Działanie adiuwantowe Mycobacterium paratuberculosis w zwiększaniu immunogenności autoantygenów podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy alternatywny protokół aktywnego wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy C57BL/6, przy użyciu immunogennej epitopowej oligodendrocytów glikoproteiny mielinowej (MOG)_35-55 zawieszonej w niekompletnym adiuwancie Freunda zawierającym zabity termicznie Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

Streszczenie

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) wywołane przez glikoproteinę oligodendrocytów mieliny (MOG) wymaga immunizacji peptydem MOG zemulgowanym w kompletnym adiuwantzie Freunda (CFA) zawierającym inaktywowane Mycobacterium tuberculosis. Antygenowe składniki prątków aktywują komórki dendrytyczne w celu stymulowania limfocytów T do produkcji cytokin, które promują odpowiedź Th1 za pośrednictwem receptorów toll-podobnych. W związku z tym ilość i gatunek prątków obecnych podczas prowokacji antygenowej są bezpośrednio związane z rozwojem EAE. W niniejszej pracy przedstawiono alternatywny protokół indukcji EAE u myszy C57BL/6 przy użyciu zmodyfikowanego niekompletnego adiuwanta Freunda zawierającego zabity termicznie szczep K-10 Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

M. paratuberculosis, członek kompleksu Mycobacterium avium, jest czynnikiem wywołującym chorobę Johne'a u przeżuwaczy i został zidentyfikowany jako czynnik ryzyka kilku zaburzeń zależnych od ludzkich komórek T, w tym stwardnienia rozsianego. Ogólnie rzecz biorąc, myszy uodpornione Mycobacterium paratuberculosis wykazywały wcześniejszy początek i większe nasilenie choroby niż myszy uodpornione CFA zawierającym szczep M. tuberculosis H37Ra w tych samych dawkach 4 mg / ml. Determinanty antygenowe szczepu K-10 Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) były w stanie wywołać silną odpowiedź komórkową Th1 podczas fazy efektorowej, charakteryzującą się znacznie większą liczbą limfocytów T (CD4 ⁺ CD27 ⁺), komórek dendrytycznych (CD11c⁺ I-A / I-E⁺) i monocytów (CD11b ⁺ CD115 ⁺) w śledzionie w porównaniu z myszami uodpornionymi CFA. Co więcej, odpowiedź proliferacyjnych komórek T na peptyd MOG wydawała się być najwyższa u myszy uodpornionych M. paratuberculosis. Zastosowanie encefalitogenu (np. MOG_35-55) zemulgowanego w adiuwancie zawierającym M. paratuberculosis w preparatuberculosis może być alternatywną i zwalidowaną metodą aktywacji komórek dendrytycznych do pobudzania limfocytów T CD4+ specyficznych dla epitopu mieliny podczas fazy indukcji EAE.

Wprowadzenie

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest powszechnym modelem do badania ludzkich zaburzeń demielinizacyjnych¹. Istnieje kilka modeli EAE: aktywna immunizacja przy użyciu różnych peptydów mieliny w połączeniu z silnymi adiuwantami, bierna immunizacja przez transfer in vitro specyficznych dla mieliny limfocytów CD4 ⁺ oraz transgeniczne modele spontanicznych EAE². Każdy z tych modeli ma specyficzne cechy, które pozwalają na badanie różnych aspektów EAE, takich jak początek, faza efektorowa lub faza przewlekła. Model glikoproteiny mielinowej oligodendrocytów (MOG) EAE jest dobrym modelem do badania immunologicznych mechanizmów przewlekłego zapalenia nerwów i demielinizacji, ponieważ charakteryzuje się jednojądrzastym naciekiem zapalnym, demielinizacją obwodowej istoty białej i zmniejszoną regeneracją po szczycie choroby¹.

