Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Multimodalne nieliniowe hiperspektralne obrazowanie chemiczne przy użyciu mikroskopii generacji drgań i częstotliwości ze skanowaniem liniowym

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65388

⸱

1 grudnia 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, UC San Diego, 2State Key Laboratory of Molecular Reaction Dynamics, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, 3Materials Science and Engineering Program, UC San Diego, 4Department of Electrical and Computer Engineering, UC San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

Multimodalny, szybki system obrazowania hiperspektralnego został opracowany w celu uzyskania szerokopasmowych obrazów generowania oscylacyjnej sumy częstotliwości (VSFG), wraz z modalnościami obrazowania jasnego pola i generacji drugiej harmonicznej (SHG). Ze względu na to, że częstotliwość podczerwieni rezonansuje z drganiami molekularnymi, ujawnia się mikroskopijna wiedza o morfologii strukturalnej i mezoskopowej próbek dopuszczonych do symetrii.

Streszczenie

Generowanie oscylacyjnej sumy częstotliwości (VSFG), nieliniowy sygnał optyczny drugiego rzędu, jest tradycyjnie używany do badania cząsteczek na granicy faz jako technika spektroskopowa o rozdzielczości przestrzennej ~100 μm. Jednak spektroskopia nie jest czuła na niejednorodność próbki. Aby badać mezoskopowo heterogeniczne próbki, wraz z innymi przesunęliśmy granicę rozdzielczości spektroskopii VSFG do poziomu ~1 μm i skonstruowaliśmy mikroskop VSFG. Ta technika obrazowania może nie tylko określić morfologię próbki poprzez obrazowanie, ale także zarejestrować szerokopasmowe widmo VSFG w każdym pikselu obrazów. Będąc nieliniową techniką optyczną drugiego rzędu, jej reguła wyboru umożliwia wizualizację niecentrosymetrycznych lub chiralnych samoorganizujących się struktur powszechnie spotykanych między innymi w biologii, materiałoznawstwie i bioinżynierii. W tym artykule publiczność zostanie poprowadzona przez konstrukcję odwróconej transmisji, która pozwala na obrazowanie nieustalonych próbek. Praca ta pokazuje również, że mikroskopia VSFG może rozwiązywać specyficzne chemicznie informacje geometryczne poszczególnych samodzielnie składających się arkuszy, łącząc je z solverem funkcji sieci neuronowych. Na koniec, obrazy uzyskane w konfiguracjach jasnego pola, SHG i VSFG różnych próbek pokrótce omawiają unikalne informacje ujawnione przez obrazowanie VSFG.

Wprowadzenie

Generowanie drgań o sumie częstotliwości (VSFG), nieliniowa technika optyczna drugiego rzędu1,2, była szeroko stosowana jako narzędzie spektroskopowe do chemicznego profilowania próbek dopuszczonych do symetrii3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21,22. Tradycyjnie, VSFG był stosowany do układów międzyfazowych8,9,10,11 (tj. gaz-ciecz, ciecz-ciecz, gaz-ciało stałe, ciało stałe-ciecz), które nie mają symetrii inwersji - wymogu aktywności VSFG. Ta aplikacja VSFG dostarczyła bogactwo szczegółów molekularnych zakopanych interfejsów12,13, konfiguracje cząsteczek wody na interfejsach14,15,16,17,18, oraz związki chemiczne na interfejsach19,20,21,22.

Chociaż VSFG był potężny w określaniu gatunków molekularnych i konfiguracji na stykach, jego potencjał w pomiarze struktur molekularnych materiałów pozbawionych centrów inwersji nie został wykorzystany. Dzieje się tak częściowo dlatego, że materiały mogą być niejednorodne pod względem środowiska chemicznego, składu i układu geometrycznego, a tradycyjny spektrometr VSFG ma duży obszar oświetlenia rzędu 100μm2. W związku z tym tradycyjna spektroskopia VSFG dostarcza uśrednionych zespołowo informacji o próbce w typowym obszarze oświetlenia 100μm2. To uśrednianie zespołów może prowadzić do anulowania sygnałów między dobrze uporządkowanymi domenami o przeciwstawnych orientacjach i błędnej charakterystyki lokalnych heterogeniczności15,20,23,24.

Dzięki postępom w zakresie obiektywów mikroskopowych o wysokiej aperturze numerycznej (NA), opartych na refleksach (geometrie Schwarzschilda i Cassegraina), które są prawie wolne od aberracji chromatycznych, rozmiar ostrości dwóch wiązek w eksperymentach VSFG może zostać zmniejszony ze 100μm2 do 1-2μm2, a w niektórych przypadkach submikron25. Uwzględniając ten postęp technologiczny, nasza grupa i inni rozwinęli VSFG w platformę mikroskopową20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Ostatnio wdrożyliśmy odwrócony układ optyczny i schemat wykrywania szerokopasmowego37, który umożliwia bezproblemowe zbieranie obrazów multimodalnych (VSFG, generacja drugiej harmonicznej (SHG) i optyczne jasne pole). Obrazowanie multimodalne umożliwia szybką inspekcję próbek za pomocą obrazowania optycznego, korelację różnych typów obrazów ze sobą i lokalizowanie pozycji sygnałów na obrazach próbek. Dzięki achromatycznej optyce oświetlenia i wyborowi impulsowego źródła oświetlenia laserowego, ta platforma optyczna pozwala na przyszłą bezproblemową integrację dodatkowych technik, takich jak między innymi mikroskopia fluorescencyjna38 i mikroskopia Ramana.

