Tutaj prezentujemy metodę standaryzacji usieciowanego peptydu kolagenowego agonisty płytek krwi (CRP-XL) za pomocą agregegometrii przepuszczalności światła. Chociaż protokół jest ukierunkowany na funkcję płytek krwi, proces eksperymentalny można zastosować do większości cząsteczek biologicznych i testów biologicznych, aby zapewnić rygor naukowy i odtwarzalność.
Artykuł metodologiczny
Odtwarzalność i harmonizacja w badaniach z wykorzystaniem standardów biologicznych: przykład peptydu kolagenozależnego-związanego z agonistą płytek krwi
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Metrologia - nauka o pomiarach - to temat, o którym niewielu biologów uczy się podczas szkolenia na ich niekorzyść; zastosowanie prostych procesów standaryzacji w codziennej pracy daje pewność danych i powtarzalność na odległość i czas.
Ta metoda pokazuje, jak ustandaryzować podstawowy eksperyment laboratoryjny szeroko stosowany w badaniach nad hemostazą i praktyce klinicznej, w szczególności mierząc odpowiedzi na peptyd kolagenowy agonisty receptora kolagenu płytkowego (glikoproteiny [GP]VI), usieciowany krzyżowo (CRP-XL) przez agregegometrię transmisji światła (LTA). Zastosowanie tego podejścia zapewni odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjną i harmonizację między laboratoriami, niezależnie od materiału agonisty lub dostawcy. Co ważne, metoda ta ma zastosowanie do innych agonistów płytek krwi, a także do wielu innych cząsteczek biologicznych i testów biologicznych.
Proces opisany poniżej polega na wykonaniu serii 6-8 punktowych rozcieńczeń 'standardu' i 'testu' (materiału, który sprawdzasz) i uruchomieniu ich obok siebie w wybranym teście (w tym przypadku LTA). CRP-XL stosuje się w stężeniach masowych/objętościowych, ale nie każdy materiał daje taką samą aktywność biologiczną przy danym stężeniu, dlatego wykonuje się serię rozcieńczeń w celu porównania materiału wzorcowego i badanego oraz określenia, jakie stężenie jest potrzebne do uzyskania równoważnej aktywności. Szereg rozcieńczeń musi obejmować agregację 0-100%. Dane są wykreślane przy użyciu regresji nieliniowej i określana jest wartość EC50 dla każdej próbki (wzorca i testu). Aby przypisać aktywność, podziel wartość EC50 wzorca przez wartość testu, aby określić, o ile jest ona bardziej lub mniej silna i odpowiednio dostosuj stężenie. Takie podejście zapewni, że ta sama "aktywność" biologiczna będzie wielokrotnie dodawana do testu.
Wprowadzenie
Wielu z nas używa biologicznych agonistów i antagonistów w naszych eksperymentach, najczęściej w teście biologicznym, który określa ilościowo ich wpływ na funkcjonowanie komórek w określonych warunkach. Opisana tutaj metoda dotyczy usieciowanego peptydu związanego z kolagenem agonisty płytek krwi (CRP-XL), agonisty glikoproteiny VI, który aktywuje płytki krwi i którego aktywność można mierzyć w różnych testach (agregegometria przepuszczalności światła, mikroskopia, cytometria przepływowa, uwalnianie Ca2 + itp.), ale protokół standaryzacji agonisty ma zastosowanie do każdego biologicznego agonisty / antagonisty i / lub testu biologicznego. Nauki fizyczne są dobrze zorientowane w stosowaniu norm w swojej codziennej praktyce zawodowej, a firmy opracowujące leki bioterapeutyczne w sektorze komercyjnym rozumieją wartość korzystania z norm referencyjnych1, jednak pozostają one niedostatecznie wykorzystywane przez wielu naukowców biologicznych, zwłaszcza w akademickiej społeczności badawczej, a ich brak negatywnie wpływa na jakość wyników naukowych.
