Tutaj prezentujemy alternatywny protokół aktywnego wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy C57BL/6, przy użyciu immunogennej epitopowej oligodendrocytów glikoproteiny mielinowej (MOG)35-55 zawieszonej w niekompletnym adiuwancie Freunda zawierającym zabity termicznie Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Działanie adiuwantowe Mycobacterium paratuberculosis w zwiększaniu immunogenności autoantygenów podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) wywołane przez glikoproteinę oligodendrocytów mieliny (MOG) wymaga immunizacji peptydem MOG zemulgowanym w kompletnym adiuwantzie Freunda (CFA) zawierającym inaktywowane Mycobacterium tuberculosis. Antygenowe składniki prątków aktywują komórki dendrytyczne w celu stymulowania limfocytów T do produkcji cytokin, które promują odpowiedź Th1 za pośrednictwem receptorów toll-podobnych. W związku z tym ilość i gatunek prątków obecnych podczas prowokacji antygenowej są bezpośrednio związane z rozwojem EAE. W niniejszej pracy przedstawiono alternatywny protokół indukcji EAE u myszy C57BL/6 przy użyciu zmodyfikowanego niekompletnego adiuwanta Freunda zawierającego zabity termicznie szczep K-10 Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.
M. paratuberculosis, członek kompleksu Mycobacterium avium, jest czynnikiem wywołującym chorobę Johne'a u przeżuwaczy i został zidentyfikowany jako czynnik ryzyka kilku zaburzeń zależnych od ludzkich komórek T, w tym stwardnienia rozsianego. Ogólnie rzecz biorąc, myszy uodpornione Mycobacterium paratuberculosis wykazywały wcześniejszy początek i większe nasilenie choroby niż myszy uodpornione CFA zawierającym szczep M. tuberculosis H37Ra w tych samych dawkach 4 mg / ml. Determinanty antygenowe szczepu K-10 Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) były w stanie wywołać silną odpowiedź komórkową Th1 podczas fazy efektorowej, charakteryzującą się znacznie większą liczbą limfocytów T (CD4 + CD27 +), komórek dendrytycznych (CD11c+ I-A / I-E+) i monocytów (CD11b + CD115 +) w śledzionie w porównaniu z myszami uodpornionymi CFA. Co więcej, odpowiedź proliferacyjnych komórek T na peptyd MOG wydawała się być najwyższa u myszy uodpornionych M. paratuberculosis. Zastosowanie encefalitogenu (np. MOG35-55) zemulgowanego w adiuwancie zawierającym M. paratuberculosis w preparatuberculosis może być alternatywną i zwalidowaną metodą aktywacji komórek dendrytycznych do pobudzania limfocytów T CD4+ specyficznych dla epitopu mieliny podczas fazy indukcji EAE.
Wprowadzenie
Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest powszechnym modelem do badania ludzkich zaburzeń demielinizacyjnych1. Istnieje kilka modeli EAE: aktywna immunizacja przy użyciu różnych peptydów mieliny w połączeniu z silnymi adiuwantami, bierna immunizacja przez transfer in vitro specyficznych dla mieliny limfocytów CD4 + oraz transgeniczne modele spontanicznych EAE2. Każdy z tych modeli ma specyficzne cechy, które pozwalają na badanie różnych aspektów EAE, takich jak początek, faza efektorowa lub faza przewlekła. Model glikoproteiny mielinowej oligodendrocytów (MOG) EAE jest dobrym modelem do badania immunologicznych mechanizmów przewlekłego zapalenia nerwów i demielinizacji, ponieważ charakteryzuje się jednojądrzastym naciekiem zapalnym, demielinizacją obwodowej istoty białej i zmniejszoną regeneracją po szczycie choroby1.