W tym nowym układzie badano próbki takie jak organizacje hierarchiczne i klasa molekularnych samoorganizacji (MSA). Materiały te obejmują kolagen i biomimetykę, w których zarówno skład chemiczny, jak i organizacja geometryczna są ważne dla ostatecznej funkcji materiału. Ponieważ VSFG jest nieliniowym sygnałem optycznym drugiego rzędu, jest szczególnie wrażliwy na układy międzycząsteczkowe39,40, takie jak odległość międzycząsteczkowa lub kąty skrętu, co czyni go idealnym narzędziem do ujawniania zarówno składu chemicznego, jak i układów molekularnych. Niniejsza praca opisuje modalności VSFG, SHG i jasnego pola głównego instrumentu składającego się z lasera na ciele stałego domieszkowanego iterbem, który pompuje optyczny wzmacniacz parametryczny (OPA), domowego multimodalnego mikroskopu odwróconego i monochromatorowego analizatora częstotliwości sprzężonego z dwuwymiarowym detektorem ładowanego urządzenia sprzężonego (CCD)27. Dostępne są procedury budowy i wyrównywania krok po kroku oraz pełna lista części konfiguracji. Dogłębna analiza MSA, której podstawowa podjednostka molekularna składa się z jednej cząsteczki siarczanu sodu i dodecylu (SDS), powszechnego środka powierzchniowo czynnego, oraz dwóch cząsteczek β-cyklodekstryny (β-CD), znanej w niniejszym dokumencie jako SDS@2 β-CD, jest również podana jako przykład, aby pokazać, w jaki sposób VSFG może ujawnić specyficzne dla cząsteczki szczegóły geometryczne zorganizowanej materii. Wykazano również, że specyficzne dla substancji chemicznych szczegóły geometryczne MSA można określić za pomocą podejścia opartego na solverze funkcji sieci neuronowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hiperspektralny mikroskop VSFG z liniowym skanowaniem

  1. System laserowy
    1. Należy użyć impulsowego systemu laserowego (patrz Tabela materiałów) z centrami przy 1025 nm ± 5 nm. Laser jest ustawiony na 40 W, 200 kHz (200 µJ/impuls) przy szerokości impulsu ~290 fs.
      UWAGA: Dokładna częstotliwość powtarzania może się różnić, a laser o wysokiej częstotliwości powtarzania zazwyczaj lepiej sprawdza się w tym mikroskopie VSFG.
    2. Wyjście lasera seed należy wprowadzić do komercyjnego optycznego wzmacniacza parametrycznego (OPA), aby wygenerować wiązkę w średniej podczerwieni (MIR) (patrz Tabela materiałów). Należy dostroić MIR do interesującej częstotliwości (Rysunek 1A).
      UWAGA: W niniejszym badaniu MIR jest scentrowany na 3450 nm ± 85 nm (~2900 ± 72 cm-1) z czasem trwania impulsu ~290 fs i energią impulsu ~6 µJ, co obejmuje część obszaru grupy funkcyjnej -CHx.
  2. Wiązka up-conversion
    1. Pozostałą wiązkę 1025 nm z OPA należy przeprowadzić przez etalon Fabry-Perota (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać spektralnie zwężoną wiązkę up-conversion o FWHM ~4,75 cm-1.
    2. Zwężoną wiązkę 1025 nm należy przefiltrować przestrzennie za pomocą szafirowego otworu o średnicy 8 µm.
      UWAGA: Wiązkę 1025 nm można wizualizować za pomocą karty NIR.
    3. Polaryzację impulsu 1025 nm należy kontrolować za pomocą płytki falowej λ/2 (patrz Tabela materiałów).
  3. Wiązka MIR
    1. Wiązkę MIR należy przeprowadzić przez stopień opóźniający w celu precyzyjnej kontroli nakładania się czasowego.
    2. Polaryzację MIR należy kontrolować za pomocą płytki falowej λ/2.
  4. Mikroskop VSFG
    1. Obie wiązki (up-conversion i MIR) należy nałożyć na siebie przestrzennie na dostosowanym lustrze dichroicznym (DM, Rysunek 1B), które jest przepuszczalne dla MIR i odbijające dla NIR (patrz Tabela materiałów). Do prowadzenia wyrównania należy użyć dwóch przysłon: jednej bezpośrednio za DM i jednej na dalnym końcu. Po przysłonie należy użyć miernika mocy, aby określić, czy MIR jest wycentrowany, oraz karty NIR do zlokalizowania pozycji NIR.
      UWAGA: Po nałożeniu wiązek można użyć wiązki NIR do prowadzenia obu wiązek.
    2. Nałożone wiązki należy skierować do mikroskopu odwróconego z zintegrowanym jednoosiowym rezonansowym skanerem wiązki o częstotliwości 325 Hz (zamontowanym do zintegrowanego skanera dwupozycyjnego (I2PS), Rysunek 1B) (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Skaner rezonansowy rzuca linię z dwóch nałożonych wiązek na tylną aperturę obiektywu kondensora. Jest on zamontowany na suwaku, który umożliwia płynną rekonfigurację między trybami VSFG/SHG a polem jasnym.
    3. Dwie przestrzennie nałożone wiązki należy skupić na próbce za pomocą w pełni refleksyjnego obiektywu Schwarzschilda (SO, Rysunek 1B,D) (patrz Tabela materiałów).
    4. Sygnał VSFG generowany przez próbkę należy zbierać za pomocą refrakcyjnego obiektywu z korekcją do nieskończoności (RO, Rysunek 1B,D) (patrz Tabela materiałów).
    5. Skolimowany sygnał wyjściowy VSFG należy przeprowadzić przez polaryzator liniowy, a następnie przez telecentryczny system soczewek tubusowych składający się z dwóch soczewek ogniskowych f = 60 mm (TL1 i TL2, Rysunek 1B,C) (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Powiększony obraz z soczewek tubusowych powstaje w szczelinie wejściowej monochromatora (MC, Rysunek 1B,C), a dane rozdzielone przestrzennie/częstotliwościowo są wykrywane na dwuwymiarowym detektorze CCD (CCD, Rysunek 1B).
  5. Tryb SHG
    1. Aby przełączyć się na obrazowanie SHG, należy zablokować wiązkę IR i obrócić siatkę spektrografu do 501,5 nm, aby obrazować sygnał SHG.
  6. Tryb pola jasnego
    1. Aby przełączyć się na optyczne obrazowanie w polu jasnym, należy włączyć źródło białego światła (patrz Tabela materiałów). Należy przesunąć zintegrowany suwak (I2PS, Rysunek 1B), aby zbierać obrazy w polu jasnym w kierunku przeciwbieżnym, gdzie obiektyw obrazujący (RO) pełni funkcję kondensora, a obiektyw kondensora (SO) pełni funkcję obiektywu obrazującego.
    2. Obraz skolimowanego wyjścia obiektywu refrakcyjnego należy uformować w płaszczyźnie sensora kamery RGB do pola jasnego za pomocą komercyjnie dostępnego systemu soczewek tubusowych (patrz Tabela materiałów).

