Method Article

Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania

DOI:

10.3791/65413

⸱

May 19th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, University Hospital Zurich, University of Zurich, 2Ectica Technologies AG

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model in vitro niszy naczyniowej szpiku kostnego jest tworzony przez wysiewanie komórek mezenchymalnych i śródbłonka na prefabrykowane hydrożele PEG 3D. Sieci śródbłonka, komponenty ECM i aktywność ALP w niszach różnią się w zależności od zastosowanego czynnika wzrostu. Platforma może być wykorzystywana do zaawansowanych modeli nowotworów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kość i szpik kostny są wysoce unaczynionymi i strukturalnie złożonymi organami, i są miejscami powstawania raka i przerzutów. Modele in vitro podsumowujące funkcje specyficzne dla kości i szpiku kostnego, w tym unaczynienie, które są zgodne z badaniami przesiewowymi leków, są wysoce pożądane. Takie modele mogą wypełnić lukę między uproszczonymi, strukturalnie nieistotnymi dwuwymiarowymi (2D) modelami in vitro a droższymi, etycznie wymagającymi modelami in vivo. W artykule opisano kontrolowany trójwymiarowy (3D) test współhodowli oparty na zmodyfikowanych matrycach poli(glikolu etylenowego) (PEG) do generowania unaczynionych, osteogennych nisz szpiku kostnego. Konstrukcja matrycy PEG umożliwia rozwój kultur komórkowych 3D poprzez prosty etap wysiewu komórek, który nie wymaga enkapsulacji, umożliwiając w ten sposób rozwój złożonych systemów kohodowli. Co więcej, matryce są przezroczyste i wstępnie odlane na 96-dołkowych płytkach obrazowych ze szklanym dnem, dzięki czemu system nadaje się do mikroskopii. W opisanym tutaj teście ludzkie mezenchymalne komórki zrębu pochodzące ze szpiku kostnego (hBM-MSC) są najpierw hodowane, aż do uformowania się wystarczająco rozwiniętej sieci komórkowej 3D. Następnie dodaje się ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej wykazujące ekspresję GFP (HUVEC). Rozwój kultury jest śledzony przez mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną. Obecność sieci hBM-MSC sprzyja tworzeniu się struktur podobnych do naczyń krwionośnych, które inaczej nie powstałyby i pozostają stabilne przez co najmniej 7 dni. Zakres powstawania sieci podobnych do naczyń krwionośnych można łatwo określić ilościowo. Model ten można dostroić do osteogennej niszy szpiku kostnego poprzez uzupełnienie pożywki hodowlanej białkiem morfogenetycznym kości 2 (BMP-2), które sprzyja osteogennemu różnicowaniu hBM-MSC, co oceniano na podstawie zwiększonej aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP) w 4. i 7. dniu kohodowli. Ten model komórkowy może być wykorzystany jako platforma do hodowli różnych komórek nowotworowych i badania, w jaki sposób oddziałują one z niszami naczyniowymi specyficznymi dla kości i szpiku kostnego. Co więcej, nadaje się do automatyzacji i analiz o wysokiej zawartości, co oznacza, że umożliwi badania przesiewowe leków przeciwnowotworowych w wysoce powtarzalnych warunkach hodowli.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kość i szpik kostny są strukturalnie i funkcjonalnie złożonymi organami, kluczowymi dla ludzkiego zdrowia. Znajduje to odzwierciedlenie w istnieniu odrębnych nisz, które regulują hematopoezę i utrzymanie kości1. Obecnie powszechnie przyjmuje się, że w zdrowym szpiku kostnym utrzymanie i ekspansja hematopoetycznych i szkieletowych komórek macierzystych, a także ich potomstwa, są kontrolowane przez odrębne nisze. Nisze te obejmują różne typy komórek, w tym komórki osteolineage, mezenchymalne komórki macierzyste, komórki śródbłonka i okołonaczyniowe, komórki neuronalne i glejowe, adipocyty, osteoklasty, makrofagi i neutrofile2. Nic dziwnego, że te nisze, głównie związane z układem krwionośnym, są również zaangażowane w rozwój różnych typów białaczki3 i są miejscem przerzutów dla różnych nowotworów4. Ze względu na swoje specyficzne role w tworzeniu, przebudowie i utrzymaniu kości (szpiku), unaczynienie związane z kośćmi ma odrębne wyspecjalizowane struktury, różniące się od naczyń krwionośnych występujących w innych częściach ciała5,6,7. Tak więc leki antyangiogenne lub modulujące naczynia krwionośne stosowane ogólnoustrojowo mogą mieć różne efekty w tych wyspecjalizowanych środowiskach8. W związku z tym wysoce pożądane są modele do badania mechanizmów molekularnych związanych z utrzymaniem fizjologicznych właściwości kości i szpiku kostnego, regeneracją kości i szpiku kostnego oraz odpowiedziami na leczenie terapeutyczne.

Klasyczne dwuwymiarowe (2D) hodowle tkanek oraz badania in vivo z wykorzystaniem modeli zwierzęcych dostarczyły nieocenionego wglądu w role różnych komórek i graczy molekularnych zaangażowanych w rozwój kości i szpiku kostnego9,10. Modele, które pozwalają na wysokoprzepustowe eksperymenty z odpowiednimi komórkami ludzkimi, mogą poszerzyć naszą wiedzę na temat modulowania wybranych parametrów w tych wysoce złożonych systemach.

W ciągu ostatniej dekady, zasady wywodzące się z inżynierii tkankowej zostały wykorzystane do generowania modeli tkanek 3D11,12. Opierały się one głównie na enkapsulacji komórek istotnych dla tkanek w biomateriałach w celu ustanowienia mono- lub kokultur 3D13. Do najczęściej używanych biomateriałów należą fibrin14, collagen15 i Matrigel16,17, z których wszystkie są wysoce biokompatybilne i zapewniają odpowiednie warunki do wzrostu wielu typów komórek. Te biomateriały mają zdolność generowania modeli in vitro, które podsumowują kluczowe aspekty różnych nisz naczyniowych znalezionych in vivo18. Co więcej, zastosowanie urządzeń mikroprzepływowych do generowania perfundowanych modeli naczyń krwionośnych kości i szpiku kostnego przyczyniło się do wygenerowania modeli in vitro o większej złożoności19,20,21,22.

Trudność w kontrolowaniu składu i inżynierii właściwości naturalnie występujących biomateriałów zainspirowała rozwój syntetycznych analogów, które można racjonalnie zaprojektować z przewidywalnymi właściwościami fizycznymi, chemicznymi i biologicznymi23,24. Opracowaliśmy w pełni syntetyczne hydrożele na bazie usieciowanego poli(glikolu etylenowego) (PEG) czynnika XIII (FXIII), które są funkcjonalizowane peptydami RGD i miejscami rozszczepienia metaloproteazy matrycy (MMP), aby ułatwić przyłączanie i przebudowę komórek25,26. Modułowa konstrukcja tych biomateriałów została z powodzeniem wykorzystana do optymalizacji warunków tworzenia unaczynionych modeli 3D kości i szpiku kostnego27,28.

Do testowania większej liczby różnych warunków hodowli i nowych terapii, wymagane są modele o większej przepustowości. Niedawno wykazaliśmy, że sieciowanie FXIII naszego hydrożelu PEG może być kontrolowane za pomocą procesu elektrochemicznego, tak że powstaje głęboki gradient sztywności hydrożelu29. Kiedy komórki są dodawane do takich hydrożeli, migrują one w kierunku wnętrza i stopniowo przekształcają się w wysoce połączone sieci komórkowe 3D30. Eliminacja konieczności kapsułkowania komórek w hydrożelu, który jest zwykle obecny w innych rusztowaniach 3D, nie tylko upraszcza projekt eksperymentalny, ale także umożliwia sekwencyjne dodawanie różnych typów komórek w różnych punktach czasowych w celu wygenerowania złożonych systemów kohodowli. Hydrożele te są dostępne w postaci wstępnie odlanej na 96-dołkowych płytkach obrazowych ze szklanym dnem, dzięki czemu tworzenie kultur 3D jest osiągalne zarówno za pomocą ręcznych, jak i automatycznych protokołów wysiewu komórek. Przezroczystość optyczna hydrożeli PEG sprawia, że platforma jest kompatybilna z mikroskopią.

