniscope względem powierzchni obrazowania.
- Krok krytyczny: w przypadku prowadzenia badania podłużnego zarejestruj filmy względem tego samego pola widzenia, na przykład średniego obrazu z filmu wykonanego w pierwszym dniu obrazowania (Rysunek 4B).
- Oblicz ΔF/F filmu, korzystając z odpowiedniej karty, i rzutuj film, aby wygenerować obraz maksymalnej projekcji filmu ΔF/F. Obraz ten wykaże regiony wykazujące zmiany poziomów fluorescencji, potencjalnie pojedyncze neurony, i może być użyty do pomiaru średniej średnicy neuronów (Rysunek 4C).
- Alternatywnie, zmierz średnicę komórek na filmie po korekcji ruchu, gdzie neurony wykazują wyraźną fluorescencję.
- Zidentyfikuj komórki, korzystając z algorytmów w oprogramowaniu.
- Choć na tym etapie dostępne są dwie opcje (PCA-ICA i CNMF-E), w niniejszym badaniu należy zastosować CNMF-E. Wprowadź średnią średnicę komórki w pikselach i uruchom algorytm, aby wygenerować zestaw komórek zawierający regiony zainteresowania (ROI), które wykazują aktywność typową dla komórek.
- Ręcznie wybierz ROI będące komórkami (posiadające morfologię i aktywność typową dla komórek22,23 oraz znajdujące się w polu widzenia FOV), oddzielając je od ROI niebędących komórkami, a następnie zatwierdź wyselekcjonowany zestaw komórek (Rysunek 4D).
- Wyeksportuj ślady wapniowe każdego ROI do dalszej analizy.
8. Przetwarzanie danych z dwufotonowego obrazowania wapnia
- W przypadku filmów z rejestracji dwufotonowej należy użyć pakietu języka Python przeznaczonego do analizy danych wapniowych z obrazowania dwufotonowego.
- Najpierw połącz obrazy wykonane w serii T w stos .tiff, zgodnie z poniższym opisem.
- W interfejsie opcji Run dostosuj parametry, w tym wartość tau oraz częstotliwość klatek, tak aby odpowiadały one zastosowanemu wskaźnikowi GCaMP i częstotliwości klatek podczas rejestracji.
- Opcjonalnie: ustaw parametr do_registration na 1, aby zarejestrować film. Jest to równoważne z krokiem korekcji ruchu opisanym powyżej.
- Opcjonalnie: ustaw parametr anatomical_only na 1, aby wykrywać ROI, wykorzystując cechy anatomiczne w połączeniu z dynamiką fluorescencji. Wymaga to podania średnicy komórki, dlatego należy dokonać pomiarów za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów. Jest to zazwyczaj zalecane, ponieważ pozwala na generowanie ROI o bardziej naturalnych kształtach (Rycina 5A-C).
- Po ustawieniu wszystkich parametrów uruchom algorytm, aby przeprowadził wszystkie obliczenia jednocześnie. Postęp prac można monitorować w graficznym interfejsie użytkownika (GUI).
- Po zakończeniu procesu wróć do interfejsu wyboru komórek w celu ręcznej weryfikacji wyników identyfikacji komórek.
- Zapisz obraz wyselekcjonowanego zestawu komórek nałożony na projekcję maksymalną filmu. Będzie on wykorzystywany później jako obraz referencyjny do rejestracji danych z pomiarów jednofotonowych.
- Następnie algorytm automatycznie zapisuje wyniki w formacie .npy, do których można później uzyskać dostęp za pomocą języka Python. Alternatywnie wyniki można zapisać w plikach o innym formacie w celu dalszej analizy w innym oprogramowaniu.