Schemat układu wzbudzenia optycznego z laserem 1025 nm, systemem spektroskopowym i analizą w średniej podczerwieni.
Rysunek 1: Multimodalny hiperspektralny mikroskop VSFG. (A) Widok z góry głównego układu. Laser pompujący 1025 nm został skierowany do OPA w celu wygenerowania strojonego impulsu w średniej podczerwieni (mid-IR). Pozostałe promieniowanie 1025 nm było często zwężane przez etalon (E) i filtrowane przestrzennie do wiązki Gaussa przez filtr przestrzenny (SFG). Wiązki mid-IR i 1025 nm są nakładane przestrzennie na specjalnie dostosowanym lustrze dichroicznym (DM) i prowadzone przez mikroskop odwrócony (obszar w ramce w A). (B) Obie wiązki są kierowane do rezonansowego skanera wiązki 325 Hz zamontowanego na zintegrowanym suwaku 2-pozycyjnym (I2PS), co umożliwia płynne przełączanie między trybem pola jasnego a modalnościami optyki nieliniowej. Platforma mikroskopowa jest wyposażona w refleksyjny obiektyw Schwarzschilda (SO) z korekcją nieskończoności, który pełni rolę kondensora, oraz refrakcyjny obiektyw obrazujący (RO) z korekcją nieskończoności zamontowany na pionowej scenie nanopozycjonującej (VNP) w osi z. SO skupia linię nadchodzących wiązek, które rezonansowy skaner wiązki odbija na próbce, podczas gdy RO zbiera liniową sekcję sygnałów VSFG. Ważne jest precyzyjne sterowanie pozycją osi z obiektywu RO z dokładnością do 1 µm, aby zapewnić optymalne warunki ogniskowania próbki dla uzyskania obrazowania wysokiej jakości. Skolimowana linia sygnału VSFG jest następnie kierowana do układu soczewek tubusowych składającego się z dwóch soczewek (TL1 i TL2), co tworzy powiększony obraz w szczelinie wlotowej monochromatora (MC). Linia widm z rozdzielczością częstotliwościową jest następnie obrazowana hiperspektralnie na urządzeniu CCD. Po zebraniu każdej linii hiperspektralnej próbka jest skanowana w osi prostopadłej do osi skanowania rezonansowego skanera wiązki przy użyciu NP. Aby zebrać obrazy próbki w polu jasnym, I2PS jest przesuwany do pozycji pola jasnego i instalowane jest lustro przechwytujące światło z białego źródła światła (WLS). Światło jest następnie skupiane przez RO i obrazowane przez SO. Obraz powstaje następnie w płaszczyźnie sensora kamery pola jasnego (BC) u góry mikroskopu odwróconego. (C) Szczegółowy widok drogi optycznej przez obszar soczewek tubusowych do MC i CCD. (D) Szczegółowy widok obszaru próbki między SO a RO. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

2. Ustawienie mikroskopu hiperspektralnego i kalibracja przestrzenna pionowej osi CCD

  1. Wstępnie zoptymalizuj pozycję płaszczyzny próbki (oś z nanopozycjonera), używając standardowej próbki wzorca ZnO (grubości 1 µm) naniesionego metodą rozpylania na szkiełko okrywowe o wymiarach 15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± 0,005 mm i ustawiając ostrość w trybie obrazowania w polu jasnym.
    UWAGA: Konieczne może być dostosowanie pozycji z obiektywu (RO) oraz wyrównania światła białego. Reprezentatywny obraz ZnO na szklanym wzorcu używanym do kalibracji wyrównania przedstawiono na Ryc. 2.
  2. Przenieś I2PS z powrotem do ramienia iluminacji nieliniowej i zoptymalizuj wysokość próbki, aby uzyskać maksymalną nie strokesową intensywność VSFG generowaną przez obszary ZnO obserwowane na kamerze CCD.
    UWAGA: Pozycja z obiektywu (RO) musi zostać dostosowana w celu uzyskania maksymalnej intensywności. Może być konieczne kilkukrotne powtórzenie kroków 2.1 i 2.2 przed osiągnięciem optymalnej wysokości próbki i RO.
  3. Włącz skaner wiązki rezonansowej i zbierz linię obrazów.
  4. Zbierz obrazy intensywności nierezonansowej, skanując próbkę prostopadle do kierunku skanera wiązki. Wykonaj pionowe przekroje danych obrazu i ustal stosunek piksela do mikrona (patrz Ryc. 3 oraz legenda).
    ​UWAGA: Analizuje się pochodną tych przekrojów liniowych, aby wyznaczyć stosunek piksela do mikrona dla pionowej osi CCD, który zostanie wykorzystany w przyszłych obrazach.