CRP-XL to specyficzny agonista specyficzny dla GPVI, którego pole płytek krwi używało przez dziesięciolecia od czasu jego opisu w 1995 roku2, pomagając społeczności odróżnić rolę GPVI od innych białek płytek krwi wiążących kolagen3,4. Ten agonista może być pozyskiwany z różnych źródeł komercyjnych lub produkowany we własnym zakresie. Monomer peptydowy można zakupić od dostawcy, a następnie usieciować we własnym zakresie lub może to zrobić dostawca za dodatkową opłatą. Dalsze oszczędności można osiągnąć poprzez zmniejszenie wymaganej czystości przy dostawie (na przykład 70% w porównaniu z 95%). Nie ma również zgody co do tego, jak należy przechowywać CRP-XL, przy czym niektórzy decydują się na krioprzechowywanie, a inni chłodzenie, niektórzy utrzymują materiał liofilizowany do czasu użycia, a inni przechowują go w roztworze (wodzie lub buforze, w zależności od preferencji). W związku z tym jakość i skład zasobów laboratoryjnych są nieustandaryzowane lub zharmonizowane. Ponieważ ten agonista jest stosowany w określonym stężeniu (masa/objętość), a nie w jednostkach aktywności, siła działania CRP-XL w jednym laboratorium, np. przy 1 μg/ml, nie będzie taka sama jak w innym. Warto zauważyć, że inni agoniści płytek krwi stosowani w tej dziedzinie są już standaryzowani (np. trombina, która jest dostarczana i stosowana w jednostkach aktywności, a nie masa/objętość), więc przejście od masy/objętości do jednostek biologicznych nie powinno być zbyt trudne dla społeczności. Należy również zauważyć, że reakcje pacjentów na agonistów płytek krwi, w tym CRP-XL, są zmienne pod względem ich wrażliwości na agonistów, a także ich zdolności do odpowiedzi (zakresu odpowiedzi)5, dlatego tym ważniejsze jest stosowanie stałych ilości aktywności agonistycznej w testach.
Jeśli agoniści płytek krwi mogą być zharmonizowani poprzez użycie ich przy określonej aktywności, a nie wadze/objętości, można zapewnić, że eksperyment w jednym laboratorium jest bezpośrednio porównywalny z tym w innych laboratoriach i może być dokładnie odtworzony z pewnością. Do czasu, gdy teren osiągnie porozumienie w sprawie sposobu przechowywania i standaryzacji aktywności CRP-XL, konieczne jest przeprowadzanie regularnych kontroli materiału, aby zapewnić jego spójność przez miesiące/lata, w których jest używany.
Przypisywanie wartości aktywności dla standardów biologicznych musi być wykonane poprzez wspólne, wieloośrodkowe badania (na przykład6,7) i wymagać specjalistycznej wiedzy. Potrzeba ustalonych standardów biologicznych dla agonistów płytek krwi została niedawno podkreślona przez wspólne wieloośrodkowe badanie8 wspierane przez Międzynarodowe Towarzystwo Zakrzepicy i Hemostazy (ISTH); Dopóki nie będzie dostępna międzynarodowa norma CRP-XL, naukowcy mogą standaryzować swój własny materiał lokalnie, aby zapewnić spójność w czasie oraz to, że nowy materiał pozyskiwany komercyjnie lub wewnętrznie ma porównywalną aktywność z poprzednimi preparatami, a także z pozostałymi preparatami.
Protokół
Krew powinna być pobierana od zdrowych ochotników, którzy wyrazili zgodę, i przetwarzana zgodnie z lokalnymi zasadami. Protokół ten mierzy agregację płytek krwi indukowaną przez agonistów w osoczu bogatopłytkowym (PRP) za pomocą agregegometrii transmisji światła (LTA). ISTH zapewnia ustandaryzowane protokoły, w tym metodę przygotowania PRP z 2013 r. i LTA9. Zbierz pełną krew do 4% cytrynianu sodu zgodnie z zaleceniami ISTH zgodnie z zasadami lokalnej komisji etycznej. Wyklucz dawców, którzy przyjmowali NLPZ w ciągu ostatnich 2 tygodni.
1. Procedura testowa
- Pobrać podwielokrotność surowca CRP-XL i rozcieńczyć go w buforze testowym (Tyrodes10) (Tabela 1) do stężenia początkowego, które spowoduje maksymalną agregację (patrz UWAGA poniżej kroku 1.3).
UWAGA: W literaturze stężenie 1 μg/ml spowoduje maksymalną agregację, ale niektóre laboratoria potrzebują wyższych stężeń, aby osiągnąć ten sam efekt - odpowiednio dostosuj serię rozcieńczeń - Wykonać odpowiednią serię rozcieńczeń z wzorcem (patrz UWAGA poniżej kroku 1.3 i Rysunek 1) tak, aby stężenia były takie same jak odczynnik testowy.
- Sporządzić serię rozcieńczeń od 6 do 8 punktów dla testu i wzorca, ponownie w buforze testowym, który przyjmuje odpowiedź agregacji od 100% do 0% agregacji. Przykład przedstawiający 8-punktową krzywą stężenia serii rozcieńczeń przedstawiono w tabeli 2.