Tutaj prezentujemy prostą metodę generowania i charakteryzowania unaczynionych nisz osteogennych w ramach tej gotowej do użycia, syntetycznej platformy plug-and-play. Pokazujemy, że rozwój sieci naczyniowych może być stymulowany przez czynnik wzrostu powszechnie stosowany do indukowania osteogenezy in vitro, białko morfogenetyczne kości-2 (BMP-2), podczas gdy różnicowaniu osteogennemu można zapobiec poprzez suplementację czynnikiem wzrostu fibroblastów 2 (FGF-2)27,31. Utworzone sieci różnią się od sieci stymulowanych FGF-2 pod względem ogólnego wyglądu, a także dystrybucji komórek i ECM. Ponadto monitorowaliśmy indukcję osteogenną przy użyciu fosfatazy alkalicznej jako markera. Wykazujemy zwiększoną ekspresję tego markera w czasie i porównujemy ekspresję z ekspresją w sieciach stymulowanych FGF-2 przy użyciu metod jakościowych i ilościowych. Na koniec pokazujemy przydatność wygenerowanych wnęk tego modelu do dwóch potencjalnych zastosowań. Po pierwsze, przeprowadziliśmy test wrażliwości na lek potwierdzający słuszność koncepcji, dodając bewacyzumab do wstępnie uformowanych nisz i monitorując degradację sieci naczyniowych w jego obecności. Po drugie, dodaliśmy komórki raka piersi MDA-MB-231 i kostniakomięsaka U2OS do wstępnie utworzonych nisz osteogennych, pokazując, że nisze można wykorzystać do badania interakcji między komórkami rakowymi a ich środowiskiem.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 podsumowuje następujące sekcje protokołu.

1. Ustanowienie monokultury zrębu 3D

  1. Przygotować zawiesinę komórek hBM-MSC.
    1. Hoduj hBM-MSCs do poziomu konfluencji 70%-90% w MEMα uzupełnionym 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny i 5 ng/ml FGF-2 w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze. Komórki mogą być używane do przejścia 6.
    2. Umyj komórki PBS i odłącz je za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C. Zatrzymaj proces odklejania, przepłukując je podłożem podstawowym (MEMα uzupełnione 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny). Zebrać zawieszone komórki w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    3. Policz komórki za pomocą hematocytometru lub automatycznego licznika komórek i określ całkowitą liczbę komórek w zawiesinie.
    4. Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 200 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć supernatant.
    5. Zawiesić komórki w odpowiedniej objętości podłoża podstawowego, aby osiągnąć stężenie 1 x 107 komórek/ml roztworu podstawowego.
    6. Przygotować stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml zawierające wymaganą objętość podłoża podstawowego uzupełnionego odpowiednimi czynnikami wzrostu (FGF-2 i BMP-2 w określonych stężeniach, np. 0 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/mL, 100 ng/ml lub 200 ng/ml). Na dołek wymagane jest 200 μl. Jeśli wysiew komórek ma być przeprowadzony za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, należy również wziąć pod uwagę martwą objętość urządzenia. Do ręcznego wysiewu komórek wystarczy nadmiar objętości wynoszący 10%.
    7. Dodać hBM-MSCs z roztworu podstawowego w rozcieńczeniu 1:66,67, aby uzyskać stężenie 1,5 x10,5 5 komórek/ml.
  2. Przygotuj talerz do siewu.
    1. Usuń polipropylenową folię samoprzylepną pokrywającą 96-dołkową płytkę hydrożelową.
    2. Ostrożnie zassać bufor do przechowywania przykrywający hydrożele. Do tego zadania użyj myjki do mikropłytek; Możliwa jest jednak ręczna obsługa.
      1. W przypadku korzystania z ręcznego aspiratora lub pipety wielokanałowej przyłóż końcówkę do ścianki studzienki i powoli przesuwaj się w dół w kierunku krawędzi studzienki wewnętrznej, jednocześnie zasysając bufor. Pozwoli to uniknąć uszkodzenia powierzchni hydrożelu.
      2. W przypadku korzystania z automatycznej myjki do płytek, należy ustawić dysze zasysające w odległości co najmniej 3,8 mm od nośnika płytki (odpowiada to 0,8 mm od wewnętrznego pierścienia płytki hydrożelowej) w kierunku krawędzi studzienki. Zapoznaj się z instrukcją producenta, aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje i uzyskać rysunki płytki 96-dołkowej płytki hydrożelowej.
  3. Dodać 200 μl/basenik zawiesiny komórek przygotowanej w kroku 1.1.7 po dokładnym wymieszaniu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Podczas siewu, aby uniknąć nierównomiernej sedymentacji komórek w jednym obszarze podłoża, nie należy przechylać płytki. W przypadku siewu ręcznego należy okresowo mieszać zawiesinę komórkową (po wysianiu trzech dołków), aby utrzymać jednorodną mieszankę. W przypadku wysiewu automatycznego, należy wymieszać pipetą serologiczną bezpośrednio przed dozowaniem w celu dozowania objętości zawierających równą liczbę komórek.
  4. Utrzymywać kultury w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze.
  5. Monitoruj rozwój kultur za pomocą mikroskopii jasnego pola z obiektywem 5x, zgodnie z potrzebami. Uzyskaj obrazy referencyjne około 30 minut po wysiewie, aby ocenić liczbę dodanych komórek.

2. Ustanowienie 3D kokultury komórek zrębu i śródbłonka

  1. Przygotować zawiesinę komórek GFP-HUVEC.
    1. Przygotować kolby do hodowli HUVEC, pokrywając roztworem składającym się ze 150 μg/ml kolagenu I ze szczurzego ogona w 0,02 M kwasie octowym przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przed użyciem spłukać raz PBS.
    2. Hoduj GFP-HUVEC do poziomu konfluencji 80%-100% w EGM-2 uzupełnionym 10% FBS w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze. Komórki mogą być używane do pasażu 7.
    3. Umyj komórki PBS i odłącz je za pomocą 0,05% Trypsin-EDTA przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C. Zatrzymaj proces odklejania poprzez przepłukanie podłożem podstawowym (MEMα uzupełnione 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny). Zebrać zawieszone komórki w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    4. Policz komórki za pomocą hematocytometru lub automatycznego licznika komórek i określ całkowitą liczbę komórek obecnych w zawiesinie.
    5. Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 200 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć supernatant.
    6. Zawiesić komórki w odpowiedniej objętości podłoża podstawowego, aby osiągnąć stężenie 1 x 107 komórek/ml roztworu podstawowego.
    7. Przygotować stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml zawierające wymaganą objętość podłoża podstawowego uzupełnionego odpowiednimi czynnikami wzrostu (FGF-2 i BMP-2 w określonych stężeniach, np. 0 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml lub 200 ng/ml), jak opisano dla hBM-MSCs w kroku 1.1.6.
    8. Dodać GFP-HUVEC z roztworu podstawowego w rozcieńczeniu 1:66,67, aby uzyskać stężenie 1,5 x 105 komórek/ml, jak opisano dla hBM-MSCs w kroku 1.1.7.
  2. Odessać pożywkę z płytki zawierającej monokulturę zrębu, jak opisano w celu usunięcia buforu w kroku 1.2.2.
  3. Dodać 200 μl/basenik zawiesiny komórek GFP-HUVEC przygotowanej w kroku 2.1.8, jak opisano dla dodawania hBM-MSC w kroku 1.3.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze. Zmieniaj podłoże co 3-4 dni.
  5. Monitoruj rozwój kultury za pomocą mikroskopii jasnego pola i mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu obiektywu 5x, zgodnie z potrzebami. Utrzymuj kultury do 4 lub 7 dnia kohodowli w celu uzyskania odpowiednio wczesnej lub pośredniej charakterystyki lub zgodnie z życzeniem.