Wzorzec mikroskopowy, skala 25μm, układ siatki, obraz mikroskopowy, analiza powierzchni materiału.
Rycina 2: Reprezentatywna jakość obrazu dla wstępnego wyrównania w trybie obrazowania w polu jasnym dla wzorca ZnO. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Kalibracja nanopozycjonera z wykresami natężenia sygnału; proces kalibracji pomiaru optycznego.
Rycina 3: Schemat kalibracji osi pionowej. Rycina ta ilustruje sposób przeliczania pikseli CCD na pionowe wymiary przestrzenne w jednostce µm. (A) Pozyskano i zrekonstruowano obraz pokrywki z naniesionym wzorem z ZnO. Następnie wyznaczono odległość w pikselach między przeciwległymi krawędziami wzoru (mały pionowy pasek w A). Ponieważ krzyż ZnO został zaprojektowany tak, aby mieć szerokość 25 µm, można wykorzystać stosunek szerokości fizycznej do szerokości w pikselach do obliczenia współczynnika przelicznika wymiaru fizycznego na piksel. Reprezentatywny obraz z skalibrowaną osią pionową przedstawiono w (B). (C) Na koniec wykonano przekrój pionowy, zgodnie z oznaczeniem czerwoną linią. (D) Obliczono pochodną przekroju pionowego w celu wyznaczenia rozdzielczości przestrzennej. Pochodna przekroju pionowego służy do uzyskania rozdzielczości przestrzennej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Gromadzenie danych hiperspektralnych

  1. Zbierz widma z pionowej linii sygnałów VSFG na detektorze CCD, w którym widma są rozproszone wzdłuż osi poziomej, a pozycje przestrzenne są rejestrowane na osi pionowej CCD.
    UWAGA: Wynikiem jest dwuwymiarowy zestaw danych dla przekroju pojedynczej linii.
  2. Po obrazowaniu hiperspektralnym przekroju liniowego próbki, przeskanuj próbkę w osi prostopadłej do osi skanowania liniowego, korzystając z trójwymiarowego nanopozycjonera (NP, Rysunek 1).
    UWAGA: Nanopozycjoner 3D jest istotny dla zapewnienia wysokiej precyzji i powtarzalności w lokalizowaniu obszarów próbki (płaszczyzna x-y), a także w ustawianiu ostrości próbki (oś z).
  3. Powtarzaj kroki od 3.1 do 3.2, aby uzyskać hiperspektralny obraz VSFG.

4. Analiza danych hiperspektralnych

  1. Przeprowadź rozdzielenie spektralne (spectral unmixing) danych, korzystając z przepływu pracy biblioteki obrazowania hiperspektralnego w narzędziach obrazowania MatLab41.
    UWAGA: Rozdzielenie spektralne koreluje lokalizacje przestrzenne z unikalnymi widmami. Kod Matlab do analizy danych hiperspektralnych znajduje się w Pliku uzupełniającym 1.
    1. Utwórz czterowymiarową hiperpkostkę (x = przestrzeń, y = przestrzeń, z = intensywność zależna od częstotliwości, ω = częstotliwość), używając funkcji hypercube z biblioteki obrazowania hiperspektralnego w narzędziach do przetwarzania obrazów Matlab41.
    2. Określ liczbę unikalnych widm za pomocą funkcji countEndmembersHFC  przy wartości prawdopodobieństwa fałszywego alarmu (PFA) wynoszącej 10-7.
    3. Zidentyfikuj unikalne widma, korzystając z funkcji rozdzielenia spektralnego nfindr .
    4. Na koniec, używając funkcji sid , przypisz każdy piksel do jednego z unikalnych widm zidentyfikowanych w poprzednim kroku.
      UWAGA: Dodatkowe metody rozdzielania i dopasowywania spektralnego można przeprowadzić za pomocą alternatywnych funkcji/algorytmów oferowanych w Bibliotece Obrazowania Hiperspektralnego MatLab41.
  2. Dopasuj dane sumaryczne dla każdej wyizolowanej warstwy do funkcji Voigta42 (Plik uzupełniający 1).
    UWAGA: Funkcja Lorentza reprezentuje czysty limit homogenicznego kształtu linii, podczas gdy funkcja Gaussa wynika z limitów niehomogenicznych. W rzeczywistości układy mogą znajdować się w kombinacji limitów homogenicznych i niehomogenicznych, co wymaga zastosowania funkcji Voigta – jest to powszechna praktyka w spektroskopii fazy skondensowanej, w tym w VSFG.

