Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wraz z postępem mikroskopii wielofotonowej i technologii molekularnych, obrazowanie fluorescencyjne szybko się rozwija, stając się potężnym podejściem do badania struktury, funkcji i plastyczności żywych tkanek mózgu. W porównaniu z konwencjonalną elektrofizjologią, mikroskopia fluorescencyjna może uchwycić aktywność neuronalną, a także morfologię komórek, umożliwiając długoterminowe zapisy zidentyfikowanych populacji neuronów w rozdzielczości jednokomórkowej lub subkomórkowej. Jednak obrazowanie w wysokiej rozdzielczości zazwyczaj wymaga stabilnego, stałego ustawienia głowy, które ogranicza ruchy zwierzęcia, a przygotowanie płaskiej powierzchni z przezroczystego szkła umożliwia wizualizację neuronów w jednej lub więcej płaszczyznach poziomych, ale jest ograniczone w badaniu procesów pionowych przebiegających na różnych głębokościach. W tym miejscu opisujemy procedurę łączenia mocowania płyty czołowej i mikropryzmatu, która daje obrazowanie wielowarstwowe i multimodalne. To chirurgiczne przygotowanie nie tylko daje dostęp do całej kolumny kory wzrokowej myszy, ale umożliwia obrazowanie dwufotonowe w pozycji unieruchomionej głowy i obrazowanie jednofotonowe w swobodnie poruszającym się paradygmacie. Korzystając z tego podejścia, można pobierać próbki zidentyfikowanych populacji komórek w różnych warstwach kory mózgowej, rejestrować ich reakcje w stanach stacjonarnych i swobodnie poruszających się oraz śledzić długoterminowe zmiany na przestrzeni miesięcy. W ten sposób metoda ta zapewnia kompleksowe badanie mikroobwodów, umożliwiając bezpośrednie porównanie aktywności neuronalnej wywołanej przez dobrze kontrolowane bodźce i w naturalnym paradygmacie behawioralnym.
Wprowadzenie
Pojawienie się dwufotonowego obrazowania fluorescencyjnego in vivo1,2, łączące nowe technologie w systemach optycznych i genetycznie modyfikowane wskaźniki fluorescencji, stało się potężną techniką w neurobiologii do badania skomplikowanej struktury, funkcji i plastyczności w żywym mózgu3,4. W szczególności ta metoda obrazowania oferuje niezrównaną przewagę nad tradycyjną elektrofizjologią, rejestrując zarówno morfologię, jak i dynamiczną aktywność neuronów, ułatwiając w ten sposób długoterminowe śledzenie zidentyfikowanych neuronów....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z brytyjską ustawą Animals (Scientific Procedures) Act 1986 na podstawie osobistych i projektowych licencji zatwierdzonych i wydanych przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych (Home Office) po odpowiedniej ocenie etycznej. Hodowano dorosłe linie transgeniczne CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21, a ich potomstwo wykorzystano w eksperymencie. Dla zapewnienia bezpieczeństwa badaczy oraz utrzymania warunków sterylnych wszystkie procedury wykonywano w warunkach aseptycznych, stosując pełne środki ochrony osobistej.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
- Aby....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiono metodę prowadzenia przewlekłego wielowarstwowego obrazowania wapniowego in vivo tej samej populacji neuronów przez okres kilku tygodni, z wykorzystaniem modalności obrazowania jednofotonowego i dwufotonowego, w warunkach swobodnego poruszania się oraz z unieruchomioną głową. Tutaj wykazano możliwość identyfikacji odpowiadających sobie populacji neuronów podczas obrazowania jednofotonowego w czasie, gdy zwierzę eksplorowało otwartą arenę w ciemności (Rysunek 7A). Ślady .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj wykazaliśmy zdolność do obserwowania i bezpośredniego porównywania neuronów w warunkach skupienia na głowie i swobodnego poruszania się w tych samych populacjach neuronalnych. Podczas gdy zademonstrowaliśmy zastosowanie w korze wzrokowej, protokół ten można dostosować do wielu innych obszarów mózgu, zarówno obszarów korowych, jak i głębokich jąder 24,25,26,27,28, a także innych konfiguracji pozyskiwania danych <.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych lub konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Pani Charu Reddy i Profesorowi Matteo Carandini (Cortex Lab) za ich porady dotyczące protokołu chirurgicznego i dzielenia się transgenicznym szczepem myszy. Dziękujemy dr Norbertowi Hogrefe (Inscopix) za jego wskazówki i pomoc w rozwoju chirurgii. Dziękujemy Pani Andreei Aldea (Sun Lab) za pomoc w przygotowaniu operacji i przetwarzaniu danych. Praca ta była wspierana przez Moorfields Eye Charity.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,9% roztwór chlorku sodu do infuzji (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Sól fizjologiczna do nawodnienia i przygotowania leków |