MOG-EAE jest indukowane przez immunizację podatnych myszy peptydem MOG35-55 w pełnym adiuwantie Freunda (CFA), a następnie dootrzewnowe wstrzyknięcie toksyny krztuścowej. Zwiększa to przepuszczalność bariery krew-mózg i pozwala specyficznym dla mieliny limfocytom T aktywowanym na obrzeżach dotrzeć do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), gdzie zostaną ponownie aktywowane3. CFA odgrywa kluczową rolę w indukcji EAE poprzez zwiększenie wychwytu antygenu przez komórki prezentujące antygen oraz ekspresji cytokin związanych z odpowiedziami humoralnymi i komórkowymi4. Mechanizm ten wynika głównie z obecności zabitych Mycobacterium tuberculosis zemulgowanych w oleju, których składniki stanowią silny bodziec dla układu odpornościowego5. W rzeczywistości indukcja EAE jest bezpośrednio związana z ilością prątków obecnych podczas prowokacji antygenowej6.
Dodanie innych zabitych prątków, takich jak Mycobacterium butyricum, do niekompletnego adiuwantu Freunda class<="xref">7, jak również efekt kombinacji adiuwantów8, może modulować przebieg kliniczny EAE i w konsekwencji wpływać na odtwarzalność wyników. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), czynnik etiologiczny choroby Johne'a u przeżuwaczy, jest związany z zaburzeniami zapalnymi ludzkiego OUN9, ponieważ jego składniki antygenowe są zdolne do wywoływania silnej odpowiedzi humoralnej i komórkowej u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym i zaburzeniami ze spektrum nerwu wzrokowego9. Dlatego w niniejszym protokole pokazujemy alternatywną i powtarzalną metodę indukcji MOG-EAE poprzez zastąpienie M. tuberculosis w CFA M. paratuberculosis.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szkoły Medycznej Uniwersytetu Juntendo (numer zatwierdzenia 290238) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.
1. Ogólne uwagi na temat eksperymentu
- Myszy należy trzymać w indywidualnych klatkach w pomieszczeniu dla zwierząt w kontrolowanych, wolnych od patogenów warunkach w temperaturze 23 °C ± 2 °C przy wilgotności 50% ± 10% oraz 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem ad libitum do pożywienia i wody.
- Wstrzyknąć myszom sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez antygenu i CFA i użyć ich odpowiednio jako kontroli negatywnej i pozytywnej.
2. Przygotowanie antygenów mykobakteryjnych
- Hoduj szczep M. paratuberculosis K-10 w płynnym podłożu Middlebrook 7H9 wzbogaconym o 10% OADC (kwas oleinowy, albumina, dekstroza, katalaza), 0,005% Tween 80 i 2 mg/L mykobaktyny J przez 2 tygodnie w kolbach do hodowli tkankowych T25 w temperaturze 37 °C. Regularnie oceniaj wzrost kolonii poprzez oględziny.
UWAGA: Z M. paratuberculosis należy obchodzić się w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). - Hodować kulturę wzbogacającą w 500 ml kolby Erlenmeyera z zawiesiną 1,7 × 105 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml w końcowej objętości 200 ml (to samo podłoże co krok 2.1) w inkubatorze z wytrząsaniem przez 1 tydzień.
UWAGA: Ponieważ organizmy zanieczyszczające mogą wpływać na wyniki, bakterie muszą zostać zaszczepione na pożywce stałej Middlebrook 7H10 w celu określenia morfologii kolonii i sprawdzenia czystości za pomocą konwencjonalnych zestawów do wykrywania M. paratuberculosis za pomocą konwencjonalnych zestawów do wykrywania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). - Dezaktywować zawiesiny bakteryjne przez 5-10 minut w temperaturze 70 °C i odwirować przy 3 000 × g przez 10 minut. Zważony osad przemyć dwukrotnie w PBS, rozbić przez sonikację i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przenieś granulkę do sterylnego pojemnika i zamroź ją suchym lodem lub ciekłym azotem. Natychmiast przenieść do komory liofilizacji.
- Liofilizacja (4 h w temperaturze -50 °C w próżni) M. paratuberculosis zgodnie z instrukcją obsługi maszyny.