5. Analiza geometryczna próbki

  1. Wyznacz geometrię próbek zgodnie z procedurą opisaną w krokach 5.2-5.3. W niniejszym badaniu jako przykład wykorzystano SDS@2β-CD. Wyprowadź dozwolone przez symetrię elementy tensora χ(2) na podstawie symetrii C7 podjednostki molekularnej próbki mezo-arkuszy SDS@2β-CD.
    UWAGA: Dozwolone przez symetrię χ(2) zależą od symetrii. Aby obliczyć dozwoloną podatność nieliniową dla dowolnej symetrii, należy odnieść się do publikacji43.
  2. Zastosuj obrót Eulera27, aby powiązać pomiary w układzie laboratoryjnym z układem molekularnym.
    UWAGA: W przypadku SDS@2β-CD jego symetria C7 prowadzi do ośmiu niezależnych równań wiążących 8 sygnałów wyjściowych (χ(2) w układzie laboratoryjnym) z 8 parametrami wejściowymi (6 niezależnych hiperpolaryzowalności β(2) oraz dwa kąty: ϴ, kąt nachylenia względem płaszczyzny wszystkich arkuszy próbki, oraz φ, obrót arkusza w płaszczyźnie (Rysunek 4)). Do wyznaczenia wspólnych orientacji molekularnych dwóch arkuszy wykorzystuje się dwa arkusze. Relacje między φ1 a φ2 (kąty obrotu w płaszczyźnie dwóch arkuszy) można wyznaczyć z obrazów w świetle przechodzącym. W niniejszym przykładzie φ2 = φ1 + 60°. Zakłada się, że wszystkie jednostki molekularne są nachylone pod tym samym kątem, zatem ϴ1 = ϴ2. Daje to 11 niewiadomych (9 niezależnych, w tym 6 niezależnych hiperpolaryzowalności β(2), ϴ1 i φ1, oraz względny stosunek pokrycia między arkuszami N, oraz dwa kąty zależne: φ2 i ϴ2) dla 16 znanych wartości (8 polaryzacji w układzie laboratoryjnym na arkusz dla dwóch arkuszy).
  3. Powiąż rozdzielone polaryzacyjnie χ(2) w układzie laboratoryjnym i hiperpolaryzowalność β(2) w układzie molekularnym za pomocą solvera opartego na funkcji sieci neuronowej.
    UWAGA: Szczegółowe podsumowanie tego podejścia znajduje się w publikacji27.
    1. Stwórz w języku Python44 za pomocą biblioteki Keras model warstwowej sieci neuronowej o strukturze węzłów 200-100-50 i funkcji aktywacji tangens hiperboliczny.
    2. Stwórz losowo wygenerowaną macierz wartości 100 000 x 11 dla β(2), ϴ1, ϴ2, φ1, φ2 oraz N. Oblicz odpowiadające im 16 wartości χ(2) w układzie laboratoryjnym, korzystając z równania wyznaczonego w punkcie 5.2 za pomocą obrotów Eulera.
    3. Wykorzystaj obliczone wartości χ(2) (łącznie 100 000 x 16 wartości) jako dane wejściowe i wytrenuj sieć w celu przewidywania 11 wartości (β(2), ϴ1, ϴ2, φ1, φ2 i N) na podstawie dostarczonych 16 wartości χ(2).
    4. Po wytrenowaniu użyj innego zestawu 1000 wpisów z danymi wejściowymi i wyjściowymi, aby przetestować model. Przewidziane wyjście i wyjście rzeczywiste powinny wykazywać liniową zależność o nachyleniu równym 1.
    5. Na koniec wprowadź eksperymentalnie zmierzone χ(2) z dwóch arkuszy (dla każdego arkusza zmierzono 8 wartości χ(2)) i użyj wytrenowanego modelu do przewidzenia kąta nachylenia ϴ oraz innych właściwości.

Diagram orientacji krystalograficznej z χ(2)(θ,φ,β) i strukturą cząsteczkową przy θ=23°.
Rycina 4: Ilustracja transformacji Eulera. (A) Ilustracja transformacji Eulera między podatnością drugiego rzędu χ(2) w układzie współrzędnych laboratoryjnych (XYZ) a hiperpolaryzowalnością βijk w układzie współrzędnych cząsteczkowych (xyz). Rotacja Eulera z-y'-z'' jest wykonywana na współrzędnych cząsteczkowych, gdzie φ jest kątem obrotu w płaszczyźnie, θ jest kątem nachylenia, a ψ jest kątem skręcenia. Kąt ψ jest całkowany dla dowolnych kątów skręcenia wokół osi cząsteczki. Kąt φ nie jest całkowany, ponieważ wszystkie cząsteczki obracają się pod konkretnym kątem względem układu laboratoryjnego, tworząc samoorganizujące się warstwy. N jest względnym stopniem pokrycia powierzchni dwóch warstw. (B) Wizualizacja nachylonych podjednostek tworzących warstwę, wyznaczona na podstawie wyników sieci neuronowej. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Wagner et al.27. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat molekularny z układem spektroskopii VSFG do analizy sygnału, przedstawiający widoki z góry i z boku.
Rycina 5: Struktura molekularna, morfologia i potencjalna orientacja SDS@β-CD. (A) Widok z góry oraz (B) widok z boku struktury chemicznej SDS@β-CD. (C