3. Procedura charakterystyki 1: Kwantyfikacja tworzenia sieci komórek śródbłonka

  1. W żądanych punktach czasowych uzyskaj sygnał GFP z GFP-HUVEC za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, używając ustawień odpowiednich do kwantyfikacji (tj. najlepsza ostrość, wysoki kontrast i małe powiększenie [np. 5x] dla większych pól widzenia).
  2. Wstępnie przetrzymuj równomiernie wszystkie obrazy zrobione tego samego dnia (np. przy użyciu Fiji32), aby jeszcze bardziej zwiększyć kontrast. Należy pamiętać, że sygnał GFP może stać się ciemniejszy wraz z czasem hodowli; W związku z tym obrazy uzyskane w różnych dniach mogą wymagać różnej obróbki.
    1. Jeśli korzystasz z Fidżi lub ImageJ, otwórz wszystkie obrazy kanału GFP w tym samym punkcie czasowym i otwórz menu Jasność i kontrast. Wybierz obraz, który reprezentuje stan pośredni (nie najciemniejszy i nie najjaśniejszy sygnał), a następnie automatycznie dostosuj kontrast, wybierając opcję Auto. Wybierz opcję Ustaw i zaznacz opcję Propaguj do wszystkich innych otwartych obrazów.
    2. Oceń wizualnie, czy automatycznie wybrany zakres pasuje do wszystkich obrazów w bieżącym punkcie czasowym, a następnie ręcznie dostosuj i ponownie propaguj do wszystkich obrazów zgodnie z potrzebami.
    3. Zapisz skorygowane obrazy jako pliki TIF i powtórz kroki 3.2.1 i 3.2.2 dla pozostałych uzyskanych punktów czasowych.
  3. Zastosuj filtr rozmycia mediany (np. promień 3 dla obrazów o wymiarach 2048x2048) do wszystkich obrazów, aby uniknąć rozpoznawania artefaktów w dalszej kolejności, a tym samym ułatwić dokładną identyfikację sieci. Zmniejsz rozmiar przez kategoryzację (2x2) i zapisz wszystkie wstępnie przetworzone obrazy jako pliki TIF kolorów RGB w skali szarości w folderze w celu określenia ilościowego. Te kroki można wykonać ręcznie lub w trybie wsadowym przy użyciu makr, które autorzy udostępnią na żądanie.
  4. Przeanalizuj wszystkie obrazy w folderze utworzonym w krokach 3.1–3.3 przy użyciu trybu procesu wsadowego w analizatorze angiogenezy dla ImageJ33. Należy pamiętać, że w zależności od rozmiaru obrazów i dostępnej pamięci roboczej może to potrwać kilka minut na obraz.
  5. Zweryfikuj wyniki kwantyfikacji, badając nakładki rozpoznanych struktur i oryginalnych obrazów. Jeśli algorytm rozpoznaje sztuczne struktury, w których na oryginalnym obrazie widać tylko kilka komórek lub nie ma ich wcale, dostosuj parametry przetwarzania wstępnego i ponownie przeanalizuj oryginalne obrazy lub wyklucz takie problematyczne obszary i/lub powtórz obrazy z analizy.
  6. Znormalizować uzyskane wartości do obszaru 1 mm2 , mnożąc wartości każdej próbki przez stosunek analizowanego obszaru do 1 mm2. Ten krok ma szczególne znaczenie, jeśli używane są obrazy o różnych rozmiarach.
  7. Wyodrębnij z analizy różne parametry sieci, takie jak całkowita długość sieci, liczba połączeń, liczba segmentów, liczba izolowanych segmentów, odstęp rozgałęzień i średni rozmiar siatki, i użyj ich do scharakteryzowania sieci śródbłonka w różnych punktach czasowych i w różnych warunkach hodowli.

4. Procedura charakterystyki 2: Ocena depozycji ECM

  1. W żądanych końcowych punktach czasowych oceń odkładanie się ECM za pomocą immunofluorescencji. Dodać pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko różnym cząsteczkom ECM w 100 μl pożywki hodowlanej w ciągu ostatnich 6 godzin hodowli lub po utrwaleniu, jak opisano poniżej.
    1. Przemyć kultury raz 200 μl/studzienkę PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej i utrwalić je 100 μl/studzienką 4% paraformaldehydu pod dygestoriami chemicznymi przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że zaleca się naprawę wszystkich studzienek płytki w tym samym czasie, ponieważ otaczające kultury mogą zostać uszkodzone na tym etapie. Przemyć utrwalone kultury 200 μl/basenik PBS w temperaturze pokojowej trzy razy przez 5 minut za każdym razem i przechowywać w temperaturze 4 °C w 200 μl/basenik PBS lub natychmiast przejść do następnego etapu.
    2. Przed inkubacją z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko cząsteczkom ECM po utrwaleniu, należy inkubować utrwalone kultury z 200 μl/basenik 1% BSA w PBS jako roztwór blokujący przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      1. Odessać roztwór blokujący i inkubować ze 100 μl/basenik roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w 1% BSA w PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Przemywać 200 μl/basenik PBS trzy razy przez 5 minut, co najmniej 3 godziny i 5 minut, odpowiednio w temperaturze RT.
        UWAGA: Długi etap płukania jest wymagany do całkowitej dyfuzji niezwiązanego przeciwciała z hydrożelu.
    3. Aby ułatwić przenikanie wtórnego roztworu barwiącego, w tym wewnątrzkomórkowych przeciwbarwników, należy przepuszczać kultury przy użyciu 0,3% Triton X-100 i 1% BSA w PBS przez 30-90 min w temperaturze pokojowej, w zależności od gęstości komórkowej kultur.
      UWAGA: W przypadku barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych na podstawie przeciwciał, etap ten należy wykonać przed inkubacją z pierwszorzędowym przeciwciałem opisanym w kroku 4.1.2.
    4. Przygotować wtórne roztwory barwiące zawierające odpowiednie przeciwciała drugorzędowe i przeciwbarwniki zgodnie z życzeniem (np. barwienie jądrowe, takie jak DAPI i barwienie cytoszkieletu, takie jak falloidyna-rodamina).
      1. Przygotować bufor barwiący składający się z 0,1% Triton X-100, 1% BSA w PBS i barwników przeciwstawnych (np. 1 μg/ml DAPI i 1:4 000 falloidyny-rodaminy) i dodać odpowiednie przeciwciała drugorzędowe w zalecanych rozcieńczeniach.
      2. Dodać 100 μl/basenik wtórnego roztworu barwiącego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Podobnie jak w procedurze po inkubacji przeciwciał pierwotnych, przemyć 200 μl/basenik PBS trzy razy przez 5 minut, co najmniej 3 godziny i 5 minut, odpowiednio w temperaturze pokojowej.
    5. Aby uzyskać rozdzielczość 3D struktur, należy uzyskać stosy konfokalne zaczynające się od szklanego dna z krokiem z 2,5 μm, osiągając końcową wysokość 500 μm, użyć obiektywu 10x i zoomu cyfrowego 0,75x. Aby wygenerować rekonstrukcję 3D sygnału GFP i F-aktyny na Fidżi, należy ustawić próg każdego kanału osobno przed utworzeniem kompozytu i wygenerowaniem rekonstrukcji za pomocą przeglądarki Fiji 3D Viewer.
    6. W celu wizualizacji zdeponowanego ECM z barwień immunologicznych należy uzyskać stosy konfokalne o wysokości 100 μm z krokiem z 5 μm, obiektywem 10x i zoomem cyfrowym 1,5x. Generuj projekcje o maksymalnej intensywności i dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału osobno na Fidżi przed utworzeniem kompozytu.
  2. Wykonaj bezpośrednie barwienie kolorystyczne środowiska zewnątrzkomórkowego.
    1. Dodać 200 μl/studzienkę roztworu barwiącego Picrosirius Red do studzienek utrwalonych paraformaldehydem i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    2. Następnie umyj poplamione studzienki pięć razy wodą destylowaną, a następnie myj dwa razy dziennie lub co drugi dzień przez 3-4 dni, monitorując oczyszczanie koloru próbki. Utrzymuj płytki w temperaturze 4 °C podczas długich etapów mycia (tj. dłużej niż 6 godzin).
    3. Uzyskuj obrazy barwionych próbek za pomocą mikroskopu jasnego pola wyposażonego w kolorową kamerę i utrzymuj równy balans bieli we wszystkich warunkach. Aby uzyskać przegląd próbek, użyj małego powiększenia (np. 2,5x), aby zeskanować całą studnię. Jeśli do mikroskopu nie jest dołączone oprogramowanie obsługujące automatyczne zszywanie, należy to zrobić ręcznie (np. za pomocą funkcji Pairwise Stitching w Fiji34).
      UWAGA: Studzienki używane wcześniej do immunofluorescencji mogą być do tego wykorzystane, pod warunkiem, że akwizycja obrazu fluorescencji zostanie zakończona.
    4. Wykonaj te same czynności, które opisano dla barwienia Picrosirius Red w krokach 4.2.1-4.2.3, aby wykonać barwienie, mycie i obrazowanie Alizarin Red.