Rysunek 5: Identyfikacja komórek przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów dwufotonowych. (A) Reprezentatywny obraz identyfikacji komórek uzyskany z oprogramowania do przetwarzania obrazów dwufotonowych. Przy ustawieniu parametru Anatomical_only na 0, przy zachowaniu pozostałych parametrów bez zmian, w obszarze między liniami przerywanymi obecne są liczne obiekty niebędące komórkami, co utrudnia ręczną weryfikację rzeczywistych komórek. (B) Przykłady pomiarów średnicy komórek wykonane na obrazie (A) przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów (góra lewo; 7,5 piksela, góra prawo; 9, dół lewo; 6,5, dół prawo; 7,5). (C) Reprezentatywny obraz identyfikacji komórek. Przy ustawieniu parametru Anatomical_only na 1 oraz wprowadzeniu średniej średnicy komórek z (B) do algorytmu średnicy komórek, w obszarze między liniami przerywanymi nie występują żadne obiekty niebędące komórkami (paski skali reprezentują 200 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
9. Rejestracja zidentyfikowanych zestawów komórek w różnych modalnościach obrazowania
- Przeprowadź rejestrację komórek zidentyfikowanych z zapisów jednofotonowych i dwufotonowych za pomocą algorytmu multimodalnej rejestracji i analizy obrazu (MIRA), który jest dostępny poprzez interfejs Python oprogramowania do obrazowania jednofotonowego.
- Algorytm ten dopasowuje dane jednofotonowe i dwufotonowe za pomocą rejestracji nieliniowej (non-rigid registration). Należy zapoznać się z zestawem demonstracyjnych notatników online dostępnych na stronie internetowej i wykorzystanych w tej badaniu.
UWAGA: Notatniki zostały napisane w taki sposób, aby całe przetwarzanie odbywało się w oprogramowaniu 1P, przez co nie są one kompatybilne z oprogramowaniem do przetwarzania 2P. W związku z tym w przypadku niniejszego badania należy wykonać tylko niektóre kroki opisane w notatnikach.
- Algorytm ten dopasowuje dane jednofotonowe i dwufotonowe za pomocą rejestracji nieliniowej (non-rigid registration). Należy zapoznać się z zestawem demonstracyjnych notatników online dostępnych na stronie internetowej i wykorzystanych w tej badaniu.
- Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w notatnikach demonstracyjnych, które obejmują generowanie obrazu strukturalnego dla każdej metody obrazowania. Domyślnie polega to na wygenerowaniu maksymalnej projekcji stosu z w osi z dla obrazowania dwufotonowego oraz obrazu średniego z zapisu jednofotonowego. Alternatywnie można użyć obrazu średniego z zapisu dwufotonowego.
- W odpowiedzi na prośbę programu, zastosuj pasmowo-przepustowy filtr przestrzenny do obrazów, aby lepiej zwizualizować punkty orientacyjne, a następnie zorientuj je ponownie tak, aby były zgodne.
- Wybierz pasujące do siebie punkty orientacyjne na obu obrazach (Rysunek 6A).
- Wykorzystaj je do obliczenia przekształcenia (warp) niezbędnego do dopasowania obu obrazów. Zazwyczaj wystarczające powinno być od 3 do 5 punktów orientacyjnych.
- Algorytm oblicza przekształcenie w oparciu o kombinację punktów orientacyjnych i podobieństwa obrazów. Optymalizuj względną wagę przypisaną do tych dwóch czynników, aż do uzyskania satysfakcjonujących wyników.
- Przekształć mapę komórek pozyskaną w sesji jednofotonowej, aby wygenerować nową mapę komórek dopasowaną do danych dwufotonowych.
- Następnie zaimportuj tę przekształconą mapę komórek do oprogramowania przetwarzającego 1P, aby wygenerować obraz z maksymalną projekcją z filmu dwufotonowego w tle.
- Wyeksportuj ten obraz do celów rejestracji.
- W oprogramowaniu programistycznym dopasuj dwa obrazy wygenerowane do tej pory (dwufotonową mapę komórek nałożoną na dwufotonowy obraz maksymalnej projekcji) oraz nałóż przekształconą jednofotonową mapę komórek na dwufotonowy obraz maksymalnej projekcji (Rysunek 6B,C).