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najbardziej krytyczne kroki to od 1,42 do 1,44. Bardzo ważne jest, aby dobrze ustawić soczewkę obiektywu, aby uzyskać optyczną rozdzielczość przestrzenną. Ważne jest również, aby zebrać emitowany sygnał, przekaźnik i wyświetlić wiązkę skanującą jako linię w szczelinach wejściowych. Odpowiednie wyrównanie gwarantowałoby najlepszą rozdzielczość i stosunek sygnału do szumu. W przypadku typowej próbki, takiej jak arkusze SDS@2 β-CD 100 μm na 100 μm, obraz o dobrej rozdzielczości (rozdzielczość ~1 μm) z wysokim stosunkiem syg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Rozwój instrumentu jest wspierany przez Grant NSF CHE-1828666. ZW, JCW i WX są wspierane przez National Institutes of Health, National Institute of General Medical Sciences, Grant 1R35GM138092-01. BY jest wspierany przez Stowarzyszenie Promocji Innowacji Młodzieży Chińskiej Akademii Nauk (CAS, 2021183).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x KameraPor ThorlabsWFA4100podłącz kamerę do mikroskopu lub układu optycznego
Lustro pryzmatyczne kątowe 25,0 mm, chronione złotoThorlabsMRA25-M01odbijają światło i wytwarzają odbicie wsteczne, przekierowując światło z powrotem wzdłuż jego pierwotnej ścieżki
3" Uniwersalny uchwyt na słupek-5 sztukThorlabsUPH3-P5przytrzymuje i podpiera słupki o różnych rozmiarach i konfiguracjach
Płyta klatki od 30 mm do 60 mm, grubość 4 mmThorlabsLCP4Sprzekształca się między systemem koszykowym 30 mm a systemem klatek 60 mm
Korpus Cerna o wysokości 500 mm z CEA1500 ramienia Epi zapewniająfunkcję umożliwiania technik oświetlenia najwyższej jakości w mikroskopii
60 mm montowany w klatce i oslash; 50,0 mm IrisThorlabsLCP50Skontrolują ilość światła przechodzącego przez układ optyczny
Wspornik montażowy klatki 60 mmThorlabsLCP01Bmontuje i ustawia system klatki 60 mm w konfiguracjach optycznych
EtalonSLS Optics Ltd.Dostosowanegenerowanie wąskopasmowego światła 1030 nm 
Wspornik montażowy płyty klatkiThorlabsKCB2przytrzymaj i wyreguluj lustra pod precyzyjnym kątem
CCDAndor TechnologiesNewton Przetwornik CCD 2D dla częstotliwości i rozdzielczości przestrzennej
Współliniowy optyczny wzmacniacz parametrycznyKonwersja światłaOrpheus-One-HPPrzestrajalny generator światła MID
Chlorek miedziThermo Fischer ScientificA16064.30Komponent do samodzielnego montażu
Dostosowane lustro dichroiczneNewportDostosowaneselektywnie odbija lub przepuszcza światło w oparciu o jego długość fali lub polaryzację
Adapter Ext do M32 IntThorlabsSM1A34zapewnia kompatybilność i ułatwia łączenie komponentów o różnych typach gwintów
Obiektyw refrakcyjny z korekcją nieskończonościZeiss420150-9900-000Obiektyw
Schwarzschilda z korekcją nieskończoności PikeTechnologies Inc.891-0007Obiektyw odblaskowy
Węglik laserowy, konwersja światłaC18212Źródło lasera
M32x0,75 Zewnętrzne do wewnętrznego RMSThorlabsM32RMSSdostosować lub przekonwertować rozmiar gwintu lub typ obiektywów mikroskopowych 
M32x0,75 Zewnętrzne do M27x0,75 Wewnętrzne torby do grawerowaniaM32M27Sdostosować lub przekonwertować rozmiar gwintu lub typ obiektywów mikroskopu 
Ręczny moduł ostrości kondensatora o średniej wysokościThorlabsZFM1030regulację ostrości elementu optycznego
MonochromatorAndor TechnologiesShamrock 500iZapewnia rozdzielczość częstotliwości dla każdego skanowania liniowego
Zmotoryzowany moduł z 1" skokiem dla ramion montowanych na krawędziThorlabsZFM2020kontrolować pionowe położenie obiektywu do obrazowania
Nanopozycjonerszalony Laboratoria miejskie Inc.MMP33D
próbkaEOPCSC-25325 Hz skaner wiązki rezonansowej
Kolorowa kamera CCD RGB KameraThorlabsDCU224CBrightfield, wycofana, ale inne kamery będą działać równie dobrze
Soczewka tubusu RGBThorlabsITL200białego światła
Kątowa kinematyczna płytka stykowaThorlabsOPX2400zawierają mechanizm przesuwny z dwiema stałymi pozycjami
Kątowe mocowanie lustra kinematycznego, 30 mmThorlabsKCB1przytrzymują i regulują lustra pod precyzyjnym kątem
Kątowe mocowanie lustra kinematycznego, 60 mmThorlabsKCB2przytrzymują i regulują lustra pod precyzyjnym kątem
SM2, ramię klatkowe 60 mm do stolika ostrości CernaThorlabsCSA2100bezpiecznie montować i ustawiać kondensatory
Zatrzaskowa osłona klatki do klatki 60 mm, 24 cale długości,ThorlabsC60L24zamyka i chroni elementy wewnątrz klatki
Dodecylosiarczan soduThermo Fischer ScientificJ63394. AKElement do samodzielnego montażu
Trzykanałowy kontroler i skrzynka pokręteł do 1" Cerna Travel StagesThorlabsMCM3001sterowania ZFM2020
Soczewka tubusuThorlabsLA1380-AB - Odbiór sygnału N-BK7SFG
Zestaw widocznych diod LEDThorlabsWFA1010zapewniają oświetlenie w konfiguracji obrazowania
Źródło światła białegoThorlabsWFA1010Źródło oświetlenia światłem białym do obrazowania w jasnym polu
WPH05M-1030 - Ø 1/2" Płyta półfalowa o zerowym rzędzie, & Oslash; Montaż 1", 1030 nm ThorlabsWPH05M-1030zmienia stan polaryzacji przechodzącego przez niego światła
WPLQ05M-3500 - Ø 1/2" montowana płyta ćwierćfalowa niskiego rzędu, 3,5 i mikro; m ThorlabsWPLQ05M-3500zmieniają stan polaryzacji przechodzącego przez nie światła
Oś X Stalowe stopnie suwakowe o długim skokuOptosigmaTSD-65122CUU, które zapewniają wydłużony skok w kierunku poziomym (X)
XT95 4-calowy nośnik szynowyThorlabsXT95RC4montażu i pozycjonowania elementów optycznych
Etap translacji osi XY z obrotemo 360 stopniThorlabsXYR1precyzyjny ruch i pozycjonowanie obiektów w dwóch wymiarach, wraz z możliwością obracania platformy
Translator liniowy XY(1/2") z centralnym otworem przelotowym SM1ThorlabsXYT1zapewniają precyzyjny ruch i pozycjonowanie w dwóch wymiarach
Konwersja światłalasera półprzewodnikowego domieszkowanego YbCB3-40WLaser nasienny
β-CyklodekstrynaThermo Fischer NaukowyJ63161.22Komponent do samodzielnego montażu
Skaner rezonansowy kolekcja