5. Procedura charakterystyki 3: Ocena różnicowania osteogennego poprzez monitorowanie aktywności ALP

  1. W różnych końcowych punktach czasowych hodowli (np. dzień 4 i dzień 7 kohodowli) należy ocenić ilościowo aktywność ALP, stosując barwienie fosforanem 5-bromo-4-chloro-3-indolylu (BCIP)/błękitem nitro tetrazolowym (NBT).
    1. Przemyć kultury raz 200 μl/basenik PBS przed inkubacją z roztworem substratu BCIP/NBT, który należy przygotować zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować w temperaturze 37 °C, okresowo monitorując rozwój koloru. Gdy kolor zacznie się rozwijać w warunkach nieosteogennych, natychmiast przemyj raz 200 μl/studzienkę PBS, a następnie utrwal 4% paraformaldehydu, jak opisano w kroku 4.1.1.
    2. Uzyskaj kolorowe obrazy barwionych próbek, zgodnie z opisem w kroku 4.2.3 dla barwienia Picrosirius Red.
  2. W różnych punktach czasowych zakończenia hodowli (np. 4. i 7. dzień kohodowli) określ ilościowo aktywność ALP w lizatach komórkowych.
    1. Przemyć kultury trzykrotnie 200 μl/basenik PBS przed inkubacją z 200 μl/basenik 0,25% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C. Co 10 minut mieszać kultury, energicznie pipetując w górę iw dół, aby ułatwić trawienie, i monitorować morfologię kultur za pomocą standardowego mikroskopu do hodowli komórkowych.
    2. Po uzyskaniu płynnej, jednokomórkowej zawiesiny bez wydłużonych struktur komórkowych w studzienkach (zwykle po 20-30 minutach), przenieś próbki do probówek o pojemności 2 ml, dodaj 200 μl podłoża podstawowego MSC w celu zahamowania trypsyny i odwiruj przy 500 x g przez 5 minut w celu osadzenia pobranych komórek. Zdekantować supernatant i zamrozić granulki w temperaturze -80 °C lub przejść bezpośrednio do kroku 5.2.3.
    3. Rozmrozić osadki komórkowe otrzymane w kroku 5.2.2 i inkubować z 500 μl buforu do lizy składającego się z 0,56 M 2-amino-2-metylo-1-propanolu, 0,2% Triton X-100, pH 10, przez 30 minut na lodzie. Następnie odwirować przy 16 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i utrzymać próbki na lodzie. Po dokonaniu pomiarów opisanych w kroku 5.2.7 należy zamrozić próbki w temperaturze -20 °C lub -80 °C lub bezpośrednio kontynuować kwantyfikację DNA, jak opisano w kroku 5.2.8.
      UWAGA: Bufor do lizy można przygotować z wyprzedzeniem, sterylnie przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotować odczynnik ALP składający się z 20 mM sześciowodnej soli disodowej fosforanu 4-nitropenylu i 4 mM MgCl2 w buforze do lizy.
      UWAGA: Najlepiej jest przygotować ten roztwór na świeżo w dniu oznaczania ilościowego.
    5. Nie naruszając żadnych granulowanych zanieczyszczeń, należy dozować 50 μl supernatantu z lizatu komórkowego przygotowanego w kroku 5.2.3 do studzienek standardowej, przezroczystej 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w dwóch egzemplarzach. Dodaj bufor do lizy do dwóch studzienek jako ślepe kontrole.
    6. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl/studzienkę odczynnika ALP do studzienek wypełnionych w kroku 5.2.5. Krótko wstrząsnąć płytką i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, chroniąc przed światłem. Studnie o wyższej aktywności ALP będą miały kolor żółty. Zatrzymać reakcję, dodając 100 μl/basenik 1 M NaOH za pomocą pipety wielokanałowej.
    7. Odczytaj gęstość optyczną przy 410 nm za pomocą czytnika płytek. Uśrednij duplikaty techniczne i odejmij średnią ślepych kontrolek.
    8. Wykonaj kwantyfikację DNA, aby znormalizować aktywność ALP oznaczoną w poprzednich krokach w stosunku do całkowitej liczby komórek. W tym miejscu opisano metodę opartą na pomiarach fluorescencji, ale każda inna metoda oznaczania ilościowego DNA w lizatach komórkowych jest zgodna z testem. Przygotować odczynniki i wzorce DNA wymagane do kwantyfikacji DNA przy użyciu dostępnych w handlu zestawów zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Do przygotowania wzorców DNA zaleca się stosowanie buforu do lizy.
    9. Jeżeli próbki użyte do oznaczania ilościowego ALP opisanego w kroku 5.2.3 zostały zamrożone, należy je rozmrozić, odwirować przy 16 100 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i umieścić na lodzie. Nie naruszając żadnych granulowanych zanieczyszczeń, dozować 50 μl supernatantu lizatu komórkowego do studzienek czarnej 96-dołkowej płytki w dwóch egzemplarzach. Zamrażać próbki w temperaturze -20 °C lub -80 °C i w razie potrzeby powtórzyć oznaczanie ilościowe ALP i DNA. Dodaj wzorce DNA w dwóch egzemplarzach.
    10. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 μl środka barwiącego DNA, inkubuj i odczytaj intensywność fluorescencji zgodnie z instrukcjami producenta. Korzystając ze standardowych wartości krzywej, określ i zastosuj konwersję zmierzonych wartości intensywności do stężeń DNA.
    11. Znormalizować wartości ALP uzyskane w kroku 5.2.7, dzieląc je przez odpowiednie stężenie DNA w każdej próbce.

6. Aplikacja 1: Wykonywanie testów wrażliwości na leki

  1. Gdy sieci śródbłonka są w pełni rozwinięte (zwykle w 4 dniu kohodowli komórek zrębu i śródbłonka), dodaj związki antyangiogenne, takie jak bewacyzumab, do kultur w świeżej pożywce hodowlanej i przetestuj ich aktywność w czasie i w różnych warunkach (np. różne stężenia FGF-2 lub BMP-2).
    1. Przygotować świeżą pożywkę hodowlaną zawierającą te same czynniki wzrostu, które do tego momentu były stosowane w odpowiednich kulturach.
      1. Przygotować roztwór kontrolny składający się z rozcieńczalnika związku będącego przedmiotem zainteresowania (np. dla bewacyzumabu: 60 mg/ml dwuwodnego α-trehalozy, 0,4 mg/ml Tween20, 5,8 mg/ml fosforanu sodu jednozasadowego i jednowodnego oraz 1,2 mg/ml dwuzasadowego fosforanu sodu, bezwodnego) i sterylnie przefiltrować.
      2. Dodać interesujący związek o pożądanym stężeniu (np. 10 μg/ml bewacyzumabu) i równą objętość roztworu kontrolnego do pożywki przeznaczonej odpowiednio dla warunków badania i kontroli.
  2. Odessać pożywkę z kultury i dodać 200 μl/basenik pożywki świeżo przygotowanej w kroku 6.1.1. Inkubować przez czas odpowiedni dla badanego związku (np. dla bewacyzumabu: 2 dni). Monitoruj rozwój kultury i scharakteryzuj sieci śródbłonka zgodnie z opisem w sekcji 3. Oceń skuteczność związku w hamowaniu angiogenezy lub ablacji wstępnie uformowanych struktur za pomocą obrazów GFP i ilościowych parametrów sieci wyodrębnionych z analizy opisanej w kroku 3.7.

7. Aplikacja 2: Tworzenie zaawansowanych systemów kohodowli z różnymi typami komórek nowotworowych

  1. W 4 dniu kohodowli, kiedy sieci śródbłonka są już w większości ustalone, dodaj inne typy komórek, takie jak komórki rakowe MDA-MB-231 lub U2OS, do kultur w świeżej pożywce hodowlanej.
    1. Oznacz komórki rakowe za pomocą żywego barwnika kompatybilnego z komórkami zgodnie z instrukcjami producenta, aby móc je odróżnić od HUVEC znakowanych GFP i nieznakowanych hBM-MSC w kokulturach.
    2. Przygotować zawiesinę komórek nowotworowych o stężeniu 1,5 x 104 komórek/ml w świeżej pożywce zawierającej te same czynniki wzrostu, które do tego czasu były stosowane w odpowiednich hodowlach.
  2. Monitoruj rozwój kultury i lokalizację komórek rakowych zgodnie z potrzebami.
    UWAGA: W zależności od rodzaju, aktywności i środowiska może minąć kilka dni, zanim dotrą do struktur naczyniowych w kokulturach komórek zrębu i śródbłonka (np. 2 dni w przypadku MDA-BM-231 i U2OS). Dlatego obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji interakcji rak-komórka naczyniowa powinno być odpowiednio zaplanowane.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niszowe hodowle naczyniowe zostały założone przez sekwencyjne wysiewanie hBM-MSC i GFP-HUVEC na prefabrykowanych hydrożelach na bazie PEG z gradientem sztywności w 96-dołkowej płytce obrazowej (Rysunek 1). Kultury monitorowano podłużnie za pomocą żywej mikroskopii epifluorescencyjnej, a następnie charakteryzowano w wybranych punktach czasowych. Przedział zewnątrzkomórkowy oceniano za pomocą bezpośrednich barwień kolorowych i barwienia na bazie przeciwciał. Aktywność ALP określono ilościowo po pobraniu i lizie komórek z wygenerowanych nisz. Ponadto wykazaliśmy przydatność tej platformy do oznaczania wrażliwości na leki antyangiogenne oraz jako podstawy dla modeli kohodowli nowotworów.