- Pod koniec liofilizacji wyjmij pojemnik ze stali nierdzewnej z liofilizatora i przenieś go na stół do czyszczenia biologicznego. Za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej usuń wysuszone grudki MAP przylegające do wewnętrznej ścianki pojemnika ze stali nierdzewnej i sproszkowaj je tak drobno, jak to możliwe.
- Zważyć sproszkowane komórki za pomocą wagi elektronicznej i ręcznie umieścić je w aseptycznej fiolce o pojemności 10 ml o stężeniu 10 mg/ml.
UWAGA: Gęstość komórek określono ilościowo w gramach suchej masy na litr próbki. Po 3 tygodniach 1 mg (mokra masa) osadu komórek bakteryjnych zawiera około 2,5 × 108 jtk.
3. Przygotowanie emulsji MOG 35-55
- Zawartość jednej fiolki suszonego M. paratuberculosis (10 mg) zmielić na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka i dodać 10 ml do niekompletnego adiuwanta Freunda w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 10 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -4 °C.
- Przed szczepieniem należy rozcieńczyć roztwór podstawowy do końcowego stężenia 4 mg/ml.
- Rozcieńczyć peptyd MOG35-55 w ddH2O do końcowego stężenia 2 mg/ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Za pomocą homogenizatora wymieszać roztwór MOG35-55 (2 mg/ml) z równą objętością adiuwantu (4 mg/ml) z etapu 3.2 w probówce o pojemności 5 ml, aż powstanie gęsta emulsja. Po każdych 10 sekundach mieszania umieść roztwór na lodzie na 20 s i odkręć rurkę, aby odzyskać cały roztwór.
- Przenieść emulsję do strzykawki o pojemności 1 ml, usunąć całe powietrze i dodać igłę 27 G. Emulsja jest teraz gotowa do wstrzykiwania.
NUTA. Ze względu na to, że podczas przygotowania dochodzi do pewnej utraty lepkiej emulsji MOG35-55, najlepiej jest przygotować 1,5-krotność potrzebnej ilości.
4. Szczepienia zwierząt
- Znieczulić zwierzęta inhalacją izofluranu, aby zminimalizować stres u zwierząt.
- Emulsję (200 μl zawierającą 200 μg/mysz MOG35-55) wstrzyknąć podskórnie w dolną część pleców.
- Dawkę toksyny krztuścowej (100 μl zawierającą 200 ng/mysz) należy podawać dootrzewnowo w dniach 0 i 2 po szczepieniu.
UWAGA: Toksyna krztuścowa ma wielorakie działanie supresyjne na układ odpornościowy; Unikać połknięcia i kontaktu z oczami i skórą.
5. Ocena kliniczna
- Codziennie monitoruj myszy pod kątem masy ciała i objawów klinicznych. Stosować następujący system punktacji: 0 = brak objawów klinicznych; 1 = wiotki ogon; 2 = upośledzenie odruchu prostowania i osłabienie kończyn tylnych; 3 = całkowity paraliż kończyn tylnych; 4 = całkowity paraliż kończyn tylnych z częściowym paraliżem kończyn przednich; 5 = konający.