Bibliografia

  1. Zhu, X. D., Suhr, H., Shen, Y. R. Surface vibrational spectroscopy by infrared-visible sum frequency generation. Physical Review B. 35 (6), 3047-3050 (1987).
  2. Shen, Y. R. Surface properties probed by second-harmonic and sum-frequency generation. Nature. 337 (6207), 519-525 (1987).
  3. Li, Y., Shrestha, M., Luo, M., Sit, I., Song, M., Grassian, V. H., Xiong, W. Salting up of proteins at the air/water interface. Langmuir. 35 (43), 13815-13820 (2019).
  4. Wang, C., Li, Y., Xiong, W. Extracting molecular responses from ultrafast charge dynamics at material interfaces. Journal of Materials Chemistry C. 8 (35), 12062-12067 (2020).
  5. Nihonyanagi, S., Mondal, J. A., Yamaguchi, S., Tahara, T. Structure and dynamics of interfacial water studied by heterodyne-detected vibrational sum-frequency generation. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 579-603 (2013).
  6. Nihonyanagi, S., Yamaguchi, S., Tahara, T. Ultrafast dynamics at water interfaces studied by vibrational sum frequency generation spectroscopy. Chemical Reviews. 117 (16), 10665-10693 (2017).
  7. Singh, P. C., Nihonyanagi, S., Yamaguchi, S., Tahara, T. Ultrafast vibrational dynamics of water at a charged interface revealed by two-dimensional heterodyne-detected vibrational sum frequency generation. The Journal of Chemical Physics. 137 (9), 094706(2012).
  8. Jubb, A. M., Hua, W., Allen, H. C. Environmental chemistry at vapor/water interfaces: insights from vibrational sum frequency generation spectroscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 63 (1), 107-130 (2012).
  9. Ishiyama, T., Sato, Y., Morita, A. Interfacial structures and vibrational spectra at liquid/liquid boundaries: molecular dynamics study of water/carbon tetrachloride and water/1,2-dichloroethane interfaces. The Journal of Physical Chemistry C. 116 (40), 21439-21446 (2012).
  10. Sapi, A., Liu, F., Cai, X., Thompson, C. M., Wang, H., An, K., Krier, J. M., Somorjai, G. A. Comparing the catalytic oxidation of ethanol at the solid-gas and solid-liquid interfaces over size-controlled pt nanoparticles: striking differences in kinetics and mechanism. Nano Letters. 14 (11), 6727-6730 (2014).
  11. Chen, X., Wang, J., Sniadecki, J. J., Even, M. A., Chen, Z. Probing α-helical and β-sheet structures of peptides at solid/liquid interfaces with SFG. Langmuir. 21 (7), 2662-2664 (2015).
  12. Dramstad, T. A., Wu, Z., Gretz, G. M., Massari, A. M. Thin films and bulk phases conucleate at the interfaces of pentacene thin films. The Journal of Physical Chemistry C. 125 (30), 16803-16809 (2021).
  13. Xiang, B., Li, Y., Pham, C. H., Paesani, F., Xiong, W. Ultrafast direct electron transfer at organic semiconductor and metal interfaces. Science Advances. 3 (11), e1701508(2017).
  14. Livingstone, R. A., Nagata, Y., Bonn, M., Backus, E. H. G. Two types of water at the water-surfactant interface revealed by time-resolved vibrational spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 137 (47), 14912-14919 (2015).
  15. Wagner, J. C., Hunter, K. M., Paesani, F., Xiong, W. Water capture mechanisms at zeolitic imidazolate framework interfaces. Journal of the American Chemical Society. 143 (50), 21189-21194 (2021).
  16. Montenegro, A., Dutta, C., Mammetkuliev, M., Shi, H., Hou, B., Bhattacharyya, D., Zhao, B., Cronin, S. B., Benderskii, A. V. Asymmetric response of interfacial water to applied electric fields. Nature. 594 (7861), 62-65 (2021).
  17. Nihonyanagi, S., Ishiyama, T., Lee, T., Yamaguchi, S., Bonn, M., Morita, A., Tahara, T. Unified molecular view of the air/water interface based on experimental and theoretical χ(2) spectra of an isotopically diluted water surface. Journal of the American Chemical Society. 133 (42), 16875-16880 (2011).
  18. Shen, Y. R., Ostroverkhov, V. Sum-frequency vibrational spectroscopy on water interfaces: polar orientation of water molecules at interfaces. Chemical Reviews. 106 (4), 1140-1154 (2006).
  19. Hosseinpour, S., Roeters, S. J., Bonn, M., Peukert, W., Woutersen, S., Weidner, T. Structure and dynamics of interfacial peptides and proteins from vibrational sum-frequency generation spectroscopy. Chemical Reviews. 120 (7), 3420-3465 (2020).
  20. Wang, H., Xiong, W. Vibrational sum-frequency generation hyperspectral microscopy for molecular self-assembled systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72 (1), 279-306 (2021).
  21. Wang, H. -F., Velarde, L., Gan, W., Fu, L. Quantitative sum-frequency generation vibrational spectroscopy of molecular surfaces and interfaces: lineshape, polarization, and orientation. Annual Review of Physical Chemistry. 66 (1), 189-216 (2015).
  22. Inoue, K., Ahmed, M., Nihonyanagi, S., Tahara, T. Reorientation-induced relaxation of free oh at the air/water interface revealed by ultrafast heterodyne-detected nonlinear spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 5344(2020).
  23. Wang, H., Gao, T., Xiong, W. Self-phase-stabilized heterodyne vibrational sum frequency generation microscopy. ACS Photonics. 4 (7), 1839-1845 (2017).
  24. Wang, H., Xiong, W. Revealing the molecular physics of lattice self-assembly by vibrational hyperspectral imaging. Langmuir. 38 (10), 3017-3031 (2022).