- W tym badaniu w tym celu należy użyć aplikacji do estymacji rejestracji, która pozwala użytkownikowi porównać wyniki różnych technik rejestracji. Biorąc pod uwagę, że oba obrazy mają to samo tło, wystarczająca była technika korelacji fazowej z rejestracją sztywną (rigid registration).
- Po zakończeniu rejestracji przeszukaj zarejestrowany obraz w poszukiwaniu nakładających się ROI. Są to ROI, które są aktywne w obu sesjach zapisu i mogą zostać wykorzystane w dalszej analizie.
Rysunek 6: Rejestracja komórek w różnych modalnościach przy użyciu przepływu pracy MIRA. (A) Reprezentatywny obraz z przepływu pracy dopasowania komórek. Po lewej stronie pokazano obraz średni z danych jednofotonowych, a po prawej obraz średni z danych dwufotonowych. Pasujące punkty orientacyjne z obu obrazów zostają wybrane i oznaczone w oprogramowaniu za pomocą zrandomizowanego schematu kolorów (czerwone okręgi). (B) Przykład dopasowanych obrazów pokazujący dwa zidentyfikowane zestawy komórek – jednofotonowe (fioletowe) i dwufotonowe (zielone) – nałożone na obraz średni z danych dwufotonowych. (C) Obraz obszaru oznaczonego białą ramką w (B); dopasowane komórki są tutaj przedstawione jako nakładające się zielone i fioletowe obrysy. Na wszystkich panelach pasek skali reprezentuje 200 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Wyniki
Przedstawiono metodę prowadzenia przewlekłego wielowarstwowego obrazowania wapniowego in vivo tej samej populacji neuronów przez okres kilku tygodni, z wykorzystaniem modalności obrazowania jednofotonowego i dwufotonowego, w warunkach swobodnego poruszania się oraz z unieruchomioną głową. Tutaj wykazano możliwość identyfikacji odpowiadających sobie populacji neuronów podczas obrazowania jednofotonowego w czasie, gdy zwierzę eksplorowało otwartą arenę w ciemności (Rysunek 7A). Ślady wapniowe zostały wyekstrahowane z zidentyfikowanych neuronów i poddane standaryzacji z-score w celu porównania (Rysunek 7B). Neurony wykazały porównywalne poziomy fluorescencji i częstotliwości wyładowań w sesjach oddalonych od siebie o 3 tygodnie.
Rysunek 7: Dynamikę wapnia z pierwotnej kory wzrokowej można stabilnie rejestrować w sesjach trwających 3 tygodnie. (A) Filtry przestrzenne zidentyfikowanych neuronów nałożone na obrazy z maksymalnej projekcji z trzech oddzielnych zapisów tego samego pola widzenia podczas jednofotonowego obrazowania wapnia u zwierząt swobodnie poruszających się, obejmujących okres 3 tygodni. ROI są oznaczone w kolejności, w jakiej są przedstawione w (B). Ciemne obszary w drugiej (środkowej) i trzeciej (prawej) sesji są wynikiem rejestracji obrazu z wykorzystaniem pierwszej (lewej) sesji jako referencji (Pasek skali reprezentuje 0.5 mm). (B) Aktywność wapnia w formie Z-score dla zarejestrowanych ROI w pierwszej (lewej), drugiej (środkowej) i trzeciej (prawej) sesji przedstawionych w (A). Pozioma skala to 10 s, a pionowa skala to 10 sd. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Następnie zaprezentowano rejestrację populacji neuronalnej przy użyciu różnych modalności obrazowania. Sesje obrazowania jednofotonowego i dwufotonowego przeprowadzono tego samego dnia. Na podstawie danych jednofotonowych zidentyfikowano obszary zainteresowania (ROI), które następnie poddano ręcznej kurateli w celu wygenerowania mapy komórek (Rycina 8A). Podobnie przetworzono dane dwufotonowe w celu wygenerowania mapy komórek, w której komórki zostały zidentyfikowane automatycznie, a następnie ręcznie wyselekcjonowane do celów demonstracyjnych. Następnie średni obraz projekcji z sesji jednofotonowej dopasowano do obrazu maksymalnej projekcji ze stosu z-stack obrazowania dwufotonowego za pomocą platformy MIRA (Rycina 8B). Ta przekształcona mapa komórek została wyeksportowana, nałożona na obraz maksymalnej projekcji dwufotonowej i wyrównana z dwufotonową mapą komórek (Rycina 8C). Umożliwiło to identyfikację komórek, co pozwoliło wykazać aktywność tych samych komórek w obu modalnościach obrazowania (Rycina 8D), co może być wykorzystane do ilościowej analizy odpowiedzi neuronalnych.