UWAGA: Niektóre laboratoria dodają agonistę w sumie 10% objętości testu, np. 50 μL agonisty na 450 μl płytek krwi, tak aby rozcieńczać 10-krotne stężenie do końcowego stężenia 1x w teście, podczas gdy inne dodają mniejsze (bardziej skoncentrowane) objętości agonisty, np. 5 μl agonisty do 495 μl płytek krwi - po prostu upewnij się, że seria rozcieńczeń jest odpowiednia dla testu, mając na uwadze Jak przemieszczenie objętości wpływa na stężenie płytek krwi - ponownie, bądź konsekwentny. W tym przykładzie 30 μl 10x agonisty dodaje się do 270 μl osocza bogatopłytkowego (PRP). - Gdy płytki krwi są już odpoczęte i gotowe do użycia, podzielić je na kuwety LTA, dodać mieszadło i pozostawić do osiągnięcia temperatury 37 °C w studzienkach podtrzymujących.
- Po osiągnięciu temperatury umieść kuwetę (kuwety) w agresjometrze i rozpocznij rejestrowanie śladów. Dodać agonistę (mieszając) i zapisać dane.
- Powtórz krok 1.4 dla każdego stężenia w teście i wzorcu, aż do momentu zebrania danych potrzebnych do wykreślenia krzywych (przykładowe krzywe pokazane w Rysunek 2).
- Oblicz siłę działania odczynnika testowego w stosunku do siły działania wzorca; ponownie użyj dowolnej metryki - maksymalnej agregacji lub obszaru pod krzywą - o ile istnieje spójność, a model analizy odpowiednio pasuje do danych.
2. Sprawdzanie krzywych stężeń
- Najpierw sprawdź, czy krzywe stężenie-odpowiedź są równoległe. Istnieje wiele pakietów oprogramowania, które to robią, ale tutaj proces jest opisany dla Graphpad Prism (patrz Rysunek 3).
- Wprowadź dane tak, aby log(stężenie) znajdowało się na osi X, a odpowiedź (maksymalna agregacja %, AUC) znajdowała się na osi Y (Rysunek 3A)
- Transformacja stężeń CRP-XL (Rysunek 3B)
- Wybierz Regresja nieliniowa z funkcji analizy i użyj równania do stymulacji/hamowania dawka-odpowiedź.
- Wybierz logarytm (agonista) a odpowiedź (zmienne nachylenie) - użyj dopasowania 3- lub 4-kierunkowego, w zależności od tego, co jest najlepsze dla danych.
- Określ, czy krzywe są równoległe, korzystając z karty Porównaj (jak pokazano w Rysunek 3C) i kliknij przycisk, aby porównać zestawy danych, aby upewnić się, że nachylenie (nachylenie wzgórza) i asymptoty (góra i dół krzywej) są równoważne. W tym przykładzie nachylenie wzgórza dla testu wynosi 2,279, a nachylenie normy wynosi 2,025, co daje współczynnik 1,125.
- Jeśli nachylenia są równoległe (na przykład kryterium akceptacji współczynnika nachylenia wynosi 0,8-1,25), a asymptoty są równoważne, należy przeprowadzić obliczenia potencji (EC50), wykonując kroki 2.1.3 i 2.1.4. W przedstawionym przykładzie asymptoty zostały ograniczone, ponieważ ocena w kroku 2.1.5 potwierdziła, że asymptoty są równoważne.
- Podziel wartość EC50 wzorca przez wartość testu, aby określić względną moc. W przedstawionym przykładzie test/standard (0,07259/0,1498) = 0,4846, tj. "test" jest o połowę słabszy niż standard.
- Dostosuj stężenia masowe/objętościowe, aby uwzględnić różnicę w sile działania, tj. jeśli wzorzec był używany wcześniej przy 1 μg/ml, nowy materiał zostanie użyty przy 1/0,4846 = 2,063 μg/ml), aby zapewnić porównywalne ilości materiału aktywnego używane w eksperymentach
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia schemat serii rozcieńczeń i ma na celu podkreślenie, że seria rozcieńczeń jest niezbędna zarówno dla wzorca, jak i dla próbki badawczej. Rysunek 2A pokazuje krzywe agregacji dla wzorca, natomiast dane dla próbki badawczej przedstawiono na Rysunku 2B. Przy stężeniu 0,075 µg/mL widoczna jest wyraźna odpowiedź na wzorzec, podczas gdy dla próbki badawczej odpowiadające jej stężenie (0,075 µg/mL) jest płaskie, co oznacza brak odpowiedzi. Dane te służą do wykreślenia kolejnych wykresów w celu wyznaczenia EC50. W przedstawionym tutaj przykładzie do wykreślenia krzywej zależnośc odpowiedzi od stężenia i wyznaczenia EC50, jak pokazano na Rysunku 3, przyjęto 100% maksymalnej agregacji.