MOG-EAE jest indukowane przez immunizację podatnych myszy peptydem MOG_35-55 w pełnym adiuwantie Freunda (CFA), a następnie dootrzewnowe wstrzyknięcie toksyny krztuścowej. Zwiększa to przepuszczalność bariery krew-mózg i pozwala specyficznym dla mieliny limfocytom T aktywowanym na obrzeżach dotrzeć do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), gdzie zostaną ponownie aktywowane³. CFA odgrywa kluczową rolę w indukcji EAE poprzez zwiększenie wychwytu antygenu przez komórki prezentujące antygen oraz ekspresji cytokin związanych z odpowiedziami humoralnymi i komórkowymi⁴. Mechanizm ten wynika głównie z obecności zabitych Mycobacterium tuberculosis zemulgowanych w oleju, których składniki stanowią silny bodziec dla układu odpornościowego⁵. W rzeczywistości indukcja EAE jest bezpośrednio związana z ilością prątków obecnych podczas prowokacji antygenowej⁶.

Dodanie innych zabitych prątków, takich jak Mycobacterium butyricum, do niekompletnego adiuwantu Freunda class<="xref">7, jak również efekt kombinacji adiuwantów⁸, może modulować przebieg kliniczny EAE i w konsekwencji wpływać na odtwarzalność wyników. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), czynnik etiologiczny choroby Johne'a u przeżuwaczy, jest związany z zaburzeniami zapalnymi ludzkiego OUN⁹, ponieważ jego składniki antygenowe są zdolne do wywoływania silnej odpowiedzi humoralnej i komórkowej u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym i zaburzeniami ze spektrum nerwu wzrokowego⁹. Dlatego w niniejszym protokole pokazujemy alternatywną i powtarzalną metodę indukcji MOG-EAE poprzez zastąpienie M. tuberculosis w CFA M. paratuberculosis.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szkoły Medycznej Uniwersytetu Juntendo (numer zatwierdzenia 290238) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.

1. Ogólne uwagi na temat eksperymentu

1. Myszy należy trzymać w indywidualnych klatkach w pomieszczeniu dla zwierząt w kontrolowanych, wolnych od patogenów warunkach w temperaturze 23 °C ± 2 °C przy wilgotności 50% ± 10% oraz 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem ad libitum do pożywienia i wody.
2. Wstrzyknąć myszom sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez antygenu i CFA i użyć ich odpowiednio jako kontroli negatywnej i pozytywnej.

2. Przygotowanie antygenów mykobakteryjnych

1. Hoduj szczep M. paratuberculosis K-10 w płynnym podłożu Middlebrook 7H9 wzbogaconym o 10% OADC (kwas oleinowy, albumina, dekstroza, katalaza), 0,005% Tween 80 i 2 mg/L mykobaktyny J przez 2 tygodnie w kolbach do hodowli tkankowych T25 w temperaturze 37 °C. Regularnie oceniaj wzrost kolonii poprzez oględziny.
   UWAGA: Z M. paratuberculosis należy obchodzić się w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
2. Hodować kulturę wzbogacającą w 500 ml kolby Erlenmeyera z zawiesiną 1,7 × 10⁵ jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml w końcowej objętości 200 ml (to samo podłoże co krok 2.1) w inkubatorze z wytrząsaniem przez 1 tydzień.
   UWAGA: Ponieważ organizmy zanieczyszczające mogą wpływać na wyniki, bakterie muszą zostać zaszczepione na pożywce stałej Middlebrook 7H10 w celu określenia morfologii kolonii i sprawdzenia czystości za pomocą konwencjonalnych zestawów do wykrywania M. paratuberculosis za pomocą konwencjonalnych zestawów do wykrywania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
3. Dezaktywować zawiesiny bakteryjne przez 5-10 minut w temperaturze 70 °C i odwirować przy 3 000 × g przez 10 minut. Zważony osad przemyć dwukrotnie w PBS, rozbić przez sonikację i przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Przenieś granulkę do sterylnego pojemnika i zamroź ją suchym lodem lub ciekłym azotem. Natychmiast przenieść do komory liofilizacji.
5. Liofilizacja (4 h w temperaturze -50 °C w próżni) M. paratuberculosis zgodnie z instrukcją obsługi maszyny.
6. Pod koniec liofilizacji wyjmij pojemnik ze stali nierdzewnej z liofilizatora i przenieś go na stół do czyszczenia biologicznego. Za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej usuń wysuszone grudki MAP przylegające do wewnętrznej ścianki pojemnika ze stali nierdzewnej i sproszkowaj je tak drobno, jak to możliwe.
7. Zważyć sproszkowane komórki za pomocą wagi elektronicznej i ręcznie umieścić je w aseptycznej fiolce o pojemności 10 ml o stężeniu 10 mg/ml.
   UWAGA: Gęstość komórek określono ilościowo w gramach suchej masy na litr próbki. Po 3 tygodniach 1 mg (mokra masa) osadu komórek bakteryjnych zawiera około 2,5 × 10⁸ jtk.