| 18004-1 Wiertło Trephine o średnicy 1,8 mm | FST | 18004-18 | Wiertło |
| 1ml strzykawka | Terumo | MDSS01SE | 1ml Igła |
| 23G x 5/8 cala 6% LUER Igła | |||
| Terumo NN-2316R 23G71000 Zautomatyzowany aparat stereotaktyczny z wbudowanym oprogramowaniem | RWD-RWD | ||
| Wchłanialna hemostatyczna gąbka żelatynowa (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | żel-pianka |
| Wkładki nasączone alkoholem 70% alkoholu izopropylowego | Braun | 9160612 | Poduszki alkoholowe |
| Folia aluminiowa | Dowolny sprzedawca | - | Folia do zakrywania oczu podczas operacji |
| Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automatyczna pompa do mikroiniekcji | WPI | 8091 | |
| Roztwór betadyny (10% jodowany powidon) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (dostosowany) | System obrazowania dwufotonowego Bruker | ||
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Absorber anestezjologiczny |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x soczewka obiektywowa |
| Kompaktowy system anestezjologiczny - pojedynczy gaz - izofluran K/F, z koncentratorem tlenu model: ZY-5AC i oczyszczaczem | Vet-Tech | AN001 | Kompaktowy system anestezjologiczny |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Środek dezynfekujący (kwas podchlorawy) |
| Deksametazon Fosforan sodu do wstrzykiwań, USP, 4 mg / ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus: 70789 | deksametazonu |
| , krawędź tnąca 4 mm, grubość 0,5 mm, stal nierdzewna | Fine Science Tools | 10055-12 | Nóż do siekania kory |
| Dwustronna, nieprzebijająca mysz & Pręty do uszu noworodków szczurów | Stoelting | 51649 | Drążek do uszu |
| Mikroskop atrapy | Inscopix | Mikroskop atrapy | Pomaga w implantacji |
| Etanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Służy do produkcji 70% etanolu |
| Marka rybacka Jednorazowe rękawiczki nitrylowo-indygo Rękawice PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | |
| Monitor homeotermiczny 50-7222-F | Aparatura harwardzka | 50-7222-F | Hometermiczny system monitorowania/poduszka grzewcza |
| Oprogramowanie do przetwarzania obrazu | Oprogramowanie do przetwarzania obrazów | ImageJ-Image | |
| Oprogramowanie do przetwarzania danych Inscopix (IDPS) | Obrazowanie wapnia Inscopix-One-photon | oprogramowanie do przetwarzania | |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Dwufotonowy laser obrazujący |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalacji | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Klej silikonowy |
| MICROMOT zasilacz sieciowy NG 2/S, z agregatem wiertarskim 60/E | PROXXON | NR 28 515 | Wiertarka ręczna |
| Pakiet zintegrowanego systemu obrazowania i optogenetyki nVoke | System obrazowania Inscopix-One-photon i oprogramowanie | ||
| Zestaw implantów ProView Zestaw implantów | Inscopix | ProView Mikroskop | atrapetyczny, ramię stereotaktyczne i nasadka |
| ProView Sonda pryzmatyczna | Inscopix | 1050-002203 | Soczewka mikropryzmatyczna |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Mikroskop stereotaksyjny na ramieniu przegubowym z zaciskiem stołowym | WPI | PZMTIII-AAC | mikroskop |
| Zestaw uniwersalny Super-Bond, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhezyjny cement |
| Dwufotonowe oprogramowanie do obrazowania wapnia | Suite2P-Dwufotonowe | oprogramowanie do obrazowania wapnia | |
| Waporyzator | Vet-Tech-Isoflurane | parownik | |
| Xailin Smarująca maść do oczu 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Maść okulistyczna |
Bibliografia
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