Współhodowle hBM-MSC i HUVEC wykazujących ekspresję GFP zostały założone przez wysiew 3 x 104 komórek/studnię przy braku czynników wzrostu lub w obecności FGF-2 lub BMP-2 przy 50 ng/ml, jak opisano w protokole. Od samego początku różnice między kulturami można było zaobserwować zarówno na obrazach jasnego pola, jak i fluorescencji, pokazujących tylko GFP-HUVEC (Rysunek 2A). Obserwując te same obszary wzdłużnie, można było zauważyć różnice w rozwoju kultur, takie jak szybszy rozwój w obecności FGF-2. Ogólnie rzecz biorąc, kultury wydawały się mniej rozwinięte przy braku jakiegokolwiek czynnika wzrostu, z mniejszą liczbą rozprzestrzeniających się komórek obu typów i obecnością obszarów bezkomórkowych. W przeciwieństwie do tego, obrazy w jasnym polu pokazały najgęstsze kultury w obecności BMP-2. Jednak sieci naczyniowe powstały zarówno w warunkach zawierających czynnik wzrostu, a najbardziej rozległe i wzajemnie połączone sieci powstały z FGF-2. Te zaobserwowane różnice można również określić ilościowo za pomocą analizatora angiogenezy dla ImageJ. Rzeczywiście, całkowita długość sieci była największa w obecności FGF-2 i najniższa przy braku czynników wzrostu (Rysunek 2B). Liczba węzłów wskazujących punkty rozgałęzień w sieciach była zgodna z tym samym trendem, co długość całkowita (Rysunek 2C). I odwrotnie, oba warunki zawierające czynnik wzrostu charakteryzowały się znacznie mniejszą liczbą izolowanych segmentów, co wskazuje na wyższe wzajemne połączenia, niż warunki bez żadnego czynnika wzrostu (Rysunek 2D). Dodatkowo, obrazowanie konfokalne 3D wykazało silniejszą penetrację komórek śródbłonka pod względem głębokości w stanie stymulowanym FGF-2 (Ryc. 2E).

hBM-MSC/GFP-HUVEC kokultury były utrzymywane przez 7 dni w obecności FGF-2 lub BMP-2, zanim zostały utrwalone i wybarwione pod kątem komponentów ECM. Barwienia immunocytochemiczne, a następnie konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa wykazały uderzające różnice w morfologii hodowli w zależności od rodzaju suplementacji czynnikiem wzrostu (Figura 3A). W przypadku FGF-2 hodowla została zorganizowana w skondensowane struktury mikrokrążeniowe, które były gęste zarówno w komórkach śródbłonka, jak i mezenchymalnych, podczas gdy w obecności BMP-2 hBM-MSC obejmowały znacznie większy obszar, jak wynika z bardziej rozległych obszarów F-aktyno-dodatnich i GFP-ujemnych. Białka ECM fibronektyna i kolagen I były zlokalizowane w podobny sposób, podczas gdy laminina i kolagen IV były bardziej skoncentrowane wokół struktur śródbłonka. Jednak to zwiększone stężenie wokół struktur śródbłonka było znacznie bardziej wyraźne w obecności FGF-2 niż w obecności BMP-2. Oprócz barwienia opartego na przeciwciałach, przeprowadzono bezpośrednie barwienie kolorem w celu oceny ogólnego stanu zwłóknienia ECM (barwienie czerwienią Picrosiriusa; Rysunek 3B), a także osadzanie się Ca na ECM (barwienie czerwienią alizarynową; Rysunek 3C) utworzonych wnęk. Barwienie czerwienią Picrosirius było silniejsze i bardziej rozległe w niszach hodowanych z BMP-2, a barwienie czerwienią alizarynową podążało za tym samym trendem.

Następnie, kultury zostały scharakteryzowane pod względem ich potencjału osteogennego, oceniając aktywność ALP jako wczesny marker osteogenny. W 4 i 7 dniu kohodowli komórki zostały pobrane z nisz poprzez trawienie hydrożeli z trypsyną. Aby określić ilościowo aktywność ALP, pobrane komórki poddano lizie i przeprowadzono test pNPP. Uzyskane wartości zostały znormalizowane w stosunku do całkowitego DNA dla każdej próbki, aby uwzględnić potencjalne różnice w liczbie komórek w różnych warunkach. Rzeczywiście, można było zaobserwować niewielkie różnice między zawartością DNA w tych warunkach, a najmniej komórek zostało pobranych ze stanu bez żadnego czynnika wzrostu (nie pokazano). Znormalizowana aktywność ALP różniła się jednak znacznie w zależności od warunków, z tendencją do wzrostu aktywności przy wyższych stężeniach BMP-2 i plateau na poziomie 100 ng / ml (Rysunek 4A,B). Najniższe poziomy aktywności stwierdzono dla stanu zawierającego 50 ng/ml FGF-2. Chociaż podobne tendencje można było zaobserwować w obu ocenianych punktach czasowych, wszystkie wartości znacznie wzrosły w czasie w kulturze od dnia 4 do dnia 7. Oprócz testu ilościowego, aktywność ALP można jakościowo zwizualizować za pomocą bezpośredniego barwienia kolorem w oparciu o konwersję substratu BCIP/NBT. Bardziej rozległe i intensywniejsze purpurowe zabarwienie zaobserwowano w obecności BMP-2 w porównaniu z FGF-2 (Figura 4C).

Aby zademonstrować dwa potencjalne zastosowania scharakteryzowanych nisz osteogennych, przeprowadzono badanie potwierdzające słuszność koncepcji wrażliwości na leki i ko-hodowle raka. W celu oznaczenia wrażliwości na lek bewacyzumab lub roztwór kontrolny składający się z rozcieńczalnika postaci bewacyzumabu dodano do pożywki hodowlanej zawierającej świeży BMP-2. W 4 dniu, gdy utworzono ustalone sieci w obecności 50 ng / ml BMP-2, podczas regularnej zmiany pożywki dodano roztwór kontrolny lub pożywkę zawierającą bewacyzumab, a kultury monitorowano za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Dodanie 10 μg/ml bewacyzumabu doprowadziło do retrakcji lub ablacji wcześniej utworzonej sieci, podczas gdy stan kontrolny nadal charakteryzował się rozległymi sieciami 2 dni po zmianie pożywki (Figura 5A, B). Zmiany te można również określić ilościowo, śledząc całkowitą długość sieci za pomocą Angiogenesis Analyzer for ImageJ na obrazach fluorescencyjnych pozyskiwanych codziennie (Rysunek 5C). Alternatywnie, bewacyzumab lub jakikolwiek inny związek może być również dodawany od początku kohodowli, aby ocenić ich wpływ na tworzenie sieci. W przypadku bewacyzumabu całkowicie zahamowało to tworzenie sieci śródbłonka (nie wykazano).

Dla drugiego zastosowania, komórki raka piersi MDA-MB-231 lub kostniakomięsaka U2OS zostały dodane do kokultur dnia 4 w gęstości 1,5 x 103 komórek/studzienkę w świeżej pożywce zawierającej 50 ng/ml BMP-2. Aby odróżnić je od HUVEC znakowanych GFP i nieznakowanych hBM-MSC, komórki rakowe inkubowano za pomocą CellTrace FarRed tuż przed wysiewem do nisz osteogennych. Hodowle monitorowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; Na początku większość komórek nowotworowych znajdowała się blisko powierzchni podłoża, ale po 2 dniach można je było znaleźć w bliższej odległości od warstw zawierających kokultury naczyniowe. W związku z tym dzień 2 został wybrany jako punkt wyjścia dla mikroskopii poklatkowej, aby pokazać dynamikę interakcji między komórkami rakowymi a komórkami w niszy naczyniowej. Co ciekawe, komórki MDA-MB-231 można było zaobserwować zarówno zbliżając się, jak i oddalając od struktur śródbłonka, a zatem prawdopodobnie sondowały lub przebudowywały swoje środowisko (Ryc. 5D). Używając CellTrace FarRed jako etykiety dla komórek rakowych, GFP jako etykiety dla HUVEC i dodatkowego barwienia dla F-aktyny, wszystkie typy komórek można było rozróżnić za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (Rysunek 5E).