UWAGA: Po wstępnej obserwacji objawów klinicznych zwierzętom zapewnia się zwiększony dostęp do wody i pożywienia. Karma dla gryzoni jest zmiękczana i nawilżana, a następnie umieszczana na podłodze klatki z zasobnika na żywność. W przypadku zwierząt odwodnionych podaje się podskórnie suplementację płynów lub podaje się gnojowicę z karmy dla gryzoni przez zgłębnik doustny. Jeśli mysz będzie wymagała tego typu pomocy przez ponad 3 dni, zostanie przeprowadzona eutanazja. - Aby uniknąć lub zminimalizować ból i stres zwierząt, należy zastosować następujące punkty końcowe u ludzi: utrata masy ciała większa niż 20%, wynik kliniczny ≥4,0, brak odruchu prostowania w wyniku 3 oraz gdy zwierzę nie jest w stanie uzyskać dostępu do paszy lub wody przez 24 godziny < br /> UWAGA: Myszy poddano eutanazji w 30 dniu po indukcji EAE poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcia pentobarbitalu (≥150 mg / kg).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Grupy myszy C57BL/6 (łącznie n = 15/grupa) zaszczepiono MOG35-55 w emulsji zawierającej M. paratuberculosis lub powszechną metodą z użyciem CFA. We wszystkich grupach myszy wystąpiła ostra choroba monofazowa charakteryzująca się pojedynczym szczytem niepełnosprawności obserwowanym w 14-17 dniu, po którym następowała częściowa poprawa objawów w ciągu kolejnych 10 dni (Rycina 1A). Myszy zaszczepione adiuwantem zawierającym M. paratubercu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wykazaliśmy solidny alternatywny protokół aktywnego wywoływania ciężkiego EAE u myszy C57BL / 6J przy użyciu peptydu MOG35-55 emulgowanego w adiuwantzie zawierającym M. paratuberculosis10. Indukcja EAE tą metodą skutkowała cięższą chorobą niż ta wywołana wspólnym protokołem z CFA. Różnica ta może wynikać z różnych składników lipidowych w ścianie komórkowej prątków11. W rzeczywistości, w przeciwieństwie do innych prątków, M. paratuberculosis wytw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca otrzymała wsparcie z grantu od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (grant nr. JP 23K14675).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| przeciwciało anty-mysie CD115 | Biolegend, USA | 135505 | do cytofluorymetrii 1:1,000 |
| przeciwciało anty-mysie CD11b | Biolegend, USA | 101215 | do cytofluorymetrii 1:1,000 |
| przeciwciało anty-mysie CD11c | Biolegend, USA | 117313 | do cytofluorymetrii 1:1,000 |
| przeciwciało anty-mysie CD16/32 Biolegend | , USA | 101302 | dla cytofluorymetria 1:1,000 |
| anty-mysie CD4 przeciwciało | Biolegend, USA | 116004 | do cytofluorymetrii 1:1,000 |
| przeciwciało anty-mysie CD8a | Biolegend, USA | 100753 | do cytofluorymetrii 1:1,000 |
| przeciwciało anty-mysie I-A/I-E Biolegend | , USA | 107635 | do cytofluorymetrii 1:1,000 |
| przeciwciało anty-mysie Ly-6C Biolegend | , USA | 128023 | do cytofluorymetrii 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | do izolacji i hodowli myszy, |
| C57BL/6J | , Charles River Laboratory, Japonia | 3 tygodnie, samiec i samica | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | do hodowli komórkowych, ciepły w temperaturze 37 &; C przed użyciem |
| Liofilizator | Eyela, Tokio, Japonia | FDU-1200 | do liofilizacji bakterii |
| niekompletna e Freund' s adiuwant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | do stosowania w adiuwantach |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | pomoc w rozwoju prątków |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | pochodzenia bydlęcego |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desuccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | do stosowania w adiuwantach |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | stymulator wzrostu | |
| Glikolipid oligodendrocytów mieliny (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | peptyd encefalotykogenny |
| Albumina jaja kurzego (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | antygen kontroli ujemnej do testu proliferacyjnego |
| Roztwór toksyny krztuścowej | Fujifilm Wako, Osaka Japonia | 168-22471 | Z bakterii Gram-ujemnych Bordetella pertussi, zwiększa przepuszczalność bariery krew-mózg |
| Homogenizator Polytron PT 3100 | Kinematica | do mieszania antygenu z adiuwantem | |
| RPMI 1640 z L-glutaminą | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | Do hodowli komórkowych |
| Tymidyna, [Metylo-3H], w 2% etanolu, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | do oznaczania proliferacji, stosowanie (1 μ Ci/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorymetria pod kątem żywotności komórek |
Bibliografia
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
- Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114(2013).
- Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064(2020).
- Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
- O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216(2017).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
- Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179(2017).
- Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477(2021).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