3. Przygotowanie emulsji MOG _35-55

1. Zawartość jednej fiolki suszonego M. paratuberculosis (10 mg) zmielić na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka i dodać 10 ml do niekompletnego adiuwanta Freunda w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 10 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -4 °C.
2. Przed szczepieniem należy rozcieńczyć roztwór podstawowy do końcowego stężenia 4 mg/ml.
3. Rozcieńczyć peptyd MOG_35-55 w ddH₂O do końcowego stężenia 2 mg/ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Za pomocą homogenizatora wymieszać roztwór MOG_35-55 (2 mg/ml) z równą objętością adiuwantu (4 mg/ml) z etapu 3.2 w probówce o pojemności 5 ml, aż powstanie gęsta emulsja. Po każdych 10 sekundach mieszania umieść roztwór na lodzie na 20 s i odkręć rurkę, aby odzyskać cały roztwór.
5. Przenieść emulsję do strzykawki o pojemności 1 ml, usunąć całe powietrze i dodać igłę 27 G. Emulsja jest teraz gotowa do wstrzykiwania.
   NUTA. Ze względu na to, że podczas przygotowania dochodzi do pewnej utraty lepkiej emulsji MOG_35-55, najlepiej jest przygotować 1,5-krotność potrzebnej ilości.

4. Szczepienia zwierząt

1. Znieczulić zwierzęta inhalacją izofluranu, aby zminimalizować stres u zwierząt.
2. Emulsję (200 μl zawierającą 200 μg/mysz MOG_35-55) wstrzyknąć podskórnie w dolną część pleców.
3. Dawkę toksyny krztuścowej (100 μl zawierającą 200 ng/mysz) należy podawać dootrzewnowo w dniach 0 i 2 po szczepieniu.
   UWAGA: Toksyna krztuścowa ma wielorakie działanie supresyjne na układ odpornościowy; Unikać połknięcia i kontaktu z oczami i skórą.

5. Ocena kliniczna

1. Codziennie monitoruj myszy pod kątem masy ciała i objawów klinicznych. Stosować następujący system punktacji: 0 = brak objawów klinicznych; 1 = wiotki ogon; 2 = upośledzenie odruchu prostowania i osłabienie kończyn tylnych; 3 = całkowity paraliż kończyn tylnych; 4 = całkowity paraliż kończyn tylnych z częściowym paraliżem kończyn przednich; 5 = konający.
   UWAGA: Po wstępnej obserwacji objawów klinicznych zwierzętom zapewnia się zwiększony dostęp do wody i pożywienia. Karma dla gryzoni jest zmiękczana i nawilżana, a następnie umieszczana na podłodze klatki z zasobnika na żywność. W przypadku zwierząt odwodnionych podaje się podskórnie suplementację płynów lub podaje się gnojowicę z karmy dla gryzoni przez zgłębnik doustny. Jeśli mysz będzie wymagała tego typu pomocy przez ponad 3 dni, zostanie przeprowadzona eutanazja.
2. Aby uniknąć lub zminimalizować ból i stres zwierząt, należy zastosować następujące punkty końcowe u ludzi: utrata masy ciała większa niż 20%, wynik kliniczny ≥4,0, brak odruchu prostowania w wyniku 3 oraz gdy zwierzę nie jest w stanie uzyskać dostępu do paszy lub wody przez 24 godziny < br /> UWAGA: Myszy poddano eutanazji w 30 dniu po indukcji EAE poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcia pentobarbitalu (≥150 mg / kg).