figure-results-1
Rysunek 1: Proste podejście do niezawodnego generowania unaczynionych, osteogennych nisz. Prefabrykowane syntetyczne hydrożele o głębokim gradiencie sztywności pozwalają na generowanie kultur 3D poprzez sekwencyjne wysiewanie komórek bez konieczności bezpośredniej enkapsulacji. hBM-MSC są wstępnie hodowane przez 3 dni przed dodaniem HUVEC wykazujących ekspresję GFP. Hodowle są monitorowane poprzez wzdłużne pozyskiwanie sygnałów jasnego pola i GFP. W wybranych punktach czasowych nisze są dalej oceniane pod kątem ich osadzania się ECM i stanu osteogennego. Aktywność fosfatazy alkalicznej ocenia się poprzez bezpośrednie barwienie barwne oraz poprzez pobieranie komórek z nisz i przeprowadzanie testu pNPP na lizatach komórkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Stymulacja sieci naczyniowych za pomocą FGF-2 lub BMP-2. (A) Obrazy jasnego pola i fluorescencji (GFP) zostały uzyskane w 2, 4 i 6 dniu kohodowli komórek hodowanych przy braku czynników wzrostu lub w obecności FGF-2 lub BMP-2, oba przy 50 ng/ml. Pasek skali: 400 μm. (B-D) Ilościowe parametry sieci GFP-HUVEC zobrazowane w 4 dniu kohodowli, analizowane za pomocą Angiogenesis Analyzer for ImageJ. Dane są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu GraphPad Prism 9.5.1. Zwykłą jednoczynnikową ANOVA z testem wielokrotnych porównań Dunnetta przeprowadzono z n ≥ 4; * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. (E) Trójwymiarowe rekonstrukcje wygenerowane ze stosów konfokalnych (całkowita wysokość: 547,5 μm; z-krok: 2,5 μm) sygnałów GFP i F-aktyny dla warunków stymulowanych FGF-2- (górny rząd) i BMP-2- (dolny rząd). Podziałka skali: 300 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Indukcja delokalizowanego rozprzestrzeniania się hBM-MSC i depozycji ECM przez BMP-2. (A-C) Siedmiodniowe kokultury hodowane w obecności FGF-2 lub BMP-2 poddano (A) immunofluorescencji lub (B,C) bezpośredniemu barwieniu kolorem. (A) Kultury wybarwiono pod kątem F-aktyny i białek ECM: fibronektyny, lamininy, kolagenu I i kolagenu IV. Obrazy przedstawiają projekcje maksymalnej intensywności stosów konfokalnych (całkowita wysokość: 100 μm; krok z: 5 μm). Pasek skali: 200 μm. (B,C) Kultury barwiono przy użyciu (B) Picrosirius Red i (C) Alizarin Red. W górnym rzędzie znajdują się zszyte, całościowe widoki obrazów uzyskanych w powiększeniu 2,5x (podziałka skali: 1 000 μm), natomiast w dolnym rzędzie przedstawiono jedno pole widzenia uzyskane przy 5-krotnym powiększeniu (pasek skali: 400 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Biochemiczna ocena aktywności ALP indukowanej przez BMP-2 poprzez bezpośrednie barwienie kolorem. (A,B) Aktywność ALP została określona w lizatach komórkowych kultur hodowanych przy braku czynników wzrostu lub w obecności BMP-2 w różnych stężeniach lub FGF-2 przy 50 ng/ml przez (A) 4 dni lub (B) 7 dni wspólnej hodowli. Wykazano, że aktywność ALP jest znormalizowana do zawartości DNA w każdej próbce lizatu. Dane są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu GraphPad Prism 9.5.1. Zwykłą jednoczynnikową ANOVA z testem wielokrotnych porównań Dunnetta przeprowadzono przy n = 5; **** P < 0,0001. (C) Bezpośrednie barwienie aktywności ALP w niszach uprawianych w obecności 50 ng/ml FGF-2 lub BMP-2 przez 7 dni kohodowli. Obrazy po lewej stronie przedstawiają zszyte całościowe przeglądy obrazów uzyskanych w powiększeniu 2,5x (pasek skali: 1,000 μm), podczas gdy obrazy po prawej stronie przedstawiają jedno pole widzenia uzyskane przy 5-krotnym powiększeniu (pasek skali: 400 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Zastosowanie osteogennych, unaczynionych nisz w zaawansowanych modelach raka. (A) Sygnały GFP kultur hodowanych w obecności BMP-2 zostały zobrazowane w 4 dniu wspólnej hodowli, zanim przez 2 dni dodawano roztwór kontrolny (po lewej) lub bewacyzumab w stężeniu 10 μg/ml (po prawej), po czym kultury były ponownie obrazowane (6 dzień kohodowli). Pasek skali: 600 μm. (B) Obrazy w większym powiększeniu kultur leczonych bewacyzumabem pokazano w A. Pasek skali: 250 μm. (C) Całkowita długość sieci śródbłonka, jak pokazano w A, określono ilościowo za pomocą analizatora angiogenezy dla ImageJ z obrazów uzyskiwanych codziennie; n ≥ 3. (D) Komórki raka piersi MDA-MB-231 znakowane CellTrace FarRed dodano do 4-dniowych kultur kozależnych hodowanych w obecności BMP-2, a obrazy poklatkowe uzyskano począwszy od 2 dni po dodaniu komórek rakowych. Podziałka skali: 100 μm. (E) Projekcje maksymalnej intensywności stosów konfokalnych (całkowita wysokość: 70 μm; krok z: 2,4 μm) potrójnych kokultur wygenerowanych zgodnie z opisem w D i utrwalonych i wybarwionych dla F-aktyny. Po lewej: nisze z komórkami raka piersi MDA-MB-231; po prawej: nisze z komórkami kostniakomięsaka U2OS. Podziałka liniowa dla obrazów po lewej stronie: 200 μm; Podziałka skali dla obrazów po prawej: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy protokół tworzenia modelu in vitro wysoce unaczynionych nisz kostnych i szpiku kostnego w pełni syntetycznej i kontrolowanej matrycy 3D opartej na PEG, która ma różnorodne zastosowania w badaniach biologii kości i szpiku kostnego, inżynierii tkankowej i badaniach nad rakiem. Model ten opiera się na syntetycznym hydrożelu na bazie PEG, który jest funkcjonalizowany peptydami RGD i miejscami rozszczepienia MMP i jest odlewany z głębokim gradientem gęstości na 96-dołkowych płytkach obrazowych ze szklanym dnem30. Wykazano, że ta platforma plug-and-play umożliwia tworzenie wysoce połączonych ze sobą sieci komórkowych 3D bez konieczności kapsułkowania komórek w hydrożelu. Podobnie jak w przypadku wcześniej opisanego protokołu enkapsulacji komórek, w tej pracy pokazujemy przebudowę substratu przez ECM28 wbudowany w komórkę w celu stworzenia mikrośrodowiska specyficznego dla typu komórki. Dzięki tej metodzie można łatwo przeprowadzać badania przesiewowe leków i analizy o wysokiej zawartości w wysoce powtarzalnych, organotypowych warunkach hodowli 3D. 96-dołkowe płytki ze szklanym dnem i optycznie przezroczyste hydrożele sprawiają, że platforma jest kompatybilna z automatyzacją obsługi cieczy i mikroskopią o wysokiej przepustowości.

Pierwszym krokiem do wytworzenia osteogennej niszy naczyniowej szpiku kostnego jest wstępna hodowla hBM-MSC na hydrożelu PEG przez co najmniej 3 dni. W tym czasie przyczepiają się do hydrożelu, wnikają w niego i zaczynają nawiązywać kontakty komórka-komórka oraz odkładanie ECM. Przed rozmieszczeniem hBM-MSC należy usunąć bufor magazynu. Ponieważ hydrożel znajduje się wewnątrz wewnętrznej studzienki w standardowej studzience 96-dołkowej płytki obrazowej, można bezpiecznie włożyć końcówkę aspiracyjną wzdłuż boku studzienki, aż dotknie wewnętrznego pierścienia studzienki. Pompa próżniowa może być używana do zasysania, jeśli jest ustawiona na najniższą możliwą siłę ssania. Alternatywnie do zasysania buforu z płytki hydrożelowej można użyć automatycznej myjki płytkowej z wysokością dyszy dostosowaną do co najmniej 0,8 mm powyżej wewnętrznego pierścienia studzienki. Zastosowanie automatyzacji do obsługi cieczy może zminimalizować uszkodzenia powierzchni hydrożelu i prowadzić do większej odtwarzalności powstałych kultur. Małe defekty na powierzchni hydrożelu stają się widoczne, gdy komórki osiądą na hydrożelu i pojawiają się na niższej płaszczyźnie ogniskowania w uszkodzonych obszarach hydrożelu. W związku z tym uzyskanie obrazów referencyjnych w dniu 0 służy jako dobra kontrola jakości jednorodności wysiewu komórek i integralności powierzchni hydrożelu. Podczas gdy małe defekty powierzchni hydrożelu nie wykluczają dalszego korzystania ze studzienki, komórki mają tendencję do gromadzenia się w uszkodzonych obszarach i mogą wyrastać w niereprezentatywne wzory lub szybciej docierać do dolnej szklanki, gdzie rosną w monowarstwę. Artefakty te należy odnotować podczas użytkowania/oceny tych studni. Podobne względy mają zastosowanie do wszelkich zmian pożywki wykonywanych przez cały czas trwania testu.