  25. Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. -H., Potma, E. O. Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy. Optics Letters. 36 (19), 3891(2011).
  26. Wang, H., Wagner, J. C., Chen, W., Wang, C., Xiong, W. Spatially dependent h-bond dynamics at interfaces of water/biomimetic self-assembled lattice materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (38), 23385-23392 (2020).
  27. Wagner, J. C., Wu, Z., Wang, H., Xiong, W. Imaging orientation of a single molecular hierarchical self-assembled sheet: the combined power of a vibrational sum frequency generation microscopy and neural network. The Journal of Physical Chemistry B. 126 (37), 7192-7201 (2022).
  28. Han, Y., Hsu, J., Ge, N. -H., Potma, E. O. Polarization-sensitive sum-frequency generation microscopy of collagen fibers. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (8), 3356-3365 (2015).
  29. Chung, C. -Y., Potma, E. O. Biomolecular imaging with coherent nonlinear vibrational microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 77-99 (2013).
  30. Potma, E. O. Advances in vibrationally resonant sum-frequency generation microscopy. Optics in the Life Sciences Congress. , OSA: Washington, DC, 2017. p NM4C.2 (2017).
  31. Han, Y., Raghunathan, V., Feng, R. R., Maekawa, H., Chung, C. -Y. Y., Feng, Y., Potma, E. O., Ge, N. -H. H. Mapping molecular orientation with phase sensitive vibrationally resonant sum-frequency generation microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (20), 6149-6156 (2013).
  32. Hsu, J., Haninnen, A., Ge, N. -H., Potma, E. O. Molecular imaging with sum-frequency generation microscopy. Optics in the Life Sciences. , OSA: Washington, DC, 2015. p NT4C.4 (2015).
  33. Hanninen, A., Shu, M. W., Potma, E. O. Hyperspectral imaging with laser-scanning sum-frequency generation microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (9), 4230(2017).
  34. Wang, H., Chen, W., Wagner, J. C., Xiong, W. Local ordering of lattice self-assembled SDS@2β-CD materials and adsorbed water revealed by vibrational sum frequency generation microscope. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (29), 6212-6221 (2019).
  35. Cimatu, K., Baldelli, S. Chemical imaging of corrosion: sum frequency generation imaging microscopy of cyanide on gold at the solid−liquid interface. Journal of the American Chemical Society. 130 (25), 8030-8037 (2008).
  36. Shah, S. A., Baldelli, S. Chemical imaging of surfaces with sum frequency generation vibrational spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 53 (6), 1139-1150 (2020).
  37. Wagner, J. ackson C., Zishan, W. u, Xiong, W. Multimodal nonlinear vibrational hyperspectral imaging. ChemRxiv. , (2023).
  38. Yan, C., Wagner, J., Wang, C., Ren, J., Lee, C., Wan, Y., Wang, S., Xiong, W. Multi-dimensional widefield infrared-encoded spontaneous emission microscopy: distinguishing chromophores by ultrashort infrared pulses. ChemRxiv. , (2023).
  39. Lin, Y., Fromel, M., Guo, Y., Guest, R., Choi, J., Li, Y., Kaya, H., Pester, C. W., Kim, S. H. Elucidating interfacial chain conformation of superhydrophilic polymer brushes by vibrational sum frequency generation spectroscopy. Langmuir. 38 (48), 14704-14711 (2022).
  40. Choi, J., Lee, J., Makarem, M., Huang, S., Kim, S. H. Numerical simulation of vibrational sum frequency generation intensity for non-centrosymmetric domains interspersed in an amorphous matrix: a case study for cellulose in plant cell wall. The Journal of Physical Chemistry B. 126 (35), 6629-6641 (2022).
  41. Matlab Image Processing Toolbox Hyperspectral Imaging Library. , The Mathworks, Inc., Natick, MA USA. Google Scholar Forthcoming.
  42. Armstrong, B. H. Spectrum line profiles: the Voigt function. Journal of Quantitative Spectroscopy and Radiative Transfer. 7 (1), 61-88 (1967).
  43. Wu, Z., Xiong, W. Neumann's principle based eigenvector approach for deriving non-vanishing tensor elements for nonlinear optics. The Journal of Chemical Physics. 157 (13), 134702(2022).
  44. Chollet, F. Keras Neural Network Library. https://github.com/fchollet/keras accessed Apr 12. , (2021).
  45. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  46. Xiong, W., Laaser, J. E., Mehlenbacher, R. D., Zanni, M. T. Adding a dimension to the infrared spectra of interfaces using heterodyne detected 2D sum-frequency generation (HD 2D SFG) spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20902-20907 (2011).
  47. Lukas, M., Backus, E. H. G., Bonn, M., Grechko, M. Passively stabilized phase-resolved collinear sfg spectroscopy using a displaced sagnac interferometer. The Journal of Physical Chemistry A. 126 (6), 951-956 (2022).
  48. Ji, N., Ostroverkhov, V., Chen, C., Shen, Y. Phase-sensitive sum-frequency vibrational spectroscopy and its application to studies of interfacial alkyl chains. Journal of the American Chemical Society. 129 (33), 10056-10057 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie hiperspektralnenieliniowa mikroskopia optycznamikroskopia skanuj ca liniowoobrazowanie SHGobrazowanie multimodalnestruktury samosk adaj ce sianaliza sieci neuronowychmorfologia mezoskopowa
Multimodalne nieliniowe hiperspektralne obrazowanie chemiczne przy użyciu mikroskopii generacji drgań i częstotliwości ze skanowaniem liniowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.