Rycina 1: Graficzny opis dwóch serii rozcieńczeń dla próby (po lewej) i wzorca (po prawej). Zaczynając od najwyższego stężenia (sugerowane stężenie: 10 µg/mL CRP-XL), wykonuje się równolegle sekwencyjne rozcieńczenia 1:2 w 8 punktach (>3 jednostki logarytmiczne). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Krzywe agregacji dla serii rozcieńczeń standardowych (lewa) i testowych (prawa). W miarę postępu agregacji płytek krwi (oś x), ilość światła przechodzącego przez próbkę i docierającego do czujnika wzrasta (oś y). (A) Standard. (B) Test. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Wprowadzanie i analiza danych. (A) Wprowadzanie danych, (B) transformacja oraz (C,D) analiza pod kątem paralelizmu (wykorzystanie oprogramowania do oceny, czy nachylenia krzywych Hilla i asymptoty są porównywalne [C]). (E) Jeśli krzywe są równoległe, wyznaczenie potencji (EC50) za pomocą nieliniowego dopasowania regresji krzywej. (F) Wykres przekształconych danych. Szczegóły znajdują się w opisie metody. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| bufor Tyrodesa9 | ||
| Składniki | Stężenie | Komentarze |
| NaCl | 134 mM | |
| Na2HPO4 | 0,34 mM | |
| KCl | 2,9 mM | |
| NaHCO33 | 12 mM | |
| kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) | 20 mM | |
| Glukoza | 5 mM | |
| MgCl₂2 | 1 mM | pH 7,3 |
Tabela 1: Skład buforu Tyrodesa.
| 8-stopniowa seria rozcieńczeń | |
| Rozcieńczenie 1 | 10 µg/mL |
| Rozcieńczenie 2 | 5 µg/mL |
| Rozcieńczenie 3 | 2.5 µg/mL |
| Rozcieńczenie 4 | 1.25 µg/mL |
| Rozcieńczenie 5 | 0.625 µg/mL |
| Rozcieńczenie 6 | 0.3125 µg/mL |
| Rozcieńczenie 7 | 0.15625 µg/mL |
| Rozcieńczenie 8 | 0.073125 µg/mL |
Tabela 2: Przykład przedstawiający 8-punktową serię rozcieńczeń.
Dyskusja
Jak pokazano tutaj, proces standaryzacji materiałów jest bardzo prosty. Chociaż ocena nowych partii materiału i/lub sprawdzenie, czy bieżąca partia jest stabilna i nie traci aktywności w czasie, nagrodą jest to, że eksperymenty są powtarzalne za każdym razem i porównywalne przez lata, a nie tylko przez cały okres eksploatacji odczynnika. Oznacza to również, że inni badacze mogą dokładnie odtworzyć warunki testowe i że społeczność jest zharmonizowana na poziomie globalnym. Krytyczne etapy protokołu obejmują pobranie krwi pełnej i przygotowanie PRP9, a także precyzję podczas wykonywania serii rozcieńczeń. Ważne jest również, aby upewnić się, że krzywa testowa i standardowa są równoległe przed przystąpieniem do porównania EC50 . Jeśli linie nie są równoległe lub asymptoty nie są równoważne, może to oznaczać, że materiał testowy i standardowy różnią się w pewnym stopniu.
Każdy, kto pracuje w naukach biologicznych, wie, że testy biologiczne nie zawsze działają spójnie, więc należy o tym pamiętać podczas oceny danych. W pokazanym tutaj przykładzie, mimo że używamy tych samych dawców do pomiaru siły działania dwóch bardzo podobnych, jeśli nie identycznych, materiałów, zbocza wzgórz i asymptoty nie są identyczne. Akceptujemy jednak pewien stopień zmienności i dochodzimy do wniosku, że krzywe są w tym przypadku równoległe, a zatem nadają się do porównywania i dostosowywania mocy. Cząsteczki biologiczne są duże i złożone, a modyfikacje potranslacyjne podczas produkcji mogą wpływać na ich siłę działania w testach biologicznych. Standaryzacja biomolekuł i testów biologicznych nie może być wykonana przy użyciu samej masy lub objętości i musi być wykonana poprzez ilościowe określenie i porównanie aktywności biologicznej w teście biologicznym11. Należy wykorzystać swoje wykształcenie i doświadczenie, aby ocenić dane w kontekście testu.