Drugi etap protokołu polega na dodaniu GFP-HUVEC do wstępnie uformowanej monokultury hBM-MSC (dzień 0 kohodowli). ECM zdeponowany przez hBM-MSC stanowi doskonałe rusztowanie dla wzrostu komórek śródbłonka, które w tej pracy, nawet w obecności pożywki kondycjonowanej hBM-MSC, mogły tworzyć tylko okrągłe skupiska komórek na hydrożelach (nie pokazano). Po wysiewie na kulturach hBM-MSC, HUVEC integrują się i tworzą struktury przypominające mikronaczynia porównywalne do tych obserwowanych w kokulturach generowanych przez enkapsulację komórek27,28. Zazwyczaj dobrze rozwinięte sieci mikrokrążeniowe 3D tworzą się w ciągu 4 dni od kohodowli i można to monitorować wzdłużnie za pomocą HUVEC znakowanych GFP. Struktury te mogą być utrzymywane w hodowli przez co najmniej 7 dni, co oznacza, że jest wystarczająco dużo czasu, aby śledzić zmiany w organizacji sieci naczyniowej w odpowiedzi na leczenie, takie jak badania przesiewowe leków antyangiogennych. Elementy morfologiczne sieci śródbłonka można określić ilościowo w trybie wsadowym poprzez segmentację obrazów GFP przy użyciu dobrze znanych narzędzi, takich jak wtyczka Angiogenesis Analyzer firmy ImageJ33, a ich parametry można wykorzystać do oceny, na przykład, skuteczności leku i farmakodynamiki.

Istotną zaletą opisywanego modelu komórkowego dla wielu potencjalnych zastosowań jest jego plastyczność. Samo uzupełnienie pożywki hodowlanej różnymi czynnikami wzrostu może zmienić wygląd kokultury. Na przykład obecność BMP-2 w okresie mono- i kohodowli tworzy osteogenną niszę naczyniową, wykazując zwiększoną aktywność ALP, zewnątrzkomórkowe odkładanie się wapnia, a także składanie i odkładanie ECM. Wręcz przeciwnie, w obecności FGF-2 markery osteogenne są nieobecne, a kokultura tworzy mniej bocznych asocjacji komórkowych, ale wykazuje wyraźniejszy wzrost komórek 3D. Fakt, że FGF-2 hamuje aktywność ALP, podczas gdy BMP-2 wywołuje silniejszą aktywność ALP w porównaniu z brakiem leczenia czynnikiem wzrostu, jest zgodny z wcześniejszymi obserwacjami27. Jednak pomimo tych dużych różnic w komponencie zrębu hBM-MSC, zakres sieci mikronaczyniowej był bardzo podobny dla dwóch stanów leczonych czynnikiem wzrostu w tej pracy. W kulturach kontrolnych utworzyło się tylko kilka krótkich sieci naczyniowych, reprezentujących być może słabo unaczynioną niszę szpiku kostnego. Sugeruje to, że po prostu zmieniając rodzaj, stężenie i czas dodawania czynników wzrostu do pożywki hodowlanej, można wytworzyć szereg dobrze zdefiniowanych unaczynionych nisz szpiku kostnego, które byłyby wymagane w badaniach porównawczych. Jednakże, aby zapewnić powtarzalne wyniki, ważne jest, aby pamiętać, że progresja i morfologia hodowli mogą się różnić w zależności od historii użytych komórek (np. liczby pasaży i metody oddzielenia zastosowanej podczas rutynowego utrzymywania hodowli) i zaleca się kontrolę takich czynników podczas projektowania testu.

Tutaj, jako pierwsze zastosowanie tego modelu, demonstrujemy wrażliwość zmodyfikowanych sieci mikronaczyniowych na leczenie bewacyzumabem w stężeniu 10 μg/mL. W szczególności ważne jest, aby potwierdzić, że zastosowany algorytm może dokładnie rozpoznać sieć śródbłonka, ponieważ artefakty są często generowane na obrazach ze słabo rozwiniętymi sieciami. W takim przypadku parametry wykorzystywane do przetwarzania obrazu (przed i w trakcie segmentacji) muszą zostać dopracowane, często metodą prób i błędów.

Jako drugie zastosowanie przedstawiamy zaawansowany model kokultury utworzony przez sekwencyjne wysiewanie komórek mezenchymalnych, śródbłonka i nowotworowych. Model ten pozwala na badanie interakcji między komórkami nowotworowymi, zrębem i unaczynieniem szpiku kostnego, które mogą być ważnymi czynnikami podczas przerzutów. Ponadto model ten może być wykorzystywany do badań przesiewowych leków i testowania związków o celach wykraczających poza angiogenezę.

W hodowlach 2D komórki nie odbierają fizjologicznych sygnałów mikrośrodowiskowych, nie nabywają naturalnie występujących morfologii komórek, a w konsekwencji różnicują się inaczej w porównaniu z komórkami w natywnych środowiskach3D 35. Podczas hodowli w zmodyfikowanych hydrożelach 3D, komórki wcześnie osadzają nieodłączny ECM, który zapewnia miejsca adhezji i może być aktywnie przebudowywany 28,36. W tym przypadku, aby stworzyć uproszczony model 3D do zastosowań przesiewowych, komórki tworzące naczynia zostały wysiane na powierzchnię zmodyfikowanych hydrożeli i pozwolono na utworzenie sieci naczyniowych przy braku perfuzji. Oceny oparte na obrazowaniu przeprowadzono na projekcjach 2D komórek śródbłonka przyczyniających się do struktur naczyniowych. Jednak tylko obrazy konfokalne ujawniły mniej wyraźne wrastanie sieci naczyniowych 3D w próbkach stymulowanych przez BMP-2 w porównaniu z próbkami stymulowanymi FGF-2. Sugeruje to, że długość powstałych struktur naczyniowych była niedoszacowana, podczas gdy ich łączność była przeszacowana. Ponadto nie badano interakcji między komórkami okołonaczyniowymi i śródbłonka a tworzeniem światła naczyń. Aspekty te, zwłaszcza w odniesieniu do reakcji na leczenie odwykowe, będą wymagały dalszej uwagi. Wreszcie, pożądane byłyby udoskonalone protokoły, aby najpierw ustanowić rozległe sieci naczyniowe 3D, a dopiero potem indukować ich różnicowanie osteogenne, aby wygenerować więcej fizjologicznych modeli kości i szpiku kostnego.

Ogólnie rzecz biorąc, prezentowany tutaj model jest bardzo wszechstronny i można go łatwo dostosować do konkretnych zastosowań. Na przykład można wykorzystać komórki mezenchymalne i śródbłonka z różnych źródeł. Wiadomo, że MSCs tkanki tłuszczowej i MSCs pępowiny wyrażają różne czynniki angiogenne w porównaniu z BM-MSC i można je łatwo zastąpić jako alternatywny składnik zrębu37. Zamiast HUVEC można również zastosować komórki śródbłonka wyizolowane z już zdefiniowanych nisz szpiku kostnego. Można również ustanowić kokulturę z pochodzącymi od pacjenta, dopasowanymi komórkami mezenchymalnymi i śródbłonka szpiku kostnego do zastosowań w medycynie spersonalizowanej, jak ostatnio zasugerowano w przypadku unaczynionych kokultur mięśniowych38. Dodatkowo konstrukcja płytki hydrożelowej pozwala na wzdłużne monitorowanie hodowli zarówno za pomocą mikroskopii jasnego pola, jak i mikroskopii fluorescencyjnej, oferując w ten sposób użytkownikowi możliwość skrócenia lub wydłużenia czasu hodowli w zależności od zastosowania. Alternatywnie, gęstości komórek używane do wysiewu mogą być odpowiednio dostosowane, aby przyspieszyć lub opóźnić tworzenie się sieci komórkowej, jeśli potrzebne są krótsze lub dłuższe czasy obserwacji niż te w tym protokole. W każdym razie należy zachować ostrożność, aby uniknąć przerostu komórek w struktury przypominające arkusze, co może prowadzić do skurczenia się hydrożelu i ostatecznego oderwania komórek.