Rysunek 8: Dynamika wapnia z pierwotnej kory wzrokowej zarejestrowana przy użyciu różnych modalności obrazowania. (A) Filtry przestrzenne zidentyfikowanych neuronów nałożone na obraz maksymalnej projekcji z sesji jednofotonowej u zwierzęcia swobodnie poruszającego się. Oznaczone neurony to te, które zostały pomyślnie przypisane do danych z rejestracji dwufotonowej przedstawionych w (C). (B) Te same kontury pokazane w (A) zostały przekształcone w celu dopasowania do danych z sesji dwufotonowej pokazanych w (C). (C) Filtry przestrzenne ROI pokazane w (A) po wyrównaniu (białe) oraz ROI zidentyfikowane za pomocą oprogramowania do przetwarzania 2P z sesji rejestracyjnej dwufotonowej z unieruchomioną głową w tym samym dniu (zielone), nałożone na obraz maksymalnej projekcji z sesji dwufotonowej. Nakładające się ROI uznaje się za zarejestrowane i wybiera do dalszej analizy (paski skali reprezentują 0,5 mm). (D) Standaryzowana aktywność wapnia (Z-score) zarejestrowanych ROI w sesjach rejestracyjnych jednofotonowej (lewo) i dwufotonowej (prawo) (poziomy pasek skali to 10 s, a pionowy pasek skali to 10 sd). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Tutaj wykazaliśmy zdolność do obserwowania i bezpośredniego porównywania neuronów w warunkach skupienia na głowie i swobodnego poruszania się w tych samych populacjach neuronalnych. Podczas gdy zademonstrowaliśmy zastosowanie w korze wzrokowej, protokół ten można dostosować do wielu innych obszarów mózgu, zarówno obszarów korowych, jak i głębokich jąder 24,25,26,27,28, a także innych konfiguracji pozyskiwania danych i zachowań29,30.
Ważne jest, aby zwrócić uwagę na krytyczne kroki w ramach tego protokołu, ponieważ umożliwiają one optymalne pozyskiwanie danych. Po pierwsze, podczas wykonywania z-stacków ważne jest utrzymanie stałej luminancji przez cały czas. Jak opisano wcześniej, światło rozprasza się, im więcej tkanki musi przeniknąć; w ten sposób, zwiększając wzmocnienie, laser ma większą moc, aby móc dalej wnikać w tkankę i wzbudzać nasze ROI. Nie zaleca się jednak uruchamiania stosu z przyrostem wymaganym do wzbudzenia ROI w tkance głębokiej, ponieważ spowoduje to nadmierną ekspozycję struktur fluorescencyjnych i fototoksyczność oraz może wybielić tkankę na powierzchni kory. W związku z tym wybranie opcji Względny gradient wykładniczy pozwala oprogramowaniu obliczyć stały gradient mocy potrzebnej do tego, aby być optymalnym na każdym kroku stosu z. Po drugie, kolejnym krytycznym krokiem, który ma pomóc w konsekwentnej rejestracji zestawów komórek w czasie, jest zapisanie średniego obrazu filmu wykonanego podczas pierwszej sesji obrazowania jednofotonowego. Dzięki temu użytkownik może porównać wszelkie kolejne sesje obrazowania z oryginalnym obrazem, aby zapewnić ciągłość w zestawach komórek i akwizycji danych.