Wyniki

Grupy myszy C57BL/6 (łącznie n = 15/grupę) zostały uodpornione MOG_35-55 w emulsji zawierającej M. paratuberculosis lub metodą powszechną za pomocą CFA. Wszystkie grupy myszy wykazywały ostrą chorobę jednofazową charakteryzującą się pojedynczym szczytem niepełnosprawności obserwowanym po 14-17 dniach, po którym następuje częściowe ustąpienie objawów w ciągu następnych 10 dni (Rysunek 1A). Myszy zaszczepione adiuwantem zawierającym M. paratubercul...

Dyskusja

Wykazaliśmy solidny alternatywny protokół aktywnego wywoływania ciężkiego EAE u myszy C57BL / 6J przy użyciu peptydu MOG_35-55 emulgowanego w adiuwantzie zawierającym M. paratuberculosis¹⁰. Indukcja EAE tą metodą skutkowała cięższą chorobą niż ta wywołana wspólnym protokołem z CFA. Różnica ta może wynikać z różnych składników lipidowych w ścianie komórkowej prątków¹¹. W rzeczywistości, w przeciwieństwie do innych prątków, M. paratuberculosis wytw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
przeciwciało anty-mysie CD115	Biolegend, USA	135505	do cytofluorymetrii 1:1,000
przeciwciało anty-mysie CD11b	Biolegend, USA	101215	do cytofluorymetrii 1:1,000
przeciwciało anty-mysie CD11c	Biolegend, USA	117313	do cytofluorymetrii 1:1,000
przeciwciało anty-mysie CD16/32  Biolegend	, USA	101302	dla cytofluorymetria 1:1,000
anty-mysie CD4  przeciwciało	Biolegend, USA	116004	do cytofluorymetrii 1:1,000
przeciwciało anty-mysie CD8a	Biolegend, USA	100753	do cytofluorymetrii 1:1,000
przeciwciało anty-mysie I-A/I-E Biolegend	, USA	107635	do cytofluorymetrii 1:1,000
przeciwciało anty-mysie Ly-6C  Biolegend	, USA	128023	do cytofluorymetrii 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	do izolacji i hodowli myszy,
C57BL/6J	, Charles River Laboratory, Japonia		3 tygodnie, samiec i samica
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	do hodowli komórkowych, ciepły w temperaturze 37 &; C przed użyciem
Liofilizator	Eyela, Tokio, Japonia	FDU-1200	do liofilizacji bakterii
niekompletna e Freund' s adiuwant	Difco Laboratories, MD, USA	263810	do stosowania w adiuwantach
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	pomoc w rozwoju prątków
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	pochodzenia bydlęcego
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desuccated	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	do stosowania w adiuwantach
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		stymulator wzrostu
Glikolipid oligodendrocytów mieliny (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	peptyd encefalotykogenny
Albumina jaja kurzego (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	antygen kontroli ujemnej  do testu proliferacyjnego
Roztwór toksyny krztuścowej	Fujifilm Wako, Osaka Japonia	168-22471	Z bakterii Gram-ujemnych Bordetella pertussi, zwiększa przepuszczalność bariery krew-mózg
Homogenizator Polytron PT 3100	Kinematica		do mieszania antygenu z adiuwantem
RPMI 1640 z L-glutaminą	Gibco Life Techologies, USA	11875093	Do hodowli komórkowych
Tymidyna, [Metylo-3H], w 2% etanolu, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	do oznaczania proliferacji, stosowanie (1 μ Ci/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	cytofluorymetria pod kątem żywotności komórek