Wreszcie, przy użyciu tego modelu można wykonać szeroki zakres testów. Oprócz immunofluorescencji i mikroskopii wykonywanej w żywych lub utrwalonych hodowlach, kultury 3D mogą być trawione enzymatycznie, a komórki mogą być pobierane i poddawane dowolnemu testowi biochemicznemu. Tutaj pokazujemy oznaczanie aktywności ALP i kwantyfikację zawartości DNA w lizatach komórkowych za pomocą testów kolorymetrycznych/fluorometrycznych, ale system jest kompatybilny z wieloma innymi technikami, w tym PCR, RNAseq i proteomiką. Jeśli czułość pożądanego testu nie jest bardzo wysoka, można połączyć próbki z więcej niż jednego dołka, aby zwiększyć ilość próbki dostępnej do testu. Jeśli pożądane zastosowanie wymaga szybszego rozpuszczania żelu, można zastosować wytrząsanie orbitalne płytki w połączeniu z mniejszymi objętościami roztworu trawiennego, aby zapewnić tworzenie się wirów w studzienkach, zakładając, że wszystkie studzienki na płytce zostaną wykorzystane w ten sposób (żywe kultury są wrażliwe na takie ostre obchodzenie się). Podsumowując, przedstawiamy tutaj protokół, który, jeśli zostanie zastosowany zgodnie z opisem, gwarantuje wygenerowanie modelu in vitro , który podsumowuje kluczowe aspekty osteogennych nisz naczyniowych, ale jest również na tyle wszechstronny, że można go modyfikować pod kątem zastosowań dostosowanych do potrzeb klienta.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ectica Technologies AG jest producentem płytki studzienkowej z hydrożelem 3DProSeed i posiada interesy handlowe. Benjamin R. Simona i Martin Ehrbar są udziałowcami Ectica Technologies AG.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Riccardo Urbanetowi za pomoc techniczną przy urządzeniach do obsługi cieczy oraz Rodi Odabasi za wsparcie przy mikroskopii epifluorescencyjnej. Praca ta została sfinansowana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (granty o numerach 310030E_202429 i 205321_204318) oraz Ectica Technologies AG.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% Trypsyna-EDTAGibco25200-072
2 ml mikroprobówkiEppendorf30120094
2-amino-2-metylo-1-propanolSigmaA9199
3DProSeed hydrożelowa płytka studzienkowaEctica TechnologiesECT. PS1.001.096
Sześciowodna sól disodowa fosforanu 4-nitrofenyluSigma71768
Alizarin Red SSigmaA5533
Przeciwciało antykolagenowe IVAbcamab6311
Przeciwciało anty-Laminin 1 + 2Abcamab7463
Automatyczna myjka do płytAgilent BiotekELχ 50
Automatyczna myjka/dozownikAgilent BiotekMULTIFLO FX wyposażony w pompę perystaltyczną Kaseta
BevacizumabIdentyfikator dowodowyPS-E07-2019-00119 A009
BMP-2Peprotech120-02C
BSAAppliChemA1391
WirówkaEppendorf5415 RDo wirowania probówek 2 ml przy 16100 x g podczas analizy ALP
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyLeicaStellaris 5
Stożkowe probówki wirówkowe 50 mlTPP91050
DAPISigmaD9542
DyLight 649 Przeciwciało anty-królicze IgG (minimalna reaktywność x) OsiołBiolegend406406
DyLight 649 Przeciwciało anty-mysie IgG (minimalna reaktywność x) KozaBiolegend405312
EGM-2LonzaCC-3162
Mikroskop epifluorescencyjnyLeicaDMI6000B
FBSGibco10500-064
FGF-2Peprotech100-18B
Fibronektyna (IST-9)Santa Cruzsc-59826
GFP-HUVECsPELOBiotechPB-CAP-0001GFP
hBM-MSCs-izolowany w Szpitalu Uniwersyteckim w Bazylei; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, i wsp. Ekspansja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębu ze świeżego szpiku kostnego w systemie opartym na rusztowaniu 3D pod bezpośrednią perfuzją. PLoS jeden. 2014; 9(7):e102359
Mikroskop odwróconyZeiss200M
Chlorek magnezuSigmaM8266
MDA-MB-231 linia komórkowa raka piersi-Uprzejmie uzyskana od J Massagu i ostrego; w Memorial Sloan-Kettering Cancer Center
MEMαGibco22571-038
Czytnik obrazowania wielomodowegoAgilent BiotekCytation 1Do automatycznego obrazowania
Czytnik obrazowania wielomodowego - fluorescencja i absorbancjaAgilent BiotekCytation 5Do pomiaru absorbancji i intensywności fluorescencji dzięki analizie ALP
ParaformaldehydArtechemisUS 040
PBSGibco10010-015
Penicylina/StreptomycynaGibco15140-122
Faloidyna-rodaminaInvitrogenR415
Picro-Sirius Red SolutionAbcamab246832
Quant-iT PicoGreen dsDNA Zestaw do oznaczaniaThermoFisher ScientificP7589
Rekombinowane przeciwciało anty-kolagenowe IAbcamab260043
SIGMAFAST BCIP/NBTSigmaB5655-25TAB
Wodorotlenek soduSigma1064981000
Fosforan sodu dwuzasadowy, bezwodnySigmaS-0876
Fosforan sodu jednozasadowy, monohydratMerck1.06346
Triton X-100SigmaT8787
Tween20AppliChemLinia komórkowa kostniakomięsaka A4974
U2OS-Uprzejmie uzyskana od J Snedekera w Instytucie Biomechaniki w Zurychu 
&alfa;-trehaloza dwuwodnaSigma90208
5uL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  2. Calvi, L. M., Link, D. C. Cellular complexity of the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Calcified Tissue International. 94 (1), 112-124 (2014).
  3. Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444(2018).
  4. Yip, R. K. H., et al. Mammary tumour cells remodel the bone marrow vascular microenvironment to support metastasis. Nature Communications. 12 (1), 6920(2021).
  5. Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 477-494 (2017).
  6. Augustin, H. G., Koh, G. Y. Organotypic vasculature: From descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science. 357 (6353), (2017).
  7. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  8. Barillari, G. The anti-angiogenic effects of anti-human immunodeficiency virus drugs. Frontiers in Oncology. 10, 806(2020).
  9. Owen, M., Friedenstein, A. J. Stromal stem-cells - Marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Foundation Symposia. 136, 42-60 (1988).
  10. Sacchetti, B., et al. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment. Cell. 131 (2), 324-336 (2007).
  11. Traore, M. A., George, S. C. Tissue engineering the vascular tree. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).
  12. Bessy, T., Itkin, T., Passaro, D. Bioengineering the bone marrow vascular niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 645496(2021).
  13. Bray, L. J., et al. A three-dimensional ex vivo tri-culture model mimics cell-cell interactions between acute myeloid leukemia and the vascular niche. Haematologica. 102 (7), 1215-1226 (2017).
  14. Montano, I., et al. Formation of human capillaries in vitro: The engineering of prevascularized matrices. Tissue Engineering Part A. 16 (1), 269-282 (2010).
  15. Sun, Z. Y., Kemp, S. S., Lin, P. K., Aguera, K. N., Davis, G. E. Endothelial k-RasV12 expression induces capillary deficiency attributable to marked tube network expansion coupled to reduced pericytes and basement membranes. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 42 (2), 205-222 (2022).
  16. Kleinman, H. K., et al. Basement-membrane complexes with biological-activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
  17. Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement-membrane in the morphological-differentiation of human-endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
  18. Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods in Molecular Biology. 1066, 17-28 (2013).
  19. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).
  20. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  21. Wang, X. L., et al. Engineering anastomosis between living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Lab on a Chip. 16 (2), 282-290 (2016).
  22. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
  23. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23 (1), 47-55 (2005).
  24. Kyburz, K. A., Anseth, K. S. Synthetic mimics of the extracellular matrix: How simple is complex enough. Annals of Biomedical Engineering. 43 (3), 489-500 (2015).
  25. Ehrbar, M., et al. Enzymatic formation of modular cell-instructive fibrin analogs for tissue engineering. Biomaterials. 28 (26), 3856-3866 (2007).
  26. Ehrbar, M., et al. Biomolecular hydrogels formed and degraded via site-specific enzymatic reactions. Biomacromolecules. 8 (10), 3000-3007 (2007).
  27. Blache, U., et al. Dual role of mesenchymal stem cells allows for microvascularized bone tissue-like environments in PEG hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5 (4), 489-498 (2016).
  28. Blache, U., et al. Notch-inducing hydrogels reveal a perivascular switch of mesenchymal stem cell fate. Embo Reports. 19 (8), e45964(2018).
  29. Simona, B. R., et al. Density gradients at hydrogel interfaces for enhanced cell penetration. Biomaterials Science. 3 (4), 586-591 (2015).
  30. Zhang, N., et al. Soft hydrogels featuring in-depth surface density gradients for the simple establishment of 3d tissue models for screening applications. SLAS Discovery. 22 (5), 635-644 (2017).
  31. Martin, I., Muraglia, A., Campanile, G., Cancedda, R., Quarto, R. Fibroblast growth factor-2 supports ex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow. Endocrinology. 138 (10), 4456-4462 (1997).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Carpentier, G., Martinelli, M., Courty, J., Cascone, I. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. 4th ImageJ User and Developer Conference. , Mondorf-les-Bains, Luxembourg. 198-201 (2012).
  34. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  35. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  36. Loebel, C., Mauck, R. L., Burdick, J. A. Local nascent protein deposition and remodelling guide mesenchymal stromal cell mechanosensing and fate in three-dimensional hydrogels. Nature Materials. 18 (8), 883-891 (2019).
  37. Curtis, M. B., Kelly, N., Hughes, C. C. W., George, S. C. Organotypic stromal cells impact endothelial cell transcriptome in 3D microvessel networks. Scientific Reports. 12 (1), 20434(2022).
  38. Wust, R., Terrie, L., Muntefering, T., Ruck, T., Thorrez, L. Efficient co-isolation of microvascular endothelial cells and satellite cell-derived myoblasts from human skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 964705(2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Vascularized Bone MarrowPEG Hydrogels3D Co CultureOsteogenic DifferentiationMesenchymal Stromal CellsEndothelial CellsFluorescence MicroscopyAlkaline Phosphatase ActivityBone Marrow NicheHigh Throughput Screening

Related Articles