Ograniczenia tej techniki polegają na tym, że chociaż dane mogą wskazywać na problem z odczynnikami (odczynnikami), nie mogą powiedzieć, na czym polega problem. Konieczne będą dalsze prace, aby ustalić, dlaczego materiały nie są porównywalne. W idealnym świecie każdy materiał krytyczny dla eksperymentu (eksperymentów) i późniejszych wniosków naukowych byłby weryfikowany za pomocą spektroskopii mas, ale nie zawsze jest to możliwe. Jeśli jednak dane nie są porównywalne, dalsze dochodzenie jest nadal uzasadnione w pewnym zakresie. Kolejnym ograniczeniem takiego podejścia jest czas i zasoby potrzebne do jego wykonania. Idealnie byłoby, gdyby test i norma były porównywane u 3-6 dawców, aby zapewnić pewną pewność co do przypisania aktywności biologicznej materiałowi, ale uważamy, że jest to uzasadnione wspieraniem odtwarzalności i wiarygodności. Standaryzacja materiału biologicznego nie jest potrzebna za każdym razem, gdy przeprowadzane są eksperymenty, ale powinna być wykonywana co najmniej dla każdej nowej partii agonistów, najlepiej częściej, w zależności od stabilności i zastosowania. Rzeczywiście, jeśli norma zostanie udostępniona, jest to coś, co międzynarodowe organizacje normalizacyjne mogą zapewnić jasność.
Chociaż przedstawiony tutaj przykład dotyczy CRP-XL w kontekście pomiaru agregacji płytek krwi, protokół porównywania aktywności biologicznej biomolekuł w testach biologicznych ma szerokie zastosowanie w całym sektorze.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4% cytrynian sodu | Sigma-Aldrich | S1804 | Antykoagulant rozpuszczony w wodzie9 |
| 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy kwas (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | Usieciowany, potrójnie helisowy peptyd2,4 o sekwencji GCP*(GPP*)GCP*G (jednoliterowy kod aminokwasu: P* = hydroksyprolina został uzyskany na zamówienie niestandardowe od Peptide Protein Research Ltd. | |
| Kuwety i mieszadła | Stago | 86921 | Materiały eksploatacyjne do agresgometru |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Pakiet oprogramowania do analizy | wykresów | pryzmatycznych | |
| Płytki krwi osocze | Izolowane z krwi pełnej od zdrowych ochotników wolne od niesteroidowych leków przeciwzapalnych przez minimum 10 dni8. |
Bibliografia
- Faya, P., et al. Potency assignment of biotherapeutic reference standards. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113577(2020).
- Morton, L. F., et al. Integrin alpha 2 beta 1-independent activation of platelets by simple collagen-like peptides: collagen tertiary (triple-helical) and quaternary (polymeric) structures are sufficient alone for alpha 2 beta 1-independent platelet reactivity. The Biochemical Journal. 306 (2), 337-344 (1995).
- Pugh, N., et al. Synergism between platelet collagen receptors defined using receptor-specific collagen-mimetic peptide substrata in flowing blood. Blood. 115 (24), 5069-5079 (2010).
- Farndale, R. W., et al. Cell-collagen interactions: the use of peptide Toolkits to investigate collagen-receptor interactions. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 2), 241-250 (2008).
- Dunster, J. L., et al. Multiparameter phenotyping of platelet reactivity for stratification of human cohorts. Blood Advances. 5 (20), 4017-4030 (2021).
- Hubbard, A. R., et al. Establishment of the WHO 2nd International Standard Factor V, plasma (16/374): communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 695-697 (2019).
- Sergaki, C., et al. Developing whole cell standards for the microbiome field. Microbiome. 10 (1), 123(2022).
- Alessi, M. C., et al. Multi-center evaluation of light transmission platelet aggregation reagents: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. (23), (2023).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: A consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , (2013).
- Taylor, L., et al. Discovery of novel GPVI receptor antagonists by structure-based repurposing. PLoS One. 9 (6), e101209(2014).
- Coxon, C. H., Longstaff, C., Burns, C. Applying the science of measurement to biology: Why bother. PLoS Biology. 17 (6), e3000338(2019).
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Reproducibility and Harmonization in Research using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide
Posted by JoVE Editors on 12/08/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Reproducibility and Harmonization in Research using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide. The Authors section was updated from:
Carmen H. Coxon1
Peter Rigsby1
1National Institute for Biological Standards and Control
to:
Carmen H. Coxon1
Peter Rigsby1
1Medicines and Healthcare products Regulatory Agency