Warto zauważyć, że niezależnie zaprojektowano lekkie, zminiaturyzowane mikroskopy dwufotonowe31,32, które umożliwiają obrazowanie w wysokiej rozdzielczości u swobodnie zachowujących się zwierząt. Chociaż podkreśla ekscytujący postęp w obrazowaniu in vivo w wysokiej rozdzielczości, ograniczone pole widzenia (FOV) i wysoce wyspecjalizowana konstrukcja sprawiają, że jest to wyzwanie dla zwykłych użytkowników końcowych. Opisana przez nas metoda integruje kilka dobrze znanych platform łatwo dostępnych od dostawców komercyjnych, dzięki czemu jest to łatwy wybór. Teoretycznie można go również zastąpić dostosowanym, samodzielnie składanym mikropryzmatem kompatybilnym z miniskopem typu open source i ogólnym mikroskopem dwufotonowym33,34.
Niemniej jednak protokół ten stoi przed wyzwaniami, takimi jak dokładna implantacja mikropryzmatów, ponieważ błędy mogą prowadzić do nieopłacalnych FOV, a w konsekwencji do naruszenia danych. Utrzymanie spójnych pól widzenia we wszystkich modalnościach jest również wyzwaniem ze względu na różne cele wykorzystywane do pozyskiwania obrazów. Ponieważ jednak osie XY mikropryzmatu pozostają stałe, zmiana pola widzenia występuje wzdłuż osi Z; w związku z tym określone punkty orientacyjne obecne w obu trybach obrazowania (takie jak naczynia krwionośne, artefakty w tkance korowej i identyczne neurony) są wykorzystywane do synchronizacji FOV. Co więcej, ważne jest, aby zastosować rejestrację w celu wyrównania i identyfikacji tych samych neuronów w różnych modalnościach. Kolejnym wyzwaniem, o którym należy pamiętać, jest zminimalizowanie fotowybielania tkanki GCaMP podczas pozyskiwania w obu modalnościach. Dlatego ważne jest, aby skrócić czas spędzony na nagrywaniu, zoptymalizować stosunek sygnału do szumu (poprzez zwiększenie wzmocnienia, a nie mocy diody LED/lasera) i odczekać 24-48 godzin między sesjami obrazowania.
Pomimo tych nieodłącznych złożoności, nasz protokół, gdy jest wykonywany z chirurgiczną precyzją i odpowiednimi technikami przetwarzania obrazu, stanowi solidną platformę do porównywania aktywności neuronalnej. Umożliwia porównanie stanów skupienia na głowie w ściśle kontrolowanych zadaniach i swobodnie poruszających się stanów, które naśladują bardziej naturalne zachowania, rozszerzając w ten sposób potencjalne zastosowania w dziedzinie neuronauki.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych lub konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Pani Charu Reddy i Profesorowi Matteo Carandini (Cortex Lab) za ich porady dotyczące protokołu chirurgicznego i dzielenia się transgenicznym szczepem myszy. Dziękujemy dr Norbertowi Hogrefe (Inscopix) za jego wskazówki i pomoc w rozwoju chirurgii. Dziękujemy Pani Andreei Aldea (Sun Lab) za pomoc w przygotowaniu operacji i przetwarzaniu danych. Praca ta była wspierana przez Moorfields Eye Charity.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,9% roztwór chlorku sodu do infuzji (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Sól fizjologiczna do nawodnienia i przygotowania leków |
| 18004-1 Wiertło Trephine o średnicy 1,8 mm | FST | 18004-18 | Wiertło |
| 1ml strzykawka | Terumo | MDSS01SE | 1ml Igła |
| 23G x 5/8 cala 6% LUER Igła | |||
| Terumo NN-2316R 23G71000 Zautomatyzowany aparat stereotaktyczny z wbudowanym oprogramowaniem | RWD-RWD | ||
| Wchłanialna hemostatyczna gąbka żelatynowa (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | żel-pianka |
| Wkładki nasączone alkoholem 70% alkoholu izopropylowego | Braun | 9160612 | Poduszki alkoholowe |
| Folia aluminiowa | Dowolny sprzedawca | - | Folia do zakrywania oczu podczas operacji |
| Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automatyczna pompa do mikroiniekcji | WPI | 8091 | |
| Roztwór betadyny (10% jodowany powidon) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (dostosowany) | System obrazowania dwufotonowego Bruker | ||
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Absorber anestezjologiczny |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x soczewka obiektywowa |
| Kompaktowy system anestezjologiczny - pojedynczy gaz - izofluran K/F, z koncentratorem tlenu model: ZY-5AC i oczyszczaczem | Vet-Tech | AN001 | Kompaktowy system anestezjologiczny |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Środek dezynfekujący (kwas podchlorawy) |
| Deksametazon Fosforan sodu do wstrzykiwań, USP, 4 mg / ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus: 70789 | deksametazonu |
| , krawędź tnąca 4 mm, grubość 0,5 mm, stal nierdzewna | Fine Science Tools | 10055-12 | Nóż do siekania kory |
| Dwustronna, nieprzebijająca mysz & Pręty do uszu noworodków szczurów | Stoelting | 51649 | Drążek do uszu |
| Mikroskop atrapy | Inscopix | Mikroskop atrapy | Pomaga w implantacji |
| Etanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Służy do produkcji 70% etanolu |
| Marka rybacka Jednorazowe rękawiczki nitrylowo-indygo Rękawice PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | |
| Monitor homeotermiczny 50-7222-F | Aparatura harwardzka | 50-7222-F | Hometermiczny system monitorowania/poduszka grzewcza |
| Oprogramowanie do przetwarzania obrazu | Oprogramowanie do przetwarzania obrazów | ImageJ-Image | |
| Oprogramowanie do przetwarzania danych Inscopix (IDPS) | Obrazowanie wapnia Inscopix-One-photon | oprogramowanie do przetwarzania | |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Dwufotonowy laser obrazujący |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalacji | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Klej silikonowy |
| MICROMOT zasilacz sieciowy NG 2/S, z agregatem wiertarskim 60/E | PROXXON | NR 28 515 | Wiertarka ręczna |
| Pakiet zintegrowanego systemu obrazowania i optogenetyki nVoke | System obrazowania Inscopix-One-photon i oprogramowanie | ||
| Zestaw implantów ProView Zestaw implantów | Inscopix | ProView Mikroskop | atrapetyczny, ramię stereotaktyczne i nasadka |
| ProView Sonda pryzmatyczna | Inscopix | 1050-002203 | Soczewka mikropryzmatyczna |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Mikroskop stereotaksyjny na ramieniu przegubowym z zaciskiem stołowym | WPI | PZMTIII-AAC | mikroskop |
| Zestaw uniwersalny Super-Bond, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhezyjny cement |
| Dwufotonowe oprogramowanie do obrazowania wapnia | Suite2P-Dwufotonowe | oprogramowanie do obrazowania wapnia | |
| Waporyzator | Vet-Tech-Isoflurane | parownik | |
| Xailin Smarująca maść do oczu 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Maść okulistyczna |
Bibliografia
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V. Reshaping the optical dimension in optogenetics. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3(2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472(2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970(2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. The minicolumn hypothesis in neuroscience. Brain. 125, 935-951 (2002).
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579(2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678(2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728(2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894(2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897(2023).
Przedruki i uprawnienia
